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CN117144067A - 用于多重化核酸检测的组合物和方法 - Google Patents

用于多重化核酸检测的组合物和方法 Download PDF

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CN117144067A
CN117144067A CN202311421114.9A CN202311421114A CN117144067A CN 117144067 A CN117144067 A CN 117144067A CN 202311421114 A CN202311421114 A CN 202311421114A CN 117144067 A CN117144067 A CN 117144067A
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cases
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赵颖
奕巧莲
徐英春
郭莉娜
李响
冯慧颖
于政升
杨坤
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Beijing Kayudi Biotechnology Co ltd
Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
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Beijing Kayudi Biotechnology Co ltd
Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
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Abstract

本申请提供了用于多重化核酸检测的组合物和方法，特别是用于分析物检测的系统、方法、组合物和试剂盒。所述系统、方法、组合物和试剂盒可以允许多种分析物的多重分析。本申请提供的组合物包含用于实施所述方法的各种探针、酶、标记物部分、淬灭剂部分或引物。此外，本申请提供了用于分析物检测的分析方法以及用于实施该方法的装置和/或系统。

Description

用于多重化核酸检测的组合物和方法
技术领域
本申请涉及核酸检测。更具体而言，本申请提供了用于多重化核酸检测的组合物和方法。
背景技术
分析物检测在分子生物学和医学领域具有多种应用。例如，核酸检测提供用于诊断疾病状况的信息，以预防或控制人群中的疾病传播。此外，核酸检测还可以有助于诊断或预测对象的某种病状，以促进疗法和治疗设计。尽管分子生物学技术有所进步，但目前的分析物检测方法缺乏效率、模块性和/或准确性；费力；和/或耗时。
发明内容
本申请提供了用于分析物检测的方法、组合物和系统。本申请提供的方法、组合物和系统可以允许多种核酸的多重检测。这些方法、组合物和系统也是模块化的，因此提供了分析各种类型或亚型的分析物的统一平台。此外，相对于现有的对应物，该方法、组合物和系统可以被优化以提高准确度和速度。因为本申请提供的方法、组合物和系统是简化的，所以它们只需要很少的工作就可以实现。
本申请提供了组合物。在一方面，组合物包含至少一种探针，其中探针包含与SEQID NO: 1-12中任一者的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸。
在一些实施方案中，组合物包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12种探针。在一些实施方案中，组合物包含4种探针。在一些实施方案中，4种探针包含4种多核苷酸，所述多核苷酸与以下序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%的序列同一性：（a）SEQID NO: 1、4、7和10；（b）SEQ ID NO: 2、5、8和11；或（c）SEQ ID NO: 3、6、9和12。在一些实施方案中，组合物包含第一探针，并且第一探针包含与SEQ ID NO: 1-3中任一者的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，组合物还包含：（a）第二探针，所述第二探针包含与SEQ ID NO: 13-15中任一者的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸；（b）第三探针，所述第三探针包含与SEQ ID NO: 35-37中任一者的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸；或（c）它们的组合。在一些实施方案中，其中：（a）当第一探针包含与SEQ ID NO: 1的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸时，组合物还包含第四探针，所述第四探针包含与SEQ ID NO: 57-58中任一者的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸；（b）当第一探针包含与SEQ ID NO: 2的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸时，组合物还包含第四探针，所述第四探针包含与SEQ IDNO: 59-60中任一者的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸；或（c）当第一探针包含与SEQ ID NO: 3的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸时，组合物还包含第四探针，所述第四探针包含与SEQ ID NO: 61-62中任一者的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，组合物包含第一探针，并且第一探针包含与SEQID NO: 4-6中任一者的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，组合物还包含：（a）第二探针，所述第二探针包含与SEQ IDNO: 16-18中任一者的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸；（b）第三探针，所述第三探针包含与SEQ ID NO: 38-40中任一者的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸；或（c）它们的组合。在一些实施方案中，其中：（a）当第一探针包含与SEQ ID NO: 4的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸时，组合物还包含第四探针，所述第四探针包含与SEQ ID NO: 63-64中任一者的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸；（b）当第一探针包含与SEQ ID NO: 5的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸时，组合物还包含第四探针，所述第四探针包含与SEQ ID NO: 65-66中任一者的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸；或（c）当第一探针包含与SEQ ID NO: 6的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸时，组合物还包含第四探针，所述第四探针包含与SEQ ID NO: 67-68中任一者的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，组合物包含第一探针，并且第一探针包含与SEQ ID NO: 7-9中任一者的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，组合物还包含：（a）第二探针，所述第二探针包含与SEQ ID NO: 19-21中任一者的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸；（b）第三探针，所述第三探针包含与SEQ IDNO: 41-43中任一者的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸；或（c）它们的组合。在一些实施方案中，其中：（a）当第一探针包含与SEQ IDNO: 7的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸时，组合物还包含第四探针，所述第四探针包含与SEQ ID NO: 69-70中任一者的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸；（b）当第一探针包含与SEQ ID NO: 8的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸时，组合物还包含第四探针，所述第四探针包含与SEQ ID NO: 71-72中任一者的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸；或（c）当第一探针包含与SEQ ID NO: 9的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸时，组合物还包含第四探针，所述第四探针包含与SEQ ID NO: 73-74中任一者的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，组合物包含第一探针，并且第一探针包含与SEQ ID NO: 10-12中任一者的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，组合物还包含：（a）第二探针，所述第二探针包含与SEQ ID NO: 22-24中任一者的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸；（b）第三探针，所述第三探针包含与SEQ ID NO: 44-46中任一者的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸；或（c）它们的组合。在一些实施方案中，其中：（a）当第一探针包含与SEQ ID NO: 10的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸时，组合物还包含第四探针，所述第四探针包含与SEQ IDNO: 75-76中任一者的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸；（b）当第一探针包含与SEQ ID NO: 11的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸时，组合物还包含第四探针，所述第四探针包含与SEQ ID NO: 77-78中任一者的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸；或（c）当第一探针包含与SEQ ID NO: 12的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸时，组合物还包含第四探针，所述第四探针包含与SEQ ID NO: 79-80中任一者的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸。
从以下详细描述中，本公开的另外的方面和优点对于本领域技术人员来说将变得显而易见，其中仅示出和描述了本公开的说明性实例。如将认识到的，本公开能够具有其他和不同的实例，并且其若干细节能够在各个明显方面进行修改，所有这些都不脱离本公开。因此，附图和说明书本质上被认为是说明性的，而非限制性的。
援引并入
在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本申请，如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体且单独地指明通过引用并入。就通过引用并入的出版物和专利或专利申请与本说明书中包含的公开内容相矛盾而言，本说明书旨在取代和/或优先于任何此类矛盾材料。
附图说明
本发明的新颖特征在所附权利要求中具体地阐述。通过参考以下阐述其中利用了本发明原理的说明性实施方案的详细描述以及附图（在本申请中还被称为“图”），将更好地理解本发明的特征和优点，在附图中：
图1描绘了本申请所述的方法的示例性工作流程。
图2描绘了本申请所述的方法的另一示例性工作流程。
具体实施方式
介绍
本申请提供了用于分析物检测的方法、组合物、装置、系统和试剂盒。该方法可以包括图1的工作流程100。在步骤101中，第一探针可以结合靶标分析物。在步骤102中，可以随后释放第一探针的片段或区段。释放的片段或区段随后可以在步骤103中结合第二探针，并在步骤104中产生可检测信号。本申请提供的组合物、装置、系统和试剂盒可以用于实施本申请所述的方法。如本申请使用的术语“分析物”通常指的是作为分析的对象的物体，或者是在本申请描述的方法的步骤期间直接或间接分析的物体，无论其是否是分析的对象。分析物可以是天然存在的。分析物可以是非天然存在的或合成的。分析物可以是，可以源自和/或可以衍生自样品，如生物样品。在一些实例中，分析物是核酸分子或包括核酸分子。分析物可以是如本申请所述的靶核酸分子。
在一方面，该方法可以包括图2的工作流程200。在步骤201中，介体探针（mediatorprobe）可以与靶核酸杂交。介体探针可以包括本申请所述的介体探针中的任何一种。在步骤202中，可以随后释放介体探针的片段或区段。在一些情况下，步骤202可以包括使用酶从介体探针释放所释放的片段或区段。释放的片段或区段可以随后在步骤203中与报告探针杂交，并且随后在步骤204中产生可检测的信号。报告探针可以包括本申请所述的报告探针中的任何一种。在一些情况下，步骤204中的可检测信号可以包括在如本申请所述的解链曲线分析中产生/检测的杂交信号或变性信号。
在一些情况下，在步骤201之前，任选的步骤201.1可以包括在扩增反应中扩增靶核酸。扩增可以包括至少一种引物。例如，扩增可以包括上游引物和/或下游引物。
在替代的工作流程200中，不执行步骤202-204。在这一替代的方法中，步骤201包括将冠状病毒或对照基因检测探针和/或如本申请所述的上游引物与靶核酸杂交。步骤202包括从检测探针的5’末端释放至少一个核苷酸，从而产生用于检测靶核酸的可检测信号。任选的步骤201.1可以如本申请所述来执行。
该方法（以及用于实施该方法的组合物、装置、系统和试剂盒）与现有的方法相比具有多种有益的优势。因为所述方法可以提供具有可以产生的各种可检测信号的各种信号检测机会，所以所述方法可以允许多重检测多于一种的靶核酸，如本申请所述。本申请提供的组合物、装置、系统和试剂盒可以用于实施本申请所述的方法。
如本申请所使用的，术语“核酸”、“核酸分子”、“核酸序列”、“核酸片段”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”通常是指可以具有不同长度的碱基的多核苷酸，包括例如脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核酸（DNA）、核糖核苷酸或核糖核酸（RNA）或其类似物。核酸可以是单链的。核酸可以是双链的。核酸可以是部分双链的，例如具有至少一个双链区和至少一个单链区。部分双链的核酸可以具有一个或多个突出区（overhanging region）。核酸可以包含核酸可以包含四个天然核苷酸碱基的序列：腺嘌呤（A）；胞嘧啶（C）；鸟嘌呤（G）；和胸腺嘧啶（T）（当核酸是RNA时，尿嘧啶（U）代替胸腺嘧啶（T））。核酸可以包括一个或多个非标准核苷酸、核苷酸类似物和/或经修饰的核苷酸。
如本申请所使用的，术语“杂交（hybridization/hybridizing）或“结合（在两个核酸分子之间）”是指互补的单链核酸分子形成双链核酸的过程。具有基本上互补性的两个核酸序列可以（彼此）杂交。两个核酸序列的杂交或退火所需的互补性程度取决于所使用的杂交条件（例如，温度、pH或反应混合物的离子强度）。
本申请所述的组合物可以用于实施如在以下中描述的方法：Faltin 等人，ClinChem . 2012年11月；58(11):1546-56；Huang等人，Proc Natl Acad Sci U S A . 2022年3月1日；119(9):e2110672119；美国专利第11,111,522号；和美国专利第102,80,453号，其各自整体并入本申请。
介体探针
本申请提供了介体探针。本申请提供的介体探针可以促进可检测信号的产生。可以切割介体探针。介体探针可以与靶核酸或其扩增产物杂交。可以产生介体探针的经切割的片段或区域。如本申请所述，介体探针的经切割的片段或区段可以与报告探针杂交。介体探针或其经切割的片段（或区段）可以在扩增反应中延伸（例如，当分别与靶核酸或报告探针杂交时）。在一些情况下，使用介体探针或其经切割的片段或区段产生可检测信号可以包括在如本申请所述的解链曲线分析中的杂交或变性反应。
介体探针可以包含模板结合核苷酸序列。模板结合核苷酸序列可以包含能够与模板核酸（例如，靶核酸、其扩增产物、其衍生产物或其任何组合）杂交的核苷酸序列。模板结合核苷酸序列可以包括表1中描述的序列中的任何一种。因此，模板结合核苷酸序列也可以是用于模板核酸的扩增反应的引物或杂交探针。模板结合核苷酸序列可以与靶核酸杂交。
如本申请所使用的，术语“相同”、“序列同一性”或“百分比同一性”当用于两个或更多个核酸序列时是指两个或更多个相同的序列，或者可替代地，当进行比较和比对以获得最大对应性时具有指定百分比的相同的核苷酸的两个或更多个序列，如使用下列序列比较算法中的任何一种或多种测量的：Needleman-Wunsch（参见，例如Needleman, Saul B.；和Wunsch, Christian D. (1970). “A general method applicable to the search forsimilarities in the amino acid sequence of two proteins” Journal of MolecularBiology 48 (3):443-53）；Smith-Waterman（参见，例如Smith, Temple F.；和Waterman,Michael S., “Identification of Common Molecular Subsequences” (1981) Journalof Molecular Biology 147:195-197）；或BLAST（基本局部比对搜索工具（Basic LocalAlignment Search Tool）；参见，例如Altschul S F, Gish W, Miller W, Myers E W,Lipman D J, “基本局部比对搜索工具” (1990) J Mol Biol 215 (3):403-410）。如本申请所使用的，术语“基本上相同”或“基本上的同一性”当用于两个或更多个核酸序列时是指当进行比较和比对以获得最大对应性时具有至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的核苷酸或氨基酸残基同一性的两个或更多个序列或子序列（如生物活性片段），如使用序列比较算法或通过目测所测量的。基本上相同的序列通常被认为是同源的，而不涉及实际的祖先。在一些实施方案中，在被比较的序列的区域上存在“基本上的同一性”。在一些实施方案中，在长度至少25个残基、长度至少50个残基、长度至少100个残基、长度至少150个残基、长度至少200个残基或长度大于200个残基的区域上存在基本上的同一性。在一些实施方案中，被比较的序列在被比较的序列的全长上基本上相同。典型地，基本上相同的核酸或蛋白质序列包括少于100%的核苷酸或氨基酸残基同一性，因为此类序列通常将被认为是“相同的”。
如本申请所使用的，术语“序列互补性”或“互补的”当用于两个核酸序列时，是指基于互补的规范的沃森-克里克碱基配对而彼此互补的两个序列，其中一个核酸序列在5’至3’方向上与另一个核酸序列在3’至5’方向上对齐。在一些情况下，因为核酸分子可以是双链的，所以序列同一性和序列互补性可以互换地使用。在一些情况下，因为核苷酸序列的互补对应部分（complementary counter part）可以基于规范的沃森-克里克碱基配对立即推导出来，所以序列同一性和序列互补性可以互换地使用。
介体探针可以具有多于一个的模板结合核苷酸序列。例如，介体探针可以具有2个模板结合核苷酸序列。如本申请所述，两个模板结合序列中的一个结合靶核酸，并且另一个结合报告探针的序列。在一些情况下，模板结合核苷酸序列可以具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或更多个核苷酸。在一些情况下，模板结合核苷酸序列可以具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。
两个模板结合核苷酸序列可以被配置为彼此分离。在一些情况下，模板结合核苷酸序列可以使用切割反应彼此分离。在一些情况下，介体探针可以与靶核酸杂交，并且包含两个模板结合核苷酸序列中的一个的经切割的片段可以通过切割反应产生。在一些情况下，介体探针可以与靶核酸杂交，并且仅包含两个模板结合核苷酸序列中的一个的经切割的片段可以通过切割反应产生，并从另一个模板结合核苷酸序列和靶核酸的杂交产物中分离。在一些情况下，介体探针可以与具有两个模板结合核苷酸序列中的一个的靶核酸杂交，并且包含其他模板结合核苷酸序列的经切割的片段可以通过切割反应产生，并从模板结合核苷酸序列和靶核酸的杂交产物中分离。因此，另一个模板结合核苷酸序列或经切割的片段也可以是用于核酸序列的扩增反应的引物或杂交探针（如来自本申请所述的报告探针的那些）。切割反应可以包括本申请所述的酶。两个模板结合核苷酸序列可以被0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个核苷酸分开。
在一些情况下，介体探针的一种或多种模板结合核苷酸可以包含与天然存在的核苷酸序列互补的序列。在一些情况下，介体探针的一种或多种模板结合核苷酸可以包含与非天然存在的核苷酸序列互补的序列。在一些情况下，介体探针的第一模板结合核苷酸包含与非天然存在的核苷酸序列互补的序列，并且介体探针的第二模板结合核苷酸包含与天然存在的核苷酸序列互补的序列。在一些情况下，天然存在的核苷酸序列是本申请公开的靶核酸或其片段。在一些情况下，非天然存在的核苷酸序列是本申请公开的报告探针的一部分。
在一些情况下，与非天然存在的核苷酸序列互补的介体探针的模板结合核苷酸可以包括与表1的序列具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，与非天然存在的核苷酸序列互补的介体探针的模板结合核苷酸可以包含与SEQ ID NO: 91、93、95、97、99、101、103、105、107或109中任一者的序列具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。因此，与非天然存在的核苷酸序列互补的介体探针的模板结合核苷酸可以包含与SEQ ID NO: 92、94、96、98、100、102、104、106、108或110中任一者的序列具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列互补性的序列。
在一些情况下，介体探针可以具有与表1的序列为至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，介体探针可以具有与SEQ ID NO: 1-12中的任一者为至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列，至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，介体探针可以具有与SEQ ID NO: 1为至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列，至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，介体探针可以具有与SEQ ID NO:2为至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列，至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，介体探针可以具有与SEQID NO: 3为至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列，至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，介体探针可以具有与SEQ ID NO: 4为至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列，至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，介体探针可以具有与SEQ ID NO: 5为至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列，至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，介体探针可以具有与SEQ ID NO: 6为至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列，至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，介体探针可以具有与SEQ ID NO: 7为至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列，至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，介体探针可以具有与SEQ ID NO: 8为至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列，至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，介体探针可以具有与SEQ ID NO: 9为至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列，至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，介体探针可以具有与SEQ ID NO:10为至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列，至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，介体探针可以具有与SEQ ID NO: 11为至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列，至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，介体探针可以具有与SEQ ID NO: 12为至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列，至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。
在一些情况下，介体探针可以具有与SEQ ID NO: 1、4、7或10中的任一者为至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，本申请提供的组合物可以具有4种介体探针，所述4种介体探针包含与SEQ ID NO: 1、4、7和10为至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列，至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的4种序列。在一些情况下，介体探针可以具有与SEQ ID NO: 2、5、8或11中的任一者为至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列，至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，本申请提供的组合物可以具有4种介体探针，所述4种介体探针包含与SEQ ID NO: 2、5、8和11为至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列，至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的4种序列。在一些情况下，介体探针可以具有与SEQ ID NO: 3、6、9或12中的任一者为至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列，至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，本申请提供的组合物可以具有4种介体探针，所述4种介体探针包含与SEQ ID NO: 3、6、9和12为至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列，至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的4种序列。
在一些情况下，本申请提供的组合物可以具有包含4种序列（序列A、B、C和D）的4种介体探针，其中序列A可以具有与SEQ ID NO: 1-3中的任一者为至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列，至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列；其中序列B可以具有与SEQ ID NO: 4-6中的任一者为至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列，至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列；其中序列c可以具有与SEQ ID NO: 7-9中的任一者为至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列，至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列；并且其中序列D可以具有与SEQ ID NO: 10-12中的任一者为至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列，至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。
在一些情况下，用于结合或杂交甲型流感病毒的序列的介体探针可以具有与SEQID NO: 1-3中的任一者为至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，用于结合或杂交乙型流感病毒的序列的介体探针可以具有与SEQ ID NO: 4-6中的任一者为至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列，至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，用于结合或杂交呼吸道合胞病毒的序列的介体探针可以具有与SEQ ID NO: 7-9中的任一者为至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列，至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，用于结合或杂交肺炎支原体的序列的介体探针可以具有与SEQ IDNO: 10-12中的任一者为至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列，至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，介体探针包含SEQ ID NO: 143-158中的任何一个。
介体探针的模板结合核苷酸序列中的任何一个可以包含与本申请所述的那些靶核酸中的任何一个互补的序列。
报告探针
本申请提供了报告探针。本申请提供的报告探针（或其衍生物）可以促进一种或多种可检测信号的产生。该可检测信号可以有助于在如本申请所述的解链曲线分析中定量和/或鉴定靶标分析物（如靶核酸）。报告探针可以与介体探针的经切割的片段杂交。报告探针可以在核酸扩增反应中用作模板。在这种情况下，报告探针可以是模板，而介体探针的经切割的片段可以是引物。在其他情况下，包含报告探针和介体探针的经切割的片段（或其扩增产物）的杂交分子可以经受变性。
报告探针可以具有这样的结构，即结构为/具有单链的；双链的（即，包含至少两个碱基配对的核苷酸）；单链的和双链的两者（即，包含单链区域和双链区域两者）；线性的；分支的；圆形的；发夹环（或茎-环区）；假结；或者它们的任何组合。在一些情况下，报告探针可以具有多于一种本申请所述的结构。例如，报告探针可以在一种条件下具有一种结构，而在另一种条件下可以具有不同的结构。在一些情况下，两个互补的核苷酸序列可以位于报告探针（或其序列）的两个末端区域（5’端区域和3’端区域），使得报告探针可以经由两个互补核苷酸序列的互补配对形成发夹结构。例如，两个互补的核苷酸序列可以形成发夹结构的臂（茎）。发夹结构的臂可以具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个核苷酸。发夹结构的臂可以具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。发夹结构的臂可以具有2-10、3-9、4-8或5-7个核苷酸。发夹结构的臂可以包含SEQ ID NO: 111-112、113-114、115-116、117-118、119-120、121-122、123-124、125-126、127-128、129-130、131-132或133-134的任何两个序列。对于具有发夹臂的报告探针，当与介体探针的经切割的片段结合时，发夹结构的臂可以变性（在核酸扩增反应中，使用或不使用经切割的片段作为引物，报告探针作为模板），从而分离两个臂（和末端，或偶联到末端的标记物/淬灭剂部分）。两个臂的分离可以促进如本申请所述的可检测信号的产生（如使用解链曲线分析产生/分析的信号）。
在一些情况下，报告探针可以具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100或更多个核苷酸。在一些情况下，报告探针可以具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100个核苷酸。
在一些情况下，报告探针包含被配置以与介体探针的序列杂交或互补的序列。例如，报告探针可以包含被配置成与模板结合核苷酸序列或介体探针的经切割的片段的序列杂交或互补的序列（如本申请所使用的，这种序列可以被称为“用于报告探针的杂交的模板序列”）。在一些情况下，报告探针可以具有至少1个或多于1个用于报告探针的杂交的不同的模板序列。当包含多于一个用于报告探针的杂交的模板序列时，报告探针可以用于如本申请所述的多重检测。用于报告探针的杂交的两个模板序列可以具有核苷酸序列的重叠。例如，如果用于报告探针的杂交的第一模板序列和第二模板序列共享5个核苷酸的相同序列，则这两个序列可以具有5个核苷酸的重叠。在一些情况下，用于报告探针的杂交的两个模板序列可以具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或更多个核苷酸的重叠。在一些情况下，用于报告探针的杂交的两个模板序列可以具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸的重叠。当用于报告探针的杂交的两个模板序列至少具有重叠时，它们可以具有核苷酸序列的重叠。例如：用于报告探针的杂交的两个模板序列可以分别具有AAGGCCTT和AGGCCTTX的序列；其中A是腺苷，G是鸟嘌呤，C是胞嘧啶，T是胸腺嘧啶，并且X是A、C、G和T中的任一者。在这种情况下，用于报告探针的杂交的两个模板序列具有一个核苷酸的偏移。在一些情况下，用于报告探针的杂交的两个模板序列可以具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个核苷酸的偏移。在一些情况下，用于报告探针的杂交的两个模板序列可以具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的偏移。
当用于或被配置成用于核酸扩增反应时，用于报告探针的杂交的模板序列可以具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、100或更多个核苷酸的长度。当用于或被配置成用于核酸扩增反应时，用于报告探针的杂交的模板序列可以具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或100个核苷酸的长度。
用于报告探针的杂交的模板序列可以与模板结合核苷酸序列或介体探针的经切割的片段的序列互补。在一些情况下，用于报告探针的杂交的模板序列可以包括与表1中描述的序列中的任一者的序列具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，用于报告探针的杂交的模板序列可以包含与SEQ ID NO: 92、94、96、98、100、102、104、106、108或110中任一者的序列具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。因此，用于报告探针的杂交的模板序列可以包含与SEQ ID NO:91、93、95、97、99、101、103、105、107或109中任一者的序列具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列互补性的序列。
在一些情况下，报告探针包含当报告探针与介体探针的序列杂交时被配置成延伸模板序列的序列。报告探针可以包含在核酸扩增反应中，当模板结合核苷酸序列或介体探针的经切割的片段的序列与模板序列杂交以用于报告探针的杂交时被配置成用作核酸聚合的模板的序列（如本申请所使用的，这种序列可以被称为“用于报告探针的延伸的模板序列”）。当用于或被配置成用于核酸扩增反应时，用于报告探针的延伸的模板序列可以具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、50、60、70、80、90、100或更多个核苷酸的长度。当用于或被配置成用于核酸扩增反应时，用于报告探针的杂交的模板序列可以具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、50、60、70、80、90或100个核苷酸的长度。
报告探针可以包含标记物部分和淬灭剂部分。在一些情况下，标记物部分和淬灭剂部分可以各自偶联到报告探针或其衍生物的末端。如本申请所使用的，术语“偶联”通常是指两个或更多个物体之间的缔合，其可以是暂时的或基本上永久的。第一物体可以可逆地或不可逆地偶联到第二物体。例如，核酸分子可以可逆地偶联到标记物部分或淬灭剂部分。偶联可以涵盖附着，如第一物体到第二物体的附着。偶联可以包括影响两个物体之间的缔合的任何相互作用，包括例如共价键、非共价相互作用、π相互作用、基于范德华力的相互作用、疏水相互作用、磁性相互作用、电磁相互作用、吸附或任何其他有用的相互作用。在一些情况下，偶联可以包括通过连接或化学手段将包含标记物部分或淬灭剂部分的衔接子连接到包含靶核酸、上游引物/下游引物、介体探针、介体探针的经切割的片段、报告探针或它们的组合的核酸分子上。例如，报告探针可以包含分子信标（beacon），其中可检测信号的产生需要经由核酸扩增或延伸分离标记物部分和淬灭剂部分，如Faltin等人，Clin Chem.2012年11月；58(11):1546-56；Huang等人，Proc Natl Acad Sci U.S.A. 2022年3月1日；119(9):e2110672119；或美国专利第11,111,522号中所述，其各自整体并入。
在一些情况下，标记物部分和淬灭物部分可以包括在以下中描述的标记物部分和淬灭物部分中的任何一种：Pesce等人编著，Fluorescence Spectroscopy（Marcel Dekker,纽约州，1971）；White等人，Fluorescence Analysis: A Practical Approach（MarcelDekker，纽约州，1970）；Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of AromaticMolecules, 第2版（学术出版社（Academic Press），纽约州，1971）；Griffiths, Color ANDConstitution of Oiganic Molecules（学术出版社，纽约州，1976）；Bishop编著，Indicators（佩加蒙出版社（Peigamon Press），牛津，1972）；Haugland, Handbook ofFluorescent Probes and Research Chemicals（Molecular Probes，Eugene, 1992）；Pringsheim, Fluorescence and Phosphorescence（Interscience Publishers，纽约州，1949）；Haugland, R .P., Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals,第6版（Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996）；或美国专利第3,996,345号和第4,351,760号，其各自通过引用整体并入本申请。
标记物部分、淬灭剂部分、用于杂交的模板序列或用于报告探针的延伸的模板序列可以以如本申请所述的构型排列。例如，报告探针可以从3’-5’包含用于报告探针的杂交的模板序列（H）和用于报告探针的延伸的模板序列（E）。在一些情况下，报告探针也可以包含5’-LM-E-H-QM-3’。在一些情况下，报告探针可以包含5’-QM-E-H-LM-3’。
在一些情况下，报告探针可以包含与表1的序列具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，报告探针可以包含与SEQ ID NO: 57-80中任一者的序列具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，报告探针可以包含与SEQ ID NO: 57具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，报告探针可以包含与SEQ ID NO: 58具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，报告探针可以包含与SEQ ID NO: 59具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，报告探针可以包含与SEQ ID NO: 60具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，报告探针可以包含与SEQ ID NO: 61具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，报告探针可以包含与SEQ ID NO: 62具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，报告探针可以包含与SEQ ID NO: 63具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，报告探针可以包含与SEQ ID NO: 64具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，报告探针可以包含与SEQ ID NO: 65具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，报告探针可以包含与SEQ ID NO: 66具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，报告探针可以包含与SEQ ID NO: 67具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，报告探针可以包含与SEQ ID NO: 68具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，报告探针可以包含与SEQ ID NO: 69具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，报告探针可以包含与SEQ ID NO: 70具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，报告探针可以包含与SEQ ID NO: 71具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，报告探针可以包含与SEQ ID NO: 72具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，报告探针可以包含与SEQ ID NO: 73具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，报告探针可以包含与SEQ ID NO: 74具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，报告探针可以包含与SEQ ID NO: 75具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，报告探针可以包含与SEQ ID NO: 76具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，报告探针可以包含与SEQ ID NO: 77具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，报告探针可以包含与SEQ ID NO: 78具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，报告探针可以包含与SEQ ID NO: 79具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，报告探针可以包含与SEQ ID NO: 80具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。
在一些情况下，报告探针可以包含与SEQ ID NO: 57-62中任一者的序列具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，报告探针可以包含与SEQ ID NO: 63-68中任一者的序列具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，报告探针可以包含与SEQ ID NO:69-74中任一者的序列具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，报告探针可以包含与SEQ ID NO: 75-80中任一者的序列具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。
在一些情况下，组合物可以包含4种报告探针，其中所述4种报告探针包含4种序列（序列A、B、C和D），其中序列A包含与SEQ ID NO: 57-62中任一者的序列具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列；其中序列B包含与SEQ ID NO: 63-68中任一者的序列具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列；其中序列C包含与SEQ ID NO: 69-74中任一者的序列具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列；并且其中序列A包含与SEQ ID NO: 75-80中任一者的序列具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。
在一些情况下，组合物可以包含4种报告探针，其中所述4种报告探针包含4种序列（序列A、B、C和D），其中序列A包含与SEQ ID NO: 57-58中任一者的序列具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列；其中序列B包含与SEQ ID NO: 63-64中任一者的序列具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列；其中序列C包含与SEQ ID NO: 69-70中任一者的序列具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列；并且其中序列A包含与SEQ ID NO: 75-76中任一者的序列具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。
在一些情况下，组合物可以包含4种报告探针，其中所述4种报告探针包含4种序列（序列A、B、C和D），其中序列A包含与SEQ ID NO: 59-60中任一者的序列具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列；其中序列B包含与SEQ ID NO: 65-66中任一者的序列具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列；其中序列C包含与SEQ ID NO: 71-72中任一者的序列具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列；并且其中序列A包含与SEQ ID NO: 77-78中任一者的序列具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。
在一些情况下，组合物可以包含4种报告探针，其中所述4种报告探针包含4种序列（序列A、B、C和D），其中序列A包含与SEQ ID NO: 61-62中任一者的序列具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列；其中序列B包含与SEQ ID NO: 67-68中任一者的序列具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列；其中序列C包含与SEQ ID NO: 73-74中任一者的序列具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列；并且其中序列A包含与SEQ ID NO: 79-80中任一者的序列具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，报告探针包含SEQ ID NO: 159-186中的任一者。
报告探针也可以被修饰。这种修饰可以允许报告探针（或其序列）对核酸酶活性（例如，核酸酶活性、5’核酸酶活性、5’-3’核酸外切酶活性或本申请所述的任何核酸酶活性）具有抗性。例如，可以将核酸酶抗性修饰可引入到报告探针的核苷酸骨架中。核酸酶抗性修饰可以包含硫代磷酸酯键、烷基磷酸三酯键、芳基磷酸三酯键、烷基膦酸酯键、芳基膦键、酯键、氢化磷酸酯键、烷基氨基磷酸酯键、芳基氨基磷酸酯键、2’-O-氨基丙基修饰、2’-O-烷基修饰、2’-O-烯丙基修饰、2’-O-丁基修饰、1-(4’-硫代-PD-呋喃核糖基)修饰或它们的组合。
上游引物/下游引物
本申请提供了上游引物和下游引物。上游引物和下游引物可以用于在本申请所述的扩增中产生如本申请所述的模板核酸的扩增产物或衍生物。使用本申请所述的方法，上游引物可以促进使用本申请所述的方法产生介体探针的切割片段。此外，使用上游引物/下游引物产生模板核酸的扩增产物或衍生物可能具有增加分析物（例如，模板核酸）的序列总量和增加分析物或模板核酸的检测灵敏度或准确性的有益优势。在一些其他情况下，上游（或下游）引物可以用作探针，用于使用如本申请所述的方法产生介体探针的经切割的片段。因此，上游（或下游）引物不能用于核酸扩增反应。
在一些情况下，上游引物可以具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个核苷酸。在一些情况下，上游引物可以具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些情况下，下游引物可以具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个或更多个核苷酸。在一些情况下，下游引物可以具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。
在一些情况下，通过对称扩增来扩增靶核酸。对称扩增可以包括使用等量的上游引物和下游引物以用于扩增靶核酸。在一些情况下，通过不对称扩增来扩增靶核酸。不对称扩增可以使用不等量的用于靶核酸的上游引物和下游引物来进行。例如，在一些情况下，上游引物相对于下游引物过量，或者下游引物相对于上游引物过量。上游引物可以比下游引物多至少约50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%、300%、400%、500%、85%、90%、95%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、100倍或1000倍。上游引物可以比下游引物多至多约50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%、300%、400%、500%、85%、90%、95%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、100倍或1000倍。下游引物可以比上游引物多至少约50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%、300%、400%、500%、85%、90%、95%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、100倍或1000倍。下游引物可以比上游引物多至多约50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%、300%、400%、500%、85%、90%、95%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、100倍或1000倍。
在一些情况下，上游引物或下游引物可以包含与表1的序列具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，上游引物可以包含与SEQ ID NO: 13-26 & 29-32中任一者的序列具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，下游引物可以包含与SEQ ID NO:35-48 & 51-54中的任一者具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。
在一些情况下，用于与甲型流感病毒的序列杂交的上游引物可以包含与SEQ IDNO: 13-15中任一者的序列具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，用于与甲型流感病毒的序列杂交的下游引物可以包含与SEQ ID NO: 35-37中的任一者具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。
在一些情况下，用于与乙型流感病毒的序列杂交的上游引物可以包含与SEQ IDNO: 16-18中任一者的序列具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，用于与乙型流感病毒的序列杂交的下游引物可以包含与SEQ ID NO: 38-40中的任一者具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。
在一些情况下，用于与人类呼吸道合胞病毒的序列杂交的上游引物可以包含与SEQ ID NO: 19-21中任一者的序列具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，用于与人类呼吸道合胞病毒的序列杂交的下游引物可以包含与SEQ ID NO: 41-43中的任一者具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。
在一些情况下，用于与肺炎支原体的序列杂交的上游引物可以包含与SEQ ID NO:22-24中任一者的序列具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，用于与肺炎支原体的序列杂交的下游引物可以包含与SEQ ID NO: 44-46中的任一者具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。
在一些情况下，用于与冠状病毒的序列杂交的上游引物可以包含与SEQ ID NO:25-26 & 29-32中任一者的序列具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，用于与冠状病毒的序列杂交的下游引物可以包含与SEQ ID NO: 47-48 & 51-54中的任一者具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。
在一些情况下，上游引物和/或下游引物可以用于扩增对照基因（例如，作为对靶核酸的质量、核酸扩增反应条件、本申请所述的方法的条件或它们的组合的对照）。在一些情况下，用于与对照基因的序列杂交的上游引物可以包含与SEQ ID NO: 33-34中任一者的序列具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，用于与对照基因的序列杂交的下游引物可以包含与SEQ ID NO: 55-56中的任一者具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。
冠状病毒/对照基因检测探针
当分析本申请所述的冠状病毒和/或对照基因时，检测探针用于检测冠状病毒或对照基因的序列。检测探针与标记物部分和淬灭物部分偶联。例如，该方法包括：（1）将上游引物与冠状病毒或对照基因的序列杂交；（2）将检测探针与冠状病毒或对照基因的序列杂交；（3）在核酸扩增反应中，使用冠状病毒或对照基因的序列作为模板，从上游引物延伸新生链核酸分子；以及（4）使用本申请所述的酶产生检测探针的经切割的片段，从而分离与检测探针偶联的标记物部分和淬灭物部分，并产生可检测的信号。在一些情况下，步骤（3）可以省略。
在一些情况下，用于检测冠状病毒或对照基因的检测探针包含与表1的序列具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，用于检测冠状病毒的检测探针包含与SEQ IDNO: 81、82和85-88中的任一者具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，用于检测冠状病毒的检测探针包含SEQ ID NO: 135-140中的任一者。在一些情况下，用于检测对照基因的检测探针包含与SEQ ID NO: 89-90中的任一者具有至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或100%序列同一性的序列。在一些情况下，用于检测对照基因的检测探针包含SEQ ID NO: 141-142中的任一者。
当检测使用检测探针产生的可检测信号时，可以使用或不使用解链曲线分析来检测或分析可检测信号。
酶
本申请提供了酶。酶可以用于诱导介体探针或检测探针的切割，以产生包含模板结合核苷酸序列或其部分的经切割的片段（例如，被配置成与报告探针杂交或具有与报告探针的序列互补的序列的片段）。当（1）介体探针或检测探针与靶核酸（或其衍生物）杂交，且（2）上游引物与靶核酸（或其衍生物）杂交时，酶可以具有可以诱导介体探针或检测探针的切割的核酸酶活性（如本申请所述）。酶可以具有本申请所述的5’核酸酶活性。例如，在本申请所述的方法中，当介体探针或检测探针使用与靶核酸杂交的第二模板结合核苷酸序列与靶核酸接触时，第一模板结合核苷酸序列不与靶核酸杂交，保持单链结构。在一些情况下，具有核酸酶活性的酶可以用于从介体探针或检测探针的第二模板结合核苷酸序列和模板核酸的杂交部分切割单链第一模板结合核苷酸序列，产生（并释放）包含第一模板结合核苷酸序列的介体探针或检测探针的经切割的片段。
在一些情况下，酶对介体探针或检测探针的切割可以是：（1）不依赖于上游引物的延伸（使用模板核酸作为模板）或（2）依赖于上游引物的延伸（使用模板核酸作为模板）。在（1）中，在上游引物和介体探针或检测探针与靶核酸杂交后，如果上游引物和介体探针或检测探针足够紧密接近，则具有核酸酶活性（例如，5’核酸酶活性）的酶可以通过结合至上游引物并且在没有延伸（或扩增反应）的情况下切割介体探针或检测探针来诱导介体探针或检测探针的切割。在（2）中，在与靶核酸杂交之后，如果上游引物没有与介体探针或检测探针紧密接近，则可以使用核酸聚合酶，以在核酸扩增反应中使用靶核酸作为模板来催化上游引物的延伸或聚合。随后，具有核酸酶活性（例如，5’核酸酶活性）的酶可以用于接触并结合至上游引物或其延伸产物（与靶核酸或其扩增产物杂交；以及通过结合至上游引物并在没有延伸（或扩增反应）的情况下切割介体探针或检测探针来诱导介体探针或检测探针的切割。在（1）中，上游引物的3’端和介体探针或检测探针的5’端可以是连续的（当/如果它们都与靶核酸杂交时，在上游引物和介体探针或检测探针之间没有核苷酸）；或者具有至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的距离。在（2）中，上游引物的3’端和介体探针或检测探针的5’端可以具有至少31、40、50、100、200、300、400、500、1000或更多个核苷酸的距离。在（1）中，上游引物的3’端和介体探针或检测探针的5’端之间的距离可以是1-30、1-29、1-28、1-27、1-26、1-25、1-24、1-23、1-22、1-21、1-20、1-19、1-18、1-17、1-16、1-15、1-14、1-13、1-12、1-11、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2或1个核苷酸。在（2）中，上游引物的3’端和介体探针或检测探针的5’端可以具有至多31、40、50、100、200、300、400、500或1000个核苷酸的距离。另外，在（1）中，上游引物也可以是不用于参与介体探针或检测探针的切割的扩增反应的探针。在一些情况下，在（1）中，上游引物也可以是引物（用于靶核酸的扩增反应）和探针（用于参与介体探针或检测探针的切割的扩增反应）。例如，在（1）中，上游引物可以：（1a）用于产生靶核酸的扩增产物；以及（1b）用于以不依赖于延伸的方式产生介体探针或检测探针的切割片段。（1a）可以在（1b）之前进行。（1a）可以与（1b）同时进行。
虽然介体探针（或包含模板结合核苷酸序列的分子，如经切割的片段）和上游引物可以是两种独立的不同分子，但当/如果它们与同一分子（如模板核酸）杂交时，它们之间的距离可以作为将它们分开的核苷酸的数量来测量。该距离可以作为在上游引物的3’末端处的核苷酸和介体探针（或包含模板结合核苷酸序列如经切割的片段的分子）的5’末端的核苷酸之间的核苷酸的数量来测量。
使用上游寡核苷酸诱导下游寡核苷酸的切割的各种方法和组合物在本公开的其他地方描述。在一些情况下，方法和/或组合物描述于美国专利第5,210,015号、第5,487,972号、第5,691,142号、第5,994,069号和第7,381,532号；以及美国专利申请第US 2008/0241838号中，其各自通过引用整体并入本申请。
在一些情况下，介体探针上的切割位点位于第一模板结合核苷酸序列和第二模板结合核苷酸序列的连接处（例如，分别不与靶核酸杂交的序列和与靶核酸杂交的序列的连接处）。在此类情况下，酶对介体探针的切割将释放包含完整的第一模板结合序列的切割片段。在一些情况下，介体探针上的切割位点位于第一模板结合核苷酸序列的3’末端区域内。
在一些情况下，酶可以具有核酸内切酶或核酸外切酶活性。酶可以具有5’核酸外切酶活性、3’核酸外切酶活性或它们的组合。在一些情况下，酶可以具有5’核酸外切酶活性。酶可以具有3’核酸外切酶活性。酶可以具有5’核酸外切酶活性和3’核酸外切酶活性。酶可以具有核酸聚合酶，所述核酸聚合酶可以用于如本申请所述的核酸扩增反应。酶可以具有脱氧核糖核酸（DNA）聚合酶、核糖核酸（RNA）聚合酶或它们的组合。酶可以是热稳定的核酸酶。酶可以具有核酸酶活性和聚合酶活性。在一些情况下，酶可以包含具有5’核酸外切酶的热稳定的DNA聚合酶。使用具有5’核酸酶活性的核酸聚合酶可能具有有益的优势，因为该聚合酶可以使用靶核酸作为模板来催化上游引物的延伸；并且可以诱导介体探针或检测探针的切割。
在一些情况下，酶可以包括热稳定的DNA聚合酶。热稳定的DNA聚合酶可以是来自细菌的热稳定的DNA聚合酶。热稳定的DNA聚合酶可以来自细菌物种，包括Aquifex aeolieus、嗜火液菌（Aquifex pyrophilus）、深海热球菌（Pyrococcus abyssi）、掘越氏热球菌（Pyrococcus horikoshii）、沃氏热球菌（Pyrococcus woesei）、隐蔽热网菌（Pyrodictium occultum）、黄栖热菌（Thermis flavus）、巴氏热球菌（Thermococcus barossi）、戈尔贡热球菌（Thermococcus gorgonarius）、Thermococcus literalis、海岸热球菌（Thermococcus litoralis）、非洲栖热腔菌（Thermosipho africanus）、海栖热袍菌（Thermotoga maritima）、海栖热袍菌（Thermotoga maritima）、新阿波罗栖热袍菌（Thermotoga neapolitana）、新阿波罗栖热袍菌（Thermotoga neapolitana）、Thermus antranildanii、水生栖热菌（Thermus aquaticus）（Taq）、Thermus caldophllus、嗜暖栖热菌（Thermus chliarophilus）、丝状栖热菌（Thermus filiformis）、黄栖热菌（Thermus flavu）、火地栖热菌（Thermus igniterrae）、乳栖热菌（Thermus lacteus）、奥飞氏栖热菌（Thermus oshimai）、红色栖热菌（Thermus rubens）、红栖热菌（Thermus ruber）、水管致黑栖热菌（Thermus scotoductus）、西尔氏栖热菌（Thermus silvanus）、极端嗜热菌（Thermus thermophiles）（Tth）、嗜热栖热菌（Thermus thermophllus）或它们的组合。
特别优选地，具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶是Taq聚合酶。热稳定的DNA聚合酶可以是Aquifex aeolieus聚合酶。热稳定的DNA聚合酶可以是嗜火液菌聚合酶。热稳定的DNA聚合酶可以是深海热球菌聚合酶。热稳定的DNA聚合酶可以是掘越氏热球菌聚合酶。热稳定的DNA聚合酶可以是沃氏热球菌聚合酶。热稳定的DNA聚合酶可以是隐蔽热网菌聚合酶。热稳定的DNA聚合酶可以是黄栖热菌聚合酶。热稳定的DNA聚合酶可以是巴氏热球菌聚合酶。热稳定的DNA聚合酶可以是戈尔贡热球菌聚合酶。热稳定的DNA聚合酶可以是Thermococcus literalis聚合酶。热稳定的DNA聚合酶可以是海岸热球菌聚合酶。热稳定的DNA聚合酶可以是非洲栖热腔菌聚合酶。热稳定的DNA聚合酶可以是海栖热袍菌聚合酶。热稳定的DNA聚合酶可以是海栖热袍菌聚合酶。热稳定的DNA聚合酶可以是新阿波罗栖热袍菌聚合酶。热稳定的DNA聚合酶可以是新阿波罗栖热袍菌聚合酶。热稳定的DNA聚合酶可以是Thermus antranildanii聚合酶。热稳定DNA聚合酶可以是水生栖热菌（Taq）聚合酶。热稳定的DNA聚合酶可以是Thermus caldophllus聚合酶。热稳定的DNA聚合酶可以是嗜暖栖热菌聚合酶。热稳定DNA聚合酶可以是丝状栖热菌聚合酶。热稳定的DNA聚合酶可以是黄栖热菌聚合酶。热稳定的DNA聚合酶可以是火地栖热菌聚合酶。热稳定的DNA聚合酶可以是乳栖热菌聚合酶。热稳定的DNA聚合酶可以是奥飞氏栖热菌聚合酶。热稳定的DNA聚合酶可以是红色栖热菌聚合酶。热稳定的DNA聚合酶可以是红栖热菌聚合酶。热稳定的DNA聚合酶可以是水管致黑栖热菌聚合酶。热稳定的DNA聚合酶可以是西尔氏栖热菌聚合酶。热稳定的DNA聚合酶可以是极端嗜热菌（Tth）聚合酶。热稳定的DNA聚合酶可以是嗜热栖热菌聚合酶。
在一些情况下，用作本申请所述的酶的核酸酶包括侧翼核酸内切酶（Flapendonuclease）（FEN）。FEN可以包括具有5’-3’核酸外切酶活性和结构特异性核酸内切酶活性两者的核酸溶解酶。例如，FEN的核酸内切酶活性可以靶向DNA双链体（至少部分地是双链的DNA分子），该DNA双链体在链之一上包括单链5’突出端（即，“5侧翼”）。FEN可以催化单链DNA和双链DNA的连接处的磷酸二酯键的水解切割。在一些情况下，FEN还具有靶向侧翼链的5’末端和在“切口”DNA底物上的5’-3’核酸外切酶活性。在本申请所述的方法中，当第二模板结合核苷酸序列与靶核酸或其扩增产物杂交时，FEN可以切割第一模板结合核苷酸序列和第二模板结合核苷酸序列之间的连接处。
分析分析物
本申请提供了用于分析分析物的方法和组合物。在一些情况下，所述方法和组合物可以用于检测、鉴定或定量靶核酸。
在一些情况下，当检测可检测信号时，检测方法可以检测：信号的存在（例如，由标记物部分产生的信号或由标记物部分和淬灭剂部分产生的信号）；信号的信号强度的增加；信号的缺失（例如，信号被淬灭剂部分吸收、最小化、消除、淬灭或改变）；或它们的组合。
在一些情况下，检测方法可以包括解链曲线分析（或解链分析）。解链曲线分析可以包括测量双链核酸分子的解链曲线。解链曲线分析可以包括检测双链核酸分子的存在。解链曲线分析可以分析双链核酸分子在加热期间的解离或变性特征。例如，两个核酸分子可以在环境温度下经由互补碱基配对用于双链核酸分子，其中核酸分子中的一个具有标记物部分，一个具有淬灭剂部分（其与标记物部分配对），并且其中标记物部分和淬灭剂部分可以处于允许淬灭剂部分吸收、淬灭、消除、最小化或改变由双链分子中的标记物部分产生的第一可检测信号的距离。因此，当两个核酸分子是双链核酸分子的形式时，第一可检测信号可能未被检测到。在加热双链核酸分子的群体中的双链核酸分子期间，在双链核酸分子的群体的子集内两个核酸分子可能开始解离/变性。因此，在这些情况下，一条链上的淬灭剂部分不再能够吸收、淬灭、消除、最小化或改变由另一条链上的标记物部分产生的第一可检测信号，从而允许检测第一可检测信号。随着温度升高，第一检测信号的强度逐渐增加。当双链核酸分子的群体中所有双链核酸分子的两条链完全解离/变性时，第一可检测信号达到最大强度。因此，通过检测在加热或冷却过程期间产生的第一可检测信号，可以检测和分析两个核酸分子/由其形成的双链核酸分子的杂交和解析的杂交和解析。在分离过程期间，形成信号强度随温度变化的曲线。此外，通过对获得的曲线进行导数分析，可以获得以信号强度变化率为纵坐标并且以温度为横坐标的曲线（即，双链核酸分子的解链曲线）。解链曲线中的峰为解链峰，并且对应的温度为双链核酸分子的熔点（Tm值；或解链峰）。因此，通过检测双链核酸分子的Tm值，可以确定两种核酸分子中任何一种的存在（或不存在）。在本申请所述的方法中，例如，在包含经切割的片段和报告探针的双链核酸分子中，由于经切割的片段仅在靶核酸的存在下产生，因此解链曲线分析可以用于鉴定靶核酸的存在（或靶核酸的不存在）。用于进行解链曲线分析的方法和程序在Lyon等人，The Journal ofMolecular Diagnostics 2009, 11(2):93-101中有所描述，其通过引用整体并入本申请。
本申请所述的方法中的解链曲线分析可以用于多重化分析。在一些情况下，解链曲线分析的解链峰可以对应于特定的靶核酸。在一些情况下，解链曲线分析可以产生至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个解链峰。在一些情况下，解链曲线分析可以产生至多约2、3、4、5、6、7、8、9或10个更多的解链峰。对于多重化分析，两个解链峰可能具有温度差异。
多重化
本申请所述的方法、组合物、装置、系统或试剂可以允许分析物的多重分析。如本申请所用的“多重化”或“多重”分析是指在单一或相同的反应混合物或反应容器（即，其中容纳有反应混合物的容器）中同时或依次地分析多于一种的分析物。例如，可以在单一或相同的反应混合物中或者在单一或相同的反应容器中分析多个靶核酸。
在一些情况下，多重化方法可以包括分析至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、20或更多个靶核酸。在一些情况下，多重化方法可以包括分析至多约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个靶核酸。在一些情况下，多重化方法可以分析甲型流感病毒、乙型流感病毒、人类呼吸道合胞病毒、肺炎支原体、冠状病毒或它们的组合；包括或不包括对照基因。
在一些情况下，多重化方法可以包括针对一个靶核酸使用由本申请所述的标记物部分或淬灭剂部分产生的可区分的可检测信号。因此，使用本申请所述的用于多重化的方法或组合物，可以使用同一反应混合物中的多个可区分的可检测信号中的一个可区分的可检测信号来检测多个靶核酸中的每个靶核酸。
在一些情况下，多重化方法可以包括使用至少N种介体探针、至少M种报告探针，其中N和M为整数，并且其中M < N。例如，在用于分析至少两种靶核酸的方法中，第一介体探针可以与第一模板核酸杂交，并且第二介体探针可以与第二模板核酸杂交。使用本申请所述的方法，可以从第一/第二介体探针/靶核酸的杂交产物中分别产生第一经切割的片段和第二经切割的片段。然后，第一经切割的片段和第二经切割的片段可以在不同的核苷酸位置与一个报告探针杂交（例如，与在本公开的其他地方描述的用于报告探针的杂交的模板序列有偏移）。然后可以使用本申请所述的方法产生第一可检测信号和第二可检测信号，分别用于分析第一靶核酸和第二靶核酸。在一些情况下，在多重化方法中，N可以是至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多，其中N和M是整数，并且其中M <N。在一些情况下，在多重化方法中，N可以是至多约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20，其中N和M是整数，并且其中M < N。在一些情况下，在多重化方法中，M可以是至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多，其中N和M是整数，并且其中M < N。在一些情况下，在多重化方法中，N可以是至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20，其中N和M是整数，并且其中M < N。
在一些情况下，由于用于报告探针的杂交的模板序列的偏移，介体探针的至少2个经切割的片段可以与同一报告探针上的两个不同的核苷酸位置杂交。使用经切割的片段作为引物，报告探针作为模板进行后续核酸扩增，可以产生具有不同长度的至少2种扩增产物。可以使用如本申请所述的解链曲线分析来分析至少2种扩增产物。
在一些情况下，也可以使用包括至少2种介体探针和至少2种报告探针的多重化方法来产生具有不同长度的扩增产物。例如，用于两种报告探针的报告探针的延伸的模板序列可以具有不同的长度，从而当使用两种不同的介体探针（或其经切割的片段）作为引物和两种报告探针时，产生具有不同长度的扩增产物。
靶核酸
本申请中提供的靶核酸可以使用本公开中别处描述的方法、组合物、装置、系统或试剂来检测。如本申请所用的“靶核酸”可以指核酸分子或特定的核苷酸序列。
靶核酸可以包括核酸（或其序列）。靶核酸可以包括DNA、RNA或其任何组合。靶核酸可以来源于病原体。靶核酸可以包括病原体的核酸序列。病原体可以包括引起呼吸道疾病的病毒、细菌或它们的组合。病原体可以包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、人类呼吸道合胞病毒、肺炎支原体、冠状病毒或它们的组合。
当待检测的样品或靶核酸是RNA时，在实施本申请所述的方法之前，可以使用RNA作为模板进行核酸扩增反应以获得互补DNA（cDNA）。核酸扩增反应可以包括逆转录反应。逆转录反应在例如Joseph Sam-brook等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 冷泉港实验室出版社（Cold Spring Harbor Laboratory Press），冷泉港，纽约州(2001)中有所描述，其通过引用整体并入本申请。
生物样品
生物样品是指来源于对象的任何样品或来自对象的样本。生物样品可以包含靶核酸。在一些情况下，该方法可以包括使介体探针、报告探针、酶、核苷酸、上游引物/下游引物或它们的组合与包含靶核酸的生物样品接触，而不必从生物样品中提取、分离、纯化、分级靶核酸。
对象可以包括本申请所述的病原体或怀疑患有或疑似患有本申请所述的病原体的动物。动物可以是人类。生物样品可以是从动物获得的流体、组织、细胞的集合、毛发或粪便。流体可以是血液、唾液、尿液或汗液。组织可以来自器官、组织、细胞材料的块或肿瘤。生物样品可以是细胞样品或无细胞样品。生物样品可以包含靶核酸。进一步地，样品可以从各种含有无细胞序列的动物体液中提取，包括但不限于血液、血清、血浆、玻璃体、痰、尿液、眼泪、汗液、唾液、精液、粘膜分泌物、粘液、脊髓液、羊水或淋巴液。
核苷酸
本申请提供了核苷酸。核苷酸可以用于本申请所述的方法中。靶核酸、介体探针（或其经切割的片段）、报告探针或它们的组合可以包含本申请所述的核苷酸。在一些情况下，核苷酸可以用于核酸扩增反应，以被并入到靶核酸、介体探针（或其经切割的片段）、报告探针或它们的组合的扩增或衍生产物中。在其他情况下，可以通过化学方法将核苷酸并入到靶核酸、介体探针（或其经切割的片段）、报告探针或它们的组合中。
核苷酸可以包括核苷酸或核苷酸类似物。核苷酸可以是天然存在的或非天然存在的。核苷酸可以包括规范的碱基或非规范的碱基。核苷酸可以包含替代的碱基。
组合物
本申请提供了组合物，所述组合物包含样品或生物样品、靶核酸、上游引物、下游引物、介体探针、检测探针、报告探针、酶、核苷酸或它们的组合中的任一种；用于实施如本申请所述的方法。
在一些情况下，组合物可以包含探针组（probe set）。探针组可以包括本申请所述的介体探针和上游引物/下游引物。在一些情况下，探针组可以包括任何介体探针和任何报告探针，只要介体探针和介体包括在介体探针被切割之后用于杂交的互补序列。互补序列作为SEQ ID NO: 91-100中的互补对（具有100%序列互补性）中的任何一种。在一些情况下，探针组可以包括用于检测如本申请所述的特定病原体或靶核酸的任何介体探针和上游引物/下游引物。在一些情况下，探针组还可以包括用于检测冠状病毒/对照基因的上游引物/下游引物和/或检测探针。对于靶核酸的多重化检测，探针组可以包括多于一个的介体探针/报告探针/上游引物/下游引物/检测探针。
核酸扩增反应
术语“扩增（amplifying/amplification）”和“核酸扩增”可互换使用，并且通常是指产生核酸或模板的一个或多个拷贝，或核酸或模板的延伸产物。DNA的扩增可以包括产生DNA分子的一个或多个拷贝，或DNA或DNA模板的延伸产物。核酸的扩增可以是线性的、指数的或它们的组合。RNA的扩增可以包括产生RNA的一个或多个拷贝DNA拷贝或RNA的延伸产物。核酸扩增反应可以包括逆转录、引物延伸、聚合酶链式反应（PCR）、连接酶链式反应（LCR）、解旋酶依赖性扩增、不对称扩增、滚环扩增（RCA）、重组酶聚合酶反应（RPA）、环介导的等温扩增（LAMP）、基于核酸序列的扩增（NASBA）、自主序列复制（3SR）和多重置换扩增（MDA）。在使用PCR的情况下，可以使用任何形式的PCR，其中非限制性实例包括实时PCR、等位基因特异性PCR、装配PCR、不对称PCR、数字PCR、乳液PCR（ePCR或emPCR）、拨出PCR（dial-out PCR）、解螺旋酶依赖性PCR、嵌套PCR、热启动PCR、反向PCR、甲基化特异性PCR、微引物PCR、多重PCR、嵌套PCR、重叠延伸PCR、热不对称交错PCR和降落PCR（touchdown PCR）。扩增可以在包含促进核酸扩增的各种组分（例如，介体探针、报告探针、引物、靶核酸、样品、核苷酸、酶或辅因子）的反应混合物中进行。
装置和系统
本申请提供了用于实施本申请所述的方法的装置和系统。该装置可以包括热循环器。在一些情况下，该装置可以被配置成控制用于执行本申请所述的方法的步骤的温度和时间。在一些情况下，该装置还可以包括检测器，该检测器可以检测由本申请所述的方法产生的可检测信号。例如，该装置可以包括荧光计。荧光计可以被配置成检测由本申请所述的方法产生的可检测信号，该可检测信号是实时产生的。
如本申请所用的，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一个/一种（a）”、“一个/一种（an）”和“该/所述（the）”包括复数指代物。
在提供值的范围的情况下，应当理解，该范围的上限和下限之间的每个中间值，以及所述范围内的任何其他所述值或中间值都包括在本公开的范围内。在所述范围包括上限或下限的情况下，不包括这些所包括的限值中的任一个的范围也包括在本公开中。
本申请还公开了对照介体探针、报告探针、靶核酸、核苷酸或反应混合物的成分，用于根据待实施的方法的应用产生阳性对照或阴性对照。
虽然本申请已经示出和描述了本发明的各种实施方案，但对本领域技术人员而言将显而易见的是，此类实施方案仅通过示例的方式提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员可以想到许多变化、改变和替换。应该理解，可以采用本申请描述的本发明的实施方案的各种替代方案。
实施例
实施例1：示例性序列
本申请提供了用于实施如本申请所述的方法的示例性序列，如下表1所示。
表1：示例性序列
靶核酸 探针类型 序列（5'->3'）；粗体->介体探针的第一模板结合序列；下划线：茎-环臂序列；斜体:用于报告探针的杂交的模板序列；x-y或y-x描绘了与序列y偶联的标记物或淬灭剂部分x SEQIDNO:
甲型流感病毒 介体探针序列 TTGCTGCGGTTGGTACGGTTTCAGGCATCA 1
甲型流感病毒 介体探针序列 TTGCTGCGGTGCTGAGCACTTCCTGACAATGGGCT 2
甲型流感病毒 介体探针序列 TTGCTGCGGCCAAGTCATGAAGGAGAGGGAATACCGCT 3
乙型流感病毒 介体探针序列 TCAAGCCTTCAAGAAGATGGAGAAGGCAAAGCAGAACTAGC 4
乙型流感病毒 介体探针序列 TCAAGCCTTCCAATTCGAGCAGCTGAAACTGCGGTG 5
乙型流感病毒 介体探针序列 TCAAGCCTTTGCTAGTTCTGCTTTGCCTTCTCCATCTTCT 6
人类呼吸道合胞病毒 介体探针序列 TTGCTGCGGCCACATACACAGCTGCTGTTCAAT 7
人类呼吸道合胞病毒 介体探针序列 TTGCTGCGGATTGAGATAGAATCTAGAAAATCCTAC 8
人类呼吸道合胞病毒 介体探针序列 TTGCTGCGGACACTCAACAAAGATCAACTTCTGTCATCCAGC 9
肺炎支原体 介体探针序列 TCAAGCCTTAATGATCTCGCCAACGCTCC 10
肺炎支原体 介体探针序列 TCAAGCCTTACACTTCACAGCAATTCCACCGTCCT 11
肺炎支原体 介体探针序列 TCAAGCCTTCCTTCACTGGTATAACCGGTTTGTTAAG 12
甲型流感病毒 上游引物 AATGGTTGGGAGGGAATG 13
甲型流感病毒 上游引物 AAGCATGGCTGCATGTTTGTG 14
甲型流感病毒 上游引物 CGGTCCAAATTCCTGCTGA 15
乙型流感病毒 上游引物 GAGACACAATTGCCTACCTGCTT 16
乙型流感病毒 上游引物 TCCTCAACTCACTCTTCGAGCG 17
乙型流感病毒 上游引物 GCATCTTTTGTTTTTTATCCATTCC 18
人类呼吸道合胞病毒 上游引物 TGGAAACATACGTGAACAAGC 19
人类呼吸道合胞病毒 上游引物 AATGGAAAAGAAATGAAATT 20
人类呼吸道合胞病毒 上游引物 GCTCTTAGCAAAGTCAAGTTGAATGA 21
肺炎支原体 上游引物 GTCAGCTGCAGTTAGAAA 22
肺炎支原体 上游引物 GACCCATACCGTTAGCCTAGC 23
肺炎支原体 上游引物 TCTTTACGCGTTACGTATTC 24
冠状病毒 上游引物 TCTCTCTCAAAAGGTTTGAG 25
冠状病毒 上游引物 GTGCCCTTTTGATGAAGTTT 26
冠状病毒 上游引物 CGCATACAGTCTTRCAGGCT 29
冠状病毒 上游引物 CCCTGTGGGTTTTACACTTAA 30
冠状病毒 上游引物 CAGTCAGCACCTCATGGTGTA 31
冠状病毒 上游引物 GGGGAACTTCTCCTGCTACAAT 32
对照基因 上游引物 AGCCCTCACGTAGCGAA 33
对照基因 上游引物 AGATTTGGACCTGCGAGCG 34
甲型流感病毒 下游引物 TTGAGTGCTTTTRAGATCTGC 35
甲型流感病毒 下游引物 ACCAGGATATCGAGGATAACAGGA 36
甲型流感病毒 下游引物 CATTGGGTTCCTTCCATCCA 37
乙型流感病毒 下游引物 TTCTTTCCCACCGAACCAAC 38
乙型流感病毒 下游引物 CGGTGCTCTTGACCAAATTGG 39
乙型流感病毒 下游引物 CACAATTGCCTACCTGCTTTCA 40
人类呼吸道合胞病毒 下游引物 ACATGGGCACCCATATTGTA 41
人类呼吸道合胞病毒 下游引物 GGAGAATCATGCCTGTATTC 42
人类呼吸道合胞病毒 下游引物 TGCTCCGTTGGATGGTGTATT 43
肺炎支原体 下游引物 CCTTGTGAATTTGCTCAG 44
肺炎支原体 下游引物 TGCGGGATAACAGCCTCTTG 45
肺炎支原体 下游引物 AGTGTGGAATTCTCTGGCA 46
冠状病毒 下游引物 GCTTGATTCTAAGGTTGGTG 47
冠状病毒 下游引物 CTTCCTGTTCCAAGCATAAA 48
冠状病毒 下游引物 ACGATTGTGCATCAGCTGA 51
冠状病毒 下游引物 GTGTGATGTTGAWATGACATGGTC 52
冠状病毒 下游引物 AACCAGTGTGTGCCATTTGA 53
冠状病毒 下游引物 CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG 54
对照基因 下游引物 TCACGTAGCGAAGAGCG 55
对照基因 下游引物 GAGCGGCTGTCTCCACAAGT 56
甲型流感病毒 报告探针序列 GCTAGTTAACCGCCAATAACCGCAGCAA 57
甲型流感病毒 报告探针序列 CCGTGCGCTAGTTAACCGCCAATAACCGCAGCAA GCACGG 58
甲型流感病毒 报告探针序列 GCTAGTTAACCGCCAATCACCGCAGCAA 59
甲型流感病毒 报告探针序列 AAGCCCGCTAGTTAACCGCCAATCACCGCAGCAA GGGCTT 60
甲型流感病毒 报告探针序列 GCTAGTTAACCGCCAATGGCCGCAGCAA 61
甲型流感病毒 报告探针序列 CTTCGGGCTAGTTAACCGCCAATGGCCGCAGCAACCGAAG 62
乙型流感病毒 报告探针序列 GCGCGACCGGATCACGCACGATCGCTGGACTCCCGGCTCGCTGAAGGCTTGA 63
乙型流感病毒 报告探针序列 CGCAGGGCGCGACCGGATCACGCACGATCGCTGGACTCCCGGCTCGCTGAAGGCTTGA CCTGCG 64
乙型流感病毒 报告探针序列 GCGCGACCGGATCACGCACGATCGCTGGACTCCCGGCTCGCGGAAGGCTTGA 65
乙型流感病毒 报告探针序列 CGAGCGCGCGACCGGATCACGCACGATCGCTGGACTCCCGGCTCGCGGAAGGCTTGA GCTCG 66
乙型流感病毒 报告探针序列 GCGCGACCGGATCACGCACGATCGCTGGACTCCCGGCTCGCCAAAGGCTTGA 67
乙型流感病毒 报告探针序列 CGGCAGGCGCGACCGGATCACGCACGATCGCTGGACTCCCGGCTCGCCAAAGGCTTGA CTGCCG 68
人类呼吸道合胞病毒 报告探针序列 GCTAGTTAACCGCCATTGGCCGCAGCAA 69
人类呼吸道合胞病毒 报告探针序列 GGCGTGGCTAGTTAACCGCCATTGGCCGCAGCAA CACGCC 70
人类呼吸道合胞病毒 报告探针序列 GCTAGTTAACCGCCATTATCCGCAGCAA 71
人类呼吸道合胞病毒 报告探针序列 GCTGCGCTAGTTAACCGCCATTATCCGCAGCAA GCAGC 72
人类呼吸道合胞病毒 报告探针序列 GCTAGTTAACCGCCATTGTCCGCAGCAA 73
人类呼吸道合胞病毒 报告探针序列 CAGCTGGCTAGTTAACCGCCATTGTCCGCAGCAA CAGCTG 74
肺炎支原体 报告探针序列 GCGCGACCGGATCACGCACGATCGCTGGACTCCCGGCTCGCATTAAGGCTTGA 75
肺炎支原体 报告探针序列 GTGCCAGCGCGACCGGATCACGCACGATCGCTGGACTCCCGGCTCGCATTAAGGCTTGA TGGCAC 76
肺炎支原体 报告探针序列 GCGCGACCGGATCACGCACGATCGCTGGACTCCCGGCTCGCAGTAAGGCTTGA 77
肺炎支原体 报告探针序列 CCGCGGGCGCGACCGGATCACGCACGATCGCTGGACTCCCGGCTCGCAGTAAGGCTTGA CCGCGG 78
肺炎支原体 报告探针序列 GCGCGACCGGATCACGCACGATCGCTGGACTCCCGGCTCGCAGGAAGGCTTGA 79
肺炎支原体 报告探针序列 CGCCTGGCGCGACCGGATCACGCACGATCGCTGGACTCCCGGCTCGCAGGAAGGCTTGA CAGGCG 80
冠状病毒 检测探针序列 AACGCCACCACATTTG 81
冠状病毒 检测探针序列 CCTAAACAATCTATACCGG 82
冠状病毒 检测探针序列 CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG 85
冠状病毒 检测探针序列 TTAAGATGTGGTGCTTGCATACGTAGAC 86
冠状病毒 检测探针序列 TTGCTGCTGCTTGACAGATT 87
冠状病毒 检测探针序列 TGCTCCTGCCATTTGTCATGATGG 88
对照基因 检测探针序列 CY5-TCTGGTTCTGACCTGAAGGCTCTGC 89
对照基因 检测探针序列 CY5-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG 90
不适用（n/a） 介体探针的第一模板结合序列 TTGCTGCGGTT 91
n/a 用于报告探针的杂交的模板序列 AACCGCAGCAA 92
n/a 介体探针的第一模板结合序列 TCAAGCCTTCA 93
n/a 用于报告探针的杂交的模板序列 TGAAGGCTTGA 94
n/a 介体探针的第一模板结合序列 TTGCTGCGGCC 95
n/a 用于报告探针的杂交的模板序列 GGCCGCAGCAA 96
n/a 介体探针的第一模板结合序列 TCAAGCCTTAA 97
n/a 用于报告探针的杂交的模板序列 TTAAGGCTTGA 98
n/a 介体探针的第一模板结合序列 TTGCTGCGGTG 99
n/a 用于报告探针的杂交的模板序列 CACCGCAGCAA 100
n/a 介体探针的第一模板结合序列 TCAAGCCTTCC 101
n/a 用于报告探针的杂交的模板序列 GGAAGGCTTGA 102
n/a 介体探针的第一模板结合序列 TTGCTGCGGAT 103
n/a 用于报告探针的杂交的模板序列 ATCCGCAGCAA 104
n/a 介体探针的第一模板结合序列 TCAAGCCTTAC 105
n/a 用于报告探针的杂交的模板序列 GTAAGGCTTGA 106
n/a 介体探针的第一模板结合序列 TCAAGCCTTTG 107
n/a 用于报告探针的杂交的模板序列 CAAAGGCTTGA 108
n/a 介体探针的第一模板结合序列 TTGCTGCGGAC 109
n/a 用于报告探针的杂交的模板序列 GTCCGCAGCAA 110
n/a 步环对_1 CCGTGC 111
n/a 步环对_1 GCACGG 112
n/a 步环对_2 AAGCCC 113
n/a 步环对_2 GGGCTT 114
n/a 步环对_3 CTTCGG 115
n/a 步环对_3 CCGAAG 116
n/a 步环对_4 CGCAGG 117
n/a 步环对_4 CCTGCG 118
n/a 步环对_5 CGAGC 119
n/a 步环对_5 GCTCG 120
n/a 步环对_6 CGGCAG 121
n/a 步环对_6 CTGCCG 122
n/a 步环对_7 GGCGTG 123
n/a 步环对_7 CACGCC 124
n/a 步环对_8 GCTGC 125
n/a 步环对_8 GCAGC 126
n/a 步环对_9 CAGCTG 127
n/a 步环对_9 CAGCTG 128
n/a 步环对_10 GTGCCA 129
n/a 步环对_10 TGGCAC 130
n/a 步环对_11 CCGCGG 131
n/a 步环对_11 CCGCGG 132
n/a 步环对_12 CGCCTG 133
n/a 步环对_12 CAGGCG 134
冠状病毒 具有标记物/淬灭剂部分的检测探针 ROX-AACGCCACCACATTTG-MGB 135
冠状病毒 具有标记物/淬灭剂部分的检测探针 ROX-CCTAAACAATCTATACCGG-MGB 136
冠状病毒 具有标记物/淬灭剂部分的检测探针 ROX-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ2 137
冠状病毒 具有标记物/淬灭剂部分的检测探针 ROX-TTAAGATGTGGTGCTTGCATACGTAGAC-BHQ2 138
冠状病毒 具有标记物/淬灭剂部分的检测探针 ROX-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-BHQ2 139
冠状病毒 具有标记物/淬灭剂部分的检测探针 ROX-TGCTCCTGCCATTTGTCATGATGG-BHQ2 140
对照基因 具有标记物/淬灭剂部分的检测探针 CY5-TCTGGTTCTGACCTGAAGGCTCTGC-BHQ3 141
对照基因 具有标记物/淬灭剂部分的检测探针 CY5-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-BHQ3 142
甲型流感病毒 具有标记物/淬灭剂部分的介体探针 FAM-TTGCTGCGGTTGGTACGGTTTCAGGCATCA-BHQ1 143
甲型流感病毒 具有标记物/淬灭剂部分的介体探针 TTGCTGCGGTTGGTACGGTTTCAGGCATCA-C7NH2 144
甲型流感病毒 具有标记物/淬灭剂部分的介体探针 TTGCTGCGGTGCTGAGCACTTCCTGACAATGGGCT-C7NH2 145
甲型流感病毒 具有标记物/淬灭剂部分的介体探针 TTGCTGCGGCCAAGTCATGAAGGAGAGGGAATACCGCT-C7NH2 146
乙型流感病毒 具有标记物/淬灭剂部分的介体探针 FAM-TCAAGCCTTCAAGAAGATGGAGAAGGCAAAGCAGAACTAGC-BHQ1 147
乙型流感病毒 具有标记物/淬灭剂部分的介体探针 TCAAGCCTTCAAGAAGATGGAGAAGGCAAAGCAGAACTAGC-C7NH2 148
乙型流感病毒 具有标记物/淬灭剂部分的介体探针 TCAAGCCTTCCAATTCGAGCAGCTGAAACTGCGGTG-C7NH2 149
乙型流感病毒 具有标记物/淬灭剂部分的介体探针 TCAAGCCTTTGCTAGTTCTGCTTTGCCTTCTCCATCTTCT-C7NH2 150
人类呼吸道合胞病毒 介体探针 HEX-TTGCTGCGGCCACATACACAGCTGCTGTTCAAT-BHQ2 151
人类呼吸道合胞病毒 介体探针 TTGCTGCGGCCACATACACAGCTGCTGTTCAAT-C7NH2 152
人类呼吸道合胞病毒 介体探针 TTGCTGCGGATTGAGATAGAATCTAGAAAATCCTAC-C7NH2 153
人类呼吸道合胞病毒 介体探针 TTGCTGCGGACACTCAACAAAGATCAACTTCTGTCATCCAGC-C7NH2 154
肺炎支原体 具有标记物/淬灭剂部分的介体探针 HEX-TCAAGCCTTAATGATCTCGCCAACGCTCC-BHQ2 155
肺炎支原体 具有标记物/淬灭剂部分的介体探针 TCAAGCCTTAATGATCTCGCCAACGCTCC-C7NH2 156
肺炎支原体 具有标记物/淬灭剂部分的介体探针 TCAAGCCTTACACTTCACAGCAATTCCACCGTCCT-C7NH2 157
肺炎支原体 具有标记物/淬灭剂部分的介体探针 TCAAGCCTTCCTTCACTGGTATAACCGGTTTGTTAAG-C7NH2 158
甲型流感病毒 具有标记物/淬灭剂部分的报告探针 GCTAGTTAACCGCCAATAACCGCAGCAA-BHQ1 159
甲型流感病毒 具有标记物/淬灭剂部分的报告探针 FAM-GCTAGTTAACCGCCAATAACCGCAGCAA-BHQ1 160
甲型流感病毒 具有标记物/淬灭剂部分的报告探针 FAM-CCGTGCGCTAGTTAACCGCCAATAACCGCAGCAA GCACGG-BHQ1 161
甲型流感病毒 具有标记物/淬灭剂部分的报告探针 FAM-GCTAGTTAACCGCCAATCACCGCAGCAA-BHQ1 162
甲型流感病毒 具有标记物/淬灭剂部分的报告探针 FAM-AAGCCCGCTAGTTAACCGCCAATCACCGCAGCAA GGGCTT-BHQ1 163
甲型流感病毒 具有标记物/淬灭剂部分的报告探针 FAM-GCTAGTTAACCGCCAATGGCCGCAGCAA-BHQ1 164
甲型流感病毒 具有标记物/淬灭剂部分的报告探针 FAM-CTTCGGGCTAGTTAACCGCCAATGGCCGCAGCAA CCGAAG-BHQ1 165
乙型流感病毒 具有标记物/淬灭剂部分的报告探针 GCGCGACCGGATCACGCACGATCGCTGGACTCCCGGCTCGCTGAAGGCTTGA-BHQ1 166
乙型流感病毒 具有标记物/淬灭剂部分的报告探针 FAM-GCGCGACCGGATCACGCACGATCGCTGGACTCCCGGCTCGCTGAAGGCTTGA-BHQ1 167
乙型流感病毒 具有标记物/淬灭剂部分的报告探针 FAM-CGCAGGGCGCGACCGGATCACGCACGATCGCTGGACTCCCGGCTCGCTGAAGGCTTGA CCTGCG-BHQ1 168
乙型流感病毒 具有标记物/淬灭剂部分的报告探针 FAM-GCGCGACCGGATCACGCACGATCGCTGGACTCCCGGCTCGCGGAAGGCTTGA-BHQ1 169
乙型流感病毒 具有标记物/淬灭剂部分的报告探针 FAM-CGAGCGCGCGACCGGATCACGCACGATCGCTGGACTCCCGGCTCGCGGAAGGCTTGA GCTCG-BHQ1 170
乙型流感病毒 具有标记物/淬灭剂部分的报告探针 FAM-GCGCGACCGGATCACGCACGATCGCTGGACTCCCGGCTCGCCAAAGGCTTGA-BHQ1 171
乙型流感病毒 具有标记物/淬灭剂部分的报告探针 FAM-CGGCAGGCGCGACCGGATCACGCACGATCGCTGGACTCCCGGCTCGCCAAAGGCTTGA CTGCCG-BHQ1 172
人类呼吸道合胞病毒 具有标记物/淬灭剂部分的报告探针 GCTAGTTAACCGCCATTGGCCGCAGCAA-BHQ2 173
人类呼吸道合胞病毒 具有标记物/淬灭剂部分的报告探针 HEX-GCTAGTTAACCGCCATTGGCCGCAGCAA-BHQ2 174
人类呼吸道合胞病毒 具有标记物/淬灭剂部分的报告探针 HEX-GGCGTGGCTAGTTAACCGCCATTGGCCGCAGCAA CACGCC-BHQ2 175
人类呼吸道合胞病毒 具有标记物/淬灭剂部分的报告探针 HEX-GCTAGTTAACCGCCATTATCCGCAGCAA-BHQ2 176
人类呼吸道合胞病毒 具有标记物/淬灭剂部分的报告探针 HEX-GCTGCGCTAGTTAACCGCCATTATCCGCAGCAA GCAGC-BHQ2 177
人类呼吸道合胞病毒 具有标记物/淬灭剂部分的报告探针 HEX-GCTAGTTAACCGCCATTGTCCGCAGCAA-BHQ2 178
人类呼吸道合胞病毒 具有标记物/淬灭剂部分的报告探针 HEX-CAGCTGGCTAGTTAACCGCCATTGTCCGCAGCAA CAGCTG-BHQ2 179
肺炎支原体 具有标记物/淬灭剂部分的报告探针 GCGCGACCGGATCACGCACGATCGCTGGACTCCCGGCTCGCATTAAGGCTTGA-BHQ2 180
肺炎支原体 具有标记物/淬灭剂部分的报告探针 HEX-GCGCGACCGGATCACGCACGATCGCTGGACTCCCGGCTCGCATTAAGGCTTGA-BHQ2 181
肺炎支原体 具有标记物/淬灭剂部分的报告探针 HEX-GTGCCAGCGCGACCGGATCACGCACGATCGCTGGACTCCCGGCTCGCATTAAGGCTTGA TGGCAC-BHQ2 182
肺炎支原体 具有标记物/淬灭剂部分的报告探针 HEX-GCGCGACCGGATCACGCACGATCGCTGGACTCCCGGCTCGCAGTAAGGCTTGA-BHQ2 183
肺炎支原体 具有标记物/淬灭剂部分的报告探针 HEX-CCGCGGGCGCGACCGGATCACGCACGATCGCTGGACTCCCGGCTCGCAGTAAGGCTTGA CCGCGG-BHQ2 184
肺炎支原体 具有标记物/淬灭剂部分的报告探针 HEX-GCGCGACCGGATCACGCACGATCGCTGGACTCCCGGCTCGCAGGAAGGCTTGA-BHQ2 185
肺炎支原体 具有标记物/淬灭剂部分的报告探针 HEX-CGCCTGGCGCGACCGGATCACGCACGATCGCTGGACTCCCGGCTCGCAGGAAGGCTTGA CAGGCG-BHQ2 186
实施例2：检测靶核酸
本申请提供了使用如本申请所述的方法和组合物检测靶核酸（探针或序列，如表2中所述的那些）的方法。在含有15 µL的所有靶核酸的核酸、1 µL PrimeScript RT EnzymeMix I（Takara，大连，中国）、10 U的TaKaRa Ex Taq HS、70 mM Tris-HCl （pH 8.6）、40 mMNaCl、20 mM KCl、5.0 mM MgCl2、600 µM dNTP、引物对、介体探针、报告探针和检测探针各500 µM的50 µL的最终体积中进行PCR反应。PCR和解链曲线分析在FlashDetect™ Flash10仪器（Coyote Bioscience，北京，中国）中如下进行：在95℃下变性3分钟；95℃持续1 s，55℃持续5 s，72℃持续1 s的45次循环；然后是85℃持续1 s，45℃持续20 s，51℃持续30 s的5次循环，随后温度从70℃升高到95℃（0.5℃/步）。在四个检测通道（FAM、ROX、HEX和Cy5）中测量荧光强度。
表2：探针和序列
该方法包括使用上游引物和下游引物杂交和/或扩增靶核酸。上游/下游引物对的选择基于特定靶核酸的扩增。当分析甲型流感病毒、乙型流感病毒、人类呼吸道合胞病毒和/或肺炎支原体时，在上游引物与靶核酸杂交之后或同时，该方法包括将介体探针与靶核酸杂交。随后，该方法包括使用本申请所述的酶从介体探针上切割经切割的片段。随后，该方法包括将经切割的片段与报告探针杂交。任选地，该方法包括将经切割的片段（作为引物）和报告探针（作为模板）的杂交产物进行核酸扩增反应。随后，该方法包括使用解链曲线分析检测可检测信号。当分析冠状病毒和对照基因时，在上游引物与靶核酸杂交之后或同时，该方法包括将介体探针与靶核酸杂交。随后，该方法包括使用本申请所述的酶切割检测探针。随后，该方法包括检测可检测信号（在解链曲线分析内或不在解链曲线分析内）。对于多重化，本申请所述的方法可以包括使用靶向多于一种靶核酸的组合物。在解链曲线分析中，可区分的解链峰对应于一种靶核酸。
虽然本申请已经示出并描述了本发明的优选的实施方案，但对本领域技术人员而言将显而易见的是，此类实施方案仅作为示例提供。这并不意味着本发明受说明书中提供的具体实例的限制。虽然已经参考前述说明书描述了本发明，但是本申请的实施方案的描述和说明并不意味着以限制的意义来解释。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现在将会想到许多变化、改变和替换。此外，应该理解的是，本发明的所有方面不限于本申请阐述的取决于各种条件和变量的特定描述、配置或相对比例。应该理解，在实施本发明时，可以采用本申请描述的本发明的实施方案的各种替代方案。因此，预期本发明还将涵盖任何此类替代方案、修改、变化或等同方案。旨在以所附权利要求限定本发明的范围，并且由此覆盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同方案。

Claims (16)

1.一种组合物，其包含至少一种探针，其中所述探针包含与SEQ ID NO: 1-12中任一者的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12种探针。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含4种探针。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述4种探针包含4种多核苷酸，所述多核苷酸与以下序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%的序列同一性：（a）SEQ ID NO:1、4、7和10；（b）SEQ ID NO: 2、5、8和11；或（c）SEQ ID NO: 3、6、9和12。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含第一探针，并且所述第一探针包含与SEQ ID NO: 1-3中任一者的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述组合物还包含：（a）第二探针，所述第二探针包含与SEQ ID NO: 13-15中任一者的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸；（b）第三探针，所述第三探针包含与SEQ ID NO: 35-37中任一者的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸；或（c）它们的组合。
7.根据权利要求5所述的组合物，其中：（a）当所述第一探针包含与SEQ ID NO: 1的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸时，所述组合物还包含第四探针，所述第四探针包含与SEQ ID NO: 57-58中任一者的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸；（b）当所述第一探针包含与SEQ ID NO: 2的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸时，所述组合物还包含第四探针，所述第四探针包含与SEQ ID NO: 59-60中任一者的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸；或（c）当所述第一探针包含与SEQ ID NO: 3的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸时，所述组合物还包含第四探针，所述第四探针包含与SEQ ID NO:61-62中任一者的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸。
8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含第一探针，并且所述第一探针包含与SEQ ID NO: 4-6中任一者的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述组合物还包含：（a）第二探针，所述第二探针包含与SEQ ID NO: 16-18中任一者的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸；（b）第三探针，所述第三探针包含与SEQ ID NO: 38-40中任一者的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸；或（c）它们的组合。
10.根据权利要求8所述的组合物，其中：（a）当所述第一探针包含与SEQ ID NO: 4的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸时，所述组合物还包含第四探针，所述第四探针包含与SEQ ID NO: 63-64中任一者的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸；（b）当所述第一探针包含与SEQ ID NO: 5的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸时，所述组合物还包含第四探针，所述第四探针包含与SEQ ID NO: 65-66中任一者的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸；或（c）当所述第一探针包含与SEQ ID NO: 6的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸时，所述组合物还包含第四探针，所述第四探针包含与SEQ ID NO:67-68中任一者的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸。
11.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含第一探针，并且所述第一探针包含与SEQ ID NO: 7-9中任一者的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述组合物还包含：（a）第二探针，所述第二探针包含与SEQ ID NO: 19-21中任一者的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸；（b）第三探针，所述第三探针包含与SEQ ID NO: 41-43中任一者的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸；或（c）它们的组合。
13.根据权利要求11所述的组合物，其中：（a）当所述第一探针包含与SEQ ID NO: 7的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸时，所述组合物还包含第四探针，所述第四探针包含与SEQ ID NO: 69-70中任一者的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸；（b）当所述第一探针包含与SEQ ID NO: 8的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸时，所述组合物还包含第四探针，所述第四探针包含与SEQ ID NO: 71-72中任一者的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸；或（c）当所述第一探针包含与SEQ ID NO: 9的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸时，所述组合物还包含第四探针，所述第四探针包含与SEQ ID NO:73-74中任一者的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸。
14.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含第一探针，并且所述第一探针包含与SEQ ID NO: 10-12中任一者的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸。
15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述组合物还包含：（a）第二探针，所述第二探针包含与SEQ ID NO: 22-24中任一者的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸；（b）第三探针，所述第三探针包含与SEQ ID NO: 44-46中任一者的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸；或（c）它们的组合。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中：（a）当所述第一探针包含与SEQ ID NO: 10的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸时，所述组合物还包含第四探针，所述第四探针包含与SEQ ID NO: 75-76中任一者的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸；（b）当所述第一探针包含与SEQ ID NO: 11的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸时，所述组合物还包含第四探针，所述第四探针包含与SEQ ID NO: 77-78中任一者的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸；或（c）当所述第一探针包含与SEQ ID NO: 12的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸时，所述组合物还包含第四探针，所述第四探针包含与SEQ IDNO: 79-80中任一者的序列包括至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的多核苷酸。
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