CN117126281A - 抗cd73单克隆抗体及其在制备肿瘤药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程抗体，特别涉及抗CD73单克隆抗体及其在制备肿瘤药物中的应用；本发明用人胞外‑5’‑核苷酸酶(CD73)蛋白免疫小鼠，所得到的多个单克隆抗体的重链和轻链序列均是全新的氨基酸序列，可用于制备CD73酶活抑制剂和抗肿瘤药物。
Description
本申请是申请号为202011239238.1，申请日为2020年11月09日，发明名称为“抗胞外-5’-核苷酸酶的抗体序列”的中国发明专利申请的分案申请。申请人按照审查员的第一次审查意见提出分案申请。
技术领域：
本发明属于基因工程抗体，特别涉及抗CD73单克隆抗体及其在制备肿瘤药物中的应用。
背景技术：
胞外-5’-核苷酸酶(ecto-5’-nucleotidase，以下亦简称为CD73)，是多功能的胞外核酸酶，广泛分布于包括T、B淋巴细胞，巨噬细胞，树突状细胞，血管内皮，黏膜上皮细胞在内的多种组织细胞，在细胞内可同时发挥酶和非酶功能。
研究证实，CD73过表达可以促进肿瘤细胞的增殖，且在大多数实体瘤中呈高表达，包括结直肠癌、卵巢癌、胃癌、胆囊癌、前列腺癌等，并与肿瘤分期、病理类型以及预后转归密切相关；CD73-腺苷途径在肿瘤进展和免疫逃逸中起着极其重要的作用，靶向CD73能够明显提高CTLA-4以及PD-1抑制剂的抗肿瘤效应，CD73有望成为未来肿瘤免疫治疗的特效靶点。
尽管目前已经有人研发了一些治疗型CD73单克隆抗体，其中，以MEDI-9447和天镜生物的CD73抗体为代表。但是，抗体是B淋巴细胞在抗原刺激下所产生的具特异性免疫功能的球蛋白，单克隆抗体是由单个克隆的杂交瘤细胞分泌的，只能识别一种表位(抗原决定簇)的抗体。而针对同一个生物大分子的不同抗原表位可以制备出多种不同的单克隆抗体，即使抗原表位相同，获得的单抗序列也有可能不同。不同的序列以及靶位可能带来更优的药效或者更低的毒性以及更为广泛的抗瘤谱，开发出更多的抗胞外-5’-核苷酸酶的抗体序列，才有可能解决更多的临床问题。
发明内容
本发明的目的是提供多种有效的抗胞外-5’-核苷酸酶(即CD73)的抗体序列，以用于制备治疗肿瘤相关疾病的药物。
本发明用人源CD73蛋白免疫小鼠，分别获得了五个抗CD73单克隆抗体，这些单克隆抗体的重链和轻链序列，均是全新的序列，现有技术未见报道过。
本发明获得的五个抗CD73单克隆抗体中，其中四个抗体与现有技术抗体识别的抗原表位也不同。
所用的CD73蛋白为申请人自主表达的人源CD73蛋白，所用的小鼠为BABL/C小鼠。
具体的，本发明通过如下手段完成了上述工作：
A人源CD73蛋白作为抗原以30μg/只免疫BABL/C小鼠，三周后同样剂量加强免疫；
B ELISA法测定免疫后小鼠血清中的抗体滴度，达到理想效果后以50μg剂量冲击免疫；
C取免疫成功的小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合，待细胞长成细胞团后进行上清滴度检测，通过三轮亚克隆获得阳性单克隆细胞株；
D单克隆细胞株扩大培养后进行小鼠腹腔注射制备腹水，并从收集的腹水纯化得到相应的抗体；
E利用SPR技术进行单克隆抗体的亲和动力学测定；
F测定单克隆抗体对于CD73酶活性的抑制作用；
G测定单克隆抗体对于移植瘤模型的肿瘤抑制作用。
本发明获得的五个抗CD73单克隆抗体分别命名为：F2-2、E1-B6、81-2-2、06-6和9-4。这些抗体特异性的分子基础主要来自于它的高度可变区CDR1、CDR2和CDR3，这些区域是与抗原结合的关键部位。
本发明获得的五个抗CD73单克隆抗体中，每个抗体的重链和中的CDR1、CDR2和CDR3分别是如下所示氨基酸序列的多肽：
F2-2：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3；SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；
E1-B6：SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11；SEQ ID NO.12、SEQ IDNO.13和SEQ ID NO.14；
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06-6：SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27；SEQ ID NO.28、SEQ IDNO.29和SEQ ID NO.30；
9-4：SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34和SEQ ID NO.35；SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38。
本发明所述“单克隆抗体”应该解释为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任意特异性结合因子，可以是单价的或是单链抗体、双链抗体、嵌合抗体以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。
本发明所述单克隆抗体的实例是免疫球蛋白IgG亚型及其亚型亚类；
尽管抗体特异性的分子基础主要来自于它的高度可变区CDR1、CDR2和CDR3，为了维持优选的结合特性，上述CDR的序列应尽可能保留。然而，尽管如果有个别氨基酸的改变，也有可能能够达到本发明目的，甚至使结合特性更为优化。但是，个别氨基酸的改变并不能脱离本发明的构思和发明精神。
除了如上所述重链和轻链中的高度可变区CDR1、CDR2和CDR3外，其它为框架区。框架区可在结合所需的三维结构不受影响的条件下被其他序列置换。
本发明的有益效果：
经实验证实，本发明所生产的五个抗CD73单克隆抗体具有以下突出特点：
1、与人CD73具有高亲和力(详见实施例2)
2、与现有技术抗CD73单克隆抗体识别的抗原表位不同(详见实施例3)
3、生化水平实验和细胞水平实验都显示具有高效的CD73酶活抑制作用(详见实施例4)
4、可显著抑制人免疫重构鼠移植瘤的生长(详见实施例5)。
附图说明
图1为本发明的5个抗CD73单克隆抗体获得步骤的示意图。
图2为实施例2(F2-2、E1-B6、81-2-2、06-6和9-4抗体与人CD73的亲和力)的实验结果，图中Ka、Kd和KD分别为结合常数、解离常数以及亲和力常数，Contbody为MEDI-9447。
图3为实施例3(F2-2、E1-B6、81-2-2、06-6和9-4抗体抗体表位分析)的实验结果，其中表位作图顺序依次为E1-B6、81-2-2、9-4、06-4以及F2-2对其余所有抗体作图，Contbody为MEDI-9447；。
图5为实施例4(F2-2、E1-B6、81-2-2、06-6和9-4抗体对CD73酶活性的抑制)的实验结果；其中，图3是生化水平，图4是细胞水平(A549)。
图6为实施例5(F2-2、E1-B6、81-2-2、06-6和9-4抗体动物药效)的实验结果。
以上所述F2-2、E1-B6、81-2-2、06-6和9-4，分别是本发明得到的五个抗CD73单克隆抗体的名称。
序列信息:
SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3，分别是抗CD73单克隆抗体F2-2的CDR1、CDR2和CDR3；
SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，分别是抗CD73单克隆抗体F2-2的CDR1、CDR2和CDR3；
SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8，分别是抗CD73单克隆抗体F2-2和氨基酸序列；
SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11，分别是抗CD73单克隆抗体E1-B6的CDR1、CDR2和CDR3；
SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14，分别是抗CD73单克隆抗体E1-B6的CDR1、CDR2和CDR3；
SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16分别是抗CD73单克隆抗体E1-B6和氨基酸序列；
SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19分别是抗CD73单克隆抗体81-2-2的CDR1、CDR2和CDR3；
SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22，分别是抗CD73单克隆抗体81-2-2的CDR1、CDR2和CDR3；
SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24分别是抗CD73单克隆抗体81-2-2和氨基酸序列；
SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27分别是抗CD73单克隆抗体06-6的CDR1、CDR2和CDR3；
SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30，分别是抗CD73单克隆抗体06-6的CDR1、CDR2和CDR3；
SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.32分别是抗CD73单克隆抗体06-6和氨基酸序列；
SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34和SEQ ID NO.35分别是抗CD73单克隆抗体9-4的CDR1、CDR2和CDR3；
SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38，分别是抗CD73单克隆抗体9-4的CDR1、CDR2和CDR3；
SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.40分别是抗CD73单克隆抗体9-4和氨基酸序列；
SEQ ID NO.41是本申请发明人自主构建表达的CD73蛋白氨基酸序列。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下实施例对本发明进行了进一步详细说明。应当理解，实施例中所使用的具体方法、试剂等仅用于举例说明本发明，并不能限定本发明的范围。
本发明提供以下五条特异性的抗CD73单克隆抗体的重链和序列。所述单克隆抗体由CD73蛋白免疫BABL/c小鼠后经杂交瘤筛选得到的对应的单克隆细胞株表达；所述单克隆抗体型别为IgG型。
以下实施例中所用的抗原为自主表达的人源CD73蛋白，蛋白C端包含6×His标签；
所使用的免疫佐剂为北京博奥龙5周快速免疫佐剂，初次免疫21天后加强免疫一次，细胞融合前使用抗原冲击免疫一次即可进行细胞融合；
所使用的融合方法为电融合法，电融合仪为BTX公司的ECM2001型，所用融合缓冲液为原厂细胞融合液；
融合后的细胞长出细胞团后采用ELISA检测上清抗体表达，酶标板包被CD73蛋白或者His蛋白，His蛋白用来排除Anti-His的假阳性孔；
阳性孔采用有限稀释法进行亚克隆，亚克隆共进行三轮，最终获得阳性单克隆细胞株；
阳性单克隆进行腹水制备后纯化，获得对应的单克隆抗体，单克隆抗体进一步用于亲和力测定、酶活抑制实验以及动物药效评价。
实施例1抗原免疫、细胞融合以及阳性克隆的筛选和腹水抗体的制备纯化
实验目的：
采用自主表达的人源CD73蛋白作为抗原制备单克隆抗体。
实验方法：
使用杂交瘤技术制备抗人CD73单克隆抗体。具体方法为：
使用30μg蛋白对4-6周的雌性BALB/c小鼠进行免疫。
首次免疫后第21天采用同样方法加强免疫一次。
首次免疫后第35天通过眼眦采血分离血清进行血清滴度的ELISA测定。
抗体滴度达到要求后采用50μg CD73蛋白进行抗原冲击免疫。
冲击免疫3天后取脾细胞与SP2/0细胞进行融合，待细胞成团后ELISA检测杂交瘤上清液中的抗CD73抗体。
实验结果：
经过三轮亚克隆，通过亲和力以及酶活抑制双重筛选，最终获得了5株CD73抗体高表达单克隆细胞株，分别命名为F2-2、E1-B6、81-2-2、06-6和9-4。将单克隆细胞扩增后进行腹水制备纯化抗体，用于后续亲和力测定、酶活抑制实验以及动物药效测定。
经验证，所得5个单克隆抗体均具有高亲和力，同时可以有效抑制CD73酶活，同时，动物药效显示了理想的抑瘤效果。
实施例2五个抗CD73单克隆抗体与重组人CD73亲和动力学分析
实验目的：
采用Biacore T200系统检测各抗体的亲和动力学常数。
试剂和方法：
Mouse Antibody Capture Kit为购自GE公司的商品化试剂盒，采用氨基偶联的方法将抗小鼠Fc IgG固定在CM5传感器芯片上，通过偶联的抗小鼠Fc IgG捕获被测抗体，然后注射一系列浓度梯度的人CD73蛋白，之后采用试剂盒自带的pH 1.7的Glycine-Hcl再生检测系统。
运行缓冲液为HBS-EP+(10mM HEPES，pH7.4，150mM Nacl，3mM EDTA和0.05％P20)，测定温度25℃；
实验中选用的对照物为MEDI-9447；MEDI-9447为MedImmune公司的CD73抗体，我们依据其专利(US2016/0194407A1)的序列合成表达并纯化得到对照物。
使用Biacore T200评估软件，根据1：1结合模型拟合数据，计算结合(Ka)和解离(Kd)速率常数以及平衡常数(KD)。
实验结果：
根据检测结果，各抗体亲和力数据的具体结果见图2和下表：
结果显示，5个抗CD73单克隆抗体均与重组人CD73具有高亲和力，其中F2-2亲和力优于其它4个抗体，同时F2-2抗体亲和力优于MEDI-9447，其余四个抗体亲和力稍弱于MEDI-9447。
实验结论：
本发明获得的5个抗CD73单克隆抗体与人CD73均具有高亲和力。
实施例3五个抗CD73单克隆抗体的抗原表位分析
实验目的：
分析各抗体抗原表位的异同。
试剂和方法：
利用Biacore T200系统分析各抗体抗原表位的异同。
Mouse Antibody Capture Kit为购自GE公司的商品化试剂盒，采用氨基偶联的方法将抗小鼠Fc IgG固定在CM5传感器芯片上，通过偶联的抗小鼠Fc IgG捕获第一抗体，然后以100μg/mL的Mouse IgG封闭多余位点，之后依次进样CD73和第二抗体，通过传感图分析各抗体识别抗原表位的异同。
实验中选用的对照物为MEDI-9447。
实验结果：
具体实验结果见图3；
根据分析结果，各抗体表位归纳汇总如下表：
根据表位作图结果，五个抗体中F2-2识别独立表位，E1-B6、06-6、9-4识别同一表位，四个抗体与MEDI-9447识别表位均不相同，81-2-2与MEDI-9447识别同一抗原表位，但是81-2-2与MEDI-9447的CDR区氨基酸序列均不相同，应此，81-2-2也是异于MEDI-9447的全新抗体。
实验结论：
本发明获得的5个抗CD73单克隆抗体，其中有4个抗体与现有技术抗CD73单克隆抗体识别的抗原表位不同。
实施例4五个抗体对CD73酶活性的抑制
实验目的：
分别从生化水平和细胞水平检测F2-2、E1-B6、81-2-2、06-6以及9-4抗体抑制CD73酶活的能力。
实验方法：
1、生化方法
将F2-2、E1-B6、81-2-2、06-6、9-4以及MEDI-9447抗体以合适的浓度梯度加至96孔白板底部，然后每孔加CD73蛋白至终浓度为0.25μg/mL，37℃孵育15min，孵育结束后分别添加AMP和ATP至终浓度为500μmol/L和100μmol/L，37℃孵育30min。最后，每孔加入等体积的Cell titer Glo。
酶标仪化学发光法检测各孔信号值，计算并处理数据；
2、细胞方法
将F2-2、E1-B6、81-2-2、06-6、9-4以及MEDI-9447抗体以合适的浓度梯度加至96孔板底部，A549细胞消化重悬后计数，以1×105个/孔的密度接种至对应的孔，二氧化碳培养箱孵育15min，孵育结束后将AMP加至各孔，终浓度为500μmol/L，二氧化碳培养箱继续孵育24h；24h后将96孔板取出1000rpm离心5min，每孔取50μL上清至新的96孔白板对应位置，之后每孔加入ATP溶液至终浓度为100μmol/L，然后每孔加入等体积的Cell titer Glo。
酶标仪化学发光检测各孔信号值，计算并处理数据。
实验结果：见图4、图5
各抗体CD73酶活抑制效应EC50汇总见下表，其中对照物为MEDI-9447：
五种单克隆抗体中，F2-2生化和细胞水平CD73酶活抑制作用均优于其余四个抗体和MEDI-9447，其余四个抗体对CD73酶活抑制作用比MEDI-9447稍弱。
实验结论：
生化水平实验和细胞水平实验都显示，本发明获得的5个抗CD73单克隆抗体具有高效的CD73酶活抑制作用。
实施例5五个抗体的动物药效评价
实验目的：体内实验测试五个抗体抑制肿瘤细胞生长效果。
实验方法：
取90只B-NDG小鼠，至少适应性饲养一周。
培养A549细胞，隔天传一次代，最后收集细胞，PBS将细胞终浓度调整到5*107/mL，每只0.1mL接种到小鼠右侧肩部皮下。
接种后10天左右，选取肿瘤体积20-30mm3的小鼠进行分组，每组10只，共7组。
分组当天复苏PBMC细胞，PBS将细胞浓度调整到25million/mL，每只小鼠i.v.注射200μL(5millon)PBMC，然后i.v.给药，给药后每周测量2次肿瘤体积；给药频率为Q3D，共10次。
以肿瘤体积为纵坐标、给药时间为横坐标绘制各组肿瘤生长曲线；各药物组与对照组进行one way ANOVA分析，比较两组之间的差异。
实验结果：见图6。实验结果表明，与对照组IgG相比，F2-2、E1-B6、81-2-2、06-6以及9-4抗体均显示出显著的抑制肿瘤细胞生长的效果。其中81-2-2与9-4效果相当，F2-2与E1-B6效果相当，06-6药效最强。
实验结论：
本发明的五个抗CD73单克隆抗体均具有显著抑制肿瘤细胞生长的作用。
Claims (3)
1.抗CD73单克隆抗体，其重链和轻链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如下所述：
重链可变区：SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11；
轻链可变区：SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14。
2.权利要求1所述的单克隆抗体在制备肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的肿瘤为结直肠癌、卵巢癌、胃癌、胆囊癌、前列腺癌或肺癌。
3.权利要求1所述的单克隆抗体在制备CD73酶活抑制剂中的应用。
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