CN117222669A - 针对iRhom2的人源化抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及人源化抗体，或其保留靶结合能力的靶结合片段或衍生物，其与人iRhom2结合。
Description
技术领域
本申请涉及针对iRhom2的人源化抗体。
背景技术
ADAM金属肽酶结构域17(ADAM17)(人ADAM17的NCBI参考:NP_003174)，也称为TACE(肿瘤坏死因子-α转化酶)，是一种属于去整合素和金属蛋白酶的ADAM蛋白家族的酶。它是一种824个氨基酸的多肽。
ADAM17被理解为参与细胞表面处理肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，并来自反面高尔基网的胞内膜内。该过程，也称为“脱落”，涉及从膜结合的前蛋白(如pro-TNF-α)中切割和释放可溶性胞外域，并具有已知的生理学重要性。ADAM17是首个被鉴定的“脱落酶”，并且还被理解为在各种膜锚定细胞因子、细胞粘附分子、受体、配体和酶的释放中发挥作用。
TNF-α基因的克隆揭示其编码一种在内质网中易位期间插入细胞膜的26kDa II型跨膜前多肽。在细胞表面，pro-TNF-α呈生物活性，且能够通过近分泌胞间信号传导诱导免疫反应。然而，pro-TNF-α可在其Ala76-Val77酰胺键处被蛋白水解切割，该操作可从pro-TNF-α分子中释放出可溶性17kDa胞外结构域(胞外域)。该可溶性胞外域是通常称为TNF-α的细胞因子，其在该分子的旁分泌信号传导中至关重要。该可溶性TNF-α的蛋白水解释放是由ADAM17催化的。
ADAM17还通过调节乳腺中EGFR配体双调蛋白的切割来调控MAP激酶信号传导通路。ADAM17对于激活EGFR、TGFα、AREG、EREG、HB-EGF、Epigen的几种配体来说是重要的。此外，ADAM17在L-选择素(一种细胞粘附分子)的脱落中发挥作用。
最近，ADAM17被发现是放疗抗性形成的关键介质。还表明放疗激活非小细胞肺癌中的ADAM17，这导致多个存活因子脱落、生长因子通路激活和放疗诱导的治疗抗性。
由于ADAM17似乎是释放包括TNFα在内的不同致病性和非致病性因子的关键性因素，它作为治疗靶分子已成为人们关注的焦点。为此，已经进行了不同的尝试来开发ADAM17的抑制剂。
然而，到目前为止，此类抑制剂尚未被证明在临床上是成功的。
因此，本发明的目的是提供一种允许控制、调节、降低或抑制ADAM17活性的新方法。
本发明的另一目的是提供一种允许治疗炎症性疾病的新方法。
这些和其他目的通过独立权利要求的特征得以解决。从属权利要求公开了可在特定情况下优选的本发明的实施方案。同样，本说明书公开了可在特定情况下优选的本发明的进一步实施方案。
发明内容
本发明特别提供了与人iRhom2结合的人源化抗体。在一个实施方案中，这些抗体在与人iRhom2结合时抑制和/或降低TACE/ADAM17活性。
附图说明
图1提供了通过FACS(荧光机会细胞分选)斯卡查德分析对表达T7标记的全长(FL)野生型(WT)人iRhom2(由L929-2041-hiR2-FL-WT-T7(SEQ ID NO 49)异位表达)的基因工程化小鼠L929细胞群进行抗体亲和力测定的结果。这些结果表明人源化抗体16-B-03、16-B-05、16-B-07、23-B-04、42-B-02和42-B-04与L929-2041-hiR2-FL-WT-T7细胞结合的KD值在次纳摩尔至低纳摩尔范围内。
图2a描述了对基因工程化小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)群的FACS分析的结果，表明分别由MEF-DKO-hiR2-FL-WT-T7(SEQ ID NO 49)和MEF-DKO-miR2-FL-WT-T7(SEQ ID NO51)细胞异位表达的人和小鼠iRhom2全长野生型的T7标记的变体位于这些细胞的表面。染色：灰色＝仅第二抗体；黑色＝抗T7抗体
图2b示出了用于测定本发明抗体的小鼠交叉反应性的FACS分析的结果，表明作为本发明抗体的代表性示例的人源化抗体16-B-03清晰地识别了由MEF-DKO-hiR2-FL-WT-T7异位表达的人iRhom2变体，但不识别由MEF-DKO-miR2-FL-WT-T7细胞异位表达的小鼠iRhom2变体，并因此不与小鼠iRhom2交叉反应。染色：灰色＝仅第二抗体；黑色＝抗体16-B-03
图3a描述了对基因工程化MEF群的FACS分析的结果，表明由MEF-DKO-hiR1-FL-WT-T7(SEQ ID NO 50)异位表达的人iRhom1全长野生型和由MEF-DKO-hiR2-FL-WT-T7(SEQ IDNO 49)细胞异位表达的人iRhom2全长野生型的T7标记的变体分别位于这些细胞的表面。染色：灰色＝仅第二抗体；黑色＝抗T7抗体
图3b示出了用于测定本发明抗体的特异性的FACS分析的结果，表明作为本发明抗体的代表性示例的人源化抗体16-B-0—与由MEF-DKO-hiR2-FL-WT-T7(SEQ ID NO 49)细胞异位表达的人iRhom2变体形成对照—不识别由MEF-DKO-hiR1-FL-WT-T7(SEQ ID NO 50)异位表达的密切相关的人iRhom1变体，并因此对人iRhom2具有特异性。染色：灰色＝仅第二抗体；黑色＝抗体16-B-03
图4a描述了对基因工程化MEF群的FACS分析的结果，表明由MEF-DKO-恒河猴-iR1-FL-WT-T7(UniProt标识符：F6ZPC8)细胞异位表达的恒河猴iRhom1全长野生型的T7标记形式以及由MEF-DKO-恒河猴-iR2-FL-WT-T7(UniProt标识符：F6Y4X6)细胞异位表达的恒河猴iRhom2全长野生型的T7标记形式分别位于这些细胞的表面。染色：灰色＝仅第二抗体；黑色＝抗T7抗体
图4b示出了用于测定本发明抗体与恒河猴的交叉反应性的FACS分析的结果，表明作为本发明抗体16-B-03、16-B-05、16-B-07、23-B-04、42-B-02和42-B-04的代表性示例的人源化抗体16-B-03清晰地识别了由MEF-DKO-恒河猴-iR2-FL-WT-T7异位表达的恒河猴iRhom2变体，但不识别由MEF-DKO-恒河猴-iR1-FL-WT-T7细胞异位表达的恒河猴iRhom1变体，并因此与恒河猴iRhom2交叉反应，但不与恒河猴iRhom1结合。染色：灰色＝仅第二抗体；黑色＝抗体16-B-03
图5a描述了对基因工程化MEF群的FACS分析的结果，表明由MEF-DKO-食蟹猴-iR1-FL-WT-T7(UniProt标识符：A0A2K5TUM2)细胞异位表达的食蟹猴iRhom1全长野生型的T7标记形式以及由MEF-DKO-食蟹猴-iR2-FL-WT-T7(UniProt标识符：A0A2K5TX07)细胞异位表达的食蟹猴iRhom2全长野生型的T7标记形式分别位于这些细胞的表面。染色：灰色＝仅第二抗体；黑色＝抗T7抗体
图5b示出了用于测定本发明抗体与食蟹猴的交叉反应性的FACS分析的结果，表明作为本发明抗体16-B-03、16-B-05、16-B-07、23-B-04、42-B-02和42-B-04的代表性示例的人源化抗体16-B-03清晰地识别了由MEF-DKO-食蟹猴-iR2-FL-WT-T7异位表达的食蟹猴iRhom2变体，但不识别由MEF-DKO-食蟹猴-iR2-FL-WT-T7细胞异位表达的食蟹猴iRhom1变体，并因此与食蟹猴iRhom2交叉反应，但不与食蟹猴iRhom1变体结合。染色：灰色＝仅第二抗体；黑色＝抗体16-B-03
图6a描述了对基因工程化MEF群的FACS分析的结果，表明由MEF-DKO-狗-iR1-FL-WT-T7(UniProt标识符：A0A5F4CNN3)细胞异位表达的狗iRhom1全长野生型的T7标记形式以及由MEF-DKO-狗-iR2-FL-WT-T7(UniProt标识符：Q00M95)细胞异位表达的狗iRhom2全长野生型的T7标记形式分别位于这些细胞的表面。染色：灰色＝仅第二抗体；黑色＝抗T7抗体
图6b示出了用于测定本发明抗体与狗的交叉反应性的FACS分析的结果，表明作为本发明抗体16-B-03、16-B-05、16-B-07、23-B-04、42-B-02和42-B-04的代表性示例的人源化抗体16-B-03清晰地识别了由MEF-DKO-狗-iR2-FL-WT-T7异位表达的狗iRhom2变体，但不识别由MEF-DKO-狗-iR1-FL-WT-T7细胞异位表达的狗iRhom1变体，并因此与狗iRhom2交叉反应，但不与狗iRhom1结合。染色：灰色＝仅第二抗体；黑色＝抗体16-B-03
图7a描述了对基因工程化MEF群的FACS分析的结果，表明由MEF-DKO-兔-iR1-FL-WT-T7(UniProt标识符：B8K128)细胞异位表达的兔iRhom1全长野生型的T7标记形式以及由MEF-DKO-兔-iR2-FL-WT-T7(UniProt标识符：G1T7M2)细胞异位表达的兔iRhom2全长野生型的T7标记形式分别位于这些细胞的表面。染色：灰色＝仅第二抗体；黑色＝抗T7抗体
图7b示出了用于测定本发明抗体与兔的交叉反应性的FACS分析的结果，表明作为本发明抗体16-B-03、16-B-05、16-B-07、23-B-04、42-B-02和42-B-04的代表性示例的人源化抗体16-B-03清晰地识别了由MEF-DKO-兔-iR2-FL-WT-T7异位表达的兔iRhom2变体，但不识别由MEF-DKO-兔-iR1-FL-WT-T7细胞异位表达的兔iRhom1变体，并因此与兔iRhom2交叉反应，但不与兔iRhom1结合。染色：灰色＝仅第二抗体；黑色＝抗体16-B-03
图8a示出了TNFα释放测定的结果，表明本发明的人源化抗体16-B-03、16-B-05、16-B-07、23-B-04、42-B-02和42-B-04干扰THP-1细胞中LPS诱导的TNFα脱落。数据以所释放的TNFα的绝对数说明了供试品的效果。
图8b是图8a中所描述的结果，并以抑制百分比说明供试品对TNFα释放的效果。
图9a示出了TNFα释放测定的结果，表明本发明的人源化抗体16-B-03、16-B-05、16-B-07、23-B-04、42-B-02和42-B-04干扰U937细胞中PMA诱导的TNFα脱落。数据以所释放的TNFα的绝对数说明了供试品的效果。
图9b是图9a中所描述的结果，并以抑制百分比说明供试品对TNFα释放的效果。
图10a示出了IL-6R释放测定的结果，表明本发明的人源化抗体16-B-03、16-B-05、16-B-07、23-B-04、42-B-02和42-B-04干扰THP-1细胞中PMA诱导的IL-6R脱落。数据以所释放的IL-6R的绝对数说明了供试品的效果。
图10b是图10a中所描述的结果，并以抑制百分比说明供试品对IL-6R释放的效果。
图11a示出了IL-6R释放测定的结果，表明本发明的人源化抗体16-B-03、16-B-05、16-B-07、23-B-04、42-B-02和42-B-04干扰U937细胞中PMA诱导的IL-6R脱落。数据以所释放的IL-6R的绝对数说明了供试品的效果。
图11b是图11a中所描述的结果，并以抑制百分比说明供试品对IL-6R释放的效果。
图12a示出了HB-EGF释放测定的结果，表明本发明的人源化抗体16-B-03、16-B-05、16-B-07、23-B-04、42-B-02和42-B-04干扰THP-1细胞中PMA诱导的HB-EGF脱落。数据以所释放的HB-EGF的绝对数说明了供试品的效果。
图12b是图12a中所描述的结果，并以抑制百分比说明供试品对HB-EGF释放的效果。
图13a示出了HB-EGF释放测定的结果，表明本发明的人源化抗体16-B-03、16-B-05、16-B-07、23-B-04、42-B-02和42-B-04干扰U937细胞中PMA诱导的HB-EGF脱落。数据以所释放的HB-EGF的绝对数说明了供试品的效果。
图13b是图13a中所描述的结果，并以抑制百分比说明供试品对HB-EGF释放的效果。
图14a示出了TGFα释放测定的结果，表明本发明的人源化抗体16-B-03、16-B-05、16-B-07、23-B-04、42-B-02和42-B-04干扰PC3细胞中PMA诱导的TGFα脱落。数据以所释放的TGFα的绝对数说明了供试品的效果。
图14b是图14a中所描述的结果，并以抑制百分比说明供试品对TGFα释放的效果。
图15示出了用于测定本发明抗体的特异性的FACS分析的结果，表明作为本发明抗体的代表性示例的人源化抗体42-B-02与RPMI-8226(左图)和THP-1细胞(中间图)结合，RPMI-8226和THP-1细胞均内源性表达iRhom2，但不与不内源性表达iRhom2的RH-30细胞(右图)结合，并因此特异性识别内源性人iRhom2。所分析的抗体在CHO细胞中由相应的重链/κ轻链对的瞬时表达产生。染色：灰色＝仅第二抗体；黑色＝人源化抗体42-B-02
图16a描述了对在大的胞外环(人iRhom2的AA502至AA594)内具有单氨基酸取代或缺失的MEF群的FACS分析的结果，所述MEF群被基因工程化以用于表位测定。数据表明—与由MEF-DKO-hiR2-FL-WT-T7异位表达的人iRhom2全长野生型的T7标记的变体相似—由MEF-DKO-hiR2-FL-K536A-T7细胞异位表达的T7标记的人iRhom2变体hiR2-FL-K536A也位于这些细胞的表面。染色：灰色＝仅第二抗体；黑色＝抗T7抗体
图16b示出了TGFα释放测定(脱落测定)的结果，表明除了人iRhom2变体hiR2-FL-C516A、hiR2-FL-F523A、hiR2-FL-C549A、hiR2-FL-D552A、hiR2-FL-C556A、hiR2-FL-P559A、hiR2-FL-W567A、hiR2-FL-W574A和hiR2-FL-C577A以外，在大的胞外环(人iRhom2的AA502至AA594)内具有单氨基酸取代或缺失的所有137个人iRhom2变体呈功能活性，并且可在不同程度上支持TGFα的PMA刺激的脱落，指示这些变体最有可能被正确折叠。
图17a描述了用于本发明抗体的表位测定的FACS分析的结果。在大的胞外环(人iRhom2的AA502至AA594)内具有单氨基酸取代或缺失的所有128个人iRhom2变体的整个组示例性地显示了异位表达人iRhom2变体hiR2-FL-K536A的MEF-DKO-hiR2-FL-K536A-T7细胞的分析数据。数据表明人iRhom2中的单氨基酸亮氨酸536被丙氨酸的取代强烈地削弱，并因此有助于结合作为本发明抗体的代表性示例的人源化抗体42-B-02。染色：灰色＝仅第二抗体；黑色＝人源化抗体42-B-02
图17b汇总了在大的胞外环(人iRhom2的AA502至AA594)内异位表达具有单氨基酸取代或缺失的人iRhom2变体的128个工程化的功能MEF群的整个图上的所有本发明抗体的FACS分析的结果。数据揭示了与本发明抗体的iRhom2结合相关的氨基酸位置的相关模式。
图18a示出了TNFα释放测定的结果，表明本发明的所有抗体干扰从健康供体分离的人外周血单个核细胞(PBMC)中LPS诱导的TNFα脱落。数据以所释放的TNFα的绝对数说明了供试品的效果。所分析的人源化抗体在CHO细胞中由相应的重链/κ轻链对的瞬时表达产生。
图18b是图18a中所描述的结果，并以抑制百分比说明供试品对TNFα释放的效果。
图19a示出了IL-6R释放测定的结果，表明本发明的所有抗体干扰从健康供体分离的人外周血单个核细胞(PBMC)中PMA诱导的IL-6R脱落。数据以所释放的IL-6R的绝对数说明了供试品的效果。所分析的人源化抗体在CHO细胞中由相应的重链/κ轻链对的瞬时表达产生。
图19b是图19a中所描述的结果，并以抑制百分比说明供试品对IL-6R释放的效果。
图20a示出了HB-EGF释放测定的结果，表明本发明的所有抗体干扰从健康供体分离的人外周血单个核细胞(PBMC)中PMA诱导的HB-EGF脱落。数据以所释放的HB-EGF的绝对数说明了供试品的效果。所分析的人源化抗体在CHO细胞中由相应的重链/κ轻链对的瞬时表达产生。
图20b是图20a中所描述的结果，并以抑制百分比说明供试品对HB-EGF释放的效应。
图21a示出了基因人源化小鼠中体内败血性休克模型的结果，表明作为本发明抗体的代表性示例的人源化抗体42-B-02干扰基因人源化小鼠中LPS诱导的TNFα脱落。数据以所释放的TNFα的绝对数说明了供试品的效果。分析的人源化抗体是由CHO细胞中相应的重链/κ轻链对的瞬时表达产生的。
图21b是图21a中所描述的结果，并且与经缓冲液处理的对照动物(设置为100％)相比，以百分比说明供试品对TNFα释放的效果。
发明详述
根据本发明的一个方面，提供了一种结合iRhom2的人源化抗体，或其保留靶结合能力的靶结合片段或衍生物，其
a)包含一组三个重链互补决定区(CDR)和三个轻链互补决定区(CDR)，所述互补决定区包含在以下重链/轻链可变结构域序列对的一者中：
·SEQ ID NO 1和5；
·SEQ ID NO 9和13；
·SEQ ID NO 17和21；
·SEQ ID NO 25和29；
·SEQ ID NO 33和37或
·SEQ ID NO 41和45，
b)包含选自以下的一组三个重链互补决定区(CDR)和三个轻链互补决定区(CDR)
·SEQ ID NO 2、3、4、6、7和8，
·SEQ ID NO 10、11、12、14、15和16，
·SEQ ID NO 18、19、20、22、23和24，
·SEQ ID NO 26、27、28、30、31和32，
·SEQ ID NO 34、35、36、38、39和40，或
·SEQ ID NO 42、43、44、46、47和48，
c)包含b)的重链/轻链互补决定区(CDR)组，条件是CDR中的至少一者相对于相应的SEQ ID NO具有最多3个氨基酸取代，和/或
d)包含b)或c)的重链/轻链互补决定区(CDR)组，条件是CDR中的至少一者与包含在SEQ ID NO中的相应的CDR具有≥66％的序列相同性。
CDR嵌入在合适的蛋白框架、优选地可变结构域框架内，以便能够与人iRhom2结合。
在一个实施方案中，CDR是根据Kabat、Chothia或MacCallum的定义确定的，优选地其中CDR是根据表1中所述的编号确定的。
本领域已知人源化mAb的生产和/或选择方法。例如，Genentech的US6331415描述了嵌合抗体的生产，而医学研究委员会的US6548640描述了CDR移植技术，Celltech的US5859205描述了人源化抗体的生产。
人源化抗体是互补决定区来源于取自非人类物种的亲本抗体的抗体，并且被移植到人抗体例如IgG1、IgG2或IgG4的框架(至少可变结构域)中。人源化抗体结合与亲本抗体相同的靶标，但是由于其移植到了人框架中，已降低了免疫原性(例如，HAMA反应)。为此，人源化抗体在结构上与其亲本(例如，鼠)抗体不同。
在人源化中，将CDR移植到人框架中的步骤通常在亲和力成熟步骤前，以再次获取在移植过程中失去的亲和力。该过程进一步修饰了包括其CDR在内的人抗体的序列。
在一个实施方案中，CDR嵌入在合适的蛋白框架中以便能够抑制或降低TACE/ADAM17活性。
非活性菱形蛋白家族成员2(iRhom2)是在人体内由RHBDF2基因编码的蛋白。它是由约850个氨基酸组成的具有七个跨膜结构域的跨膜蛋白。
iRhom2有不同的同种型。在本文中进行的实验用NCBI参考NP_078875.4所定义的同种型建立。然而，教导内容可非限制性地转换到iRhom2的其他同种型，如下表所示：
| mRNA | 蛋白 | 名称 |
| NM_024599.5 | NP_078875.4 | 非活性菱形蛋白2转录物变体1/同种型1 |
| NM_001005498.3 | NP_001005498.2 | 非活性菱形蛋白2转录物变体2/同种型2 |
如本文所用，术语“抑制和/或降低TACE/ADAM17活性”是指描述由阻断或降低TACE/ADAM17活性的抗体或片段引起的效应，如例如在相应的脱落测定中所测量(参见，例如图8和实施例6)。
ADAM金属肽酶结构域17(ADAM17)，也称为TACE(肿瘤坏死因子-α转化酶)，是一种属于去整合素和金属蛋白酶的ADAM蛋白家族的酶。ADAM17被理解为参与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)在细胞表面的加工，并来自反面高尔基网的胞内膜内。该过程，也称为“脱落”，涉及从膜结合的前蛋白(如pro-TNF-α)中切割和释放可溶性胞外域，并具有已知的生理学重要性。ADAM17是首个被鉴定的“脱落酶”，并且还被理解为在各种膜锚定细胞因子、细胞粘附分子、受体、配体和酶的释放中发挥作用。
TNF-α基因的克隆揭示其编码一种在成熟期间插入细胞膜的26kDa II型跨膜前多肽。在细胞表面，pro-TNF-α呈生物活性，且能够经近分泌胞间信号传导诱导免疫反应。然而，pro-TNF-α可在其Ala76-Val77酰胺键处被蛋白水解切割，这可从pro-TNF-α分子中释放出可溶性17kDa胞外结构域(胞外域)。该可溶性胞外域是通常称为TNF-α的细胞因子，其在该分子的旁分泌信号传导中至关重要。该可溶性TNF-α的蛋白水解释出是由ADAM17催化的。
最近，ADAM17被发现是对放疗抗性的关键介质。还表明了放疗激活非小细胞肺癌中的ADAM17，这导致了多个存活因子脱落、生长因子通路激活和放疗诱导的治疗抗性。
ADAM17还可通过调节乳腺中EGFR配体双调蛋白的脱落来调控MAP激酶信号传导通路。ADAM17还在L-选择素(一种细胞粘附分子)的脱落中发挥作用。
如本所用，术语“CDR”或“互补决定区”旨在意指在重链和轻链多肽二者的可变区内发现的非连续抗原结合位点。这些特定区域由Kabat et al.(1977)、Kabat et al.(1991)、Chothia et al.(1987)和MacCallum et al.(1996)描述，其中定义包括相互比较时氨基酸残基的重叠或子集。然而，定义的应用是指抗体或移植抗体或其变体的CDR旨在本文所定义和使用的术语的范围内。包含由上述引用的参考文献中的每个所定义的CDR的氨基酸残基作为对比如下表1中所示。
| Kabat | Chothia | MacCallum | |
| VH CDR1 | 31-35 | 26-32 | 30-35 |
| VH CDR2 | 50-65 | 53-55 | 47-58 |
| VH CDR3 | 95-102 | 96-101 | 93-101 |
| VL CDR1 | 24-34 | 26-32 | 30-36 |
| VL CDR2 | 50-56 | 50-52 | 46-55 |
| VL CDR3 | 89-97 | 91-96 | 89-96 |
表1：CDR定义
如本文所用，术语“框架”在用于抗体可变结构域时被输入为意指抗体可变结构区内CDR区外的所有氨基酸残基。因此，可变结构域框架的长度在约100-120个氨基酸之间，但仅意指CDR外的那些氨基酸。
如本文所用，术语“能够与靶标X结合”应理解为意指相应的结合结构域以10-4或更小KD结合靶标。KD是抗体或片段与其抗原之间的平衡解离常数，即koff/kon的比率。KD与亲和力成反比。KD值涉及抗体或片段(特定实验所需的抗体或片段的量)的浓度，所以KD值越低(浓度越低)，结合结构域的亲和力越高。下表显示单克隆抗体的典型的KD范围。
表2：KD与摩尔值
优选地，抗体或片段具有最多2个氨基酸取代，并且更优选地最多1个氨基酸取代。
优选地，抗体或片段的CDR中的至少一者与相应的SEQ ID NO具有≥67％；≥68％；≥69％；≥70％；≥71％；≥72％；≥73％；≥74％；≥75％；≥76％；≥77％；≥78％；≥79％；≥80％；≥81％；≥82％；≥83％；≥84％；≥85％；≥86％；≥87％；≥88％；≥89％；≥90％；≥91％；≥92％；≥93％；≥94％；≥95％；≥96％；≥97％；≥98％；≥99％且最优选地100％的序列相同性。
如本文所用的“序列相同性百分比”通过在比较窗口上比较两个最佳比对的生物序列(氨基酸序列或多核苷酸序列)来确定，其中与不包括添加或缺失的参考序列相比，比较窗口中相应的序列的部分可包含添加或缺失(即空位)，以用于两个序列的最佳比对。通过确定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以获得匹配的位置数目，将匹配的位置数目除以比较窗口中的总位置数目并将结果乘以100以获得序列相同性百分比来计算百分比。
在两个或更多个核酸或多肽序列的语境中，术语“相同”或“相同性”百分比是指两个或更多个序列或子序列为相同序列。当在比较窗口或指定区域上进行比较和比对以获得最大对应性时，如果两个序列具有指定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸(即，指定区域上，或未指定时在参考序列的整个序列上的至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性)，则两个序列是“基本上相同的”，如使用以下序列比较算法之一或通过手动比对和目视检查所测量的。本公开提供了与本文例示的多肽基本上相同的多肽。对于氨基酸序列，相同性或基本上的相同性可存在于长度为至少5、10、15或20个氨基酸、任选地长度为至少约25、30、35、40、50、75或100个氨基酸、任选地长度为至少约150、200或250个氨基酸的区域上，或全长参考序列上。对于较短的氨基酸序列，例如，20个或更少的氨基酸的氨基酸序列，根据本文定义的保守性取代，当一个或两个氨基酸残基被保守性取代时，存在基本上的相同性。
优选地，对CDR中的至少一者进行CDR序列修饰，包括
·亲和力成熟
·免疫原性的降低
亲和力成熟是在体外提高给定抗体亲和力的过程。与天然对应物一样，体外亲和力成熟基于突变和筛选的原理。其已经成功地用于优化抗体、抗体片段或其他肽分子如抗体模拟物。使用辐射、化学诱变剂或易错PCR引入CDR内的随机突变。此外，可通过链改组来增加遗传多样性。使用噬菌体展示等展示方法进行的两轮或三轮突变和筛选通常会导致亲和力在低纳摩尔范围内的抗体片段。对于原理，参见Eylenstein等人(2016)或US20050169925A1，其内容出于实现目的通过参考并入本文。
工程化抗体含有小鼠序列衍生的CDR区，其已经连同任何所需的框架回复突变一起移植至序列衍生的V区中。因此，当将人源化抗体施用于患者时，CDR自身可引起免疫原性反应。降低由CDR引起的免疫原性的方法公开于Harding等人((2010)、或US2014227251A1，其内容出于实现目的通过参考并入本文。
根据本发明的一个实施方案，抗体或片段包含
a)以下SEQ ID NO对所示的重链/轻链可变结构域(HCVD/LCVD)对：
·1和5；
·9和13；
·17和21；
·25和29；
·33和37和/或
·41和45
b)a)的重链/轻链可变结构域(HCVD/LCVD)对，条件是
·HCVD与相应的SEQ ID NO具有≥80％的序列相同性，和/或
·LCVD与相应的SEQ ID NO具有≥80％的序列相同性，
c)a)或b)的重链/轻链可变结构域(VD)对，条件是HCVD或LCVD中的至少一者相对于相应的SEQ ID NO具有最多10个氨基酸取代，
所述抗体或片段仍然能够与人iRhom2结合和/或抑制或降低TACE/ADAM17活性。
当提及抗体或其重链或轻链时，“可变结构域”旨在意指抗体的一部分，其赋予抗原结合到分子上且不是恒定区。该术语旨在包括其保持整个可变区的全部结合功能的一部分的功能片段。可变区结合片段包括，例如，功能片段如Fab、F(ab)2、Fv、单链Fv(scfv)等。此类功能片段对本领域的技术人员来说是公知的。因此，在描述异质可变区的功能片段中使用这些术语旨在与本领域技术人员公知的定义相对应。在例如Huston等人(1993)或Plückthun和Skerra(1990)中描述了此类术语。
HCVD和/或LCVD与相应的SEQ ID NO具有≥81％；≥82％；≥83％；≥84％；≥85％；≥86％；≥87％；≥88％；≥89％；≥90％；≥91％；≥92％；≥93％；≥94％；≥95％；≥96％；≥97％；≥98％；≥99％；或最优选的100％的序列相同性。
根据本发明的一个实施方案，至少一个氨基酸取代是保守性氨基酸取代。
如本文所用，“保守性氨基酸取代”对抗体功能的效应比非保守取代更小。尽管存在许多的氨基酸分类方式，但是根据其结构和其R基团的一般化学特征，通常将它们分为6个主要的类别。
在一些实施方案中，“保守性氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换的取代。例如，本领域定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有以下的氨基酸：
·碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，
·酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，
·不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，
·非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，
·β支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和
·芳香侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
其他保守性氨基酸取代也可跨越氨基酸侧链家族发生，如当用天冬酰胺取代天冬氨酸以改变肽的电荷时。保守性变化还可进一步包括化学上同源的非天然氨基酸的取代(即，合成非天然疏水性氨基酸取代亮氨酸、合成非天然芳香性氨基酸取代色氨酸)。
根据本发明的一个实施方案，抗体或片段具有以下中的至少一者：
·与根据前述权利要求中任一项所述的抗体或片段相比，对人iRhom2≥50％的靶结合亲和力，和/或，
·根据前述权利要求中任一项所述的抗体或片段对TACE/ADAM17活性≥50％的抑制或降低效应。
如本文所用，术语“结合亲和力”旨在意指结合相互作用的强度，并因此既包括实际结合亲和力还包括表观结合亲和力。实际结合亲和力是缔合速率与解离速率之比。因此，赋予或优化结合亲和力包括更改这些组分中的任一者或二者以实现所期望的结合亲和力水平。表观亲和力可包括例如相互作用的亲和力。例如，二价异聚可变区结合片段由于其价态而表现出改变的或优化的结合亲和力。
用于测量结合剂的亲和力的合适的方法是通过表面等离子体共振(SPR)实现的。该方法是基于当在金属/液体界面处激发表面等离子体波时发生的现象。光被引导到表面不与样本接触的一侧并从其中反射，并且SPR在角度和波长的特定组合下引起反射光强度的降低。生物分子结合事件引起表面层折射率的变化，这些变化被检测为SPR信号的变化。结合事件可以是受体-配体对之间的结合缔合或解离。可基本上瞬时地测量折射率的变化，因此允许确定亲和常数的各个分量。更具体地，该方法能够精确地测量缔合速率(kon)和解离速率(koff)。
kon和koff值的测量可以是有利的，因为它们可以识别治疗上更有效的改变的可变区或优化的可变区。例如，改变的可变区或其异聚结合片段可以是更有效的，因为它比具有相似结合亲和力的可变区和异聚体结合片段相比具有更高的kon值。由于具有较高kon值的分子可以更快的速率特异性结合和抑制其靶标，因此赋予了增加的效力。相似地，本发明的分子更有效，因为它与具有相似结合亲和力的分子相比具有更低的kon值。可以观察到用具有更低koff值的分子所观察的功效增加，因为一旦结合，该分子会较慢地从其靶标解离。尽管关于本发明的改变的可变区和优化的可变区(包括其异聚可变区结合片段)进行了描述，但是上述用于测量缔合和解离速率的方法基本上可应用于任何抗体或其片段，以鉴定用于治疗或诊断目的的更有效的结合剂。
用于测量结合剂的亲和力的另一种合适的方法是通过表面经由FACS/斯卡查德分析进行的。相应的描述尤其参见实施例1。
采用表面等离子体共振测量亲和力(包括缔合和解离速率)的方法是本领域是公知的，并且可发现于例如Jonsson与Malmquist(1992)和Wu等人(1998)中。此外，本领域公知的用于测量结合相互作用的一种设备是BIAcore 2000仪，其可通过Pharmacia Biosensor(Uppsala、Sweden)商购获得。
优选地，所述靶结合亲和力为相比于参考结合剂的靶结合亲和力的≥51％、≥52％、≥53％、≥54％、≥55％、≥56％、≥57％、≥58％、≥59％、≥60％、≥61％、≥62％、≥63％、≥64％、≥65％、≥66％、≥67％、≥68％、≥69％、≥70％、≥71％、≥72％、≥73％、≥74％、≥75％、≥76％、≥77％、≥78％、≥79％、≥80％、≥81％、≥82％、≥83％、≥84％、≥85％、≥86％、≥87％、≥88％、≥89％、≥90％、≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％并且最优选的≥99％。
如本文所用，与基准结合剂相比，用合适的方法确定对TACE/ADAM17活性的抑制或降低效应的量化以确定TNFα脱落效应，如在图8和实施例6中所描述。
根据本发明的另一个方面，提供了一种人源化抗体，其与人iRhom2结合并与以下项竞争与人iRhom2的结合
a)与根据上文描述的抗体，和/或
b)选自由克隆16-B-03；16-B-05；16-B-07；23-B-04；42-B-02；和/或42-B-04组成的组的抗体。
根据本发明的另一个方面，提供了一种人源化抗体，其与以下项结合基本上相同、或相同的人iRhom2上的区域：
a)根据上文描述的抗体，和/或
b)选自由克隆16-B-03；16-B-05；16-B-07；23-B-04；42-B-02；和/或42-B-04组成的组的抗体。
本文序列表中鉴定出了克隆16-B-03；16-B-05；16-B-07；23-B-04；42-B-02；和42-B-04。
如本文所用，术语“区域”应被理解为意指胞外区、结构域、子结构域、或二级结构(例如，环)，或优选地表位。
关于此类抗体或片段的形式或结构，应用与上述相同的优选实施方案。在一个实施方案中，所述抗体或片段是单克隆抗体，或其保留靶结合能力的靶结合片段或衍生物，或抗体模拟物。
如本文所用，术语“竞争结合”是参照上述序列定义的抗体之一，意思是实际抗体或片段呈现的活性为所述序列定义的抗体或片段结合至相同的靶标、或靶标表位、或结构域或子结构域，并且是后者的变体。结合的效率(例如，动力学或热力学)可以是与后者的效率相同或大于或小于后者的效率。例如，两种抗体与底物结合的平衡结合常数可以是不同的。
此类结合竞争可以用竞争性结合测定方法适当地测量。这样的测定方法公开于Finco等人2011，其内容出于实现目的通过参考并入本文，并且其用于解释专利权利要求的含义公开于Deng等人2018，其内容出于实现目的通过引用并入本文。
为了测试该特性，可获得合适的表位作图技术，尤其包括
·X射线共晶体学和低温电子显微术(cryo-EM)
·基于阵列的寡肽扫描
·定点诱变作图
·高通量鸟枪诱变表位作图
·氢-氘交换
·交联耦合质谱法
在Banik等人(2010)和DeLisser(1999)中公开并讨论了这些方法，其内容出于实现目的通过参考并入本文。
根据一个实施方案，抗体或片段在与人iRhom2结合时至少在人iRhom2的环1的区域内结合。iRhom2的环1包含SEQ ID NO 49的第474-660位氨基酸残基。
在另一个实施方案中，抗体或片段不与位于环1的N-末端侧的近膜结构域(JMD)结合。
根据本发明的一个实施方案，TACE/ADAM17活性的抑制或降低由抗体或片段干扰iRhom2介导的TACE/ADAM17激活或TACE/ADAM17与包括底物分子的其他蛋白的相互作用引起。
根据本发明的一个实施方案，抗体或片段在与人iRhom2结合时抑制或降低诱导的TNFa脱落。
根据本发明的一个实施方案，抗体或片段在与人iRhom2结合时抑制或降低诱导的IL-6R脱落。
根据本发明的一个实施方案，抗体或片段在与人iRhom2结合时抑制或降低诱导的HB-EGF脱落。
如本文所用，肿瘤坏死因子α(TNFα)脱落或释放是指膜锚定的肿瘤坏死因子α(mTNFα/pro-TNFα)在切割后被释放至环境中变成可溶性TNFα(sTNFα或简称TNFα)的过程。该过程尤其是由TACE/ADAM17触发的。
白介素6受体(IL-6R)的释放或脱落是指通过TACE/ADAM17在靠近其跨膜结构域的蛋白水解位点处在细胞表面上对膜结合的IL-6R进行蛋白水解切割而产生可溶性IL-6R的过程。
肝素结合EGF样生长因子(HB-EGF)的释放或脱落是指产生HB-EGF的可溶性形式并使其从细胞表面游离的切割过程。肝素结合EGF样生长因子(一种对肝素有亲和力的表皮生长因子)作为膜锚定的促有丝分裂和趋化糖蛋白合成。HB-EGF首次在人巨噬细胞样细胞的条件培养基中被鉴定，是一种可展示高度调节的基因表达的87个氨基酸糖蛋白。
测定TNFα脱落效应的合适的测定方法描述于例如图8和实施例6中。测定IL-6R和/或HB-EGF的释放或脱落的合适的测定方法分别描述于例如在图10和实施例8中或在图12和实施例10中。
根据本发明的一个实施方案，抗体或片段所结合的人iRhom2包含
a)SEQ ID NO 49所示的氨基酸序列，或
b)与SEQ ID NO 49具有至少80％序列相同性的氨基酸序列，条件是所述序列保持iRhom2活性。
在一些实施方案中，人iRhom2包含与SEQ ID NO 49具有≥81％、优选地≥82％、更优选地≥83％、≥84％、≥85％、≥86％、≥87％、≥88％、≥89％、≥90％、≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％或最优选地≥99％序列相同性的氨基酸序列。
SEQ ID NO 49表示非活性菱形蛋白2(iRhom2)同种型1[智人]的氨基酸序列，可根据NCBI参考NP_078875.4获得。一般地，存在不同的iRhom2变体和同种型。同样地，存在或可能存在包含保守或沉默氨基酸取代的突变体，其保持完全或至少基本的iRhom2活性。这些同种型、变体和突变体由上述指定的相同性范围所涵盖，然而，这意味着不包括功能异常的非活性变体和突变体。
根据本发明的一个实施方案，抗体或片段是单克隆抗体，或其保留靶结合能力的靶结合片段或衍生物。
根据本发明的一个实施方案，根据本发明的抗体或片段是选自由以下组成的组的形式中的至少一者：IgG、scFv、Fab或(Fab)2。
如本所用，术语“单克隆抗体(mAb)”应是指一种具有同质抗体群的抗体组合物，即具有包括全免疫球蛋白，或其保留靶结合能力的片段或衍生物的同质群的抗体组合物。
特别优选地，这样的抗体为IgG抗体，或其保留靶结合能力的片段或衍生物。免疫球蛋白G(IgG)是一种抗体类型。IgG约占人血清抗体的75％，是血液循环中最常见的抗体类型。IgG分子由血浆B细胞产生并释放。每个IgG具有两个抗原结合位点。
IgG抗体是由四个肽链组成的分子量为约150kDa的大分子。它含有两条相同的约50kDa的γ类重链和两条相同的约25kDa的轻链，因此是四聚四级结构。这两个重链彼此连接并通过二硫键与轻链连接。所得的四聚体具有两个相同的半体，它们一起形成Y形。叉的每一端都包含一个相同的抗原结合位点。IgG的Fc区具有高度保守的N-糖基化位点。与该位点连接的N-多聚糖主要是复合型核心岩藻糖基双触角结构。此外，少量的这些N-多聚糖还具有二等分GlcNAc和α-2,6-连接的唾液酸残基。
人体内存在四个IgG亚类(IgG1、2、3和4)，按照其在血清中的丰度(IgG1最丰富)的顺序命名。
如本所用，术语“片段”应是指此类抗体的保留靶结合能力的片段，例如，
·CDR(互补决定区)，
·高变区，
·可变区(Fv)，
·IgG或IgM重链(由VH、CH1、铰链、CH2和CH3区组成)，
·IgG或IgM轻链(由VL和CL区组成)和/或
·Fab和/或F(ab)2。
如本文所用，术语“衍生物”应是指在结构上与一般的抗体概念不同但仍具有某些结构关系的蛋白构建体，例如，scFv、Fab和/或F(ab)2，以及双、三或更高特异性的抗体构建体，并且其还保留了靶结合能力。下面将对所有这些项目进行解释。
本领域技术人员已知的其他抗体衍生物为双抗体、骆驼抗体、纳米抗体、结构域抗体、具有由scFvs、IgA(由J链和分泌组分连接的两个IgG结构)组成的两条链的二价同源二聚体、鲨鱼抗体、由新世界灵长类动物框架加上非新世界灵长目动物CDR组成的抗体、包含CH3+VL+VH的二聚体构建体和抗体缀合物(例如，与毒素、细胞因子、放射性同位素或标记物连接的抗体或片段或衍生物)。这些类型在文献中有充分的描述，并且可以在本公开的基础上被本领域技术人员使用，但不进一步增加创造性活动。
&Milstein(1975)中公开了杂交瘤细胞的生产方法。
完全人mAbs的生产和/或筛选方法在本领域是已知的。这些可涉及用相应的蛋白或肽免疫的转基因动物的使用，或合适的展示技术如酵母展示、噬菌体展示、B细胞展示或核糖体展示的使用，其中在固定相针对人iRhom2筛选文库中的抗体。
在MorphoSys的US6300064和MRC/Scripps/Stratagene的US6248516中公开了体外抗体文库。例如在Dyax的US5223409中公开了噬菌体展示技术。例如TaconicArtemis的EP1480515A2中描述了转基因哺乳动物平台。
IgG、IgM、scFv、Fab和/或F(ab)2是本领技术人员公知的抗体形式。相关的启用技术可从相应的教科书中获得。
如本文所用，术语“Fab”是指包含抗原结合区的IgG/IgM片段，所述片段包含来自抗体的每个重链和轻链的一个恒定结构域和一个可变结构域。
如本文所用，术语“F(ab)2”涉及包括通过二硫键彼此连接的两个Fab片段的IgG/IgM片段。
如本文所用，术语“scFv”涉及单链可变片段，所述单链可变片段是免疫球蛋白的重链和轻链的可变区的融合体，用短接头(通常为丝氨酸(S)或甘氨酸(G))连接在一起。这种嵌合分子保留了原始免疫球蛋白的特异性，尽管去除了恒定区并引入了接头肽。
经修饰的抗体形式例如为双或三特异性抗体构建体、基于抗体的融合蛋白、免疫缀合物等。这些类型在文献中有充分的描述并且可以在本公开的技术上被本领域技术人员使用，无需进一步增加创造性活动。
如本文所用，术语“抗体模拟物”是指一种有机分子，最常见的是与靶蛋白特异性结合的蛋白，与抗体相似，但在结构上与抗体不相关。抗体模拟物一般为具有约3至20kDa摩尔质量的人工肽或蛋白。该定义尤其涵盖Affibody分子、Affilin、Affimer、Affinin、Alphabody、Anticalin、Avimer、DARPin、Fynomer、Kunitz结构域肽、Monobody和nanoCLAMP。
在一个或多个实施方案中，抗体或片段是分离的抗体，或其保留靶结合能力的靶结合片段或衍生物，或分离的抗体模拟物。
在一个或多个实施方案中，抗体是工程化或重组抗体，或其保留靶结合能力的靶结合片段或衍生物，或工程化或重组抗体模拟物。
根据本发明的一个实施方案，抗体或片段是一种为至少一种选自由以下组成的组的形式的抗体：IgG、scFv、Fab或(Fab)2。
根据本发明的一个实施方案，抗体或片段不与人iRhom1交叉反应。人iRhom1的序列在本文中公开为SEQ ID NO 50。
根据本发明的另一个方面，提供了一种编码根据上述描述的结合剂的至少一条链的核酸。
在一个实施方案中，提供了一种核酸，或一对核酸，其分别编码结合剂的重链和轻链，在后者为具有至少一条轻链和一条重链的异聚结构的单克隆抗体的情况下。
此类核酸还可以用于药物用途。核酸可以是RNA分子，或RNA衍生物，所述RNA衍生物包含例如经修饰的核苷酸如假尿苷(Ψ)或N-1甲基假尿苷(m1Ψ)，以提供稳定性并降低免疫源性(参见，例如US8278036和US9428535，其内容出于实现目的并入本文)。在另一个实施方案中，RNA包含选择最富含GC的密码子来提供稳定性并降低免疫原性(参见，例如，EP1392341，其内容出于实现目的并入本文)。mRNA可以例如在合适的脂质体中进行递送并包含特异性序列或经修饰的尿苷核苷酸，以避免免疫反应和/或提高折叠和翻译效率，有时包含5’和/3’末端处的帽修饰，以将它们靶向特定的细胞类型。在若干实施方案中，相应的RNA序列选自SEQ ID NO 100-SEQ ID NO 147。参见下表以找出哪种RNA编码哪个抗体序列。
同样地，核酸可以为DNA分子。在此类情况下，所述分子可以是任选地整合至合适的载体中的cDNA，例如，减毒的、非致病性病毒，或作为一种或多种质粒提供。此类质粒可以例如通过电穿孔装置施用于患者中，例如专利EP3397337B1中所述，其内容出于实现目的并入本文。在若干实施方案中，相应的DNA序列选自SEQ ID NO 52-SEQ ID NO 99。参见下表以找出哪个cDNA编码哪个抗体序列。
一般地，由于遗传密码的简并性，存在大量的具有编码此类链的不同的核酸。本领域技术人员完全能够确定给定的核酸是否满足上述标准。另一方面，本领域技术人员完全能够基于密码子使用表由给定的氨基酸序列逆向工程化合适的编码其的核酸。为此，可以使用由在线工具“序列操作套件”(https://www.bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html)提供的“逆翻译”等软件工具。因此，有许多可供选择的编码所声称的蛋白序列的DNA和RNA序列。这些可供选择的序列应被认为是属于本发明的范围内。
根据本发明的另一个方面，提供了根据上述描述所述的抗体或片段或核酸(在制备)用于治疗
·被诊断出炎性病况，
·患有炎性病况或
·处于发展炎性病况的风险
的人或动物对象或者用于预防此类病况的(药物中的)用途。
为了诊断炎性病况，患者要进行身体检查，并且还要被询问病史。职业者会寻找关节炎症、关节僵硬和关节功能丧失。此外，与健康对照相比，职业者可以要求X射线和/或血液测试来检测炎症性标志物，如例如血清hs-CRP、IL-6、TNF-α和IL-10、红细胞沉降率、血浆粘度、纤维蛋白原和/或铁蛋白。
根据本发明的另一个方面，提供了一种药物组合物，其包含根据上述描述所述的抗体或片段或核酸，以及任选地一种或多种药学上可接受的赋形剂。
根据本发明的另一个方面，提供了一种组合，其包含(i)根据上述描述所述的抗体或片段或核酸和(ii)一种或多种治疗活性化合物。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于治疗或预防炎性病况的方法，所述方法包括以治疗上充足的剂量向人或动物对象施用(i)根据上述描述所述的抗体或片段、(ii)根据上述描述所述的核酸、(iii)根据上述描述所述的药物组合物或(iv)根据上述描述所述的组合。
根据本发明的另一个方面，提供了一种治疗试剂盒，包含：
a)根据上述描述所述的抗体或片段、根据上述描述所述的核酸、根据上述描述所述的药物组合物或根据上述描述所述的组合，
b)用于施用所述抗体、核酸、药物组合物或组合物的设备，以及
c)使用说明书。
实施例
虽然已经在附图和前述描述中详细说明和描述了本发明，但是此类说明和描述被认为是说明性或示例性的而非限制性的；本发明并不限制于所公开的实施方案。通过对附图、本公开和所附权利要求的研究，本领域技术人员在实践所要求保护的本发明时可以理解和实现对所公开的实施方案的其他变化。在权利要求书中，“包含”一词不排除其他元素或步骤，不定冠词“一”或“一个”不排除复数。仅在相互不同的从属权利要求中列举某些措施这一事实并不表明这些措施的组合不能用于有利的目的。权利要求中的任何参考标志不应被解释为限制范围。
本文公开的所有氨基酸序列显示为从N末端到C末端；本文公开的所有核酸序列显示为5’-＞3’。
抗体人源化的一般方法
通过CDR移植进行的人源化是一种已被证明的成功的获得源自小鼠、其他异种物种或杂交瘤的抗体并降低潜在的免疫原性同时保留亲本抗体的结合和功能活性的技术。通常从嵌合抗体开始，目的是去除可变结构域中可引起免疫反应的外源框架区(FR)。这个问题的解决方案是将鼠抗体的互补决定区(CDR)“移植”到人受体框架上。
然而，仅进行CDR移植可导致结合亲和力的显著降低或完全丧失，因为Vernier区中的一组支撑框架残基对于维持CDR的构象是非常重要的。这个问题可通过将小鼠残留物重新引入人体框架来解决；此类取代通常被称为反向突变。
由于治疗性抗体最重要的特性是活性，因此在人源化过程中提出的取代不影响抗体的亲和力或稳定性是非常重要的。在过去的20年里，随着蛋白建模的进步已经收集了大量的关于以下的信息：CDR的人源化和移植的信息；抗体的生物物理学性质、CDR环的构象以及对于框架(使得能够准确地人源化具有保留的结合亲和力和稳定性的抗体)。
人源化程序按如下所述进行：
1)鉴定亲本抗体结构域和区域
2)鉴定关键位置和潜在的翻译后修饰(PTM)
抗体Fv具有许多关键位置，这些位置构成VH/VL链间界面，或负责已经定义CDR中的5个的离散组的规范结构：在对其提出取代之前，应详细考虑这些位置。
翻译后修饰(PTM)在治疗性蛋白的开发过程中会引起问题，如异质性增加、生物活性降低、稳定性降低、免疫原性、碎片化和聚集。PTM的潜在影响取决于其位置，在某些情况下取决于溶剂暴露。对以下潜在的PTM的序列进行分析：天冬氨酸脱酰胺、天冬氨酸异构化、游离半胱氨酸巯基、N-糖基化、甲硫氨酸和色氨酸的氧化。
3)基于序列分析和关键位置，为每条链选择了最佳的受体人种系序列。
基于与人种系的亲本抗体序列比对，鉴定了最匹配的条目。最佳人种系作为受体的鉴定基于下面列出的有序标准：
·跨越整个V基因(框架+CDR)的序列相同性
·相同或相容的链间界面残基
·支持具有亲本CDR规范构象的环
4)构建了亲本小鼠Fv区域的3D结构模型
5)在对分子模型进行仔细检查后，对取代每个位置的可能性进行了初步评估。位置分为中立贡献位置或关键位置。还鉴定了破坏潜在PTM的单个突变。
6)通过分析亲本和受体序列之间的不同位置来进行CDR移植。进行在中性位置中的所有取代。
对于人源化抗体的设计阶段，该程序被更准确地定义为种系化—用相应的人类氨基酸替换亲本框架中与所选受体不同的氨基酸。
7)制备、纯化不同的人源化VH和VL形式的组合并测试结合和生物活性。
8)通过评估以下标准来筛选不同形式之间的最佳人源化重链和轻链组合：
a)哺乳动物细胞(HEK 293或优选CHO)中产生的人源化形式作为人IgG1/Kapa的瞬时表达水平(与嵌合形式相比)。在收获前使用来自转染细胞的组织培养上清液，以使用ELISA进行纯化或使用Octet无标记检测系统通过蛋白A进行测量。
b)与嵌合的人IgG1/Kapa形式(嵌合意味着与人恒定区融合的亲本鼠VH和VL与人恒定区的组合)相比的结合能力(通过ELISA或FACS的EC50；或优选地通过Biacore或Ocete的Kd)。
c)与参考嵌合抗体的生物活性相比较的人源化形式在相关体外细胞测定中的生物活性。
d)与相关直系同源基因序列物种的交叉反应性(体外结合活性)。
e)人源化形式与嵌合形式相比的生物物理学性质的测定：
·SEC-HPLC图谱以确定高分子量聚集体的水平，
·在非还原和还原条件下的SDS-PAGE，
·使用MicrocalTMVP毛细管DSC系统通过差示扫描量热法(DSC)进行分析以确定Fab、CH2和CH3的Tm。
抗体生产的一般方法
为了生产重组抗体材料，设计、优化和合成靶DNA序列。将完整序列亚克隆到表达载体中，并最大限度地制备用于CHO细胞表达的转染级质粒。CHO细胞在CHO TF表达培养基(Xell AG，德国)中生长，并用编码靶蛋白的重组质粒转染。将转染后第11天收集的细胞培养上清液用于纯化。将液体细胞培液离心并过滤。将过滤的细胞培养上清液以适当的流速加样到Mab Select Prism A(Thermo Fisher，USA)亲和纯化柱上。在用适当的缓冲液洗涤和洗脱后，将洗脱的部分合并，并以缓冲液交换到最终制剂缓冲液中。通过SDS-PAGE分析对纯化的蛋白进行分子量和纯度测量。
实施例1：本发明的人源化抗体的亲和力测定
在本研究中，通过在L920-2041-hiR2-FL-WT-T7细胞(一种表达人iRhom2)的小鼠细胞系上进行间接的FACS斯卡查德分析来对本发明的人源化抗体16-B-03、16-B-05、16-B-07、23-B-04、42-B-02和42-B-04进行亲和力测量。
L929-2041-hiR2-FL-WT-T7的生成
为了生成用于对抗体进行可比较且可靠的结合分析的细胞系统，对L929(NCTC克隆929)小鼠成纤维细胞(ATCC，USA)进行基因修饰以敲除小鼠iRhom2基因。之后，用不同的人iRhom2构建体感染所得的L929小鼠iRhom2敲除细胞系以获得稳定表达不同的人iRhom2蛋白的细胞系衍生物，其允许对相同的遗传背景下的不同的iRhom2进行结合分析。
简言之，在Thermo Fisher Scientific GeneArt GmbH,Regensburg,德国上合成mRhbdf2.3 IVT gRNA(AAGCATGCTATCCTGTCGC)。在接种于24孔板中后一天，根据GeneArtCRISPR核酸酶mRNA用户指南(Thermo Fisher Scientific,USA)，使用LipofectamineCRISPRMAX转染试剂(Thermo Fisher Scientific,USA)，用gRNA/GenerArt PlatiniumCas9核酸酶(Thermo Fisher Scientific，USA)混合物转染L929亲代细胞。转染后3天，裂解细胞并提取DNA以用于采用mRhbdf2.3 fwd(TCAATGAGCTCTTTATGGGGCA)/mRhbdf2.3rev(AAGGTCTCCATCCCCTCAGGTC)5引物对(Thermo Fisher Scientific，USA)扩增特异性PCR产物。对于阳性孔的筛选，将GeneArt基因组切割检测试剂盒(Thermo Fisher Scientific，USA)应用于在Invitrogen 2％E-Gel size Select琼脂糖凝胶(Thermo FisherScientific，USA)中具有正确大小的显著单带的那些样本上。切割分析PCR产物也在Invitrogen 2％ E-Gel Size Select琼脂糖凝胶上进行分析。使用用于鉴定阳性亚克隆的切割检测试剂盒，使用有限稀释技术，对鉴定的多克隆L929群进行两轮后续亚克隆。因此，在第一轮中鉴定的最有希望的阳性亚克隆，命名为1029，在第二轮中进一步亚克隆，以获得最终克隆，命名为2041。衍生自该亚克隆的单克隆细胞群命名为L929-2041，并用于随后用人iRhom2构建体hiR2-FL-WT-T7进行感染(根据实施例3中描述的程序)以产生细胞系L929-2041-hiR2-FL-WT-T7。
对L929-2041-hiR2-FL-T7的FACS斯卡查德分析
简言之，L929-2041-hiR2-FL-T7用含10mM EDTA的PBS收获，洗涤，并重悬于FASC缓冲液(PBS，3％ FBS，0.05％叠氮化钠)，并以每孔约3x105个细胞接种于Nunc U形96孔板(Thermo Fisher Scientific，USA)中。为了沉淀细胞并去除上清液，将板在1,500rpm和4℃下离心3分钟。对于第一次染色，将细胞重悬于每孔100μl的单独FACS缓冲液(对照)或在起始浓度为160μg/ml的FACS缓冲液中连续稀释两倍(总共22个浓度)的本发明的人源化抗体16-B-03、16-B-05、16-B-07、23-B-04、42-B-02和42-B-04中并在冰上孵育1小时。之后，将板在1,500rpm和4℃下离心3分钟并用每孔200μl的FACS缓冲液洗涤两次。对于第二次染色，将细胞离心并重悬于每孔100μl的用FACS缓冲液以1:100稀释的PE缀合的山羊抗人IgG F(ab')2检测片段(Dianova,德国)中。避光，将细胞悬浮液在冰上孵育1小时。然后将板在1,500rpm和4℃下离心3分钟并用每孔200μl的FACS缓冲液洗涤三次。最后，将细胞重悬于每孔150μl的FACS缓冲液中并使用BD AccuriTM C6 Plus流式细胞仪(Becton Dickinson，德国)进行分析。采用Prism8软件(GraphPad Sowtware，USA)计算本发明的每个抗体的相应的KD值。
图1示出了本研究的代表性结果，表明本发明的人源化抗体16-B-03、16-B-05、16-B-07、23-B-04、42-B-02和42-B-04与L929-2041-hiR2-FL-T7细胞结合的KD值在次纳摩尔至低纳摩尔范围内。
实施例2：iRhom1/2-/-双敲除小鼠胚胎成纤维细胞的生成
出于各种目的，在以下一些实施例中描述的特定结合研究中，需要在缺乏任何内源性iRhom1或iRhom2蛋白的背景下表达特定水平的感兴趣iRhom变体的细胞系统。为此，建立来自对小鼠iRhom1和小鼠iRhom2(iRhom1/2-/-)均呈纯合阴性的双敲除(DKO)小鼠的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。本实施例描述了用于建立iRhom1/2-/-DKO MEF和生成永生化iRhom1/2-/-DKO MEF细胞系的小鼠品系。
用于建立iRhom1/2-/-DKO MEF的小鼠品系
简言之，在美国加州大学戴维斯分校(Rhbdf2为iRhom2的替代名称)从敲除老鼠项目(KOMP)存储库中获得C57BL/6N背景的Rhbdf2tm1b(KOMP)Wtsi小鼠品系(C57BL/6N-Rhbdf2tm1b(KOPP)Wtsi)。将杂合雄性Rhbdf2tm1b小鼠与129Sv/J遗传背景的野生型雌性小鼠交配以产生混合遗传背景(129Sv/J-C57BL/6N)的杂合子代。将这些杂合小鼠彼此交配以生成雄性和雌性子代，所述子代对于Rhbdf2基因(Rhbdf2-/-小鼠，129Sv/J-C57BL/6N)缺失来说是纯合的。通过Rhbdf-/-雄性和雌性小鼠的选育进一步扩增所得的纯合Rhbdf2敲除小鼠群体以生成足够数量的小鼠。纯合Rhbdf2-/-小鼠有活力和生育能力，没有明显的自发病理表型。
从国际敲除小鼠联合会(IKMC)的欧洲条件性小鼠诱变计划(EUCOMM)中获得Rhbdf1敲除小鼠。在Li等人PNAS,2015,doi:10.1073/pnas.1505649112中描述了这些动物的生成。纯合Rhbdf1-/-小鼠有活力和生育能力，没有明显的自发病理表型。
对于Rhbdf1与Rhbdf2(Rhbdf1/2-/-小鼠)的DKO小鼠的生成，将Rhbdf1-/-小鼠与Rhbdf2-/-小鼠交配以生成Rhbdf1+/-Rhbdf2+/-双重杂合小鼠。将这些杂合小鼠与Rhbdf2-/-小鼠交配以产生Rhbdf1+/-Rhbdf2-/-动物，将该Rhbdf1+/-Rhbdf2-/-动物彼此交配以在预期孟德尔比率(所有胚胎的1/4)下生成缺乏Rhbdf基因的E14.5胚胎(Rhbdf1/2-/-DKO胚胎)，以用于E13.5 Rhbdf1/2-/-DKO MEF的生产，如下文所述。
永生化iRhom1/2-/-DKO MEF小鼠细胞系的生成
简言之，在E13.5处死妊娠的Rhbdf1+/-Rhbdf2-/-雌性小鼠。将子宫角取出到具有冰冷PBS的器皿中。使用细尖镊子，将胚胎从母体组织中释放出来，并将每个胚胎从胎盘中取出。然后用锋利的手术刀将每个胚胎斩首，并将肝、心、肺、肠等脏器全部切除。取下0.5mm的尾部切片并转移到1.5ml Eppendorf管中，用于基因组DNA分离并后续PCR基因分型以确认胚胎的正确基因型。之后，将剩余的胚胎组织用PBS洗涤一次并转移至含2mL 0.25％胰蛋白酶/EDTA的组织培养皿中。用两个无菌手术刀将组织充分切碎，并将胰蛋白酶/细胞混合物在37℃下孵育15分钟。通过添加含有FCS的生长培养基使胰蛋白酶化停止。为了生成单细胞悬浮液，将混合物上下吸移，首先用10mL血清吸移管吸移五次，然后用5mL血清吸移管吸移五次，最后用火焰抛光的巴斯德吸移管吸移数次，以进一步解离任何剩余的细胞簇。随后，将从一个胚胎中获得的细胞铺板在两个10cm的组织培养板上。第二天，培养基用新鲜的培养基替换，并使细胞生长，直至它们达到90％的汇合度。最后，扩增细胞并存储以备用。
对于原代Rhbdf1/2-/-DKO-MEFs的永生化，使用pMSCV表达系统(Clontech,USA)用逆转录病毒系统转导细胞。简言之，如下生成pMSCV-Zeo-SV40：从质粒pMSCV-puro(Clontech，USA)中去除编码嘌呤霉素抗性的序列，并用来自pcDNA3.1(+)Zeo载体(ThermoFisher Scientific，USA)的赋予Zeocin抗性的序列代替。将逆转录病毒包装细胞系GP2-293(Clontech,USA)与包膜载体pVSV-G(Clonteech,USA)和pMSCV-Zeo-SV40质粒组合使用，以产生编码SV40大T抗原的逆转录病毒。将病毒过滤并添加到以50％汇合度铺板的原代Rhbdf1/2-/-DKO MEF中24小时。之后，允许转导的Rhbdf1/2-/-DKO-MEF在没有选择压力的生长培养基中生长24小时，然后转移到含有100μg/ml Zeocin的生长培养基中。使细胞在汇合时传代，并在传代10次后储存以备用。
实施例3：本发明的人源化抗体的小鼠交叉反应性的评估
接下来，用标记形式的人iRhom2重组永生化iRhom1/2-/-DKO MEF以测试本发明的人源化抗体的靶识别。另外，生成稳定表达标记形式的小鼠iRhom2的iRhom1/2-/-DKO MEF以测定本发明的人源化抗体的16-B-03、16-B-05、16-B-07、23-B-04、42-B-02和42-B-04与小鼠iRhom2同源基因序列的交叉反应性。
稳定表达T7标记的人或小鼠iRhom2的iRhom1/2-/-DKO MEF的生成
简言之，在第1天，将Phoenix-ECO细胞(American Type Culture Collection，USA)以每孔8x105个细胞接种于6孔组织培养板(Greiner,德国)上的标准生长培养基中，并在37℃、5％ CO2下保持过夜。在第2天，培养基用补充有终浓度为25μM的氯喹((Sigma-Aldrich,USA)的新鲜培养基替换。应用磷酸钙法，细胞用2μg/ml的pMSCV(Clontech,USA)空载体、编码用3个连续拷贝的T7表位(MASMTGGQQMG)C末端标记的人iRhom2全长野生型的pMSCV-hiR2-FL-WT-T7或编码用3个连续拷贝的T7表位C末端标记的小鼠iRhom2全长野生型的pMSCV-miR2-FL-WT-T7转染，并保持在37℃、5％ CO2下。7小时后，通过用缺乏氯喹的标准生长培养基替换细胞上清液以使转染停止，并将细胞在37℃、5％ CO2下孵育过夜以允许病毒产生。与此同时，将作为用于逆转录病毒感染的靶细胞的永生化iRhom1/2-/-DKO MEF以每孔1x105个细胞接种于6孔组织培养板上的(Greiner,德国)标准生长培养基中，并在37℃、5％ CO2下保持过夜。在第3天，收集释放pMSCV、pMSCV-hiR2-FL-WT-T7或pMSCV-miR2-FL-WT-T7同向性病毒的Phoenix-ECO细胞的上清液，用0.45μm CA过滤器过滤并用4μg/ml聚凝胺(Sigma-Aldrich,USA)补充。将培养基从永生化iRhom1/2-/-DKO MEF中去除后，在37℃、5％ CO2下将含上清液的病毒添加至靶细胞4小时以用于第一次感染。同时，将Phoenix-ECO细胞与新鲜培养基再孵育，再过4小时后，过滤并用于再次在4μg/ml聚凝胺的存在下用于相应的靶细胞群的第二次感染。同样地，进行了第三次感染循环，但过夜。在第4天，用新鲜的标准生长培养基替换含有病毒的细胞上清液。从第5天起，细胞在2mg/ml遗传霉素(G418，Thermo Fisher Scientific，USA)的存在下生长以筛选用pMSCV空载体稳定感染的永生化MEF-DKO-EV对照细胞、稳定表达用3个连续拷贝的T7表位C末端标记的人iRhom2全长野生型的MEF-DKO-hiR2-FL-WT-T7细胞和稳定表达用3个连续拷贝的T7表位C末端标记的人iRhom2全长野生型的MEF-DKO-hiR2-FL-WT-T7细胞。增殖后，存储细胞以备用。
用于测试系统验证和抗体表征的FACS分析
简言之，用含10mM EDTA的PBS收获永生化MEF-DKO-EV对照细胞、MEF-DKO-hiR2-FL-WT-T7细胞和MEF-DKO-miR2-FL-WT-T7细胞，洗涤并重悬于FACS缓冲液(PBS,3％FBS,0.05％叠氮化钠)中，并以每孔约3x105个细胞接种于Nunc U形底96孔板(Thermo FisherScientific，USA)中。为了沉淀细胞并去除上清液，将板在1,500rpm、4℃下离心3分钟。对于第一次染色，将细胞重悬于每孔100μl的单独FACS缓冲液(对照)、在3μg/ml的FACS缓冲液中的小鼠单克隆抗T7 IgG(Merck Millipore,USA)或在3μg/ml的FACS缓冲液中的本发明的人源化抗体16-B-03、16-B-05、16-B-07、23-B-04、42-B-02和42-B-04中并在冰上孵育1小时。之后，将板在1,500rpm和4℃下离心3分钟并用每孔200μl的FACS缓冲液洗涤两次。对于前述抗T7染色的第二次染色，将细胞离心并重悬于每孔100μl的用FACS缓冲液以1:100稀释的PE缀合的山羊抗人IgG F(ab')2检测片段(Dianova,德国)中。对于用本发明的人源化抗体进行的前述染色的第二次染色，将细胞离心并重悬于每孔100μl的用FACS缓冲液以1:100稀释的PE缀合的山羊抗人IgG F(ab')2检测片段(Dianova,德国)中。避光，将细胞悬浮液在冰上孵育1小时。然后将板在1,500rpm和4℃下离心3分钟并用每孔200μl的FACS缓冲液洗涤三次。最后，将细胞重悬于每孔150μl的FACS缓冲液中并使用BD AccuriTM C6 Plus流式细胞仪(Becton Dickinson，德国)进行分析。
图2a&2b示出了本实验的代表性结果。与仅用抗小鼠IgG或抗人IgG二抗孵育的对照样本(2a&2b，灰色)相比，与抗T7标记抗体的共孵育(图2a，黑色)导致MEF-DKO-EV对照细胞的背景染色非常少(图2a，左)。相比之下，抗T7标记抗体对MEF-DKO-hiR2-FL-WT-T7(图2a，中间)和MEF-DKO-miR2-FL-WT-T7(图2a,右)细胞的结合分析揭示了相对荧光强度较强增加，表明异位表达的人和小鼠iRhom2变体均位于在这些基因工程化细胞群的表面上，因此验证它们是表征本发明抗体的合适的测试系统。将这些细胞群与作为本发明人源化抗体的代表性示例的人源化抗体16-B-03共孵育(图2b，黑色)根本不导致MEF-DKO-EV对照细胞的背景染色(图2b，左)，在MEF-DKO-hiR2-FL-WT-T7细胞上的相对荧光强度有强烈偏移(与用抗T7标记抗体观察到的类似)表明本发明的人源化抗体16-B-03与人iRhom2变体较强结合(图2b，中间)。相比之下，未检测到本发明的人源化抗体16-B-03与MEF-DKO-miR2-FL-WT-T7细胞显著结合(图2b，右)，这提供了小鼠iRhom2变体未被本发明的人源化抗体16-B-03识别的证据，所述小鼠iRhom2变体在细胞表面的存在用抗T7标记抗体体证实(图2a，右)。用本发明的人源化抗体16-B-05、16-B-07、23-B-04、42-B-02、42-B-04获得了相似的结果，表明本发明的这些人源化抗体没有一个与小鼠iRhom2交叉反应。
实施例4：本发明人源化抗体的结合特异性的评估
由于人iRhom2蛋白与其密切相关的家族成员人iRhom1的序列同源性(参见对于人iRhom2的NCBI参考序列NP_078875.4.，对人iRhom1的NCBI参考序列NP_071895.3，分别计算人iRhom2与人iRhom1的胞外环1、2、3和C末端尾部的氨基酸序列相同性为67.4％、100.00％、80.00％和63.64％)，在下一步评估本发明的人源化抗体16-B-03、16-B-05、16-B-07、23-B-04、42-B-02、42-B-04对人iRhom2与人iRhom1的结合特异性。为此，生成了稳定表达标记形式的人iRhom1的iRhom1/2-/-DKO MEF。
稳定表达T7标记的人iRhom1的iRhom1/2-/-DKO MEF的生成
简言之，在第1天，将Phoenix-ECO细胞(American Type Culture Collection，USA)以每孔8x105个细胞接种于六孔组织培养板(Greiner,德国)上的标准生长培养基中，并在37℃、5％CO2下保持过夜。在第2天，培养基用补充有终浓度为25μM的氯喹(Sigma-Aldrich，USA)的新鲜培养基替换。应用磷酸钙法，细胞用2μg/ml的编码用3个连续拷贝的T7表位C末端标记的人iRhom1全长野生型的pMSCV-hiR1-FL-WT-T7(SEQ ID NO 50)转染，并保持在37℃、5％CO2下。7小时后，通过用缺氯喹的标准生长培养基替换细胞上清液使转染停止，并将细胞在37℃、5％CO2下孵育过夜以允许病毒产生。与此同时，将作为用于逆转录病毒感染的靶细胞的永生化iRhom1/2-/-DKO MEF以每孔1x105个细胞接种于6孔组织培养板(Greiner，德国)上的标准生长培养基中，并也在37℃、5％CO2下保持过夜。在第3天，收集释放pMSCV-hiR1-FL-WT-T7同向性(ecotrophic)病毒的Phoenix-ECO细胞的上清液，用0.45μmCA过滤器过滤并用4μg/ml聚凝胺(Sigma-Aldrich，USA)补充。将培养基从永生化iRhom1/2-/-DKO MEF中去除后，在37℃、5％CO2下将这些上清液添加至靶细胞4小时以用于第一次感染。同时，将Phoenix-ECO细胞与新鲜培养基一起再孵育，再过4小时后，过滤并同样在4μg/ml聚凝胺的存在下用于相应的靶细胞群的第二次感染。同样地，进行第三次感染循环，但过夜。在第4天，用新鲜的标准生长培养基替换含有病毒的细胞上清液。从第5天起，使细胞在2mg/ml遗传霉素(G418，Thermo Fisher Scientific，USA)的存在下生长以筛选稳定表达用3个连续拷贝的T7表位C末端标记的人iRhom1的永生化MEF-DKO-hiR1-FL-WT-T7。增殖后，存储细胞以备用。
用于测试系统验证和抗体表征的FACS分析
简言之，除了永生化MEF-DKO-EV对照细胞和MEF-DKO-hiR2-FL-WT-T7细胞(已在实施例3中描述)以外，用含10mM EDTA的PBS收获MEF-DKO-hiR1-FL-WT-T7细胞，洗涤并重悬于FACS缓冲液(PBS，3％FBS，0.05％叠氮化钠)中，并且以每孔约3x105个细胞接种于Nunc U形底96孔板中。为了沉淀细胞并去除上清液，将板在1,500 rpm、4℃下离心3分钟。对于第一次染色，将细胞重悬于每孔100μl的单独FACS缓冲液(对照)、在3μg/ml的FACS缓冲液中的小鼠单克隆抗T7 IgG(Merck Millipore，USA)或也在3μg/ml的FACS缓冲液中的本发明的人源化抗体16-B-03、16-B-05、16-B-07、23-B-04、42-B-02和42-B-04中并在冰上孵育1小时。之后，将板在1,500rpm和4℃下离心3分钟并用每孔200μl的FACS缓冲液洗涤两次。对于前述抗T7染色的第二次染色，将细胞离心并重悬于每孔100μl的用FACS缓冲液以1:100稀释的PE缀合的山羊抗人IgG F(ab')2检测片段(Dianova，德国)中。对于用本发明的人源化抗体进行的前述染色的第二次染色，将细胞离心并重悬于每孔100μl的用FACS缓冲液以1:100稀释的PE缀合的山羊抗人IgG F(ab')2检测片段(Dianova，德国)中。避光，将细胞悬浮液在冰上孵育1小时。然后将板在1,500rpm和4℃下离心3分钟并用每孔200μl的FACS缓冲液洗涤三次。最后，将细胞重悬于每孔150μl的FACS缓冲液中并使用BD AccuriTM C6 Plus流式细胞仪(Becton Dickinson，德国)进行分析。
图3a&3b示出了这些分析的代表性结果。与MEF-DKO-EV对照细胞(图3a，左；等同于图2a，左)和MEF-DKO-hiR2-FL-WT-T7(图3a，右；等同于图2a，中间)的染色相比时，抗T7标记抗体对MEF-DKO-hiR1-FL-WT-T7获得的相对荧光强度较强增加(图3a，中间)，表明与人iRhom2变体相似，人iRhom1变体也位于该基因工程化细胞群的表面，因此验证其为表征本发明抗体的合适的测试系统。在本上下文中，虽然实施例3中已经示出了作为本发明的人源化抗体的代表性示例的抗体16-B-03与在MEF-DKO-hiR2-FL-WT-T7细胞(图3b，右；等同于图2b，中间)上表达的人iRhom2变体的结合，但是未检测到本发明的人源化抗体16-B-03与MEF-DKO-hiR1-FL-WT-T7细胞的显著结合，这提供了人iRhom1变体未被本发明的人源化抗体16-B-03识别的证据，所述人iRhom1变体在细胞表面的存在用抗T7标记抗体(图3a，中间)验证。用本发明的人源化抗体16-B-05、16-B-07、23-B-04、42-B-02、42-B-04获得了相似的结果，表明本发明的这些人源化抗体没有一个与人iRhom1交叉反应。
实施例5：本发明抗体与不同物种的交叉反应性的评估
接下来，生成稳定表达标记形式的恒河猴、食蟹猴、狗或兔iRhom2的iRhom1/2-/-DKO MEF以确定本发明抗体与iRhom2的相应同源基因序列的交叉反应性。生成稳定表达标记形式的恒河猴、食蟹猴、狗或兔iRhom1的iRhom1/2-/-DKO MEF以证实这些物种的iRhom2与iRhom1的特异性。
稳定表达T7标记的恒河猴、食蟹猴、狗或兔iRhom2的iRhom1/2-/-DKO MEF的生成
简言之，在第1天，将Phoenix-ECO细胞(American Type Culture Collection，USA)以每孔8x105个细胞接种于6孔组织培养板上的标准生长培养基中，并在37℃、5％ CO2下保持过夜。在第2天，培养基用补充有终浓度为25μM的氯喹((Sigma-Aldrich，USA)的新鲜培养基替换。应用磷酸钙法，将细胞分别用2μg/ml的pMSCV(Clontech，USA)空载体、编码用3个连续拷贝的T7表位C末端标记的恒河猴iRhom2全长野生型的pMSCV-恒河猴-iR2-FL-WT-T7、编码用3个连续拷贝的T7表位C末端标记的食蟹猴iRhom2全长野生型的pMSCV-食蟹猴-iR2-FL-WT-T7、编码用3个连续拷贝的T7表位C末端标记的狗iRhom2全长野生型的pMSCV-狗-iR2-FL-WT-T7或编码用3个连续拷贝的T7表位C末端标记的兔iRhom2全长野生型的pMSCV-兔-iR2-FL-WT-T7转染，并保持在37℃、5％CO2下。7小时后，通过用缺乏氯喹的标准生长培养基替换细胞上清液使转染停止，并将细胞在37℃、5％ CO2下孵育过夜以允许病毒产生。与此同时，将作为用于逆转录病毒感染的靶细胞的永生化iRhom1/2-/-DKO MEF以每孔1x105个细胞接种于6孔组织培养板(Greiner，德国)上的标准生长培养基中，并也在37℃、5％ CO2下保持过夜。在第3天，收集分别释放pMSCV、pMSCV-恒河猴-iR2-FL-WT-T7、pMSCV-食蟹猴-iR2-FL-WT-T7、pMSCV-狗-iR2-FL-WT-T7或pMSCV-兔-iR2-FL-WT-T7同向性病毒的Phoenix-ECO细胞的上清液，用0.45μm CA过滤器过滤并用4μg/ml聚凝胺(Sigma-Aldrich，USA)补充。将培养基从永生化iRhom1/2-/-DKO MEF中去除后，在37℃、5％CO2下将含病毒的上清液添加至靶细胞4小时以用于第一次感染。同时，将Phoenix-ECO细胞与新鲜培养基一起再孵育，再过4小时后，过滤并同样在4μg/ml聚凝胺的存在下用于相应的靶细胞群的第二次感染。同样地，进行第三次感染循环，但过夜。在第4天，用新鲜的标准生长培养基替换含有病毒的细胞上清液。从第5天起，使细胞在2mg/ml遗传霉素(G418，ThermoFisher Scientific，USA)的存在下生长以筛选用pMSCV空载体稳定感染的永生化MEF-DKO-EV对照细胞、稳定表达用3个连续拷贝的T7表位C末端标记的恒河猴iRhom2全长野生型的pMSCV-恒河猴-iR2-FL-WT-T7细胞、稳定表达用3个连续拷贝的T7表位C末端标记的食蟹猴iRhom2全长野生型的pMSCV-食蟹猴-iR2-FL-WT-T7细胞、稳定表达用3个连续拷贝的T7表位C末端标记的狗iRhom2全长野生型的pMSCV-狗-iR2-FL-WT-T7细胞或稳定表达用3个连续拷贝的T7表位C末端标记的兔iRhom2全长野生型的pMSCV-兔-iR2-FL-WT-T7细胞。增殖后，存储细胞以备用。与此同时，以类似的方式生成稳定表达标记形式的恒河猴、食蟹猴、狗或兔iRhom1的iRhom1/2-/-DKO MEF。
用于测试系统验证和抗体表征的FACS分析
简言之，用含10mM EDTAPBS收获永生化MEF-DKO-EV对照细胞、MEF-DKO-恒河猴-iR2-FL-WT-T7细胞、MEF-DKO-食蟹猴-iR2-FL-WT-T7细胞、MEF-DKO-狗-iR2-FL-WT-T7细胞以及它们相应的iRhom1对应体，洗涤并重悬于FACS缓冲液(PBS，3％FBS，0.05％叠氮化钠)中，并且以每孔3x105个细胞接种于Nunc U形底96孔板(Thermo Fisher Scientific，USA)中。为了沉淀细胞并去除上清液，将板在1,500rpm、4℃下离心3分钟。对于第一次染色，将细胞重悬于每孔100μl的(单独)FACS缓冲液(对照)、在3μg/ml的FACS缓冲液中的小鼠单克隆抗T7 IgG(Merck Millipore，USA)或也在3μg/ml的FACS缓冲液中的本发明的抗体中并在冰上孵育1小时。之后，将板在1,500rpm和4℃下离心3分钟并用每孔200μl的FACS缓冲液洗涤两次。对于前述抗T7染色的第二次染色，将细胞离心并重悬于每孔100μl的用FACS缓冲液以1:100稀释的PE缀合的山羊抗人IgG F(ab')2检测片段(Dianova，德国)中。对于用本发明的人源化抗体进行的前述染色的第二次染色，将细胞离心并重悬于每孔100μl的在FACS缓冲液中以1:100稀释的PE缀合的山羊抗人IgG F(ab')2检测片段(Dianova，德国)中。避光将细胞悬浮液在冰上孵育1小时。然后将板在1,500rpm和4℃下离心3分钟并用每孔200μl的FACS缓冲液洗涤三次。最后，将细胞重悬于每孔150μl的FACS缓冲液中并使用BD AccuriTM C6Plus流式细胞仪(Becton Dickinson，德国)进行分析。
图4a&4b示出了对恒河猴的交叉反应性分析的代表性结果。与MEF-DKO-EV对照细胞(图4a，左；等同于图2a，左)、MEF-DKO-恒河猴-iR1-FL-WT-T7(图4a，中间)和MEF-DKO-恒河猴-iR2-FL-WT-T7(图4a，右)的染色相比时，抗T7标记抗体对MEF-DKO-恒河猴-iR1-FL-WT-T7和MEF-DKO-恒河猴-iR2-FL-WT-T7获得的相对荧光强度较强增加表明与人iRhom1和2变体相似，恒河猴iRhom1和2变体也位于该基因工程化细胞群的表面，因此证实其为表征本发明抗体的合适的测试系统。与MEF-DKO-恒河猴-iR1-FL-WT-T7的非显著结合(图4b，中间)相比，可检测到作为本发明的人源化抗体的抗体16-B-03与在MEF-DKO-恒河猴-iR2-FL-WT-T7细胞(图4b，右)上表达的恒河猴iRhom2变体显著结合。这提供了恒河猴iRhom2变体被本发明的人源化抗体16-B-03特异性识别的证据，而恒河猴iRhom1没有被识别，其在细胞表面的存在是用抗T7标记抗体验证的(图4a，中间)。用本发明的人源化抗体16-B-05、16-B-07、23-B-04、42-B-02、42-B-04获得了相似的结果，表明所有这些本发明的人源化抗体均识别出了恒河猴iRhom2，但未识别出恒河猴iRhom1。
图5a&5b示出了对食蟹猴的交叉反应性分析的代表性结果。与MEF-DKO-EV对照细胞(图5a，左；等同于图2a，左)、MEF-DKO-食蟹猴-iR1-FL-WT-T7(图5a，中间)和MEF-DKO-食蟹猴-iR2-FL-WT-T7(图5a，右)的染色相比时，抗T7标记抗体对MEF-DKO-食蟹猴-iR1-FL-WT-T7和MEF-DKO-食蟹猴-iR2-FL-WT-T7获得的相对荧光强度较强增加表明与人iRhom1和2变体相似，食蟹猴iRhom1和2变体也位于该基因工程化细胞群的表面，因此证实其为表征本发明抗体的合适的测试系统。与MEF-DKO-恒河猴-iR1-FL-WT-T7细胞的非显著结合(图5b，中间)相比，可检测到作为本发明的人源化抗体的抗体16-B-03与在MEF-DKO-食蟹猴-iR2-FL-WT-T7细胞(图5b，右)上表达的食蟹猴iRhom2变体显著结合。与没有识别出食蟹猴iRhom1(其在细胞表面的存在是用抗T7标记抗体验证的(图5a，中间))相比，这提供了食蟹猴iRhom2变体被本发明的人源化抗体16-B-03特异性识别的证据。用本发明的人源化抗体16-B-05、16-B-07、23-B-04、42-B-02、42-B-04获得了相似的结果，表明所有这些本发明的人源化抗体均识别出了食蟹猴iRhom2，但未识别出食蟹猴iRhom1。
图6a&6b示出了对狗的交叉反应性分析的代表性结果。与MEF-DKO-EV对照细胞(图6a，左；等同于图2a，左)、MEF-DKO-狗-iR1-FL-WT-T7(图6a,中间)和MEF-DKO-狗-iR2-FL-WT-T7(图6a，右)的染色相比时，抗T7标记抗体对MEF-DKO-狗-iR1-FL-WT-T7和MEF-DKO-狗-iR2-FL-WT-T7获得的相对荧光强度较强增加(图3a，中间)，表明与人iRhom1和2变体相似，狗iRhom1和2变体也位于该基因工程化细胞群的表面，因此证实其为表征本发明抗体的合适的测试系统。与MEF-DKO-狗-iR1-FL-WT-T7细胞的非显著结合(图6b，中间)相比，可检测到作为本发明的人源化抗体的抗体16-B-03与在MEF-DKO-狗-iR2-FL-WT-T7细胞(图6b，右)上表达的狗iRhom2变体显著结合。与没有识别出狗iRhom1(其在细胞表面的存在是用抗T7标记抗体验证的(图6a，中间))相比，这提供了狗iRhom2变体被本发明的人源化抗体16-B-03特异性识别的证据。用本发明的人源化抗体16-B-05、16-B-07、23-B-04、42-B-02、42-B-04获得了相似的结果，表明所有这些本发明的人源化抗体均识别出了狗iRhom2，但未识别出狗iRhom1。
图7a&7b示出了对兔的交叉反应性分析的代表性结果。与MEF-DKO-EV对照细胞(图7a，左；等同于图2a，左)、MEF-DKO-兔-iR1-FL-WT-T7(图7a，中间)和MEF-DKO-兔-iR2-FL-WT-T7(图7a，右)的染色相比时，抗T7标记抗体对MEF-DKO-兔-iR1-FL-WT-T7和MEF-DKO-兔-iR2-FL-WT-T7获得的相对荧光强度较强增加表明与人iRhom1和2变体相似，兔iRhom1和2变体也位于该基因工程化细胞群的表面，从而证实其为表征本发明抗体的合适的测试系统。与MEF-DKO-兔-iR1-FL-WT-T7细胞的非显著结合(图7b，中间)相比，可检测到作为本发明的人源化抗体的抗体16-B-03与在MEF-DKO-兔-iR2-FL-WT-T7细胞(图7b，右)上表达的恒兔iRhom2变体显著结合。与没有识别出兔iRhom1(其在细胞表面的存在是用抗T7标记抗体验证的(图7a，中间))相比，这提供了兔iRhom2变体被本发明的人源化抗体16-B-03特异性识别的证据。用本发明的人源化抗体16-B-05、16-B-07、23-B-04、42-B-02、42-B-04获得了相似的结果，表明所有这些本发明的人源化抗体均识别出了兔iRhom2，但未识别出兔iRhom1。
实施例6：本发明抗体对LPS诱导的TNFα体外脱落的抑制效应的分析
在以下研究中，进行基于ELISA的TNFα释放测定以验证本发明的人源化抗体对LPS诱导的人THP-1单核细胞内源性TNFα释放的抑制效应。
下面描述在本实施例中使用的基于ELISA的TNFα释放测定。
简言之，在第1天，将Nunc black96孔板(Thermo Fisher Scientific，USA)在4℃的4μg/ml TBS中用每孔100μl的小鼠抗人TGFα捕获抗体(作为DuoSet ELISA试剂盒的一部分提供)包被过夜。在第2天，去除捕获抗体溶液并将板在室温下用每孔300μl的TBS、1％BSA封闭1-2小时。同时，将80μl正常生长培养基中的20,000个THP-1(American Type Culture Collection，USA)细胞接种于Greiner CELLSTAR V形底96孔板(Greiner Bio One，德国)的每个孔中，并在37℃、5％CO2下与每孔20μl的标准生长培养基一起预孵育30分钟，该标准培养基补充有作为阳性对照的50μM巴马司他(BB94，Abcam，UK)(在所得的100μl样本体积中的终浓度为10μM)、作为同种型对照的15μg/ml人IgG抗体(BioLegend，USA)(在所得的100μl样本体积中的终浓度为3μg/ml)或本发明的15μg/ml人源化抗体(在所得的100μl样本体积中的终浓度为3μg/ml)。在刺激对照的情况下，添加不含供试品的20μl标准生长培养基。随后，在37℃、5％CO2下，在生长培养基中用每孔20μl的300ng/ml LPS(Sigma-Aldrich,USA)(终浓度为50ng/ml)刺激细胞(除了未刺激对照的那些)2小时。之后，将96孔板离心以沉淀细胞。与此同时，将封闭缓冲液从板中去除并在96头洗板机上将板用每孔350μl的TBS-T(Carl Roth,德国)洗涤4次。为了避免干掉，立即将30μl的TBS添加至板的每个孔中，然后每个样本转移70μl无细胞上清液。此外，将用TBS以限定浓度稀释的100μl重组人TNFα蛋白(作为DuoSet ELISA试剂盒的一部分提供)添加至板中作为标准参照物。之后，每个孔添加100μl TBS中的50ng/ml生物素化山羊抗人TNFα检测抗体，并且避直射光，将板在室温下孵育2小时。在96头洗板机(TecanGroup,瑞士)上用每孔350μl TBS-T(Carl Roth,德国)洗涤4次并在第四次循环后小心去除所有缓冲液痕量后，将用TBS以1:10,000稀释的100μl链霉亲和素-AP(R&D Systems,USA)添加至每个孔中，并且再次避直射光，将板在室温下孵育30分钟。在又一轮的96头洗板机(Tecan Group,瑞士)上用每孔350μl TBS-T(Carl Roth,德国)洗涤4次并在第四次循环后小心去除所有缓冲液痕量后，每孔添加100μlAttoPhos底物溶液(Promega,USA)以用于在室温下暗处孵育1小时。使用infinite M1000(Tecan Group,瑞士)酶标仪，在435nm的激发波长处和555nm的发射波长处收集每个孔的荧光。
图8示出了本实验的代表性结果，以绝对数(图8a)和抑制百分比(图8b)表明供试品对LPS诱导的TNFα从THP-1细胞释放的效应。虽然作为金属蛋白酶的小分子抑制剂的巴马司他(BB94)用作阳性对照，并对LPS诱导的TNFα释放产生强烈抑制，但IgG同种型对照的存在对TNFα脱落没有显著效应。相比之下，本发明的相等浓度的人源化抗体16-B-03、16-B-05、16-B-07、23-B-04、42-B-02和42-B-04对LPS诱导的TNFα从THP-1细胞释放的抑制分别为75.1％、78.7％、77.2％、77.6％、75.2％和76.1％。
实施例7：本发明抗体对PMA诱导的TNFα体外脱落的抑制效应的分析
与实施例6相反，测试本发明的抗体对LPS诱导的内源性TNFα从人THP-1释放的抑制效应，进行该分析以证实本发明的抗体对PMA诱导的内源性TNFα从人单核细胞U-937细胞释放的抑制效应。
下面将描述在本实施例中使用的基于ELISA的TNFα释放测定。
简言之，在第1天，将Nunc black96孔板(Thermo Fisher Scientific，USA)在4℃的4μg/ml TBS中用每孔100μl的小鼠抗人TGFα捕获抗体(作为DuoSet ELISA试剂盒的一部分提供)包被过夜。在第2天，去除捕获抗体溶液并将板在室温下用每孔300μl的TBS、1％BSA封闭1-2小时。同时，将80μl正常生长培养基中的75,000个U-937(European Collection of Authenticated Cell Cultures，UK)细胞接种于GreinerCELLSTAR V形底96孔板(Greiner Bio-One,德国)的每个孔中并在37℃、5％CO2下与每孔20μl标准生长培养基一起预孵育30分钟，该培养基补充有作为阳性对照的50μM巴马司他(BB94，Abcam，UK)(在所得的100μl样本体积中的终浓度为10μM)、作为同种型对照的50μg/ml人IgG抗体(BioLegend，USA)(在所得的100μl样本体积中的终浓度为10μg/ml)或本发明的16.66μg/ml抗体(在所得的100μl样本体积中的终浓度为3.33μg/ml)。在刺激对照的情况下，添加不含供试品的20μl标准生长培养基。随后，在37℃、5％CO2下，在生长培养基中用每孔20μl的150ng/ml PMA(Sigma-Aldrich,USA)(终浓度为25ng/ml)刺激细胞(除了未刺激对照的那些)1小时。之后，将96孔板离心以沉淀细胞。与此同时，将封闭缓冲液从板中去除并在96头洗板机上将板用每孔350μl的TBS-T(Carl Roth,德国)洗涤4次。为了避免干掉，立即将30μl的TBS添加至板的每个孔中，然后每个样本转移70μl无细胞上清液。此外，将用TBS以限定浓度稀释的100μl重组人TNFα蛋白(作为DuoSet ELISA试剂盒的一部分提供)添加至板中作为标准参照物。之后，每个孔添加100μl、浓度为50ng/ml TBS的生物素化山羊抗人TNFα检测抗体，并且避直射光，将板在室温下孵育2小时。在96头洗板机(Tecan Group,瑞士)上用每孔350μl TBS-T(Carl Roth,德国)洗涤4次并在第四次循环后小心去除所有缓冲液痕量后，将用TBS以1:10,000稀释的100μl链霉亲和素-AP(R&DSystems,USA)添加至每个孔中，并且再次避直射光，将板在室温下孵育30分钟。在又一轮的96头洗板机(Tecan Group,瑞士)上用每孔350μl TBS-T(Carl Roth,德国)洗涤4次并在第四次循环后小心去除所有缓冲液痕量后，每孔添加100μl AttoPhos底物溶液(Promega,USA)以用于在室温下暗处孵育1小时。使用infinite M1000(Tecan Group,瑞士)酶标仪，在435nm的激发波长处和555nm的发射波长处收集每个孔的荧光。
图9示出了本实验的代表性结果，表明供试品对PMA诱导U-937细胞释放TNFα的作用(绝对数(图9a)和抑制百分比(图9b))。虽然作为金属蛋白酶的小分子抑制剂的巴马司他(BB94)用作阳性对照，并对PMA诱导的TNFα释放产生强烈抑制，但IgG同种型对照的存在对TNFα脱落没有显著影响。相比之下，本发明的人源化抗体16-B-03、16-B-05、16-B-07、23-B-04、42-B-02和42-B-04对PMA诱导的TNFα从U-937细胞释放的抑制分别为89.8％、89.0％、90.3％、77.2％、85.0％和87.9％。
实施例8：本发明抗体对PMA诱导的白介素6受体(IL-6R)体外脱落的抑制效应的分析
在以下研究中，进行基于ELISA的IL-6R释放测定以分析本发明抗体对PMA诱导的内源性IL-6R从THP-1单核细胞释放的抑制效应。
下面将描述本实施例中使用的基于ELISA的IL-6R释放测定。
简言之，在第1天，将Nunc black96孔板(Thermo Fisher Scientific，USA)在4℃的2μg/ml TBS中用每孔100μl的小鼠抗人IL-6R捕获抗体(作为DuoSet ELISA试剂盒的一部分提供)包被过夜。在第2天，去除捕获抗体溶液并且将板在室温下用每孔300μl的TBS、1％BSA封闭1-2个小时。同时，将80μl正常生长培养基中的40,000个THP-1(American Type Culture Collection,USA)细胞接种于Greiner CELLSTAR V形底96孔板(Greiner Bio-One,德国)的每个孔中并在37℃、5％CO2下与每孔20μl标准生长培养基一起预孵育30分钟，该培养基补充有作为阳性对照的50μM巴马司他(BB94，Abcam，UK)(在所得的100μl样本体积中的终浓度为10μM)、作为同种型对照的15μg/ml人IgG抗体(BioLegend，USA)(在所得的100μl样本体积中的终浓度为3μg/ml)或本发明的15μg/ml抗体(在所得的100μl样本体积中的终浓度为3μg/ml)。在刺激对照的情况下，添加不含供试品的20μl标准生长培养基。随后，在37℃、5％CO2下，在生长培养基中用每孔20μl的150ng/mlPMA(Sigma-Aldrich,USA)(终浓度为25ng/ml)刺激细胞(除了未刺激对照的那些)1小时。之后，将96孔板离心以沉淀细胞。与此同时，将封闭缓冲液从板中去除并在96头洗板机上将板用每孔350μl的TBS-T(Carl Roth,德国)洗涤4次。为了避免干掉，立即将30μl的TBS添加至板的每个孔中，然后每个样本转移70μl无细胞上清液。此外，将用TBS以限定浓度稀释的100μl重组人IL-6R蛋白(作为DuoSet ELISA试剂盒的一部分提供)添加至板中作为标准参照物。此后，每孔添加100μl TBS中的100ng/ml生物素化羊抗人IL-6R检测抗体(作为DuoSet ELISA试剂盒的一部分提供)，并且避直射光，将板在室温下孵育2小时。在96头洗板机(Tecan Group,瑞士)上用每孔350μl TBS-T(Carl Roth,德国)洗涤4次并在第四次循环后小心去除所有缓冲液痕量后，将用TBS以1:10,000稀释的100μl链霉亲和素-AP(R&D Systems,USA)添加至每个孔中，并且再次避直射光，将板在室温下孵育30分钟。在又一轮的96头洗板机(Tecan Group,瑞士)上用每孔350μl TBS-T(Carl Roth,德国)洗涤4次并在第四次循环后小心去除所有缓冲液痕量后，每孔添加100μlAttoPhos底物溶液(Promega,USA)以用于在室温下暗处孵育1小时。使用infinite M1000(Tecan Group,瑞士)酶标仪，在435nm的激发波长处和555nm的发射波长处收集每个孔的荧光。
图10a&10b示出了本实验的代表性结果，以(绝对数(图10a)和抑制百分比(图10b))表明供试品对PMA诱导的IL-6R从THP-1细胞释放的效应。虽然作为金属蛋白酶的小分子抑制剂的巴马司他(BB94)用作阳性对照，并对PMA诱导的IL-6R释放产生强烈抑制，但IgG同种型对照的存在对IL-6R脱落没有显著影响。相比之下，本发明的相等浓度的人源化抗体16-B-03、16-B-05、16-B-07、23-B-04、42-B-02和42-B-04对PMA诱导的IL-6R从THP-1细胞释放的抑制分别为75.6％、74.0％、75.6％、70.1％、68.5％和71.6％。
实施例9：本发明抗体对PMA诱导的白介素6受体(IL-6R)体外脱落的抑制效应的分析
与上述实施例8互补，进行基于ELISA的IL-6R释放测定以证实本发明抗体对PMA诱导的内源性IL-6R从人U-937细胞释放的抑制效应。
下面将描述本实施例中使用的基于ELISA的IL-6R释放测定。
简言之，在第1天，将Nunc black96孔板(Thermo Fisher Scientific，USA)在4℃的2μg/ml TBS中用每孔100μl的小鼠抗人IL-6R捕获抗体(作为DuoSet ELISA试剂盒的一部分提供)包被过夜。在第2天，去除捕获抗体溶液并且将板在室温下用每孔300μl的TBS、1％BSA封闭1-2个小时。同时，将80μl正常生长培养基中的75,000个U-937(European Collection of Authenticated Cell Cultures，UK)细胞接种于GreinerCELLSTAR V形底96孔板(Greiner Bio-One,德国)的每个孔中并在37℃、5％CO2下与每孔20μl标准生长培养基一起预孵育30分钟，该培养基补充有作为阳性对照的50μM巴马司他(BB94，Abcam，UK)(在所得的100μl样本体积中的终浓度为10μM)、作为同种型对照的50μg/ml人IgG抗体(BioLegend，USA)(在所得的100μl样本体积中的终浓度为10μg/ml)或本发明的16.66μg/ml抗体(在所得的100μl样本体积中的终浓度为3.33μg/ml)。在刺激对照的情况下，添加不含供试品的20μl标准生长培养基。随后，在37℃、5％CO2下，在生长培养基中用每孔20μl的150ng/ml PMA(Sigma-Aldrich,USA)(终浓度为25ng/ml)刺激细胞(除了未刺激对照的那些)1小时。之后，将96孔板离心以沉淀细胞。与此同时，将封闭缓冲液从板中去除并在96头洗板机上将板用每孔350μl的TBS-T(Carl Roth,德国)洗涤4次。为了避免干掉，立即将30μl的TBS添加至板的每个孔中，然后每个样本转移70μl无细胞上清液。此外，将用TBS以限定浓度稀释的100μl重组人IL-6R蛋白(作为DuoSet ELISA试剂盒的一部分提供)添加至板中作为标准参照物。此后，每孔添加100μl TBS中的100ng/ml生物素化羊抗人IL-6R检测抗体(作为DuoSet ELISA试剂盒的一部分提供)，并且避直射光，将板在室温下孵育2小时。在96头洗板机(Tecan Group,瑞士)上用每孔350μl TBS-T(CarlRoth,德国)洗涤4次并在第四次循环后小心去除所有缓冲液痕量后，将用TBS以1:10,000稀释的100μl链霉亲和素-AP(R&D Systems,USA)添加至每个孔中，并且再次避直射光，将板在室温下孵育30分钟。在又一轮的96头洗板机(Tecan Group,瑞士)上用每孔350μl TBS-T(Carl Roth,德国)洗涤4次并在第四次循环后小心去除所有缓冲液痕量后，每孔添加100μlAttoPhos底物溶液(Promega,USA)以用于在室温下暗处孵育1小时。使用infinite M1000(Tecan Group,瑞士)酶标仪，在435nm的激发波长处和555nm的发射波长处收集每个孔的荧光。
图11示出了本实验的代表性结果，以绝对数(图11a)和抑制百分比(图11b)表明供试品对PMA诱导的IL-6R从U-937细胞释放的效应。虽然作为金属蛋白酶的小分子抑制剂的巴马司他(BB94)用作阳性对照，并对PMA诱导的IL-6R释放产生强烈抑制，但IgG同种型对照的存在对IL-6R脱落没有显著影响。相比之下，本发明的人源化抗体16-B-03、16-B-05、16-B-07、23-B-04、42-B-02和42-B-04对PMA诱导的IL-6R从U-937细胞释放的抑制分别为79.6％、81.7％、77.5％、77.8％、78.3％和82.4％。
实施例10：本发明抗体对PMA诱导的肝素结合EGF样生长因子(HB-EGF)体外脱落的抑制效应的分析
在以下研究中，进行基于ELISA的HB-EGF释放测定以分析本发明抗体对PMA诱导的内源性HB-EGF从人THP-1单核细胞释放的抑制效应。
下面将描述本实施例中使用的基于ELISA的HB-EGF释放测定。
简言之，在第1天，将Nunc black96孔板(Thermo Fisher Scientific，USA)在4℃的2μg/ml TBS中用每孔100μl的大鼠抗人HB-EGF捕获抗体(作为DuoSet ELISA试剂盒的一部分提供)包被过夜。将80μl正常生长培养基中的40,000个THP-1(American TypeCulture Collection，USA)细胞接种于Greiner CELLSTAR V形底96孔板(Greiner Bio-One,德国)的每个孔中并在37℃、5％CO2下与每孔20μl标准生长培养基一起预孵育30分钟，该培养基补充有作为阳性对照的50μM巴马司他(BB94，Abcam，UK)(在所得的100μl样本体积中的终浓度为10μM)、作为同种型对照的15μg/ml人IgG抗体(BioLegend，USA)(在所得的100μl样本体积中的终浓度为3μg/ml)或本发明的15μg/ml抗体(在所得的100μl样本体积中的终浓度为3μg/ml)。在刺激对照的情况下，添加不含供试品的20μl标准生长培养基。随后，在37℃、5％CO2下，在生长培养基中用每孔20μl的150ng/ml PMA(Sigma-Aldrich,USA)(终浓度为25ng/ml)刺激细胞(除了未刺激的对照的那些)24小时。在第2天，去除捕获抗体溶液并且板在室温下用每孔300μl的TBS、1％BSA封闭1-2个小时。之后，将96孔板离心以沉淀细胞。与此同时，将封闭缓冲液从板中去除并在96头洗板机上将板用每孔350μl的TBS-T(Carl Roth,德国)洗涤4次。为了避免干掉，立即将30μl的TBS添加至板的每个孔中，然后每个样本转移70μl无细胞上清液。此外，将用TBS以限定浓度稀释的100μl重组人HB-EGF蛋白(作为DuoSet ELISA试剂盒的一部分提供)添加至板中作为标准参照物。此后，将板在室温下孵育2小时。在96头洗板机(Tecan Group,瑞士)上用每孔350μl TBS-T(Carl Roth,德国)洗涤4次并在第四次循环后小心去除所有缓冲液痕量后，每孔添加100μl TBS中的50ng/ml生物素化羊抗人HB-EGF检测抗体(作为DuoSet ELISA试剂盒的一部分提供)，避直射光，将板在室温下孵育2小时。在96头洗板机(Tecan Group,瑞士)上用每孔350μl TBS-T(Carl Roth,德国)洗涤4次并在第四次循环后小心去除所有缓冲液痕量后，将在TBS中以1:10,000稀释的100μl链霉亲和素-AP(R&D Systems,USA)添加至每个孔中，并且再次避直射光，将板在室温下孵育30分钟。在又一轮的96头洗板机(TecanGroup,瑞士)上用每孔350μl TBS-T(Carl Roth,德国)洗涤4次并在第四次循环后小心去除所有缓冲液痕量后，每孔添加100μlAttoPhos底物溶液(Promega,USA)以用于在室温下暗处孵育1小时。使用infinite M1000(Tecan Group,瑞士)酶标仪，在435nm的激发波长处和555nm的发射波长处收集每个孔的荧光。
图12示出了本实验的代表性结果，以绝对数(图12a)和抑制百分比(图12b)表明供试品对PMA诱导的HB-EGF从THP-1细胞释放的效应。虽然作为金属蛋白酶的小分子抑制剂的巴马司他(BB94)用作阳性对照，并对PMA诱导的HB-EGF释放产生强烈抑制，但IgG同种型对照的存在对HB-EGF脱落没有显著影响。与之相比，相等浓度的本发明的人源化抗体16-B-03、16-B-05、16-B-07、23-B-04、42-B-02和42-B-04对PMA诱导的HB-EGF从THP-1细胞释放的抑制分别为80.2％、83.0％、80.5％、84.4％、81.2％和86.2％。
实施例11：本发明抗体对PMA诱导的HB-EGF体外脱落的抑制效应的分析
与上述实施例10互补，进行基于ELISA的HB-EGF释放测定以证实本发明抗体对PMA诱导的内源性HB-EGF从人U-937细胞释放的抑制效应。
本实施例中使用的基于ELISA的HB-EGF释放测定与实施例10中描述的相同，区别在于使用了U-937(European Collection of Authenticated Cell Cultures，UK)细胞(80,000个细胞/孔)，而非THP-1(American Type Culture Collection，USA)细胞。
图13示出了本实验的代表性结果，以绝对数(图13a)和抑制百分比(图13b)表明供试品对PMA诱导的HB-EGF从U-937细胞释放的效应。虽然作为金属蛋白酶的小分子抑制剂的巴马司他(BB94)用作阳性对照，并对LPS诱导的HB-EGF释放产生强烈抑制，但IgG同种型对照的存在对HB-EGF脱落几乎没有显著影响。相反地，相等浓度的本发明的人源化抗体16-B-03、16-B-05、16-B-07、23-B-04、42-B-02和42-B-04对PMA诱导的HB-EGF从U-937细胞释放的抑制分别为99.2％、99.7％、99.2％、99.5％、98.8％和99.4％。
实施例12：本发明抗体对PMA诱导的转化生长因子α(TGFα)体外脱落的抑制效应的分析
在以下研究中，进行基于ELISA的TGFα释放测定以分析本发明抗体对PMA诱导的内源性TGFα从人PC3前列腺癌细胞释放的抑制效应。
下面将描述本实施例中使用的基于ELISA的TGFα释放测定。
简言之，在第1天，将Nunc black96孔板(Thermo Fisher Scientific，USA)在4℃的0.4μg/ml TBS中用每孔100μl的羊抗人TGFα捕获抗体(作为DuoSet ELISA试剂盒的一部分提供)包被过夜。将100μl正常生长培养基中的80,000个PC3(EuropeanCollection of Authenticated Cell Cultures，UK)细胞接种于F形底96孔细胞培养板(Corning，USA)的每个孔中并在37℃、5％CO2下孵育过夜。在第2天，去除捕获抗体溶液并且板在室温下用每孔300μl的TBS、1％BSA封闭1-2个小时。同时，将细胞用PBS洗涤一次并37℃、5％CO2下与80μl OptiMEM培养基中的每孔20μl OptiMEM一起预孵育30分钟，该OptiMEM培养基补充有作为阳性对照的50μM巴马司他(BB94，Abcam，UK)(在所得的100μl样本体积中的终浓度为10μM)、作为同种型对照的50μg/ml人IgG抗体(BioLegend，USA)(在所得的100μl样本体积中的终浓度为10μg/ml)或本发明的50μg/ml抗体(在所得的100μl样本体积中的终浓度为10μg/ml)。在刺激对照的情况下，添加不含供试品的20μl OptiMEM培养基。随后，在37℃、5％CO2下，在OptiMEM中用每孔20μl的150ng/ml PMA(Sigma-Aldrich,USA)(终浓度为25ng/ml)刺激细胞(除了未刺激的对照的那些)2小时。与此同时，将封闭缓冲液从板中去除并在96头洗板机上将板用每孔350μl的TBS-T(Carl Roth,德国)洗涤4次。为了避免干掉，立即将20μl的TBS添加至板的每个孔中，然后每个样本转移80μl无细胞上清液。此外，将用TBS以限定浓度稀释的100μl重组人TNFα蛋白(作为DuoSet ELISA试剂盒的一部分提供)添加至板中作为标准参照物。此后，每孔添加100μlTBS中的37.5ng/ml生物素化羊抗人TGFα检测抗体(作为DuoSet ELISA试剂盒的一部分提供)，并避直射光，将板在室温下孵育2小时。在96头洗板机(Tecan Group,瑞士)上用每孔350μl TBS-T(Carl Roth,德国)洗涤4次并在第四次循环后小心去除所有缓冲液痕量后，将在TBS中以1:10,000稀释的100μl链霉亲和素-AP(R&D Systems,USA)添加至每个孔中，并且再次避直射光，将板在室温下孵育30分钟。在又一轮的96头洗板机(Tecan Group,瑞士)上用每孔350μl TBS-T(Carl Roth,德国)洗涤4次并在第四次循环后小心去除所有缓冲液痕量后，每孔添加100μlAttoPhos底物溶液(Promega,USA)以用于在室温下暗处孵育1小时。使用infinite M1000(Tecan Group,瑞士)酶标仪，在435nm的激发波长处和555nm的发射波长处收集每个孔的荧光。
图14示出了本实验的代表性结果，以绝对数(图14a)和抑制百分比(图14b)表明供试品对PMA诱导的TGFα从PC3细胞释放的影响。虽然作为金属蛋白酶的小分子抑制剂的巴马司他(BB94)用作阳性对照，并导致90.7％的PMA诱导的TNFα释放，但IgG同种型对照的存在对TNFα脱落没有抑制效应。在相等浓度的本发明的人源化抗体16-B-03、16-B-05、16-B-07、23-B-04、42-B-02和42-B-04的存在下，仅检测到对TGFα脱落的非常适中的影响，这些抗体分对PMA诱导的TGFα从PC3细胞释放的抑制分别为15.9％、23.8％、3.3％、21.3％、6.4％和19.5％。
实施例13：本发明抗体在内源性表达iRhom2的细胞系中的结合特异性的评估
在本研究中，对在内源性表达iRhom2的细胞系中的作为本发明抗体的代表性示例的人源化抗体42-B-02进行结合特异性分析。对RPMI-8226细胞(一种内源性表达iRhom2但对iRhom1呈内源性阴性的人B淋巴细胞系)、对THP-1细胞(一种内源性表达iRhom2和iRhom1的人单核细胞系)以及对RH-30细胞(一种对iRhom2成内源性阴性但内源性表达iRhom1的人成纤维细胞系)进行该研究。
简言之，用含10mM EDTA的PBS收获人RPMI-8226细胞(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen、德国)、THP-1细胞(American Type CultureCollection，USA)和RH-30细胞(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen、德国)，洗涤并重悬于FACS缓冲液(PBS，3％FBS、0.05％叠氮化钠)中，并且以每孔约2x105个细胞接种于Nunc U形底96孔板(Thermo Fisher Scientific，USA)中。为了沉淀细胞并去除上清液，将板在1,500rpm和4℃下离心3分钟。对于第一次染色，将细胞重悬于每孔100μl的单独FACS缓冲液(对照)或在FACS缓冲液中的3μg/ml本发明的抗体中并在冰上孵育1小时。之后，将板在1,500rpm和4℃下离心3分钟并用每孔200μl的FACS缓冲液洗涤两次。对于第二次染色，将细胞离心并重悬于每孔100μl的用FACS缓冲液以1:100稀释的PE缀合的山羊抗人IgG F(ab')2检测片段(Dianova，德国)中。避光，将细胞悬浮液在冰上孵育1小时。然后将板在1,500rpm和4℃下离心3分钟并用每孔200μl的FACS缓冲液洗涤三次。最后，将细胞重悬于每孔150μl的FACS缓冲液中并使用BD AccuriTM C6 Plus流式细胞仪(Becton Dickinson，德国)进行分析。
图15示出了本研究的代表性结果。与仅用二抗孵育的对照样本相比，RPMI-8226和THP-1细胞(二者均内源性表达iRhom2)与作为本发明抗体的代表性示例的人源化抗体42-B-02的共孵育导致两种细胞系的相对荧光强度发生强烈变化，表明本发明的人源化抗体42-B-02与对iRhom2呈内源性阳性的两个人细胞系强烈结合。与之相比，检测到作为本发明的抗体的代表性示例的人源化抗体42-B-02(右，黑色)不与RH-30细胞(其不表达iRhom2)结合，这提供了通过本发明的人源化抗体42-B-02特异性识别内源性表达的iRhom2的证据。
实施例14：基于在大的胞外环中的单氨基酸取代或缺失的本发明抗体的表位作图
现在，可用对由抗体识别的表位进行作图的几个方法，包括X射线共晶体学、基于阵列的寡肽扫描、氢-氘交换或交联耦合质谱。定点诱变或高通量霰弹枪诱变等遗传方法允许以单氨基酸分辨率进行表位作图。然而，蛋白随机位置的氨基酸取代或非相关氨基酸的取代具有引起蛋白构象变化和/或功能丧失的风险，因此可能导致对取代的氨基酸是否有助于抗体表位的误解。规避这些风险的一种巧妙且普遍接受的方法是用结构相关蛋白(即直系同源物或密切相关的家族成员)的同源氨基酸取代给定蛋白的单个氨基酸，前提是这些相关蛋白未被感兴趣的抗体识别。如前所述，本发明的所有人源化抗人iRhom2抗体都是如此，因为它们被证明既不与小鼠直系同源物交叉反应(实施例3)，也不与密切相关的家族成员人iRhom1结合(实施例4)。此外，用丙氨酸取代给定蛋白质的单个氨基酸代表了广泛使用的作图表位的方法。
因此，在鉴定有助于结合本发明抗体的单个氨基酸的方法中，设计了一组137个人iRhom2变体的质粒，其具有小鼠iRhom2相关的单氨基酸取代、人iRhom1相关的单氨基酸取代或丙氨酸的单氨基酸取代。这137个取代反映了大细胞外环1(人iRhom2的AA502至AA594)中的氨基酸，其在人iRhom2中与小鼠iRhom2不相同，在人iRhom2中与人iRhom1不相同，或者其中人iRhom2中的相应氨基酸被丙氨酸取代。代替人iRhom2的氨基酸，引入小鼠iRhom2或人iRhom1的相应位置的氨基酸，或者用丙氨酸代替人iRhom2的氨基酸。在小鼠iRhom2或人iRhom1中不存在相应的氨基酸的情况下，删除人iRhom2的相应氨基酸，导致形成变体hiR2-FL-Q502R-T7、hiR2-FL-N503A-T7、hiR2-FL-D504A-T7、hiR2-FL-H505R-T7、hiR2-FL-H505A-T7、hiR2-FL-S506A-T7、hiR2-FL-G507A-T7、hiR2-FL-C508A-T7、hiR2-FL-I509V-T7、hiR2-FL-I509A-T7、hiR2-FL-Q510A-T7、hiR2-FL-T511A-T7、hiR2-FL-Q512L-T7、hiR2-FL-Q512S-T7、hiR2-FL-Q512A-T7、hiR2-FL-R513K-T7、hiR2-FL-R513E-T7、hiR2-FL-R513A-T7、hiR2-FL-K514E-T7、hiR2-FL-K514A-T7、hiR2-FL-D515E-T7、hiR2-FL-D515A-T7、hiR2-FL-C516A-T7、hiR2-FL-S517A-T7、hiR2-FL-E518S-T7、hiR2-FL-E518A-T7、hiR2-FL-T519A-T7、hiR2-FL-L520A-T7、hiR2-FL-A521S-T7、hiR2-FL-T522V-T7、hiR2-FL-T522A-T7、hiR2-FL-F523W-T7、hiR2-FL-F523A-T7、hiR2-FL-V524A-T7、hiR2-FL-K525A-T7、hiR2-FL-W526A-T7、hiR2-FL-Q527P-T7、hiR2-FL-Q527A-T7、hiR2-FL-D528N-T7、hiR2-FL-D528I-T7、hiR2-FL-D528A-T7、hiR2-FL-D529H-T7、hiR2-FL-D529A-T7、hiR2-FL-T530P-T7、hiR2-FL-T530A-T7、hiR2-FL-G531S-T7、hiR2-FL-G531A-T7、hiR2-FL-P532A-T7、hiR2-FL-P533--T7、hiR2-FL-P533A-T7、hiR2-FL-M534S-T7、hiR2-FL-M534--T7、hiR2-FL-M534A-T7、hiR2-FL-D535--T7、hiR2-FL-D535A-T7、hiR2-FL-K536--T7、hiR2-FL-K536A-T7、hiR2-FL-S537E-T7、hiR2-FL-S537A-T7、hiR2-FL-D538L-T7、hiR2-FL-D538A-T7、hiR2-FL-L539A-T7、hiR2-FL-G540S-T7、hiR2-FL-G540A-T7、hiR2-FL-Q541H-T7、hiR2-FL-Q541A-T7、hiR2-FL-K542A-T7、hiR2-FL-R543Q-T7、hiR2-FL-R543A-T7、hiR2-FL-T544P-T7、hiR2-FL-T544Q-T7、hiR2-FL-T544A-T7、hiR2-FL-S545F-T7、hiR2-FL-S545A-T7、hiR2-FL-G546A-T7、hiR2-FL-A547V-T7、hiR2-FL-A547S-T7、hiR2-FL-V548A-T7、hiR2-FL-C549A-T7、hiR2-FL-H550A-T7、hiR2-FL-Q551A-T7、hiR2-FL-D552A-T7、hiR2-FL-P553A-T7、hiR2-FL-R554A-T7、hiR2-FL-T555V-T7、hiR2-FL-T555A-T7、hiR2-FL-C556A-T7、hiR2-FL-E557D-T7、hiR2-FL-E557A-T7、hiR2-FL-E558A-T7、hiR2-FL-P559A-T7、hiR2-FL-A560S-T7、hiR2-FL-S561A-T7、hiR2-FL-S562E-T7、hiR2-FL-S562A-T7、hiR2-FL-G563D-T7、hiR2-FL-G563A-T7、hiR2-FL-A564P-T7、hiR2-FL-A564S-T7、hiR2-FL-H565A-T7、hiR2-FL-I566E-T7、hiR2-FL-I566A-T7、hiR2-FL-W567A-T7、hiR2-FL-P568A-T7、hiR2-FL-D569E-T7、hiR2-FL-D569A-T7、hiR2-FL-D570A-T7、hiR2-FL-I571A-T7、hiR2-FL-T572A-T7、hiR2-FL-K573A-T7、hiR2-FL-W574A-T7、hiR2-FL-P575A-T7、hiR2-FL-I576A-T7、hiR2-FL-C577A-T7、hiR2-FL-T578A-T7、hiR2-FL-E579K-T7、hiR2-FL-E579A-T7、hiR2-FL-Q580N-T7、hiR2-FL-Q580A-T7、hiR2-FL-A581S-T7、hiR2-FL-R582A-T7、hiR2-FL-S583G-T7、hiR2-FL-S583A-T7、hiR2-FL-N584A-T7、hiR2-FL-H585A-T7、hiR2-FL-T586A-T7、hiR2-FL-G587N-T7、hiR2-FL-G587A-T7、hiR2-FL-F588H-T7、hiR2-FL-F588A-T7、hiR2-FL-L589P-T7、hiR2-FL-L589A-T7、hiR2-FL-H590A-T7、hiR2-FL-M591A-T7、hiR2-FL-D592A-T7、hiR2-FL-C593A-T7和hiR2-FL-E594V-T7。
本实施例描述了表达137个单氨基酸取代或缺失变体的iRhom1/2-/-DKO-MEF群的生成，以及它们在细胞表面定位和作为适当蛋白构象指标的功能活性方面的表征。随后，描述了本发明的人源化抗体16-B-03、16-B-05、16-B-07、23-B-04、42-B-02和42-B-04在表达具有单氨基酸取代或缺失的人iRhom2变体的137个工程化MEF群的整个组上的结合分析。
稳定表达具有单氨基酸取代或缺失的137个T7标记的人iRhom2变体的iRhom1/
2-/-DKO MEF的生成
简言之，在第1天，将Phoenix-ECO细胞(American Type Culture Collection，USA)以每孔8x105个细胞接种于6孔组织培养板上的标准生长培养基中并在37℃、5％ CO2下保持过夜。在第2天，培养基用补充有终浓度为25μM的氯喹((Sigma-Aldrich，USA)的新鲜培养基替换。应用磷酸钙法，用2μg/ml编码C-末端标记3个连续拷贝的T7表位(MASMTGGQQMG)的人iRhom2全长单氨基酸取代的pMSCV-hiR2-FL-Q502R-T7、pMSCV-hiR2-FL-N503A-T7、pMSCV-hiR2-FL-D504A-T7、pMSCV-hiR2-FL-H505R-T7、pMSCV-hiR2-FL-H505A-T7、pMSCV-hiR2-FL-S506A-T7、pMSCV-hiR2-FL-G507A-T7、pMSCV-hiR2-FL-C508A-T7、pMSCV-hiR2-FL-I509V-T7、pMSCV-hiR2-FL-I509A-T7、pMSCV-hiR2-FL-Q510A-T7、pMSCV-hiR2-FL-T511A-T7、pMSCV-hiR2-FL-Q512L-T7、pMSCV-hiR2-FL-Q512S-T7、pMSCV-hiR2-FL-Q512A-T7、pMSCV-hiR2-FL-R513K-T7、pMSCV-hiR2-FL-R513E-T7、pMSCV-hiR2-FL-R513A-T7、pMSCV-hiR2-FL-K514E-T7、pMSCV-hiR2-FL-K514A-T7、pMSCV-hiR2-FL-D515E-T7、pMSCV-hiR2-FL-D515A-T7、pMSCV-hiR2-FL-C516A-T7、pMSCV-hiR2-FL-S517A-T7、pMSCV-hiR2-FL-E518S-T7、pMSCV-hiR2-FL-E518A-T7、pMSCV-hiR2-FL-T519A-T7、pMSCV-hiR2-FL-L520A-T7、pMSCV-hiR2-FL-A521S-T7、pMSCV-hiR2-FL-T522V-T7、pMSCV-hiR2-FL-T522A-T7、pMSCV-hiR2-FL-F523W-T7、pMSCV-hiR2-FL-F523A-T7、pMSCV-hiR2-FL-V524A-T7、pMSCV-hiR2-FL-K525A-T7、pMSCV-hiR2-FL-W526A-T7、pMSCV-hiR2-FL-Q527P-T7、pMSCV-hiR2-FL-Q527A-T7、pMSCV-hiR2-FL-D528N-T7、pMSCV-hiR2-FL-D528I-T7、pMSCV-hiR2-FL-D528A-T7、pMSCV-hiR2-FL-D529H-T7、pMSCV-hiR2-FL-D529A-T7、pMSCV-hiR2-FL-T530P-T7、pMSCV-hiR2-FL-T530A-T7、pMSCV-hiR2-FL-G531S-T7、pMSCV-hiR2-FL-G531A-T7、pMSCV-hiR2-FL-P532A-T7、pMSCV-hiR2-FL-P533--T7、pMSCV-hiR2-FL-P533A-T7、pMSCV-hiR2-FL-M534S-T7、pMSCV-hiR2-FL-M534--T7、pMSCV-hiR2-FL-M534A-T7、pMSCV-hiR2-FL-D535--T7、pMSCV-hiR2-FL-D535A-T7、pMSCV-hiR2-FL-K536--T7、pMSCV-hiR2-FL-K536A-T7、pMSCV-hiR2-FL-S537E-T7、pMSCV-hiR2-FL-S537A-T7、pMSCV-hiR2-FL-D538L-T7、pMSCV-hiR2-FL-D538A-T7、pMSCV-hiR2-FL-L539A-T7、pMSCV-hiR2-FL-G540S-T7、pMSCV-hiR2-FL-G540A-T7、pMSCV-hiR2-FL-Q541H-T7、pMSCV-hiR2-FL-Q541A-T7、pMSCV-hiR2-FL-K542A-T7、pMSCV-hiR2-FL-R543Q-T7、pMSCV-hiR2-FL-R543A-T7、pMSCV-hiR2-FL-T544P-T7、pMSCV-hiR2-FL-T544Q-T7、pMSCV-hiR2-FL-T544A-T7、pMSCV-hiR2-FL-S545F-T7、pMSCV-hiR2-FL-S545A-T7、pMSCV-hiR2-FL-G546A-T7、pMSCV-hiR2-FL-A547V-T7、pMSCV-hiR2-FL-A547S-T7、pMSCV-hiR2-FL-V548A-T7、pMSCV-hiR2-FL-C549A-T7、pMSCV-hiR2-FL-H550A-T7、pMSCV-hiR2-FL-Q551A-T7、pMSCV-hiR2-FL-D552A-T7、pMSCV-hiR2-FL-P553A-T7、pMSCV-hiR2-FL-R554A-T7、pMSCV-hiR2-FL-T555V-T7、pMSCV-hiR2-FL-T555A-T7、pMSCV-hiR2-FL-C556A-T7、pMSCV-hiR2-FL-E557D-T7、pMSCV-hiR2-FL-E557A-T7、pMSCV-hiR2-FL-E558A-T7、pMSCV-hiR2-FL-P559A-T7、pMSCV-hiR2-FL-A560S-T7、pMSCV-hiR2-FL-S561A-T7、pMSCV-hiR2-FL-S562E-T7、pMSCV-hiR2-FL-S562A-T7、pMSCV-hiR2-FL-G563D-T7、pMSCV-hiR2-FL-G563A-T7、pMSCV-hiR2-FL-A564P-T7、pMSCV-hiR2-FL-A564S-T7、pMSCV-hiR2-FL-H565A-T7、pMSCV-hiR2-FL-I566E-T7、pMSCV-hiR2-FL-I566A-T7、pMSCV-hiR2-FL-W567A-T7、pMSCV-hiR2-FL-P568A-T7、pMSCV-hiR2-FL-D569E-T7、pMSCV-hiR2-FL-D569A-T7、pMSCV-hiR2-FL-D570A-T7、pMSCV-hiR2-FL-I571A-T7、pMSCV-hiR2-FL-T572A-T7、pMSCV-hiR2-FL-K573A-T7、pMSCV-hiR2-FL-W574A-T7、pMSCV-hiR2-FL-P575A-T7、pMSCV-hiR2-FL-I576A-T7、pMSCV-hiR2-FL-C577A-T7、pMSCV-hiR2-FL-T578A-T7、pMSCV-hiR2-FL-E579K-T7、pMSCV-hiR2-FL-E579A-T7、pMSCV-hiR2-FL-Q580N-T7、pMSCV-hiR2-FL-Q580A-T7、pMSCV-hiR2-FL-A581S-T7、pMSCV-hiR2-FL-R582A-T7、pMSCV-hiR2-FL-S583G-T7、pMSCV-hiR2-FL-S583A-T7、pMSCV-hiR2-FL-N584A-T7、pMSCV-hiR2-FL-H585A-T7、pMSCV-hiR2-FL-T586A-T7、pMSCV-hiR2-FL-G587N-T7、pMSCV-hiR2-FL-G587A-T7、pMSCV-hiR2-FL-F588H-T7、pMSCV-hiR2-FL-F588A-T7、pMSCV-hiR2-FL-L589P-T7、pMSCV-hiR2-FL-L589A-T7、pMSCV-hiR2-FL-H590A-T7、pMSCV-hiR2-FL-M591A-T7、pMSCV-hiR2-FL-D592A-T7、pMSCV-hiR2-FL-C593A-T7和pMSCV-hiR2-FL-E594V-T7转染细胞，并且保持在37℃、5％CO2下。7小时后，通过用缺乏氯喹的标准生长培养基替换细胞上清液使转染停止，并将细胞在37℃、5％CO2下孵育过夜以允许病毒产生。与此同时，将作为用于逆转录病毒感染的靶细胞的永生化iRhom1/2-/-DKO MEF以每孔1x105个细胞接种于6孔组织培养板上(Greiner，德国)的标准生长培养基中，并也在37℃、5％ CO2下保持过夜。在第3天，收集释放pMSCV-hiR2-FL-Q502R-T7、pMSCV-hiR2-FL-N503A-T7、pMSCV-hiR2-FL-D504A-T7、pMSCV-hiR2-FL-H505R-T7、pMSCV-hiR2-FL-H505A-T7、pMSCV-hiR2-FL-S506A-T7、pMSCV-hiR2-FL-G507A-T7、pMSCV-hiR2-FL-C508A-T7、pMSCV-hiR2-FL-I509V-T7、pMSCV-hiR2-FL-I509A-T7、pMSCV-hiR2-FL-Q510A-T7、pMSCV-hiR2-FL-T511A-T7、pMSCV-hiR2-FL-Q512L-T7、pMSCV-hiR2-FL-Q512S-T7、pMSCV-hiR2-FL-Q512A-T7、pMSCV-hiR2-FL-R513K-T7、pMSCV-hiR2-FL-R513E-T7、pMSCV-hiR2-FL-R513A-T7、pMSCV-hiR2-FL-K514E-T7、pMSCV-hiR2-FL-K514A-T7、pMSCV-hiR2-FL-D515E-T7、pMSCV-hiR2-FL-D515A-T7、pMSCV-hiR2-FL-C516A-T7、pMSCV-hiR2-FL-S517A-T7、pMSCV-hiR2-FL-E518S-T7、pMSCV-hiR2-FL-E518A-T7、pMSCV-hiR2-FL-T519A-T7、pMSCV-hiR2-FL-L520A-T7、pMSCV-hiR2-FL-A521S-T7、pMSCV-hiR2-FL-T522V-T7、pMSCV-hiR2-FL-T522A-T7、pMSCV-hiR2-FL-F523W-T7、pMSCV-hiR2-FL-F523A-T7、pMSCV-hiR2-FL-V524A-T7、pMSCV-hiR2-FL-K525A-T7、pMSCV-hiR2-FL-W526A-T7、pMSCV-hiR2-FL-Q527P-T7、pMSCV-hiR2-FL-Q527A-T7、pMSCV-hiR2-FL-D528N-T7、pMSCV-hiR2-FL-D528I-T7、pMSCV-hiR2-FL-D528A-T7、pMSCV-hiR2-FL-D529H-T7、pMSCV-hiR2-FL-D529A-T7、pMSCV-hiR2-FL-T530P-T7、pMSCV-hiR2-FL-T530A-T7、pMSCV-hiR2-FL-G531S-T7、pMSCV-hiR2-FL-G531A-T7、pMSCV-hiR2-FL-P532A-T7、pMSCV-hiR2-FL-P533--T7、pMSCV-hiR2-FL-P533A-T7、pMSCV-hiR2-FL-M534S-T7、pMSCV-hiR2-FL-M534--T7、pMSCV-hiR2-FL-M534A-T7、pMSCV-hiR2-FL-D535--T7、pMSCV-hiR2-FL-D535A-T7、pMSCV-hiR2-FL-K536--T7、pMSCV-hiR2-FL-K536A-T7、pMSCV-hiR2-FL-S537E-T7、pMSCV-hiR2-FL-S537A-T7、pMSCV-hiR2-FL-D538L-T7、pMSCV-hiR2-FL-D538A-T7、pMSCV-hiR2-FL-L539A-T7、pMSCV-hiR2-FL-G540S-T7、pMSCV-hiR2-FL-G540A-T7、pMSCV-hiR2-FL-Q541H-T7、pMSCV-hiR2-FL-Q541A-T7、pMSCV-hiR2-FL-K542A-T7、pMSCV-hiR2-FL-R543Q-T7、pMSCV-hiR2-FL-R543A-T7、pMSCV-hiR2-FL-T544P-T7、pMSCV-hiR2-FL-T544Q-T7、pMSCV-hiR2-FL-T544A-T7、pMSCV-hiR2-FL-S545F-T7、pMSCV-hiR2-FL-S545A-T7、pMSCV-hiR2-FL-G546A-T7、pMSCV-hiR2-FL-A547V-T7、pMSCV-hiR2-FL-A547S-T7、pMSCV-hiR2-FL-V548A-T7、pMSCV-hiR2-FL-C549A-T7、pMSCV-hiR2-FL-H550A-T7、pMSCV-hiR2-FL-Q551A-T7、pMSCV-hiR2-FL-D552A-T7、pMSCV-hiR2-FL-P553A-T7、pMSCV-hiR2-FL-R554A-T7、pMSCV-hiR2-FL-T555V-T7、pMSCV-hiR2-FL-T555A-T7、pMSCV-hiR2-FL-C556A-T7、pMSCV-hiR2-FL-E557D-T7、pMSCV-hiR2-FL-E557A-T7、pMSCV-hiR2-FL-E558A-T7、pMSCV-hiR2-FL-P559A-T7、pMSCV-hiR2-FL-A560S-T7、pMSCV-hiR2-FL-S561A-T7、pMSCV-hiR2-FL-S562E-T7、pMSCV-hiR2-FL-S562A-T7、pMSCV-hiR2-FL-G563D-T7、pMSCV-hiR2-FL-G563A-T7、pMSCV-hiR2-FL-A564P-T7、pMSCV-hiR2-FL-A564S-T7、pMSCV-hiR2-FL-H565A-T7、pMSCV-hiR2-FL-I566E-T7、pMSCV-hiR2-FL-I566A-T7、pMSCV-hiR2-FL-W567A-T7、pMSCV-hiR2-FL-P568A-T7、pMSCV-hiR2-FL-D569E-T7、pMSCV-hiR2-FL-D569A-T7、pMSCV-hiR2-FL-D570A-T7、pMSCV-hiR2-FL-I571A-T7、pMSCV-hiR2-FL-T572A-T7、pMSCV-hiR2-FL-K573A-T7、pMSCV-hiR2-FL-W574A-T7、pMSCV-hiR2-FL-P575A-T7、pMSCV-hiR2-FL-I576A-T7、pMSCV-hiR2-FL-C577A-T7、pMSCV-hiR2-FL-T578A-T7、pMSCV-hiR2-FL-E579K-T7、pMSCV-hiR2-FL-E579A-T7、pMSCV-hiR2-FL-Q580N-T7、pMSCV-hiR2-FL-Q580A-T7、pMSCV-hiR2-FL-A581S-T7、pMSCV-hiR2-FL-R582A-T7、pMSCV-hiR2-FL-S583G-T7、pMSCV-hiR2-FL-S583A-T7、pMSCV-hiR2-FL-N584A-T7、pMSCV-hiR2-FL-H585A-T7、pMSCV-hiR2-FL-T586A-T7、pMSCV-hiR2-FL-G587N-T7、pMSCV-hiR2-FL-G587A-T7、pMSCV-hiR2-FL-F588H-T7、pMSCV-hiR2-FL-F588A-T7、pMSCV-hiR2-FL-L589P-T7、pMSCV-hiR2-FL-L589A-T7、pMSCV-hiR2-FL-H590A-T7、pMSCV-hiR2-FL-M591A-T7、pMSCV-hiR2-FL-D592A-T7、pMSCV-hiR2-FL-C593A-T7和pMSCV-hiR2-FL-E594V-T7同向性病毒的Phoenix-ECO细胞的上清液，用0.45μm CA过滤器过滤，并用4μg/ml聚凝胺补充(Sigma-Aldrich，USA)。将培养基从永生化iRhom1/2-/-DKO MEF中去除后，在37℃、5％CO2下将这些上清液添加至靶细胞4小时以用于第一次感染。同时，将Phoenix-ECO细胞与新鲜培养基一起再孵育，再过4小时后，过滤并用于再次在4μg/ml聚凝胺的存在下对相应的靶细胞群进行第二次感染。同样地，进行第三轮感染，但过夜。在第4天，用新鲜的标准生长培养基替换含有病毒的细胞上清液。从第5天开始，将细胞在2mg/ml遗传霉素(G418，ThermoFisher Scientific，USA)的存在中生长用于筛选永生化的稳定表达C末端标记3个连续拷贝的T7表位的人iRhom2全长单氨基酸取代的MEF-DKO-hiR2-FL-Q502R-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-N503A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D504A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-H505R-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-H505A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-S506A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-G507A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-C508A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-I509V-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-I509A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-Q510A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T511A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-Q512L-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-Q512S-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-Q512A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-R513K-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-R513E-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-R513A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-K514E-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-K514A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D515E-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D515A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-C516A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-S517A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-E518S-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-E518A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T519A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-L520A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-A521S-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T522V-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T522A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-F523W-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-F523A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-V524A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-K525A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-W526A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-Q527P-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-Q527A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D528N-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D528I-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D528A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D529H-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D529A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T530P-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T530A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-G531S-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-G531A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-P532A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-P533--T7、MEF-DKO-hiR2-FL-P533A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-M534S-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-M534--T7、MEF-DKO-hiR2-FL-M534A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D535--T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D535A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-K536--T7、MEF-DKO-hiR2-FL-K536A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-S537E-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-S537A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D538L-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D538A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-L539A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-G540S-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-G540A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-Q541H-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-Q541A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-K542A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-R543Q-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-R543A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T544P-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T544Q-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T544A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-S545F-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-S545A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-G546A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-A547V-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-A547S-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-V548A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-C549A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-H550A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-Q551A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D552A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-P553A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-R554A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T555V-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T555A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-C556A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-E557D-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-E557A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-E558A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-P559A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-A560S-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-S561A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-S562E-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-S562A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-G563D-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-G563A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-A564P-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-A564S-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-H565A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-I566E-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-I566A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-W567A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-P568A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D569E-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D569A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D570A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-I571A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T572A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-K573A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-W574A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-P575A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-I576A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-C577A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T578A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-E579K-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-E579A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-Q580N-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-Q580A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-A581S-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-R582A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-S583G-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-S583A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-N584A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-H585A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T586A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-G587N-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-G587A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-F588H-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-F588A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-L589P-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-L589A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-H590A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-M591A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D592A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-C593A-T7和MEF-DKO-hiR2-FL-E594V-T7细胞。增殖后，存储细胞以备用。
测试系统验证的FACS分析
简言之，用含10mM EDTA的PBS收获永生化MEF-DKO-hiR2-FL-WT-T7细胞与MEF-DKO-hiR2-FL-Q502R-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-N503A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D504A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-H505R-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-H505A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-S506A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-G507A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-C508A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-I509V-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-I509A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-Q510A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T511A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-Q512L-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-Q512S-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-Q512A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-R513K-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-R513E-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-R513A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-K514E-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-K514A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D515E-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D515A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-C516A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-S517A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-E518S-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-E518A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T519A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-L520A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-A521S-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T522V-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T522A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-F523W-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-F523A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-V524A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-K525A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-W526A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-Q527P-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-Q527A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D528N-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D528I-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D528A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D529H-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D529A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T530P-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T530A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-G531S-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-G531A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-P532A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-P533--T7、MEF-DKO-hiR2-FL-P533A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-M534S-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-M534--T7、MEF-DKO-hiR2-FL-M534A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D535--T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D535A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-K536--T7、MEF-DKO-hiR2-FL-K536A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-S537E-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-S537A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D538L-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D538A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-L539A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-G540S-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-G540A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-Q541H-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-Q541A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-K542A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-R543Q-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-R543A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T544P-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T544Q-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T544A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-S545F-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-S545A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-G546A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-A547V-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-A547S-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-V548A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-C549A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-H550A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-Q551A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D552A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-P553A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-R554A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T555V-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T555A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-C556A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-E557D-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-E557A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-E558A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-P559A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-A560S-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-S561A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-S562E-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-S562A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-G563D-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-G563A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-A564P-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-A564S-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-H565A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-I566E-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-I566A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-W567A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-P568A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D569E-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D569A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D570A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-I571A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T572A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-K573A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-W574A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-P575A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-I576A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-C577A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T578A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-E579K-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-E579A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-Q580N-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-Q580A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-A581S-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-R582A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-S583G-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-S583A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-N584A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-H585A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T586A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-G587N-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-G587A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-F588H-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-F588A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-L589P-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-L589A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-H590A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-M591A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D592A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-C593A-T7和MEF-DKO-hiR2-FL-E594V-T7细胞，洗涤并重悬于FACS缓冲液(PBS，3％FBS，0.05％叠氮化钠)中，并以每孔大约1x105个细胞接种于NuncU形底96孔板(Thermo Fisher Scientific，USA)中。为了沉淀细胞并去除上清液，将板在1,500rpm、4℃下离心3分钟。对于第一次染色，将细胞重悬于每孔100μl的单独FACS缓冲液(对照)或在FACS缓冲液中的3μg/ml的小鼠单克隆抗T7 IgG(Merck Millipore，USA)中并在冰上孵育1小时。之后，将板在1,500rpm和4℃下离心3分钟并用每孔200μl的FACS缓冲液洗涤两次。对于第二次染色，将细胞离心并重悬于每孔100μl的用FACS缓冲液以1:100稀释的PE缀合的山羊抗小鼠IgG F(ab')2检测片段(Dianova，德国)中。避光，将细胞悬浮液在冰上孵育1小时。然后将板在1,500rpm和4℃下离心3分钟并用每孔200μl的FACS缓冲液洗涤三次。最后，将细胞重悬于每孔150μl的FACS缓冲液中并使用BD AccuriTM C6 Plus流式细胞仪(BectonDickinson，德国)进行分析。
图16a示出了本实验的代表性结果，示例性地针对人iRhom2变体hiR2-FL-K536A-T7。抗T7标记抗体(黑色)和抗小鼠IgG二抗(灰色)对MEF-DKO-hiR2-FL-WT-T7(左)和MEF-DKO-hiR2-FL-K536A-T7细胞(右)的结合分析揭示了相对荧光强度较强增加。这表明，与人iRhom2野生型(左)相似，人iRhom2变体hiR2-FL-K536A-T7也得到了很好地表达并位于这些细胞的表面(右)。获取在MEF-DKO-hiR2-FL-Q502R-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-N503A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D504A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-H505R-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-H505A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-S506A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-G507A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-C508A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-I509V-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-I509A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-Q510A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T511A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-Q512L-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-Q512S-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-Q512A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-R513K-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-R513E-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-R513A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-K514E-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-K514A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D515E-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D515A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-C516A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-S517A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-E518S-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-E518A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T519A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-L520A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-A521S-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T522V-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T522A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-F523W-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-F523A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-V524A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-K525A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-W526A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-Q527P-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-Q527A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D528N-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D528I-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D528A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D529H-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D529A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T530P-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T530A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-G531S-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-G531A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-P532A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-P533--T7、MEF-DKO-hiR2-FL-P533A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-M534S-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-M534--T7、MEF-DKO-hiR2-FL-M534A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D535--T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D535A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-K536--T7、MEF-DKO-hiR2-FL-K536A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-S537E-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-S537A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D538L-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D538A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-L539A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-G540S-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-G540A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-Q541H-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-Q541A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-K542A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-R543Q-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-R543A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T544P-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T544Q-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T544A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-S545F-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-S545A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-G546A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-A547V-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-A547S-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-V548A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-C549A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-H550A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-Q551A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D552A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-P553A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-R554A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T555V-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T555A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-C556A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-E557D-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-E557A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-E558A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-P559A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-A560S-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-S561A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-S562E-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-S562A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-G563D-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-G563A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-A564P-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-A564S-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-H565A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-I566E-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-I566A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-W567A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-P568A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D569E-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D569A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D570A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-I571A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T572A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-K573A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-W574A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-P575A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-I576A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-C577A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T578A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-E579K-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-E579A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-Q580N-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-Q580A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-A581S-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-R582A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-S583G-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-S583A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-N584A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-H585A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T586A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-G587N-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-G587A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-F588H-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-F588A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-L589P-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-L589A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-H590A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-M591A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D592A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-C593A-T7和MEF-DKO-hiR2-FL-E594V-T7细胞上表达的人iRhom2全长单氨基酸取代的表达和定位的相似的结果。
测试系统验证的TGFαELISA
为了测试具有单氨基酸取代或缺失的所有137个人iRhom2变体，对稳定表达这些变体(如上述实施例所述而生成的)的相应的MEF-DKO细胞系进行TGFα脱落ELISA分析。为了表明作为指示剂的所有变体(这些变体被正确折叠)的功能性，对PMA诱导的受核影响的TGFα的释放进行评估。由于本分析中使用的细胞为iRhom1/2-/-双敲除小鼠胚胎成纤维细胞(实施例2中所述)的拯救变体，其被具有单氨基酸取代或缺失的相应的人iRhom2变体拯救，稳定表达的iRhom2变体是仅表达在这些细胞中的iRhom蛋白，因此是对这些细胞中脱落TGFα唯一有贡献的iRhom。
简言之，在第1天，将Nunc black96孔板(Thermo Fisher Scientific，USA)在4℃用每孔100μl的TBS中的400ng/ml小鼠抗人TGFα抗体(作为DuoSet ELISA试剂盒的一部分提供)包被过夜。采用4D-Nucleofector系统(Lonza、瑞士)，用在pcDNA3.1载体骨架中的hTGFα-FL-WT构建体电穿孔MEF-DKO-hiR2-FL-Q502R-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-N503A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D504A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-H505R-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-H505A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-S506A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-G507A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-C508A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-I509V-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-I509A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-Q510A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T511A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-Q512L-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-Q512S-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-Q512A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-R513K-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-R513E-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-R513A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-K514E-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-K514A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D515E-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D515A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-C516A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-S517A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-E518S-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-E518A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T519A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-L520A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-A521S-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T522V-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T522A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-F523W-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-F523A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-V524A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-K525A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-W526A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-Q527P-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-Q527A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D528N-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D528I-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D528A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D529H-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D529A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T530P-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T530A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-G531S-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-G531A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-P532A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-P533--T7、MEF-DKO-hiR2-FL-P533A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-M534S-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-M534--T7、MEF-DKO-hiR2-FL-M534A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D535-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D535A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-K536-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-K536A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-S537E-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-S537A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D538L-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D538A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-L539A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-G540S-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-G540A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-Q541H-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-Q541A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-K542A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-R543Q-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-R543A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T544P-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T544Q-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T544A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-S545F-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-S545A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-G546A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-A547V-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-A547S-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-V548A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-C549A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-H550A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-Q551A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D552A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-P553A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-R554A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T555V-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T555A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-C556A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-E557D-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-E557A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-E558A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-P559A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-A560S-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-S561A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-S562E-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-S562A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-G563D-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-G563A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-A564P-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-A564S-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-H565A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-I566E-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-I566A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-W567A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-P568A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D569E-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D569A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D570A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-I571A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T572A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-K573A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-W574A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-P575A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-I576A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-C577A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T578A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-E579K-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-E579A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-Q580N-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-Q580A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-A581S-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-R582A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-S583G-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-S583A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-N584A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-H585A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T586A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-G587N-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-G587A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-F588H-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-F588A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-L589P-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-L589A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-H590A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-M591A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D592A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-C593A-T7和MEF-DKO-hiR2-FL-E594V-T7细胞，然后将携带具有单氨基酸取代或缺失的人iRhom2变体的约33,000个MEF-DKO细胞接种于F形底96孔细胞培养板(Thermo Fisher Scientific，USA)的每个孔中的100μl正常生长培养基中。在第2天，去除捕获抗体溶液并且将板在室温下用每孔300μl TBS、1％BSA封闭至少1小时。同时，将细胞用PBS洗涤一次，之后，每孔添加80μl OptiMEM培养基(Thermo Fisher Scientific,USA)。
随后，在37℃、5％CO2下，用每孔20μl PMA(Sigma-Aldrich,USA)(终浓度为25ng/ml)刺激细胞(除了未刺激的对照的那些)1小时。将20μl OptiMEM培养基添加至未刺激的对照细胞中。之后，将96孔板离心以沉淀细胞。与此同时，将封闭缓冲液从板中去除并在96头洗板机上将板用每孔350μl的TBS-T(Carl Roth,德国)洗涤4次。为了避免干掉，立即将30μl的TBS添加至板的每个孔中，然后每个样本转移70μl无细胞上清液。此后，每孔添加100μl TBS中的37.5ng/ml生物素化羊抗人TGFα检测抗体(作为DuoSetELISA试剂盒的一部分提供)，并避直射光，将板在室温下孵育2小时。在96头洗板机(TecanGroup,瑞士)上用每孔350μl TBS-T(Carl Roth,德国)洗涤4次并在第四次循环后小心去除所有缓冲液痕量后，将用TBS以1:10,000稀释的100μl链霉亲和素-AP(R&D Systems,USA)添加至每个孔中，并且再次避直射光，将板在室温下孵育30分钟。在又一轮的在96头洗板机(Tecan Group,瑞士)上每孔用350μl TBS-T(Carl Roth,德国)洗涤4次并且在第四次循环后小心去除所有缓冲液痕量后，每孔加入100μl AttoPhos底物溶液(Promega,USA)以在室温下暗处孵育1小时。使用infinite M1000(Tecan Group,瑞士)酶标仪，在435nm的激发波长处和555nm的发射波长处收集每个孔的荧光。
图16b示出了这些TGFα释放测定的结果，表明具有单氨基酸取代或缺失的所有137个人iRhom2变体中的128个呈功能活性，因为TGFα脱落可以用PMA诱导，这说明与空载体电穿孔(Mock)阴性对照群体相比，这些变体被恰当地折叠，其中未检测到PMA诱导的TGFα脱落。人iRhom2变体hiR2-FL-C516A-T7、hiR2-FL-F523A-T7、hiR2-FL-C549A-T7、hiR2-FL-D552A-T7、hiR2-FL-C556A-T7、hiR2-FL-P559A-T7、hiR2-FL-W567A-T7、hiR2-FL-W574A-T7和hiR2-FL-C577A-T7显示出没有或几乎没有功能性，因此不进行进一步分析。
表征本发明纯化的抗体以用于表位作图的FACS分析
简言之，用含10mM EDTA的PBS收获永生化MEF-DKO-hiR2-FL-Q502R-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-N503A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D504A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-H505R-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-H505A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-S506A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-G507A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-C508A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-I509V-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-I509A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-Q510A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T511A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-Q512L-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-Q512S-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-Q512A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-R513K-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-R513E-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-R513A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-K514E-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-K514A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D515E-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D515A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-C516A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-S517A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-E518S-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-E518A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T519A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-L520A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-A521S-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T522V-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T522A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-F523W-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-F523A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-V524A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-K525A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-W526A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-Q527P-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-Q527A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D528N-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D528I-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D528A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D529H-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D529A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T530P-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T530A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-G531S-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-G531A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-P532A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-P533--T7、MEF-DKO-hiR2-FL-P533A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-M534S-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-M534--T7、MEF-DKO-hiR2-FL-M534A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D535--T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D535A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-K536--T7、MEF-DKO-hiR2-FL-K536A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-S537E-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-S537A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D538L-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D538A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-L539A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-G540S-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-G540A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-Q541H-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-Q541A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-K542A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-R543Q-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-R543A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T544P-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T544Q-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T544A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-S545F-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-S545A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-G546A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-A547V-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-A547S-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-V548A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-C549A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-H550A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-Q551A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D552A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-P553A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-R554A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T555V-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T555A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-C556A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-E557D-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-E557A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-E558A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-P559A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-A560S-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-S561A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-S562E-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-S562A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-G563D-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-G563A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-A564P-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-A564S-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-H565A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-I566E-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-I566A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-W567A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-P568A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D569E-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D569A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D570A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-I571A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T572A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-K573A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-W574A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-P575A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-I576A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-C577A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T578A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-E579K-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-E579A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-Q580N-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-Q580A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-A581S-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-R582A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-S583G-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-S583A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-N584A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-H585A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-T586A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-G587N-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-G587A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-F588H-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-F588A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-L589P-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-L589A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-H590A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-M591A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-D592A-T7、MEF-DKO-hiR2-FL-C593A-T7和MEF-DKO-hiR2-FL-E594V-T7细胞，洗涤，并重悬于FACS缓冲液(PBS，3％FBS，0.05％叠氮化钠)，并且以每孔约1x105个细胞接种于Nunc U形底96孔板(Thermo Fisher Scientific，USA)中。为了沉淀细胞并去除上清液，将板在1,500rpm、4℃下离心3分钟。对于第一次染色，将细胞重悬于每孔100μl的单独FACS缓冲液(对照)或在FACS缓冲液中3μg/ml的本发明的人源化抗体16-B-03、16-B-05、16-B-07、23-B-04、42-B-02和42-B-04中并在冰上孵育1小时。之后，将板在1,500rpm和4℃下离心3分钟并用每孔200μl的FACS缓冲液洗涤两次。对于第二次染色，将细胞离心并重悬于每孔100μl的用FACS缓冲液以1:100稀释的PE缀合的山羊抗人IgG F(ab')2检测片段(Dianova，德国)中。避光，将细胞悬浮液在冰上孵育1小时。然后将板在1,500rpm和4℃下离心3分钟并用每孔200μl的FACS缓冲液洗涤三次。最后，将细胞重悬于每孔150μl的FACS缓冲液中并使用BD AccuriTM C6 Plus流式细胞仪(Becton Dickinson，德国)进行分析。
图17a示出了本实验的代表性结果。示例性地，对于具有单氨基酸取代或缺失的128个功能性人iRhom2变体的整个组，显示了用于分析表达人iRhom1变体hiR2-FL-K536A-T7的细胞的数据。作为本发明抗体(黑色)的代表性示例的人源化抗体42-B-02以及抗小鼠IgG二抗(灰色)对MEF-DKO-hiR2-FL-WT-T7细胞(左)和MEF-DKO-hiR2-FL-K536A-T7细胞(右)的结合分析表明人iRhom2的单氨基酸赖氨酸536的取代被丙氨酸取代强烈损害，并且因此有助于本发明的人源化抗体42-B-02的结合(右)。与MEF-DKO-hiR2-FL-WT-T7细胞(左)的结合用作人源化抗体42-B-02的阳性对照。
图17b(作为图17a的延伸)汇总了本发明的人源化抗体16-B-03、16-B-05、16-B-07、23-B-04、42-B-02和42-B-04在128个表达具有单氨基酸取代或缺失的人iRhom2变体的工程化功能性MEF群的整个组上的FACS分析结果。每个抗体与人iRhom2野生型的结合被认为是100％的结合。浅灰色细胞(并且用“1”标记)表示抗体与任何变体的结合分别下降30-59％，灰色细胞(用“2”标记)表示结合受损60-95％，深灰色细胞(用“3”标记)突出显示结合损失≥95％。这些数据揭示了与本发明的人源化抗体16-B-03、16-B-05、16-B-07、23-B-04、42-B-02和42-B-04的结合相关的氨基酸位置的相关模式。
实施例15：本发明的抗体对LPS诱导的TNFα在来自健康供体的原代人材料中体外脱落的抑制效应的分析
在以下研究中，进行基于ELISA的TNFα释放测定以使用外周血单个核细胞(PBMC)分析本发明的抗体对LPS诱导的内源性TNFα从获自健康供体的原代人类材料释放的抑制效应。
下面将描述在本实施例中使用的基于ELISA的TNFα释放测定。
简言之，在第1天，将Nunc black96孔板(Thermo Fisher Scientific，USA)在4℃的4μg/ml TBS中用每孔100μl的小鼠抗人TGFα捕获抗体(作为DuoSet ELISA试剂盒的一部分提供)包被过夜。在第2天，去除捕获抗体溶液并且板在室温下用每孔300μl的TBS、1％BSA封闭3小时。同时，将80μl正常生长培养基中的来自健康供体的20,000个PBMC(20,000PBMC)细胞接种于Greiner CELLSTAR V形底96孔板(Greiner Bio-One,德国)的每个孔中并在37℃、5％CO2下与每孔20μl标准生长培养基一起预孵育30分钟，该培养基补充有作为阳性对照的50μM巴马司他(BB94，Abcam，UK)(在所得的100μl样本体积中的终浓度为10μM)、作为同种型对照的15μg/ml人IgG1κ抗体(BioLegend，USA)(在所得的100μl样本体积中的终浓度为3μg/ml)或本发明的15μg/ml抗体(在所得的100μl样本体积中的终浓度为3μg/ml)。在刺激对照的情况下，添加不含供试品的20μl标准生长培养基。随后，在37℃、5％CO2下，在生长培养基中用每孔20μl的0,06ng/ml LPS(Sigma-Aldrich,USA)刺激细胞(除了未刺激对照的那些)2小时。之后，将96孔板离心以沉淀细胞。与此同时，将封闭缓冲液从板中去除并在96头洗板机上将板用每孔350μl的TBS-T(Carl Roth,德国)洗涤4次。为了避免干掉，立即将30μl的TBS添加至板的每个孔中，然后每个样本转移70μl无细胞上清液。此外，将用TBS以限定浓度稀释的100μl重组人TNFα蛋白(作为DuoSet ELISA试剂盒的一部分提供)添加至板中作为标准参照物。之后，每个孔添加100μl、浓度为50ng/ml的TBS的生物素化山羊抗人TNFα检测抗体(作为DuoSet ELISA试剂盒的一部分提供)，并且避直射光，将板在室温下孵育2小时。在96头洗板机(Tecan Group,瑞士)上用每孔350μl TBS-T(Carl Roth,德国)洗涤4次并在第四次循环后小心去除所有缓冲液痕量后，将用TBS以1:10,000稀释的100μl链霉亲和素-AP(R&D Systems,USA)添加至每个孔中，并且再次避直射光，将板在室温下孵育30分钟。在又一轮的96头洗板机(Tecan Group,瑞士)上用每孔350μl TBS-T(Carl Roth,德国)洗涤4次并在第四次循环后小心去除所有缓冲液痕量后，每孔添加100μlAttoPhos底物溶液(Promega,USA)以用于在室温下暗处孵育1小时。使用infinite M1000(Tecan Group,瑞士)酶标仪，在435nm的激发波长处和555nm的发射波长处收集每个孔的荧光。
图18示出了本实验的代表性结果，以绝对数(图18a)和抑制百分比(图18b)表明供试品对LPS诱导的TGFα从来自健康总体的PBMC释放的影响。虽然作为金属蛋白酶的小分子抑制剂的巴马司他(BB94)用作阳性对照，并导致98.9％的LPS诱导的TNFα释放的抑制，但IgG同种型对照的存在对TNFα脱落没有显著影响。相反地，相等浓度的本发明的人源化抗体16-B-03、16-B-05、16-B-07、23-B-04、42-B-02和42-B-04对LPS诱导的TNFα从来自健康供体的PBMC释放的抑制分别为74.2％、73.5％、72.8％、59.4％、64.3％和68.5％。
实施例16：本发明抗体对PMA诱导的IL-6R在来自健康供体的原代人材料中体外脱落的抑制效应的分析
在以下研究中，进行基于ELISA的IL-6R释放测定以使用外周血单个核细胞(PBMC)分析本发明抗体对PMA诱导的内源性IL-6R从获自健康供体的原代人材料释放的抑制效应。
下面将描述本实施例中使用的基于ELISA的IL-6R释放测定。
简言之，在第1天，将Nunc black96孔板(Thermo Fisher Scientific，USA)在4℃用每孔100μl的TBS中2μg/ml小鼠抗人TGFα捕获抗体(作为DuoSet ELISA试剂盒的一部分提供)包被过夜。
将80μl正常生长培养基中的来自健康供体的40,000个PBMC(STEMCELLTechnologies,加拿大)细胞接种于Greiner CELLSTAR V形底96孔细胞培养板(GreinerBio-One,德国)的每个孔中并在37℃、5％CO2下与每孔20μl标准生长培养基一起预孵育30分钟，该培养基补充有作为阳性对照的50μM巴马司他(BB94，Abcam，UK)(在所得的100μl样本体积中的终浓度为10μM)、作为同种型对照的15μg/ml人IgG抗体(BioLegend，USA)(在所得的100μl样本体积中的终浓度为3μg/ml)或15μg/ml本发明的抗体(在所得的100μl样本体积中的终浓度为3μg/ml)。在刺激对照的情况下，添加不含供试品的20μl标准生长培养基。随后，在37℃、5％CO2下，在生长培养基中用每孔20μl的150ng/ml PMA(Sigma-Aldrich,USA)(终浓度为25ng/ml)刺激细胞(除了未刺激的对照的那些)24小时。
在第2天，去除捕获抗体溶液并将板在室温下用每孔300μlTBS、1％BSA封闭2小时。
同时，将96孔板离心以沉淀细胞。与此同时，将封闭缓冲液从板中去除并在96头洗板机上将板用每孔350μl的TBS-T(Carl Roth,德国)洗涤4次。为了避免干掉，立即将30μl的TBS添加至板的每个孔中，然后每个样本转移70μl无细胞上清液。此外，将用TBS以限定浓度稀释的100μl重组人IL-6R蛋白(作为DuoSet ELISA试剂盒的一部分提供)添加至板中作为标准参照物。将板在室温下孵育2小时。在96头洗板机(Tecan Group,瑞士)上用每孔350μl TBS-T(Carl Roth,德国)洗涤4次并在第四次循环后小心去除所有缓冲液痕量后，每孔添加100μl 100ng/ml TBS的生物素化羊抗人IL-6R检测抗体(作为DuoSetELISA试剂盒的一部分提供)，并且避直射光，将板在室温下孵育2小时。在96头洗板机(Tecan Group,瑞士)上用每孔350μl TBS-T(Carl Roth,德国)洗涤4次并在第四次循环后小心去除所有缓冲液痕量后，将用TBS以1:10,000稀释的100μl链霉亲和素-AP(R&DSystems,USA)添加至每个孔中，并且再次避直射光，将板在室温下孵育30分钟。在又一轮的96头洗板机(Tecan Group,瑞士)上用每孔350μlTBS-T(Carl Roth,德国)洗涤4次并在第四次循环后小心去除所有缓冲液痕量后，每孔添加100μlAttoPhos底物溶液(Promega,USA)以用于在室温下暗处孵育1小时。使用infinite M1000(Tecan Group,瑞士)酶标仪，在435nm的激发波长处和555nm的发射波长处收集每个孔的荧光。
图19示出了本实验的代表性结果，以绝对数(图19a)和抑制百分比(图19b)表明供试品对PMA诱导的IL-6R从来自健康供体的PBMC释放IL-6R的影响。虽然作为金属蛋白酶的小分子抑制剂的巴马司他(BB94)用作阳性对照，并导致96.2％的PMA诱导的IL-6R释放的抑制，但IgG同种型对照的存在对IL-6R脱落没有显著影响。与之相比，相等浓度的本发明的人源化抗体16-B-03、16-B-05、16-B-07、23-B-04、42-B-02和42-B-04对PMA诱导的IL-6R从来自健康供体的PBMC释放的抑制分别为75.0％、79.0％、75.4％、64.6％、73.4％和78.4％。
实施例17：本发明抗体对PMA诱导的HB-EGF在来自健康供体的原代人材料中体外脱落的抑制效应的分析
在以下研究中，进行基于ELISA的HB-EGF释放测定以使用外周血单个核细胞(PBMC)分析本发明抗体对PMA诱导的内源性HB-EGF从获自健康供体的原代人材料的释放的抑制效应。
下面将描述本实施例中使用的基于ELISA的HB-EGF释放测定。
简言之，在第1天，将Nunc black96孔板(Thermo Fisher Scientific，USA)在4℃用每孔100μl的2μg/ml TBS中的小鼠抗人HB-EGF捕获抗体(作为DuoSet ELISA试剂盒的一部分提供)包被过夜。
将80μl正常生长培养基中的来自健康供体的80,000个PBMC(STEMCELLTechnologies,加拿大)细胞接种于Greiner CELLSTAR V形底96孔细胞培养板(GreinerBio-One,德国)的每个孔中并在37℃、5％CO2下与每孔20μl标准生长培养基预孵育30分钟，该培养基补充有作为阳性对照的50μM巴马司他(BB94，Abcam，UK)(在所得的100μl样本体积中的终浓度为10μM)、作为同种型对照的15μg/ml人IgG抗体(BioLegend，USA)(在所得的100μl样本体积中的终浓度为3μg/ml)或15μg/ml本发明的抗体(在所得的100μl样本体积中的终浓度为3μg/ml)。在刺激对照的情况下，添加不含供试品的20μl标准生长培养基。随后，在37℃、5％CO2下，在生长培养基中用每孔20μl的150ng/ml PMA(Sigma-Aldrich,USA)(终浓度为25ng/ml)刺激细胞(除了未刺激的对照的那些)24小时。在第2天，去除捕获抗体溶液并将板在室温下用每孔300μlTBS、1％BSA封闭2小时。
同时，将96孔板离心以沉淀细胞。与此同时，将封闭缓冲液从板中去除并在96头洗板机上将板用每孔350μl的TBS-T(Carl Roth,德国)洗涤4次。为了避免干掉，立即将30μl的TBS添加至板的每个孔中，然后每个样本转移70μl无细胞上清液。此外，将用TBS以限定浓度稀释的100μl重组人HB-EGF蛋白(作为DuoSet ELISA试剂盒的一部分提供)添加至板中作为标准参照物。将板在室温下孵育2小时。在96头洗板机(TecanGroup,瑞士)上用每孔350μl TBS-T(Carl Roth,德国)洗涤4次并在第四次循环后小心去除所有缓冲液痕量后，每孔添加100μl 50ng/ml TBS中的生物素化羊抗人HB-EGF检测抗体(作为DuoSet ELISA试剂盒的一部分提供)，避直射光，将板在室温下孵育2小时。
在96头洗板机(Tecan Group,瑞士)上用每孔350μl TBS-T(Carl Roth,德国)洗涤4次并在第四次循环后小心去除所有缓冲液痕量后，将用TBS以1:10,000稀释的100μl链霉亲和素-AP(R&D Systems,USA)添加至每个孔中，并且再次避直射光，将板在室温下孵育30分钟。在又一轮的96头洗板机(Tecan Group,瑞士)上用每孔350μl TBS-T(Carl Roth,德国)洗涤4次并在第四次循环后小心去除所有缓冲液痕量后，每孔添加100μlAttoPhos底物溶液(Promega,USA)以用于在室温下暗处孵育1小时。使用infinite M1000(Tecan Group,瑞士)酶标仪，在435nm的激发波长处和555nm的发射波长处收集每个孔的荧光。
图20示出了本实验的代表性结果，以绝对数(图20a)和抑制百分比(图20b)表明供试品对PMA诱导的HB-EGF从来自健康供体的PBMC释放的影响。虽然将作为金属蛋白酶的小分子抑制剂的巴马司他(BB94)用作阳性对照并且其100.0％抑制了PMA诱导的HB-EGF释放，但是IgG同种型对照的存在对HB-EGF脱落没有显著影响。与之相比，相等浓度的本发明的人源化抗体16-B-03、16-B-05、16-B-07、23-B-04、42-B-02和42-B-04对PMA诱导的HB-EGF从来自健康供体的PBMC释放的抑制分别为69.7％、74.8％、66.5％、49.6％、59.2％和66.7％。
实施例18：本发明抗体对LPS诱导的TNFα体内脱落的抑制效应的分析
在以下研究中，在感染性休克小鼠模型中进行基于ELISA的TNFα释放测定以验证本发明的抗体对LPS诱导的内源性TNFα释放的抑制效应。使用基因上人源化小鼠进行实验，其中部分小鼠基因组iRhom2DNA(编码抗体结合位点的外显子)被相应的人基因组DNA序列替换。所有的动物实验均是经特殊外科医院和威尔康奈尔医学院的机构动物护理和使用委员会批准的。
在第1天，将一组小鼠在200μL PBS中以250μg/kg的浓度注射本发明的抗体。第二组仅注射相同体积的PBS(每只小鼠200μl PBS)。1h后，将所有小鼠以每只小鼠50μg/200μL(250ng/μL)的浓度注射LPS(Sigma，USA)。对所有小鼠进行密切监测，并在2小时后通过吸入CO2对其实施安乐死。从胸腔中取出血液，并在室温下以4000g离心10min以去除细胞和碎片。将透明的血清转移到新的试管中，随后用PBS以1:10稀释以用于ELISA测量。
对于测量TNFα释放，使用小鼠TNFα未涂覆ELISA试剂盒(Invitrogen，USA)。简言之，在第1天，96孔板(Corning，USA)在4℃的PBS中以1:250用每孔100μl的抗小鼠TGFα捕获抗体(作为ELISA试剂盒的一部分提供)包被过夜。在第2天，去除捕获抗体溶液，使用Nunc Immunowash洗板机(VWR，USA)用每孔250μl 0.05％PBS-吐温(Boston Bio,USA)洗涤96孔板3次，并用150μl ELISA/ELISPOT稀释液(1X)(作为试剂盒的一部分提供)将板封闭1小时。然后，从板中去除封闭缓冲液，并使用Nunc Immunowash洗板机(VWR，USA)用每孔250μl 0.05％PBS-吐温(Boston Bio,USA)洗涤96孔板3次。之后，立即在将ELISA/ELISPOT稀释液中以终稀释度为1:250的20μl生物素化抗小鼠TNFα检测抗体(作为ELISA试剂盒的一部分提供)添加至所有孔中。然后，将80μl透明的以1:10稀释的血清或在限定浓度的ELISA/ELISPOT稀释液中稀释的80μl重组小鼠TNFα蛋白的标准参照物添加至板中。室温下将样本、标准物和检测抗体孵育2h。在使用Nunc Immunowash洗板机(VWR，USA)用每孔250μl 0.05％PBS-吐温(Boston Bio,USA)洗涤3次并在第三次循环后小心去除所有缓冲液痕量后，将在ELISA/ELISPOT稀释液中以1:100稀释的100μl链霉亲和素-辣根过氧化物酶缀合物(作为ELISA试剂盒的一部分提供)添加至每个孔中，并且将板在室温下孵育30分钟。在又一轮的使用Nunc Immunowash洗板机(VWR，USA)用每孔250μl 0.05％ PBS-吐温洗涤3次并且在第三次循环后小心去除所有缓冲液痕量后，每孔加入100μl TMB底物溶液(BD，USA)以孵育15分钟。通过添加100μl 2N硫酸(Sigma，USA)来阻止显色反应，并使用Multiscan Titertek读板仪(VWR，USA)在450nm波长处读取ELISA板。
图21示出了本实验的代表性结果，以绝对数(图21a)和释放百分比(图21b)表明供试品对LPS诱导的TNFα在基因人源化小鼠的血清中的释放的影响。与LPS诱导的TNFα在基因人源化小鼠的血清中的释放(设置为100％)相比，作为本发明抗体的代表性示例的人源化抗体42-B-02导致在基因人源化小鼠的血清中TNFα被LPS诱导释放了17.3％。
参考文献
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·Kabat等人,J.Biol.Chem.252、6609-6616(1977)和Kabat等人,Sequences ofprotein of immunological interest.(1991)
·Chothia等人,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)
·MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996)
·Paul Baran等人,Biol Chem.2013May 24；288(21):14756-14768.
序列
以下序列形成本申请公开内容的一部分。本申请还提供了一份与WIPOST 25兼容的电子序列表。为免生疑问，如果下表中的序列与电子序列表之间存在差异，则应认为本表中的顺序是正确的。
Claims (20)
1.一种结合iRhom2的人源化抗体，或其保留靶结合能力的靶结合片段或衍生物，其
a)包含一组三个重链互补决定区(CDR)和三个轻链互补决定区(CDR)，所述互补决定区包含在以下重链/轻链可变结构域序列对的一者中：
·SEQ ID NO 1和5；
·SEQ ID NO 9和13；
·SEQ ID NO 17和21；
·SEQ ID NO 25和29；
·SEQ ID NO 33和37或
·SEQ ID NO 41和45，
b)包含选自以下的一组三个重链互补决定区(CDR)和三个轻链互补决定区(CDR)，·SEQ ID NO 2、3、4、6、7和8，
·SEQ ID NO 10、11、12、14、15和16，
·SEQ ID NO 18、19、20、22、23和24，
·SEQ ID NO 26、27、28、30、31和32，
·SEQ ID NO 34、35、36、38、39和40，或
·SEQ ID NO 42、43、44、46、47和48，
c)包含b)的重链/轻链互补决定区(CDR)组，条件是所述CDR中的至少一者相对于相应的SEQ ID NO具有最多3个氨基酸取代，和/或
d)包含b)或c)的重链/轻链互补决定区(CDR)组，条件是所述CDR中的至少一者与包含在所述SEQ ID NO中的相应的CDR具有≥66％的序列相同性，
其中所述CDR包埋在合适的蛋白框架内，优选地可变结构域框架，以便能够与人iRhom2结合。
2.根据权利要求1所述的抗体或片段，其中所述CDR是根据Kabat、Chothia或MacCallum的定义确定的，优选地其中所述CDR是根据表1中所述的编号确定的。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的抗体或片段，其包含
a)以下SEQ ID NO对所示的重链/轻链可变结构域(HCVD/LCVD)对：
·1和5；
·9和13；
·17和21；
·25和29；
·33和37和/或
·41和45
b)a)的重链/轻链可变结构域(HCVD/LCVD)对，条件是
·所述HCVD与相应的SEQ ID NO具有≥80％的序列相同性，和/或
·所述LCVD与相应的SEQ ID NO具有≥80％的序列相同性，
c)a)或b)的重链/轻链可变结构域(VD)对，条件是HCVD或LCVD中的至少一者相对于相应的SEQ ID NO具有最多10个氨基酸取代，
所述抗体或片段仍然能够与人iRhom2结合和/或抑制或降低TACE/ADAM17活性。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体或片段，其中至少一个氨基酸取代是保守性氨基酸取代。
5.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或片段，所述抗体或片段具有以下中的至少一者：
·与根据前述权利要求中任一项所述的抗体或片段相比，对人iRhom2≥50％的靶结合亲和力，和/或
·≥50％的根据前述权利要求中任一项所述的抗体或片段对TACE/ADAM17活性的抑制或降低效应。
6.一种人源化抗体，其与人iRhom2结合并与以下项竞争与人iRhom2的结合：
a)根据权利要求1-5中任一项所述的抗体，或
b)选自由克隆16-B-03；16-B-05；16-B-07；23-B-04；42-B-02；和/或42-B-04组成的组的抗体。
7.一种人源化抗体，其与以下项结合基本上相同、或相同的人iRhom2上的区域：
a)根据权利要求1-5中任一项所述的抗体，或
b)选自由克隆16-B-03；16-B-05；16-B-07；23-B-04；42-B-02；和/或42-B-04组成的组的抗体。
8.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或片段，其在与人iRhom2结合时至少在人iRhom2的环1的区域内结合。
9.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或片段，其中TACE/ADAM17活性的抑制或降低是由干扰iRhom2介导的TACE/ADAM17激活引起的。
10.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或片段，其在与人iRhom2结合时，
·抑制或降低诱导的TNFα脱落，和/或
·抑制或降低诱导的IL-6R脱落，和/或
·抑制或降低诱导的HB-EGF脱落。
11.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或片段，其中所述抗体或片段所结合的所述人iRhom2包含
a)SEQ ID NO 49所示的氨基酸序列，或
b)与SEQ ID NO 49具有至少80％序列相同性的氨基酸序列，条件是所述序列保持iRhom2活性。
12.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或片段，其为单克隆抗体，或其保留靶结合能力的靶结合片段或衍生物。
13.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或片段，其为选自由以下组成的组的形式中的至少一者：IgG、scFv、Fab、或(Fab)2。
14.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或片段，其不与人iRhom1交叉反应。
15.编码根据前述权利要求中任一项所述的抗体或片段的至少一条链的核酸。
16.根据权利要求1-14中任一项所述的抗体或片段或根据权利要求15所述的核酸(在制备)用于治疗
·被诊断出炎性病况，
·患有炎性病况或
·处于发展炎性病况的风险的人或动物对象或者用于预防此类病况的(药物中的)用途。
17.一种药物组合物，包含根据权利要求1-14中任一项所述的抗体或片段或根据权利要求15所述的核酸，以及任选地一种或多种药学上可接受的赋形剂。
18.一种组合，包含(i)根据权利要求1-14中任一项所述的抗体或片段或根据权利要求15所述的核酸，或根据权利要求17所述的药物组合物和(ii)一种或多种治疗活性化合物。
19.一种用于治疗或预防炎性病况的方法，所述方法包括以治疗上足够的剂量向人或动物对象施用根据权利要求1-14中任一项所述的抗体或片段、根据权利要求15所述的核酸、根据权利要求17所述的药物组合物或根据权利要求18所述的组合。
20.一种治疗试剂盒，包含：
a)根据权利要求1-14中任一项所述的抗体或片段、根据权利要求15所述的核酸、根据权利要求17所述的药物组合物或根据权利要求18所述的组合，
b)用于施用所述组合物、组合物或组合的装置，以及
c)使用说明书。
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