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CN117062611A - 嵌合抗原受体（car）构建体和表达car构建体的nk细胞 - Google Patents

嵌合抗原受体（car）构建体和表达car构建体的nk细胞 Download PDF

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CN117062611A
CN117062611A CN202280024474.2A CN202280024474A CN117062611A CN 117062611 A CN117062611 A CN 117062611A CN 202280024474 A CN202280024474 A CN 202280024474A CN 117062611 A CN117062611 A CN 117062611A
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CN
China
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polypeptide
seq
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cell
amino acid
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徐启明
陈丽
朱化星
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Original Assignee
Huihe Biotechnology Shanghai Co ltd
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Abstract

本文所述的技术涉及自然杀伤(NK)细胞CAR多肽，所述多肽包括来自NK相关多肽的胞内信号转导结构域、胞内共刺激结构域和/或跨膜结构域。在各个方面中，本文描述了多核苷酸、载体或表达所述NK CAR多肽的细胞，以及包括所述NK CAR多肽、多核苷酸、载体或细胞的药物组合物。本文还描述了使用所述NK CAR多肽的方法，例如，用于治疗各种疾病和疾患，例如，癌症或感染性疾病。

Description

嵌合抗原受体(CAR)构建体和表达CAR构建体的NK细胞
相关申请的交叉引用
根据35 U.S.C.§119(e)，本申请要求2021年1月26日提交的美国临时申请号63/141,621的权益，将其内容通过引用的方式整体并入本文。
序列表
本申请包括序列表，该序列表已通过CE-PCT以ASCII格式提交，并通过引用整体并入本文。所述ASCII副本创建于2021年12月29日，命名为087825-000003WOPT_SL.txt，且大小为307,704字节。
技术领域
本文描述的技术涉及自然杀伤(NK)细胞嵌合抗原受体(CAR)构建体。
背景技术
使用嵌合抗原受体(CAR)构建体的过继性T细胞疗法已被用作癌症的治疗。CAR-T细胞疗法可导致T细胞过度活跃和细胞因子释放综合征(CRS)。这种细胞因子风暴在严重情况下可导致器官衰竭或死亡。就此而言，迫切需要能够在T细胞以外的免疫细胞类型中表达的CAR技术。NK细胞在功能上类似于CD8+细胞毒性T细胞，并且被认为是T细胞在肿瘤细胞的细胞毒性杀伤中的替代品。与CAR-T细胞相比，CAR-NK技术提供了显著优势，例如，CRS或神经毒性的发生率较低，以及“即用型产品(off-the-shelf)”生产的高度可行性。目前，大多数CAR-NK细胞研究使用为CAR-T细胞设计的CAR构建体，而不是针对NK细胞活化进行优化。就此而言，迫切需要开发用于特异性活化NK细胞以实现增强的抗肿瘤活性的CAR构建体。
发明内容
这项技术涉及可在自然杀伤(NK)细胞中表达的嵌合抗原受体(CAR)构建体及其在癌症和感染性疾病的治疗中的用途。本文描述了CAR构建体，其可用于修饰NK细胞以表达这些构建体的方法和使用CAR修饰的NK细胞作为治疗剂的方法中的NK细胞工程化。通常，NKCAR构建体包括胞外结构域(包括胞外结合结构域，即，抗原识别区)、跨膜结构域(TD)以及包括1个或2个信号转导结构域和/或共刺激结构域的胞内结构域。该技术提供了具有不同于CAR-T治疗中使用的那些的跨膜结构域和/或胞内结构域的CAR构建体，并适合用于修饰NK细胞，例如，用于将其靶向到表达给定标志物或肿瘤抗原的细胞。用本文所述的CAR构建体修饰的NK细胞比目前用于CAR-T治疗的那些具有更有效的NK细胞活化和细胞毒活性。因此，该技术提供了诱导高水平NK细胞增殖、活化、细胞因子分泌和细胞裂解活性的CAR构建体。
在一方面，本文描述了一种用于在自然杀伤(NK)细胞中表达的嵌合抗原受体(CAR)多肽，所述多肽包括(a)胞外结合结构域；(b)跨膜结构域；以及(c)胞内结构域，该胞内结构域包括以下中的至少一种：(i)来自NK细胞受体的胞内信号转导结构域；(ii)来自NK细胞膜结合信号转导接头蛋白的胞内信号转导结构域；和/或(iii)来自共刺激受体的胞内共刺激结构域。
在任一方面的一些实施方式中，该多肽从N-末端到C-末端包括：(a)胞外结合结构域；(b)跨膜结构域；以及(c)胞内结构域。
在任一方面的一些实施方式中，该多肽从C-末端到N-末端包括：(a)胞外结合结构域；(b)跨膜结构域；以及(c)胞内结构域。
在任一方面的一些实施方式中，NK细胞受体或NK细胞膜结合信号转导接头蛋白选自于由以下组成的组：(a)自然杀伤细胞受体2B4；(b)自然杀伤细胞抗原、T-细胞抗原和B-细胞抗原(NTB-A)；(c)CD2样细胞毒性细胞活化受体(CRACC)；(d)分化簇2(CD2)；(e)高亲和力IgE受体(FcεR1)；和(f)CD3-zeta(CD3ζ)。
在任一方面的一些实施方式中，NK细胞受体选自于由2B4、NTB-A、CRACC和CD2组成的组。
在任一方面的一些实施方式中，NK细胞受体是2B4。
在任一方面的一些实施方式中，NK细胞受体是NTB-A。
在任一方面的一些实施方式中，NK细胞受体是CRACC。
在任一方面的一些实施方式中，NK细胞受体是CD2。
在任一方面的一些实施方式中，NK细胞膜结合信号转导接头蛋白是CD3ζ或FcεR1。
在任一方面的一些实施方式中，来自NK细胞受体的胞内信号转导结构域或来自NK细胞膜结合信号转导接头蛋白的胞内信号转导结构域包括SEQ ID NOs：7-12中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：7-12中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
在任一方面的一些实施方式中，共刺激受体是4-1BB和/或IL2受体β(IL2RB)。
在任一方面的一些实施方式中，来自共刺激受体的胞内共刺激结构域包括SEQ IDNOs：15-16中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：15-16中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
在任一方面的一些实施方式中，胞内结构域进一步包括至少一种自剪切肽。
在任一方面的一些实施方式中，自剪切肽是T2A、P2A、E2A或F2A。
在任一方面的一些实施方式中，自剪切肽包括SEQ ID NOs：19-20中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：19-20中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
在任一方面的一些实施方式中，胞内结构域进一步包括细胞因子。
在任一方面的一些实施方式中，细胞因子是IL-15或IL-21。
在任一方面的一些实施方式中，细胞因子包括SEQ ID NOs：23-24中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：23-24中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
在任一方面的一些实施方式中，胞内结构域进一步包括至少一种自剪切肽和至少一种细胞因子。
在任一方面的一些实施方式中，细胞因子与自剪切肽相邻且位于自剪切肽远端，使得细胞因子通过自剪切肽与多肽分隔开。
在任一方面的一些实施方式中，跨膜结构域包括天然NK细胞受体的跨膜结构域。
在任一方面的一些实施方式中，天然NK细胞受体的跨膜结构域选自于由自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)、自然杀伤细胞P46相关蛋白(NKp46)、和DNAX辅助分子-1(DNAM1)组成的组。
在任一方面的一些实施方式中，跨膜结构域包括CD8的跨膜结构域。
在任一方面的一些实施方式中，跨膜结构域包括SEQ ID NOs：29-32或SEQ IDNOs：117-118中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：29-32或SEQ ID NOs：117-118中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
在任一方面的一些实施方式中，胞外结合结构域是抗体、其抗原结合片段、F(ab)片段、F(ab’)片段、单链抗体(scFv)或单域抗体(sdAb)。
在任一方面的一些实施方式中，胞外结合结构域包括scFv。
在任一方面的一些实施方式中，胞外结合结构域特异性地结合至肿瘤相关抗原。
在任一方面的一些实施方式中，肿瘤相关抗原是CD19。
在任一方面的一些实施方式中，肿瘤相关抗原是CD33。
在任一方面的一些实施方式中，胞外结合结构域包括SEQ ID NOs：35-36中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：35-36中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
在任一方面的一些实施方式中，多肽进一步包括位于胞外结合结构域的N-末端的信号肽。
在任一方面的一些实施方式中，信号肽是CD8信号肽。
在任一方面的一些实施方式中，信号肽包括SEQ ID NO：38的氨基酸序列或与SEQID NO：38至少80％相同的氨基酸序列。
在任一方面的一些实施方式中，多肽进一步包括位于胞外结合结构域远端的可检测标志物。
在任一方面的一些实施方式中，可检测标志物是3×FLAG。
在任一方面的一些实施方式中，可检测标志物包括SEQ ID NO：40的氨基酸序列或与SEQ ID NO：40至少80％相同的氨基酸序列。
在任一方面的一些实施方式中，多肽进一步包括位于胞外结合结构域远端和/或位于可检测标志物和/或信号肽近端的连接子结构域(linker domain)。
在任一方面的一些实施方式中，连接子包括SEQ ID NO：42的氨基酸序列或与SEQID NO：42至少80％相同的氨基酸序列。
在任一方面的一些实施方式中，多肽进一步包括位于胞外结合结构域和跨膜结构域之间的间隔区结构域。
在任一方面的一些实施方式中，间隔区结构域包括CD8铰链结构域。
在任一方面的一些实施方式中，间隔区包括SEQ ID NO：44的氨基酸序列或与SEQID NO：44至少80％相同的氨基酸序列。
在任一方面的一些实施方式中，多肽包括SEQ ID NOs：80-114中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：80-114中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
在本文所述的一个方面中，是用于在自然杀伤(NK)细胞中表达的嵌合抗原受体(CAR)多肽，所述多肽包括：(a)胞外结合结构域；(b)跨膜结构域；以及(c)包括来自NK细胞受体的至少一个胞内信号转导结构域的胞内结构域。
在任一方面的一些实施方式中，多肽从N-末端到C-末端包括：(a)胞外结合结构域；(b)跨膜结构域；以及(c)胞内结构域。
在任一方面的一些实施方式中，多肽从C-末端到N-末端包括：(a)胞外结合结构域；(b)跨膜结构域；以及(c)胞内结构域。
在任一方面的一些实施方式中，NK细胞受体选自于由2B4、NTB-A、CRACC和CD2组成的组。
在任一方面的一些实施方式中，NK细胞受体是2B4。
在任一方面的一些实施方式中，NK细胞受体是NTB-A。
在任一方面的一些实施方式中，NK细胞受体是CRACC。
在任一方面的一些实施方式中，NK细胞受体是CD2。
在任一方面的一些实施方式中，来自NK细胞受体的胞内信号转导结构域包括SEQID NOs：7-10中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：7-10中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
在任一方面的一些实施方式中，跨膜结构域包括天然NK细胞受体的跨膜结构域。
在任一方面的一些实施方式中，天然NK细胞受体的跨膜结构域选自于由自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)、自然杀伤细胞P46相关蛋白(NKp46)、和DNAX辅助分子-1(DNAM1)组成的组。
在任一方面的一些实施方式中，跨膜结构域包括SEQ ID NOs：29-31或SEQ IDNOs：117-118中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：29-31或SEQ ID NOs：117-118中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
在任一方面的一些实施方式中，胞外结合结构域是抗体、其抗原结合片段、F(ab)片段、F(ab’)片段、单链抗体(scFv)或单域抗体(sdAb)。
在任一方面的一些实施方式中，胞外结合结构域包括scFv。
在任一方面的一些实施方式中，胞外结合结构域特异性地结合至肿瘤相关抗原。
在任一方面的一些实施方式中，肿瘤相关抗原是CD19。
在任一方面的一些实施方式中，肿瘤相关抗原是CD33。
在任一方面的一些实施方式中，胞外结合结构域包括SEQ ID NOs：35-36中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：35-36中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
在任一方面的一些实施方式中，多肽进一步包括位于胞外结合结构域的N-末端的信号肽。
在任一方面的一些实施方式中，信号肽是CD8信号肽。
在任一方面的一些实施方式中，信号肽包括SEQ ID NO：38的氨基酸序列或与SEQID NO：38至少80％相同的氨基酸序列。
在任一方面的一些实施方式中，多肽进一步包括位于胞外结合结构域远端的可检测标志物。
在任一方面的一些实施方式中，可检测标志物是3×FLAG。
在任一方面的一些实施方式中，可检测标志物包括SEQ ID NO：40的氨基酸序列或与SEQ ID NO：40至少80％相同的氨基酸序列。
在任一方面的一些实施方式中，多肽进一步包括位于胞外结合结构域远端和/或位于可检测标志物和/或信号肽近端的连接子结构域。
在任一方面的一些实施方式中，连接子包括SEQ ID NO：42的氨基酸序列或与SEQID NO：42至少80％相同的氨基酸序列。
在任一方面的一些实施方式中，多肽进一步包括位于胞外结合结构域和跨膜结构域之间的间隔区结构域。
在任一方面的一些实施方式中，间隔区结构域包括CD8铰链结构域。
在任一方面的一些实施方式中，间隔区包括SEQ ID NO：44的氨基酸序列或与SEQID NO：44至少80％相同的氨基酸序列。
在任一方面的一些实施方式中，多肽包括SEQ ID NOs：90-105或SEQ ID NOs：110-114中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：90-105或SEQ ID NOs：110-114中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
在本文所述的一个方面中，是用于在自然杀伤(NK)细胞中表达的嵌合抗原受体(CAR)多肽，所述多肽包括(a)胞外结合结构域；(b)跨膜结构域；以及(c)胞内结构域，该胞内结构域包括以下中的至少一种：(i)来自NK细胞膜结合信号转导接头蛋白的胞内信号转导结构域；和/或(ii)来自共刺激受体的胞内共刺激结构域。
在任一方面的一些实施方式中，多肽从N-末端到C-末端包括：(a)胞外结合结构域；(b)跨膜结构域；以及(c)胞内结构域。
在任一方面的一些实施方式中，多肽从C-末端到N-末端包括：(a)胞外结合结构域；(b)跨膜结构域；以及(c)胞内结构域。
在任一方面的一些实施方式中，NK细胞膜结合信号转导接头蛋白是CD3ζ或FcεR1。
在任一方面的一些实施方式中，来自NK细胞膜结合信号转导接头蛋白的胞内信号转导结构域包括SEQ ID NOs：11-12中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：11-12中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
在任一方面的一些实施方式中，共刺激受体是4-1BB和/或IL2受体β(IL2RB)。
在任一方面的一些实施方式中，来自共刺激受体的胞内共刺激结构域包括SEQ IDNOs：15-16中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：15-16中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
在任一方面的一些实施方式中，胞内结构域进一步包括至少一种自剪切肽。
在任一方面的一些实施方式中，自剪切肽是T2A、P2A、E2A或F2A。
在任一方面的一些实施方式中，自剪切肽包括SEQ ID NOs：19-20中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：19-20中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
在任一方面的一些实施方式中，其中胞内结构域进一步包括细胞因子。
在任一方面的一些实施方式中，细胞因子是IL-15或IL-21。
在任一方面的一些实施方式中，细胞因子包括SEQ ID NOs：23-24中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：23-24中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
在任一方面的一些实施方式中，胞内结构域进一步包括至少一种自剪切肽和至少一种细胞因子。
在任一方面的一些实施方式中，细胞因子与自剪切肽相邻且位于自剪切肽远端，使得细胞因子通过自剪切肽与多肽分隔开。
在任一方面的一些实施方式中，跨膜结构域包括CD8的跨膜结构域。
在任一方面的一些实施方式中，跨膜结构域包括SEQ ID NO：32的氨基酸序列或与SEQ ID NO：32至少80％相同的氨基酸序列。
在任一方面的一些实施方式中，胞外结合结构域是抗体、其抗原结合片段、F(ab)片段、F(ab’)片段、单链抗体(scFv)或单域抗体(sdAb)。
在任一方面的一些实施方式中，胞外结合结构域包括scFv。
在任一方面的一些实施方式中，胞外结合结构域特异性地结合至肿瘤相关抗原。
在任一方面的一些实施方式中，肿瘤相关抗原是CD19。
在任一方面的一些实施方式中，肿瘤相关抗原是CD33。
在任一方面的一些实施方式中，胞外结合结构域包括SEQ ID NOs：35-36中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：35-36中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
在任一方面的一些实施方式中，多肽进一步包括位于胞外结合结构域的N-末端的信号肽。
在任一方面的一些实施方式中，信号肽是CD8信号肽。
在任一方面的一些实施方式中，信号肽包括SEQ ID NO：38的氨基酸序列或与SEQID NO：38至少80％相同的氨基酸序列。
在任一方面的一些实施方式中，多肽进一步包括位于胞外结合结构域远端的可检测标志物。
在任一方面的一些实施方式中，可检测标志物是3×FLAG。
在任一方面的一些实施方式中，可检测标志物包括SEQ ID NO：40的氨基酸序列或与SEQ ID NO：40至少80％相同的氨基酸序列。
在任一方面的一些实施方式中，多肽还包括位于胞外结合结构域远端和/或位于可检测标志物和/或信号肽近端的连接子结构域。
在任一方面的一些实施方式中，连接子包括SEQ ID NO：42的氨基酸序列或与SEQID NO：42至少80％相同的氨基酸序列。
在任一方面的一些实施方式中，多肽还包括位于胞外结合结构域和跨膜结构域之间的间隔区结构域。
在任一方面的一些实施方式中，间隔区结构域包括CD8铰链结构域。
在任一方面的一些实施方式中，间隔区包括SEQ ID NO：44的氨基酸序列或与SEQID NO：44至少80％相同的氨基酸序列。
在任一方面的一些实施方式中，多肽包括SEQ ID NOs：80-89或SEQ ID NOs：106-109中的一个的氨基酸序列，或与SEQ ID NOs：80-89或SEQ ID NOs：106-109中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
在本文所述的一个方面中，是编码本文所述多肽的多核苷酸。
在任一方面的一些实施方式中，多核苷酸包括SEQ ID NOs：45-79中的一个，或与SEQ ID NOs：45-79中的一个至少80％相同的核酸序列。
在本文所述的一个方面中，是包括本文所述多核苷酸的载体。
在任一方面的一些实施方式中，载体包括慢病毒载体。
在本文所述的一个方面中，是包括本文所述多肽、本文所述多核苷酸或本文所述载体的慢病毒。
在本文所述的一个方面中，是包括本文所述多肽、本文所述多核苷酸、本文所述载体或本文所述慢病毒的细胞或其细胞群。
在任一方面的一些实施方式中，所述细胞包括免疫细胞。
在任一方面的一些实施方式中，免疫细胞包括自然杀伤(NK)细胞。
在本文所述的一个方面中，是一种药物组合物，该组合物包括本文所述多肽、本文所述多核苷酸、本文所述载体、本文所述慢病毒或本文所述细胞，以及药学上可接受的运载体。
在本文所述的一个方面中，是一种增加NK细胞或细胞群的活化的方法，所述方法包括使所述细胞或其细胞群与本文所述多肽、本文所述多核苷酸、本文所述载体或本文所述慢病毒接触。
在任一方面的一些实施方式中，与接触多肽、多核苷酸、载体或慢病毒之前相比，将NK细胞或其细胞群与多肽、多核苷酸、载体或慢病毒接触使NK细胞的活性增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少200％、至少300％、至少400％或至少500％。
在任一方面的一些实施方式中，NK细胞或其细胞群的增加的活化包括选自于由TNFα、IFNγ、GM-CSF和颗粒酶B组成的组中的细胞因子或颗粒酶的表达增加。
在任一方面的一些实施方式中，NK细胞或其细胞群的增加的活化引起靶细胞的特异性裂解增加。
在任一方面的一些实施方式中，靶细胞表达特异性地结合至多肽的胞外结合结构域的表面抗原。
在任一方面的一些实施方式中，靶细胞是癌细胞。
在任一方面的一些实施方式中，靶细胞是被病毒或细菌感染的细胞。
在本文所述的一个方面中，是一种对需要基于CAR的治疗剂的受试者进行治疗的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的基于CAR的治疗剂，所述治疗剂选自于由以下组成的组：本文所述多肽、本文所述多核苷酸、本文所述载体、本文所述慢病毒、本文所述细胞或其细胞群以及本文所述药物组合物。
在任一方面的一些实施方式中，受试者患有癌症或被诊断患有癌症。
在任一方面的一些实施方式中，受试者患有或已经被诊断患有肾上腺癌、肛门癌、阑尾癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、胆囊癌、妊娠滋养细胞疾病、头颈部癌、霍奇金淋巴瘤、肠癌、肾癌、白血病、肝癌、肺癌、黑色素瘤、梅克尔细胞癌(Merkel cell carcinoma)、间皮瘤、多发性骨髓瘤、神经内分泌肿瘤、非霍奇金淋巴瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、鼻窦癌、皮肤癌、肉瘤、软组织肉瘤、脊柱癌、胃癌、睾丸癌、喉癌、肿瘤、甲状腺癌、子宫癌、阴道癌或外阴癌。
在任一方面的一些实施方式中，基于CAR的治疗剂的施用引起由CAR靶向的癌细胞的特异性裂解增加。
在任一方面的一些实施方式中，受试者患有感染性疾病或已被诊断患有感染性疾病。
在任一方面的一些实施方式中，感染性疾病是病毒性或细菌性疾病。
在任一方面的一些实施方式中，基于CAR的治疗剂的施用引起由CAR靶向的感染细胞的特异性裂解增加。
在本文所述的一个方面中，是制备治疗组合物的方法，该方法包括在允许多肽在细胞中表达的条件下，将编码本文所述多肽的核酸、本文所述多核苷酸、本文所述载体或本文所述慢病毒引入NK细胞。
在任一方面的一些实施方式中，在引入核酸、多核苷酸、载体或慢病毒之前，从需要治疗组合物的受试者中移除NK细胞。
在任一方面的一些实施方式中，在引入核酸、多核苷酸、载体或慢病毒后，将NK细胞返回受试者。
附图说明
图1是显示CD19 NK CARs对表达CD19的A549细胞系的细胞毒性的折线图。
图2是显示CD19 NK CARs对Raji细胞系的细胞毒性的柱状图(钙黄绿素-AM测定)。
图3是显示CD19 NK CARs对Raji细胞系的细胞毒性的柱状图(钙黄绿素-AM测定)。
图4A是显示CD19 NK CARs对Nalm6-GFP-荧光素酶细胞系的细胞毒性的折线图(生物发光测定)。图4B是显示NK CARs对Nalm6-GFP-荧光素酶细胞系的细胞毒性的折线图(生物发光测定)。
图5是显示CD19 NK CARs对Raji细胞系的细胞毒性的柱状图(钙黄绿素-AM测定)。
图6A是显示CD19 NK CARs对Nalm6-GFP-荧光素酶细胞系的细胞毒性的折线图(生物发光测定)。图6B是显示NK CARs对Nalm6-GFP-荧光素酶细胞系的细胞毒性的折线图(生物发光测定)。
图7是显示CD19 NK CARs对Raji细胞系的细胞毒性的柱状图(钙黄绿素-AM测定)。
图8是显示CD19 NK CARs对Nalm6-GFP-荧光素酶细胞系的细胞毒性的折线图(生物发光测定)。
图9是显示CD19 NK CARs对Raji细胞系的细胞毒性的柱状图(钙黄绿素-AM测定)。
图10是显示CD19 NK CARs对Nalm6-GFP-荧光素酶细胞系的细胞毒性的折线图(生物发光测定)。
图11是显示不同CD19 NK CAR细胞的细胞因子TNF-α释放的柱状图。
图12是显示不同CD19 NK CAR细胞的细胞因子IFN-γ释放的柱状图。
图13是显示不同CD19 NK CAR细胞的细胞因子GM-CSF释放的柱状图。
图14是显示不同CD19 NK CAR细胞的颗粒酶B释放的柱状图。
图15是第I组和第II组CD19 NK CAR构建体的示意图。
图16是第III组和第IV组CD19 NK CAR构建体的示意图。
图17是NK CAR构建体的示意图。
图18是CD33 NK CAR构建体的示意图。
图19是显示CD33 NK CARs对U937细胞系的细胞毒性的柱状图。
图20A-图20E是处于1:1的效靶比的CD33 NK CAR细胞的一系列24h FACS图。
图21A-图21D是处于1:4的效靶比的CD33 NK CAR细胞的一系列24h FACS图。
图22A-图22E是处于1:1的效靶比的CD33 NK CAR细胞的一系列48h FACS图。
图23A-图23D是处于1:4的效靶比的CD33 NK CAR细胞的一系列48h FACS图。
图24A是总结处于1:1的效靶比的CD33 NK CAR细胞的24h和48h FACS数据的柱状图。图24B是总结处于1:4的效靶比的CD33NK CAR细胞的24h和48h FACS数据的柱状图。
具体实施方式
该技术涉及可在自然杀伤(NK)细胞中表达的嵌合抗原受体(CAR)构建体，以及它们用于工程化或修饰NK细胞以靶向表达给定细胞表面标志物或肿瘤抗原的癌细胞或感染有病原体的细胞的用途。例如，被设计为将T细胞靶向至表达给定标志物或肿瘤抗原的细胞的一些CAR构建体可以起到将NK细胞靶向至相同靶细胞的作用，但考虑到NK细胞与T细胞相比的胞内信号转导的差异，这种活性的效率很低。就此而言，为NK细胞中的功能而设计的CAR构建体可以提供优越的结果。因此，本文所述的是CAR构建体，该构建体可用于工程化NK细胞以靶向并杀死表达给定的细胞表面标志物或肿瘤抗原的细胞。下文描述了用于治疗癌症和感染性疾病的CAR-NK细胞的工程化、制备和使用中涉及的组合物、方法和注意事项。
因此，本文所述的技术涉及自然杀伤(NK)细胞CAR多肽，所述多肽包括来自NK相关多肽的胞内信号转导结构域、胞内共刺激结构域和/或跨膜结构域。在各个方面中，本文描述了表达这种NK CAR多肽的多核苷酸、载体或细胞，以及包括这种NK CAR多肽、多核苷酸、载体或细胞的药物组合物。本文还描述了使用此类NK CAR多肽的方法，例如，用于治疗各种疾病和疾患，例如，癌症或感染性疾病。
多肽
在各个方面中，本文所述的是NK CAR多肽，该多肽包括以下结构域中的至少一个：胞外结合结构域、跨膜结构域、胞内信号转导结构域、胞内共刺激结构域、可检测标志物、自剪切肽和/或细胞因子，或其任何组合。本文所述的特定CAR不应被解释为限制，而是应用所述原理和技术的例证。在各个方面中，本文描述的是NK CAR多肽，该多肽包括胞外结合结构域、跨膜结构域和至少一个胞内信号转导结构域。
例如，在本文中考虑之列的是以下组合(参见例如表7)：
表7：NK-CAR多肽中的结构域的示例性组合。“ED”表示胞外结构域(其本身可以包括胞外结合结构域、信号肽、连接子结构域、可检测标志物和/或间隔区结构域)。“TM”表示跨膜结构域。“IS”表示胞内信号转导结构域。“IC”表示胞内共刺激结构域。“DM”表示可检测标志物。“SP”表示自剪切肽。“Cy”表示细胞因子。
在任一方面的一些实施方式中，NK-CAR多肽可包括胞外结合结构域、信号肽、连接子结构域、间隔区结构域、跨膜结构域、胞内信号转导结构域、胞内共刺激结构域、可检测标志物、自剪切肽和/或细胞因子，如本文进一步描述的。关于本文所述的各种多肽结构域的讨论，参见例如，美国专利10640570B2；Li等，2018，Cell Stem Cell 23：1-12；Bryceson等，2006，Blood 107：159-166；Claus等，2008，Frontiers in Bioscience 13：956-965；其各自的内容通过引用整体并入本文。本文进一步描述了示例性NK CAR多肽。
胞内结构域
在各个方面中，本文描述的是包括至少一个胞内结构域的NK CAR多肽。如本文进一步描述的，这种胞内结构域可包括但不限于：胞内信号转导结构域、胞内共刺激结构域、自剪切肽、细胞因子和可检测标志物。NK CAR多肽可包括胞内信号转导结构域、胞内共刺激结构域、自剪切肽、细胞因子和可检测标志物的任何组合，如表7所例示的。
在任一方面的一些实施方式中，CAR多肽包括1个、2个、3个、4个、5个或更多个胞内结构域，例如，选自至少一个胞内信号转导结构域、至少一个胞内共刺激结构域、至少一个自剪切肽、至少一个细胞因子和/或至少一个可检测标志物。在任一方面的一些实施方式中，CAR多肽包括一个胞内结构域。在任一方面的一些实施方式中，CAR多肽包括两个胞内结构域。在任一方面的一些实施方式中，CAR多肽包括三个胞内结构域。在任一方面的一些实施方式中，CAR多肽包括四个胞内结构域。在任一方面的一些实施方式中，CAR多肽包括五个胞内结构域。在任一方面的一些实施方式中，CAR多肽包括六个胞内结构域。在包括多个胞内结构域的实施方式中，多个胞内结构域可以是不同的单个胞内结构域或同一胞内结构域的多个拷贝，或前述的组合。
用于本文所述的NK CAR多肽中的胞内结构域的非限制性实例包括：(a)来自NK细胞受体的胞内信号转导结构域；(b)来自NK细胞膜结合信号转导接头蛋白的胞内信号转导结构域；和/或(c)来自共刺激受体的胞内共刺激结构域。
在任一方面的一些实施方式中，CAR多肽包括：(a)来自NK细胞受体的胞内信号转导结构域；(b)来自NK细胞膜结合信号转导接头蛋白的胞内信号转导结构域；和(c)来自共刺激受体的胞内共刺激结构域。在任一方面的一些实施方式中，CAR多肽包括：(a)来自NK细胞受体的胞内信号转导结构域。在任一方面的一些实施方式中，CAR多肽包括：(b)来自NK细胞膜结合信号转导接头蛋白的胞内信号转导结构域。在任一方面的一些实施方式中，CAR多肽包括：(c)来自共刺激受体的胞内共刺激结构域。
在任一方面的一些实施方式中，CAR多肽包括：(a)来自NK细胞受体的胞内信号转导结构域；和(b)来自NK细胞膜结合信号转导接头蛋白的胞内信号转导结构域。在任一方面的一些实施方式中，CAR多肽包括：(a)来自NK细胞受体的胞内信号转导结构域；和(c)来自共刺激受体的胞内共刺激结构域。在任一方面的一些实施方式中，CAR多肽包括：(b)来自NK细胞膜结合信号转导接头蛋白的胞内信号转导结构域；和(c)来自共刺激受体的胞内共刺激结构域。
胞内信号转导结构域
本文所述的NK CAR多肽的胞内信号转导结构域负责活化CAR所在的免疫细胞的至少一种正常效应子功能。术语“效应子功能”是指细胞的专门功能。例如，自然杀伤(NK)细胞的效应子功能可以是细胞裂解活性。因此，术语“胞内信号转导结构域”是指转导效应子功能信号(例如，来自特异性结合其同源抗原的胞外结合结构域)并指导细胞执行专门功能的多肽部分。虽然通常可以使用整个胞内信号转导结构域，但在许多情况下不需要使用整个链。如果使用胞内信号转导结构域的截短部分，这种截短部分可以代替完整链使用，只要它转导效应子功能信号即可。因此，术语“胞内信号转导结构域”意指包括足以转导效应子功能信号的胞内信号转导结构域的任何截短部分。
在任一方面的一些实施方式中，CAR多肽包括1个、2个、3个、4个、5个或更多个胞内信号转导结构域。在任一方面的一些实施方式中，CAR多肽包括三个胞内信号转导结构域。在包括多个胞内信号转导结构域的实施方式中，多个胞内信号转导结构域可为不同的单个胞内信号转导结构域或同一胞内信号转导结构域的多个拷贝，或前述的组合。
在任一方面的一些实施方式中，CAR多肽包括来自NK细胞受体的胞内信号转导结构域和/或来自NK细胞膜结合信号转导接头蛋白的胞内信号转导结构域。在任一方面的一些实施方式中，NK细胞受体或NK细胞膜结合信号转导接头蛋白(例如，至少一个胞内信号转导结构域从其衍生)选自于由以下组成的组：自然杀伤细胞受体2B4；自然杀伤细胞、T细胞和B细胞抗原(NTB-A)；CD2样细胞毒性细胞活化受体(CRACC)；分化簇2(CD2)；高亲和力IgE受体(FcεR1)；和CD3-zeta(CD3ζ)。在任一方面的一些实施方式中，来自NK细胞受体或来自NK细胞膜结合信号转导接头蛋白的胞内信号转导结构域包括免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)，该基序为重复两次的四个氨基酸的保守序列，其可启动多种信号转导途径并随后活化NK细胞。在任一方面的一些实施方式中，来自NK细胞受体或来自NK细胞膜结合信号转导接头蛋白的胞内信号转导结构域包括免疫受体酪氨酸转换基序(ITSMs)，其可取决于所结合的接头蛋白的类型而引起活化或抑制。
在任一方面的一些实施方式中，本文所述的CAR多肽的胞内信号转导结构域包括SEQ ID NOs：7-12中的一个，或与SEQ ID NOs：7-12中的一个序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，该氨基酸序列保持与SEQ ID NOs：7-12中的一个相同的功能(例如，通过结合其同源抗原来活化CAR多肽时的胞内信号转导)。在任一方面的一些实施方式中，如本文所述的CAR多肽的胞内信号转导结构域包括SEQ ID NOs：7-12中的一个，或保持相同功能的与SEQ ID NOs：7-12中的一个序列至少95％相同的氨基酸序列。
在任一方面的一些实施方式中，本文所述的CAR多肽的胞内信号转导结构域由如下编码：包括SEQ ID NOs：1-6中的一个的核酸序列，或保持相同功能的与SEQ ID NOs：1-6中的一个至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列，或SEQID NOs：1-6中的一个的密码子优化的版本。在任一方面的一些实施方式中，本文所述的CAR多肽的胞内信号转导结构域由如下编码：包括SEQ ID NOs：1-6中的一个的核酸序列，或保持相同功能的与SEQ ID NOs：1-6中的一个至少95％相同的序列。
本文所述的NK CAR多肽的细胞质信号转导部分内的细胞质信号转导序列可以以随机或特定的顺序彼此连接。任选地，长度优选在2至10个氨基酸之间的短的寡肽或多肽连接子可以形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了特别合适的连接子。
NK细胞受体
用于修饰NK细胞的嵌合抗原受体可以包括天然存在的NK细胞受体的结构域和/或变体。如本文所述，NK CAR多肽可包括来自NK细胞受体的胞内信号转导结构域。如本文所用，术语“NK细胞受体”是指由NK细胞表达的多肽，其包括与细胞之外的配体相互作用的胞外结构域；NK细胞受体还包括跨膜结构域和至少一个胞内信号转导结构域，其实例在本文中进一步描述。NK细胞受体可以是活化受体、抑制性受体、趋化性受体、粘附受体或细胞因子受体，这取决于配体的类型和在配体结合时由胞内信号转导结构域转导的胞内信号的类型。在任一方面的一些实施方式中，本文所述的NK CAR多肽包括NK活化细胞受体。本文所述的可被改编或修饰的用于NK CAR多肽的NK活化细胞受体或其结构域(例如，胞内信号转导结构域)的非限制性实例包括：NKp46、CD16、hNKp30、hNKp44、hNKp80、mNKR-P1C、NKG2D、mNKG2D-S、hKIR-S、mAct Ly49、CD94/NKG2C、CRACC、Ly9、CD84、NTBA和2B4；参见例如，Vivier等，Science 331(6013)：44-9(2011)，其内容通过引用整体并入本文。表10中提供了NK活化受体及其相应的接头的非限制性实例。在一些实施方式中，NK CAR多肽包括表10中列出的活化受体或接头蛋白的胞内信号转导结构域。
表10：活化受体及其相应的接头蛋白
活化受体 接头
NKp46 CD3ζ，FcRγ
CD16 CD3ζ，FcRγ
h NKp30 CD3ζ，FcRγ
h NKp44 DAP12
h NKp80 -
m NKR-P1C FcRγ
NKG2D DAP10
m NKG2D-S DAP12
h KIR-S DAP12
m Act.Ly49 DAP12，DAP10
CD94/NKG2C DAP12
CRACC SAP，EAT2
Ly9 SAP
CD84 SAP，EAT2
NTBA SAP
2B4 SAP，EAT2，ERT
在任一方面的一些实施方式中，如本文所述的可被改编或修饰用于NK CAR多肽的NK细胞受体或其结构域(例如，胞内信号转导结构域)是免疫细胞受体的信号淋巴细胞活化分子(SLAM)家族的成员。SLAM家族与免疫球蛋白(Ig)超家族分子的CD2家族密切相关。SLAM家族成员的非限制性实例包括SLAM、CD48、CD229、2B4、CD84、NTB-A、CRACC、BLAME和CD2F-10。在任一方面的一些实施方式中，NK细胞受体是CD2家族的成员。在任一方面的一些实施方式中，NK细胞受体选自于由2B4、NTB-A、CRACC和CD2组成的组。
1.2B4
在任一方面的一些实施方式中，如本文所述的可被改编或修饰用于NK CAR多肽的NK细胞受体或其结构域(例如，胞内信号转导结构域)是自然杀伤细胞受体2B4。NK细胞I型受体蛋白2B4也可互换地称为CD244、自然杀伤细胞受体2B4(NKR2B4)、信号淋巴细胞活化分子家族成员4(SLAMF4)、NK细胞活化诱导配体(NAIL)或Nmrk。2B4是在自然杀伤(NK)细胞(和一些T细胞)上表达的细胞表面受体，该受体介导非主要组织相容性复合体(MHC)限制性杀伤。2B4的天然配体是CD48，它在造血细胞上表达。NK细胞和靶细胞之间通过2B4受体的相互作用调节NK细胞的细胞裂解活性。对于2B4基因，已经描述了编码不同亚型的可变剪接转录变体。2B4的胞内信号转导结构域刺激NK细胞的细胞毒性、IFN-γ的产生和颗粒胞吐。SLAM家族受体(如2B4、CRACC或NTB-A)可包括具有共有序列T-X-Y-X-X-[VI]的免疫受体酪氨酸转换基序(ITSMs)，其对活化和抑制性的含有SH2结构域的结合伴侣具有重叠特异性。ITSMs可以介导与接头蛋白SH2D1A(SAP)和SH2D1B(EAT-2)的SH2结构域的相互作用。
在任一方面的一些实施方式中，2B4包括SEQ ID NO：123或与SEQ ID NO：123至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，该氨基酸序列保持与SEQ ID NO：123相同的功能(例如，响应于胞外配体结合的胞内信号转导；ITSM功能)。在任一方面的一些实施方式中，如本文所述的NK-CAR的胞内信号转导结构域包括2B4的胞内部分(例如，SEQ ID NO：123)。在任一方面的一些实施方式中，胞内信号转导结构域包括SEQ ID NO：7(即SEQ ID NO：123的残基251-370)或与SEQ ID NO：7至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，该氨基酸序列保持与SEQ ID NO：7相同的功能(例如，响应于胞外配体结合的胞内信号转导；ITSM功能)。
2B4的ITSMs包括SEQ ID NO：123的残基269-274(ITSM 1)、295-300(ITSM 2)、315-320(ITSM 3)和340-345(ITSM 4)，在SEQ ID NO：123的残基271、297、317和342处具有酪氨酸磷酸化位点。因此，在任一方面的一些实施方式中，胞内信号转导结构域包括与2B4的胞内信号转导结构域(例如，SEQ ID NO：123的残基251-370；SEQ ID NO：7)实质上相似(例如，至少70％相同)的序列，不包括SEQ ID NO：123的残基269-274、295-300、315-320或340-345处的突变，不包括SEQ ID NO：123的残基271、297、317或342处的突变，或包括SEQ ID NO：123的残基271、297、317或342处的酪氨酸。
SEQ ID NO：123，自然杀伤细胞受体2B4亚型2前体[智人]，NCBI参考序列：NP_001160135.1，370个氨基酸(aa)；粗体文本表示ITSMs，且双下划线文本表示磷酸化位点。
SEQ ID NO：1(多核苷酸)和SEQ ID NO：7(氨基酸)提供了示例性的2B4胞内信号转导结构域(例如，2B4的残基251-370；参见例如，SEQ ID NO：123的示例性全长2B4多肽序列)。
SEQ ID NO：1
SEQ ID NO：7
2.CRACC
在任一方面的一些实施方式中，如本文所述的可被改编或修饰用于NK CAR多肽的NK细胞受体或其结构域(例如，胞内信号转导结构域)是CD2样细胞毒性细胞活化受体(CRACC)。CRACC也可互换地称为SLAM家族成员7(SLAMF7)、CD319、CS1、膜蛋白FOAP-12、CD2亚群1、蛋白19A、新型LY9(淋巴细胞抗原9)样蛋白或19A24蛋白。CRACC是CD2家族的细胞表面受体，其触发NK细胞介导的细胞毒性。CRACC可以与小的细胞质接头蛋白SH2D1A/SAP和/或SH2D1B/EAT-2结合。CRACC包括细胞质酪氨酸基序、免疫受体酪氨酸转换基序(ITSMs)，其类似于在NK细胞受体2B4中发现的那些基序。
在任一方面的一些实施方式中，CRACC包括SEQ ID NO：124或与SEQ ID NO：124至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，该氨基酸序列保持与SEQ ID NO：124相同的功能(例如响应于胞外配体结合的胞内信号转导；ITSM功能)。在任一方面的一些实施方式中，如本文所述的NK-CAR的胞内信号转导结构域包括CRACC的胞内部分(例如SEQ ID NO：124)。在任一方面的一些实施方式中，胞内信号转导结构域包括SEQ ID NO：8(即SEQ ID NO：124的残基248-335)或与SEQ ID NO：8至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，该氨基酸序列保持与SEQ IDNO：8相同的功能(例如，响应于胞外配体结合的胞内信号转导；ITSM功能)。
CRACC包括ITSM-样基序(例如SEQ ID NO：124的残基282-287)和ITSM(例如SEQ IDNO：124的残基302-307)，在SEQ ID NO：124的残基284和304处具有酪氨酸磷酸化位点。因此，在任一方面的一些实施方式中，胞内信号转导结构域包括与CRACC的胞内信号转导结构域(例如SEQ ID NO：124的残基248-335；SEQ ID NO：8)实质相似(例如至少70％相同)的序列，不包括SEQ ID NO：124的残基282-287或302-307处的突变，不包括SEQ ID NO：124的残基284或304处的突变，或包括SEQ ID NO：124的残基284或304处的酪氨酸。
SEQ ID NO：124，CRACC(SLAM家族成员7)亚型a前体[智人]，NCBI参考序列：NP_067004.3，335aa；粗体文本分别表示ITSM-样基序和ITSM，且双下划线文本表示磷酸化位点。
SEQ ID NO：2(多核苷酸)和SEQ ID NO：8(氨基酸)提供了示例性的CRACC胞内信号转导结构域(例如，CRACC的残基248-335；参见例如，SEQ ID NO：124的示例性全长2B4多肽序列)。
SEQ ID NO：2
SEQ ID NO：8
3.NTB-A
在任一方面的一些实施方式中，如本文所述的可被改编或修饰用于NK CAR多肽的NK细胞受体或其结构域(例如，胞内信号转导结构域)是自然杀伤细胞、T细胞和B细胞抗原(NTB-A)。NTB-A也可互换地称为NK-T-B-Ag、SLAM家族成员6(SLAMF6)、CD352、Ly108、NTBA、KALI、KALIb或SF2000。NTB-A在NK细胞以及T和B淋巴细胞上表达。NTB-A经历酪氨酸磷酸化，并与含有Src同源2结构域的蛋白(SH2D1A)以及含有SH2结构域的磷酸酶(SHPs)结合。NTB-A在NK细胞活化过程中可以起到辅助受体的作用。
在任一方面的一些实施方式中，NTB-A包括SEQ ID NO：126或与SEQ ID NO：126至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，该氨基酸序列保持与SEQ ID NO：126相同的功能(例如，响应于胞外配体结合的胞内信号转导；ITSM功能)。在任一方面的一些实施方式中，如本文所述的NK-CAR的胞内信号转导结构域包括NTB-A的胞内部分(例如，SEQ ID NO：126)。在任一方面的一些实施方式中，胞内信号转导结构域包括SEQ ID NO：10(即SEQ ID NO：126的残基248-331)或与SEQ ID NO：10至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，该氨基酸序列保持与SEQ IDNO：10相同的功能(例如，响应于胞外配体结合的胞内信号转导；ITSM功能)。
NTB-A在SEQ ID NO：126的残基282-287和306-311处包括两个ITSMs，在SEQ IDNO：126的残基284和308处具有酪氨酸磷酸化位点。因此，在任一方面的一些实施方式中，胞内信号转导结构域包括与NTB-A的胞内信号转导结构域(例如，SEQ ID NO：126的残基248-331；SEQ ID NO：10)实质上相似(例如，至少70％相同)的序列，不包括SEQ ID NO：126的残基282-287或306-311处的突变，或不包括SEQ ID NO：126的残基284或308处的突变，或包括SEQ ID NO：126的残基284或308处的酪氨酸。
SEQ ID NO：126，NTB-A(SLAM家族成员6)亚型2前体[智人]，NCBI参考序列：NP_443163.1，331aa；粗体文本表示ITSMs，且双下划线文本表示磷酸化位点。
SEQ ID NO：4(多核苷酸)和SEQ ID NO：10(氨基酸)提供示例性的NTB-A胞内信号转导结构域(例如，NTB-A的残基248-331；参见例如，SEQ ID NO：126的示例性全长NTB-A多肽序列)
SEQ ID NO：4
SEQ ID NO：10
4.CD2
在任一方面的一些实施方式中，如本文所述的可被改编或修饰用于NK CAR多肽的NK细胞受体或其结构域(例如，胞内信号转导结构域)是分化簇2(CD2)。CD2也可互换地称为淋巴细胞功能抗原-2(LFA-2)、P50、绵羊红细胞受体(SRBC)、T11、Leu-5、红细胞受体、玫瑰花结受体或LFA-3受体。CD2由胸腺细胞、外周T细胞、NK细胞和胸腺B细胞亚群表达。CD2与抗原呈递细胞上的LFA3(CD58)相互作用。CD2本身没有酶活性，但部分地通过与CD3zeta的相互作用传递信号。CD2以自发性(例如，抗体非依赖性的)NK细胞细胞毒性将CD16募集到NK细胞免疫突触；参见例如，Christian B等，CD2 Immunobiology.Front Immunol，2020，11：1090，其内容通过引用整体并入本文。
在任一方面的一些实施方式中，CD2包括SEQ ID NO：125或与SEQ ID NO：125至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，该氨基酸序列保持与SEQ ID NO：125相同的功能(例如，响应于胞外配体结合的胞内信号转导)。在任一方面的一些实施方式中，如本文所述的NK-CAR的胞内信号转导结构域包括CD2的胞内部分(例如，SEQ ID NO：125)。在任一方面的一些实施方式中，胞内信号转导结构域包括SEQ ID NO：9(即SEQ ID NO：125的残基236-251)或与SEQ ID NO：9至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，该氨基酸序列保持与SEQ ID NO：9相同的功能(例如，响应于胞外配体结合的胞内信号转导)。
SEQ ID NO：125，T-细胞表面抗原CD2亚型2前体[智人]，NCBI参考序列：NP_001758.2，351aa
SEQ ID NO：3(多核苷酸)和SEQ ID NO：9(氨基酸)提供了示例性的CD2胞内信号转导结构域(例如，CD2的残基236-351；参见例如，SEQ ID NO：125的示例性全长CD2多肽序列)。
SEQ ID NO：3
SEQ ID NO：9
接头蛋白
在任一方面的一些实施方式中，CAR多肽包括来自NK细胞膜结合信号转导接头蛋白的胞内信号转导结构域。如本文所用，术语“NK细胞膜结合信号转导接头蛋白”，也可互换地称为“接头蛋白”，是指由NK细胞表达并与细胞膜结合的多肽，其与NK细胞受体特异性相互作用并通过接头的胞内信号转导结构域转导受体的信号。在任一方面的一些实施方式中，本文所述的NK CAR多肽包括与NK活化细胞受体结合的接头蛋白的胞内区域，所述接头蛋白通常不包括其自身的胞内信号转导结构域。本文所述的可被改编或修饰以用于NK CAR多肽的NK接头蛋白或其结构域(例如，胞内信号转导结构域)的非限制性实例包括CD3zeta、FcRγ(其可包括FcεRIγ)、DAP12、DAP10、SAP、EAT2和ERT。在任一方面的一些实施方式中，NK细胞膜结合信号转导接头蛋白是FcεRI(例如，FcεRIγ)或CD3zeta。
1.FcεRI
在任一方面的一些实施方式中，如本文所述的可被改编或修饰以用于NK CAR多肽的NK细胞膜结合信号转导接头蛋白或其结构域(例如，胞内信号转导结构域)是高亲和力IgE受体(FcεRI)。FcεRI也称为Fc epsilon RI。FcεRI是免疫球蛋白E(IgE)的Fc区的高亲和力受体，该免疫球蛋白是参与过敏和寄生虫免疫的抗体同种型。FcεRI是四聚体受体复合物，由通过肥大细胞和嗜碱性粒细胞上的两个二硫键连接的两个γ链(FcεRIγ-下游信号起始的位点)、一个α链(FcεRIα-抗体结合位点)和一个β链(FcεRIβ-其放大下游信号)组成。在任一方面的一些实施方式中，NK细胞接头蛋白为FcεRIγ，其也可互换地称为Fc-EpsilonRI-Gamma或FCER1G。在人类自然杀伤(NK)细胞上，FcεRIγ也可以与FcγRIIIa(CD16a)结合以形成IgG的低亲和力受体。
在任一方面的一些实施方式中，FcεRIγ包括SEQ ID NO：127或与SEQ ID NO：127至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，该氨基酸序列保持与SEQ ID NO：127相同的功能(例如，胞内信号转导；ITAM功能)。在任一方面的一些实施方式中，如本文所述的NK-CAR的胞内信号转导结构域包括FcεRIγ的胞内部分(例如，SEQ ID NO：127)。在任一方面的一些实施方式中，胞内信号转导结构域包括SEQ ID NO：12(即SEQ ID NO：127的残基45-86)或与SEQ ID NO：12至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，该氨基酸序列保持与SEQ ID NO：12相同的功能(例如，胞内信号转导；ITAM功能)。
FcεRIγ在SEQ ID NO：127的残基62至82处包括ITAM，在SEQ ID NO：127的残基65和76处具有酪氨酸磷酸化位点。因此，在任一方面的一些实施方式中，胞内信号转导结构域包括与FcεRIγ的胞内信号转导结构域(例如，SEQ ID NO：127的残基45-86；SEQ ID NO：12)实质上相似(例如，至少70％相同)的序列，不包括SEQ ID NO：127的残基62-82处的突变，不包括SEQ ID NO：127的残基65或76处的突变，或包括SEQ ID NO：127的残基65或76处的酪氨酸。
SEQ ID NO：127，高亲和力免疫球蛋白ε受体亚基γ前体[智人]，NCBI参考序列：NP_004097.1，86aa；粗体文本表示ITAM，且双下划线文本表示磷酸化位点。
SEQ ID NO：6(多核苷酸)和SEQ ID NO：12(氨基酸)提供了示例性的FceR胞内信号转导结构域(例如，FceRI的残基45-86；参见例如，SEQ ID NO：127的示例性全长FceRI多肽序列)。
SEQ ID NO：6
SEQ ID NO：12：
2.CD3-zeta
在任一方面的一些实施方式中，本文所述的可被改编或修饰以用于NK CAR多肽的NK细胞膜结合信号转导接头蛋白或其结构域(例如，胞内信号转导结构域)是CD3-zeta(CD3ζ)。CD3-zeta也可互换地称为CD247、T细胞表面糖蛋白CD3 Zeta链、TCRZ或IMD25。CD3-zeta包括三个ITAMs，当磷酸化时，其为蛋白激酶ZAP70提供多个对接位点，产生ZAP70磷酸化并转化为催化活性酶。在NK细胞中，CD3-zeta可以作为接头蛋白来转导NK活化受体NKp46、CD16或hNKp30的胞内信号。
在任一方面的一些实施方式中，CD3-zeta包括SEQ ID NO：128或与SEQ ID NO：128至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，该氨基酸序列保持与SEQ ID NO：128相同的功能(例如，胞内信号转导；ITAM功能)。在任一方面的一些实施方式中，如本文所述的NK-CAR的胞内信号转导结构域包括CD3-zeta的胞内部分(例如，SEQ ID NO：128)。在任一方面的一些实施方式中，胞内信号转导结构域包括SEQ ID NO：11(即SEQ ID NO：128的残基52-163)或与SEQ ID NO：11至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，该氨基酸序列保持与SEQ ID NO：11相同的功能(例如，胞内信号转导；ITAM功能)。
CD3-zeta在SEQ ID NO：128的残基69-89、107-127和138-158处包括ITAMs，在SEQID NO：128的残基72、83、110、122、141和152处具有酪氨酸或丝氨酸/苏氨酸磷酸化位点。因此，在任一方面的一些实施方式中，胞内信号转导结构域包括与CD3-zeta的胞内信号转导结构域(例如，SEQ ID NO：128的残基52-163；SEQ ID NO：11)实质上相似(例如，至少70％相同)的序列，不包括SEQ ID NO：128的残基69-89、107-127或138-158处的突变，或不包括SEQID NO：128的残基72、83、110、122、141或152处的突变，或包括SEQ ID NO：128的残基70、83、110、122、141或152处的酪氨酸。
SEQ ID NO：128，T-细胞表面糖蛋白CD3 zeta链亚型2前体[智人]，NCBI参考序列：NP_000725.1，163aa；粗体文本表示ITAMs，且双下划线文本表示磷酸化位点。在任一方面的一些实施方式中，SEQ ID NO：128中的谷氨酰胺-65(粗体斜体)可被改变为赖氨酸-65。
SEQ ID NO：5(多核苷酸)和SEQ ID NO：11(氨基酸)提供了示例性的CD3z胞内信号转导结构域(例如，CD3z的残基52-163；参见例如，SEQ ID NO：128的示例性全长CD3z多肽序列)。
SEQ ID NO：5
SEQ ID NO：11
共刺激结构域
通过NK活化受体和/或NK接头蛋白产生的信号可能不足以完全活化NK细胞，使得还需要二次或共刺激信号。如本文所用，术语“共刺激受体”是指由NK细胞表达的多肽，其包括与细胞外的共刺激配体相互作用的胞外结构域；共刺激受体通常进一步包括跨膜结构域和胞内信号转导结构域，其实例在本文中进一步描述。一旦信号被活化受体和共刺激受体二者转导，NK细胞就可被完全活化，其中每一个任选地通过接头蛋白转导其信号。在任一方面的一些实施方式中，如本文所述的可被改编或修饰以用于NK CAR多肽的共刺激受体或其结构域(例如，共刺激结构域)是4-1BB和/或IL2受体β(IL2RB)。在任一方面的一些实施方式中，CAR多肽包括4-1BB的共刺激结构域。在任一方面的一些实施方式中，CAR多肽包括IL-2RB的共刺激结构域。在任一方面的一些实施方式中，CAR多肽包括4-1BB和IL-2RB的共刺激结构域。
在任一方面的一些实施方式中，CAR多肽包括1个、2个、3个、4个、5个或更多个共刺激结构域。在任一方面的一些实施方式中，CAR多肽包括三个共刺激结构域。在包括多个共刺激结构域的实施方式中，所述多个共刺激结构域可以是不同的单个共刺激结构域或相同的共刺激结构域的多个拷贝，或前述的组合。
在任一方面的一些实施方式中，本文所述的CAR多肽的共刺激结构域包括SEQ IDNOs：15-16中的一个，或与SEQ ID NOs：15-16中的一个序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，该氨基酸序列保持与SEQ ID NOs：15-16相同的功能(例如，共刺激)。
在任一方面的一些实施方式中，本文所述的CAR多肽的共刺激结构域由如下编码：包括SEQ ID NOs：13-14中的一个的核酸序列，或保持相同功能的与SEQ ID NOs：13-14中的一个至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列，或SEQ IDNOs：13-14中的一个的密码子优化的版本。
1.4-1BB
在任一方面的一些实施方式中，如本文所述的可被改编或修饰以用于NK CAR多肽的共刺激受体或其结构域(例如，共刺激结构域)为4-1BB。4-1BB也可互换地称为CD137、肿瘤坏死因子受体超家族成员9(TNFRSF9)或淋巴细胞活化诱导(ILA)。TRAF接头蛋白已显示出与4-1BB结合并转导引起NF-kappaB活化的信号。人NK细胞上的4-1BB表达与促炎性细胞因子分泌和活化的表型标志物相关。4-1BB的细胞质结构域已显示出与富含亮氨酸重复序列(LRR)的蛋白(LRR-1)相互作用，LRR-1作为4-1BB的负调节因子。
在任一方面的一些实施方式中，4-1BB包括SEQ ID NO：129或与SEQ ID NO：129至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，该氨基酸序列保持与SEQ ID NO：129相同的功能(例如，共刺激)。在任一方面的一些实施方式中，如本文所述的NK-CAR的共刺激结构域包括4-1BB的胞内部分(例如，SEQ ID NO：129)。在任一方面的一些实施方式中，共刺激结构域包括SEQ ID NO：15(即SEQ ID NO：129的残基214-255)或与SEQ ID NO：15至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，该氨基酸序列保持与SEQ ID NO：15相同的功能(例如，共刺激)。
SEQ ID NO：129，4-1BB(肿瘤坏死因子受体超家族成员9前体)[智人]，NCBI参考序列：NP_001552.2，255aa
SEQ ID NO：13(多核苷酸)和SEQ ID NO：15(氨基酸)提供了示例性的4-1BB胞内共刺激结构域(例如，4-1BB的残基214-255；参见例如，SEQ ID NO：129的示例性全长4-1BB多肽序列)。
SEQ ID NO：13
SEQ ID NO：15
2.IL2RB
在任一方面的一些实施方式中，如本文所述的可被改编或修饰以用于NK CAR多肽的共刺激受体或其结构域(例如，共刺激结构域)是白细胞介素2受体亚基β(IL-2RB)。IL-2RB也可互换地称为CD122、白细胞介素-15受体亚基β、P75或IMD63。就结合白细胞介素2的能力而言，白细胞介素2受体以三种形式存在。低亲和力形式是α亚基的单体，并且不参与信号转导。中亲和力形式由α/β亚基异二聚体组成，而高亲和力形式由a/β/γ亚基异三聚体组成。受体的中亲和力形式和高亲和力形式都参与受体介导的内吞作用和白细胞介素2的有丝分裂信号转导。IL-2在体内可增强NK细胞对感染的应答，并且在体外可活化NK细胞。
在任一方面的一些实施方式中，IL-2RB包括SEQ ID NO：130或与SEQ ID NO：130至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，该氨基酸序列保持与SEQ ID NO：130相同的功能(例如，共刺激)。在任一方面的一些实施方式中，如本文所述的NK-CAR的共刺激结构域包括IL-2RB的胞内部分(例如，SEQ ID NO：130)。在任一方面的一些实施方式中，胞内信号转导结构域包括SEQ ID NO：16(即SEQ ID NO：130的残基266-337和530-551)或与SEQ ID NO：16至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，该氨基酸序列保持与SEQ ID NO：16相同的功能(例如，共刺激)。
SEQ ID NO：130，白细胞介素-2受体亚基β前体[智人]，NCBI参考序列：NP_000869.1，551aa
SEQ ID NO：14(多核苷酸)和SEQ ID NO：16(氨基酸)提供了示例性的IL-2RB胞内共刺激结构域(例如，IL-2RB的残基266-337和530-551；参见例如，SEQ ID NO：130的示例性全长IL-2B多肽序列)。
SEQ ID NO：14
SEQ ID NO：16
自剪切肽
在几个方面中，本文所述为包括自剪切肽的NK CAR多肽。如本文所用，术语“自剪切肽”是指能够催化其自身剪切的短氨基酸序列(例如，约18-22aa)。在任一方面的一些实施方式中，本文所述的CAR多肽包括通过自剪切肽结构域与另一多肽(例如，细胞因子)物理连接的共刺激结构域和/或胞内信号转导结构域。自剪切肽允许第一多肽(例如，NK CAR)和第二多肽(和/或第三多肽等；例如，至少一种细胞因子)的核酸存在于同一载体中，但在翻译后，自剪切肽将经翻译的多肽剪切成多个分离的多肽。
在任一方面的一些实施方式中，本文所述的CAR多肽包括1个、2个、3个、4个、5个或更多个自剪切肽。在任一方面的一些实施方式中，CAR多肽或系统包括一个自剪切肽，例如，在第一多肽和第二多肽之间。在任一方面的一些实施方式中，CAR多肽或系统包括两个自剪切肽，例如，在第一多肽和第二多肽之间，以及在第二多肽和第三多肽之间。在包括多个自剪切肽的实施方式中，所述多个自剪切肽可以是不同的单个自剪切肽或相同自剪切肽的多个拷贝，或前述的组合。
在任一方面的一些实施方式中，自剪切肽属于2A肽家族。2A肽的非限制性实例包括P2A、E2A、F2A和T2A(参见例如，表8)。F2A来源于口蹄疫病毒18；E2A来源于马鼻炎A病毒；P2A来源于猪捷申病毒-1 2A；T2A来源于thosea asigna病毒2A。在任一方面的一些实施方式中，2A肽的N-末端包括序列“GSG”(Gly-Ser-Gly)。在任一方面的一些实施方式中，2A肽的N-末端不包括序列“GSG”(Gly-Ser-Gly)。
表8：示例性自剪切肽
SEQ ID NO： 名称 序列
19 P2A (GSG)ATNFSLLKQAGDVEENPGP
20 T2A (GSG)RAEGRGSLLTCGDVEENPGP
132 T2A (GSG)EGRGSLLTCGDVEENPGP
133 E2A (GSG)QCTNYALLKLAGDVESNPGP
134 F2A (GSG)VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP
2A肽介导的剪切在蛋白翻译后开始。剪切是由2A肽的C-末端区域中的脯氨酸(P)和甘氨酸(G)之间的肽键断裂触发的。2A肽介导的剪切的分子机制涉及甘氨酰-脯氨酰肽键形成的核糖体“跳跃”，而不是真正的蛋白水解剪切。不同的2A肽具有不同的自剪切效率，其中P2A是最有效的，且F2A是最低效的。因此，高达50％的F2A-连接的蛋白可以作为融合蛋白留在细胞中。
在任一方面的一些实施方式中，本文所述的CAR多肽的自剪切肽包括SEQ ID NOs：19-20、132-134中的一个，或与SEQ ID NOs：19-20、132-134中的一个的序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，该氨基酸序列保持与SEQ IDNOs：19-20、132-134中的一个相同的功能(例如，自剪切)。
在任一方面的一些实施方式中，本文所述的CAR多肽的自剪切肽由如下编码：包括SEQ ID NOs：17、18中的一个的核酸序列，或保持相同功能的与SEQ ID NOs：17或18中的一个至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核酸序列，或SEQ IDNOs：17或18中的一个的密码子优化的版本。
SEQ ID NO：17，P2A
SEQ ID NO：18，T2A
细胞因子
在几个方面中，本文所述为包括至少一种细胞因子的NK CAR多肽。如本文所用，术语“细胞因子”是指介导和/或调节生物或细胞功能或过程(例如，免疫、炎症和造血)的小蛋白。本文使用的术语“细胞因子”包括“淋巴因子”、“趋化因子”、“单核因子”和“白细胞介素”。调节NK细胞功能的细胞因子的实例包括但不限于IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IFN-γ、GM-CSF、TGF-β、TNF-α和IFN-α。本文所用的术语“细胞因子”还意味着包括细胞因子变体，其在相应的野生型细胞因子的氨基酸序列中包括一个或多个氨基酸突变。在任一方面的一些实施方式中，使用如本文所述的至少一种自剪切肽将至少一种细胞因子连接至NKCAR多肽。可以使用自剪切肽和细胞因子的任何组合。自剪切肽的使用允许细胞因子从NKCAR多肽的末端被剪切。如果细胞因子包括信号肽，那么细胞因子可以从细胞分泌，以作用于分泌它的细胞或附近的细胞。
在任一方面的一些实施方式中，本文所述的CAR多肽包括1个、2个、3个、4个、5个或更多个细胞因子。在任一方面的一些实施方式中，CAR多肽或系统包括一种细胞因子。在任一方面的一些实施方式中，CAR多肽或系统包括两种细胞因子。在包括多个细胞因子的实施方式中，多个细胞因子可以是不同的单个细胞因子或相同细胞因子的多个拷贝，或前述的组合。
在任一方面的一些实施方式中，NK CAR的胞内结构域包括至少一个自剪切肽和至少一个细胞因子。在任一方面的一些实施方式中，NK CAR的胞内结构域包括一个自剪切肽和一个细胞因子。在任一方面的一些实施方式中，细胞因子相邻并位于自剪切肽的远端(即，与之相比更远离跨膜结构域)，使得细胞因子通过自剪切肽与多肽分隔开。在任一方面的一些实施方式中，NK CAR的胞内结构域包括两种自剪切肽和两种细胞因子。在任一方面的一些实施方式中，第一自剪切肽相邻且位于第一细胞因子的近端(即，与之相比更接近跨膜结构域)，并且第二自剪切肽相邻且位于第一和第二细胞因子之间，使得两种细胞因子通过自剪切肽与多肽分隔开。
在任一方面的一些实施方式中，NK CAR多肽包括IL-15或IL-21。在任一方面的一些实施方式中，NK CAR多肽包括IL-15。在任一方面的一些实施方式中，NK CAR多肽包括IL-21。在任一方面的一些实施方式中，NK CAR多肽包括IL-15和IL-21。IL-15由大量细胞类型和组织组成型表达，包括单核细胞、巨噬细胞、树突细胞(DC)、角质形成细胞、成纤维细胞、肌细胞和神经细胞。IL-15与由IL-2/IL-15受体β链(CD122)和共用γ链(gamma-C，CD132)组成的复合物结合并通过其转导信号。IL-15诱导自然杀伤细胞的增殖。白细胞介素-21(IL-21)由活化的人CD4+T细胞、T滤泡细胞和NK T细胞天然地表达。IL-21受体(IL-21R)在T细胞、B细胞和NK细胞表面上表达。IL-21在NK细胞和细胞毒性T细胞中诱导细胞分裂/增殖。就此而言，包括IL-15和/或IL-21可以增加表达包括细胞因子的NK CAR的NK细胞或附近NK细胞的增殖。
在任一方面的一些实施方式中，本文所述的CAR多肽的细胞因子包括SEQ ID NOs：23、24中的一个，或与SEQ ID NOs：23或24中的一个序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，该氨基酸序列保持与SEQ ID NOs：23或24中的一个相同的功能(例如，促进NK细胞增殖)。
在任一方面的一些实施方式中，本文所述的CAR多肽的细胞因子由如下编码：包括SEQ ID NOs：21、22中的一个的核酸序列，或保持相同功能的与SEQ ID NOs：21或22中的一个至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核酸序列，或SEQ IDNOs：21或22中的一个的密码子优化的版本。
SEQ ID NOs：21和23提供了示例性的IL-15细胞因子的多核苷酸和氨基酸序列(例如，亚型1；参见例如，白细胞介素-15亚型1前原蛋白[智人]，NCBI参考序列：NP_000576.1，162aa)。
SEQ ID NO：21
SEQ ID NO：23
SEQ ID NOs：22和24提供了示例性的IL-21细胞因子的多核苷酸和氨基酸序列(例如，亚型1；例如，IL-21的残基8-162(155aa)；参见例如，白细胞介素-21亚型1前体[智人]，NCBI参考序列：NP_068575.1，162aa)。
SEQ ID NO：22
SEQ ID NO：24
跨膜结构域
在各个方面中，本文所述为包括跨膜结构域的NK CAR多肽。关于跨膜结构域，CAR可以被设计为包括与CAR的胞外结合结构域和/或胞内结构域融合的跨膜结构域。在任一方面的一些实施方式中，CAR多肽包括1个、2个、3个、4个、5个或更多个跨膜结构域。在任一方面的一些实施方式中，每个CAR多肽包括一个跨膜结构域。在包括多个跨膜结构域的实施方式中，所述多个跨膜结构域可以是不同的单个跨膜结构域或相同跨膜结构域的多个拷贝，或前述的组合。
在任一方面的一些实施方式中，跨膜结构域可以来源于天然的来源或来源于合成的来源。在来源是天然的情况下，该结构域可以来源于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。在任一方面的一些实施方式中，本文所述的CAR多肽至少包括跨膜蛋白的跨膜区，所述跨膜蛋白选自于由以下组成的组：NKG2D、NKp46、DNAM、CD8、T细胞受体的α或β或ζ链、CD28、CD23ζ、CD28、4-1BB、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。在一些实施方式中，NK CAR多肽包括表10中列出的活化受体的跨膜结构域。或者，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下，它将主要包括疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。优选地，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体将见于合成的跨膜结构域的每个末端。任选地，长度优选在2至10个氨基酸之间的短的寡肽或多肽连接子可以形成CAR的胞内信号转导结构域和跨膜结构域之间的连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了特别合适的连接子。
在任一方面的一些实施方式中，NK CAR包括选自于由自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)、自然杀伤细胞P46相关蛋白(NKp46)、DNAX辅助分子-1(DNAM1)和CD8组成的组中的跨膜结构域。在任一方面的一些实施方式中，跨膜结构域包括天然NK细胞受体的跨膜结构域。在任一方面的一些实施方式中，天然NK细胞受体的跨膜结构域选自于由自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)、自然杀伤细胞P46相关蛋白(NKp46)和DNAX辅助分子-1(DNAM1)组成的组。在任一方面的一些实施方式中，跨膜结构域包括CD8的跨膜结构域。在任一方面的一些实施方式中，跨膜结构域还包括来自相同NK细胞受体的相邻的胞内结构域的一部分。作为非限制性实例，NKp46或DNAM1跨膜结构域进一步分别包括来自NKp46或DNAM1的相邻的胞内结构域的一部分。包括胞内结构域可以增加NK CAR的信号转导，因为这样的受体可以通过其自身的胞质尾区的信号转导来活化NK细胞。参见例如，Bryceson等，2006，Blood 107：159-166。在任一方面的一些实施方式中，跨膜结构域可以通过氨基酸取代而被选择或修饰，以避免这些结构域与相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而使与受体复合物的其他成员的相互作用最小化。
在任一方面的一些实施方式中，本文所述的CAR多肽的跨膜结构域包括SEQ IDNOs：29-32或SEQ ID NOs：117-118中的一个，或与SEQ ID NOs：29-32或SEQ ID NOs：117-118中的一个序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，该氨基酸序列保持与SEQ ID NOs：29-32或SEQ ID NOs：117-118相同的功能(例如，定位至细胞膜)。
在任一方面的一些实施方式中，本文所述的CAR多肽的跨膜结构域由如下编码：包括SEQ ID NOs：25-28或SEQ ID NOs：115-116中的一个的核酸序列，或保持相同功能的与SEQ ID NOs：25-28或SEQ ID NOs：115-116中的一个至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列，或SEQ ID NOs：25-28或SEQ ID NOs：115-116中的一个的密码子优化的版本。
在任一方面的一些实施方式中，本文所述的CAR多肽的跨膜结构域进一步包括与跨膜结构域来自相同的蛋白的胞内信号转导结构域，且包括SEQ ID NOs：30-31中的一个，或与SEQ ID NOs：30-31中的一个序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，该氨基酸序列保持与SEQ ID NOs：30-31相同的功能(例如，定位至细胞膜和/或胞内信号转导)。
在任一方面的一些实施方式中，本文所述的CAR多肽的跨膜结构域由核酸序列编码，该跨膜结构域进一步包括与跨膜结构域来自相同的蛋白的胞内信号转导结构域，并且该核酸序列包括SEQ ID NOs：26-27中的一个，或者保持相同功能的与SEQ ID NOs：26-27中的一个至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列，或SEQID NOs：26-27中的一个的密码子优化的版本。
在任一方面的一些实施方式中，本文所述的CAR多肽的跨膜结构域不进一步包括与跨膜结构域来自相同的蛋白的胞内信号转导结构域，而包括SEQ ID NOs：29、32、117、118中的一个，或与SEQ ID NO：29或32或117-118中的一个的序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，该氨基酸序列保持与SEQ ID NOs：29、32、117或118相同的功能(例如，定位至细胞膜)。
在任一方面的一些实施方式中，本文所述的CAR多肽的跨膜结构域由核酸序列编码，该跨膜结构域不进一步包括与跨膜结构域来自相同的蛋白的胞内信号转导结构域，而所述核酸序列包括SEQ ID NOs：25、28、115、116中的一个，或者保持相同功能的与SEQ IDNOs：25、28、115或116中的一个至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列，或SEQ ID NOs：25、28、115或116中的一个的密码子优化的版本。
1.NKG2D
在任一方面的一些实施方式中，NK CAR多肽至少包括NK细胞受体NKG2D的跨膜结构域。NKG2D也可互换地称为CD314、杀伤细胞凝集素-样受体亚家族K成员1(KLRK1)、NK细胞受体D或D12S2489E。NKG2D是跨膜蛋白，属于C-型凝集素-样受体的NKG2家族。NKG2D的特征在于II型膜取向(具有胞外C末端)和C-型凝集素结构域的存在。它与多种配体结合，包括MHC I类链相关的A和B蛋白以及UL-16结合蛋白，其中配体-受体相互作用可引起NK和T细胞的活化。NKG2D是活化的NK受体，通过接头蛋白DAP10转导信号。
在任一方面的一些实施方式中，NKG2D包括SEQ ID NO：135或与SEQ ID NO：135至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，该氨基酸序列保持与SEQ ID NO：135相同的功能(例如，定位至细胞膜和/或胞内信号转导)。在任一方面的一些实施方式中，本文所述的NK-CAR包括NKG2D的跨膜结构域(例如，SEQ ID NO：135)。在任一方面的一些实施方式中，跨膜结构域包括SEQ ID NO：29(即SEQ ID NO：135的残基52-72)或与SEQ ID NO：29至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，该氨基酸序列保持与SEQ ID NO：29相同的功能(例如，定位至细胞膜)。
SEQ ID NO：135，NKG2-D II型整合膜蛋白，UniProtKB-P26718(NKG2D_HUMAN)，216aa
SEQ ID NOs：25和29提供了示例性的NKG2D跨膜结构域的多核苷酸和氨基酸序列(例如，NKG2D的残基52-72；参见例如，SEQ ID NO：135的示例性全长NKG2D多肽序列)。
SEQ ID NO：25
SEQ ID NO：29
2.NKp46
在任一方面的一些实施方式中，NK CAR多肽至少包括NK细胞受体NKp46的跨膜结构域。NKp46也可互换地称为天然细胞毒性触发受体1(NCR1)、CD335和淋巴细胞抗原94同源物(LY94)。NKp46是46kDa的I型膜糖蛋白，在静息和活化的NK细胞上表达。其胞外区包括两个C2型、Ig-样结构域。跨膜结构域包括带正电荷的氨基酸(Arg)，该氨基酸可参与稳定其与CD3ζ的结合。其胞内区域不包括免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)，但通过与CD3ζ和FcεRIγ接头蛋白的结合而连接至细胞质内转导机构(machinery)。Nkp46与NKp30和NKp44一起被称为天然细胞毒性受体(NCR)。这些受体在杀死病毒感染的靶细胞、肿瘤细胞和MHC I类无保护细胞的细胞中发挥着非常重要的作用。
在任一方面的一些实施方式中，Nkp46包括SEQ ID NO：136或与SEQ ID NO：136至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，该氨基酸序列保持与SEQ ID NO：136相同的功能(例如定位至细胞膜和/或胞内信号转导)。在任一方面的一些实施方式中，本文所述的NK-CAR包括NKp46的跨膜结构域(例如SEQ ID NO：136)。在任一方面的一些实施方式中，跨膜结构域包括SEQ ID NO：117(即SEQ ID NO：136的残基259-279)或与SEQ ID NO：117至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，该氨基酸序列保持与SEQ ID NO：117相同的功能(例如定位至细胞膜)。
在任一方面的一些实施方式中，本文所述的NK-CAR包括NKp46的跨膜结构域和NKp46的胞内信号转导结构域(例如，SEQ ID NO：136)。在任一方面的一些实施方式中，跨膜和胞内信号转导结构域包括SEQ ID NO：30(即SEQ ID NO：136的残基259-304)或与SEQ IDNO：30至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，该氨基酸序列保持与SEQ ID NO：30相同的功能(例如，定位至细胞膜和/或胞内信号转导)。
在任一方面的一些实施方式中，本文所述的NK-CAR包括NKp46的胞内信号转导结构域(例如，SEQ ID NO：136)。在任一方面的一些实施方式中，胞内信号转导结构域包括SEQID NO：136的残基280-304或与包括SEQ ID NO：136的残基280-304的序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，该氨基酸序列保持与SEQ IDNO：136的残基280-304相同的功能(例如，胞内信号转导)。
SEQ ID NO：136，天然细胞毒性触发受体1亚型a前体[智人]，NCBI参考序列：NP_004820.2，304aa
SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：30提供了示例性的NKp46跨膜和胞内结构域的多核苷酸和氨基酸序列(例如，NKp46的残基259-304；参见例如，SEQ ID NO：136的示例性全长NKp46多肽序列)。
SEQ ID NO：26；粗体文本表示编码NKp46的示例性跨膜区的序列(例如，SEQ IDNO：136的残基259-279；SEQ ID NO：26的核苷酸(nt)1-63；SEQ ID NO：115)；无格式文本表示编码NKp46的胞内信号转导结构域的序列(参见例如，SEQ ID NO：136的残基280-304)。
SEQ ID NO：30；粗体文本表示NKp46的示例性跨膜区(参见例如，SEQ ID NO：136的残基259-279；SEQ ID NO：30的氨基酸(aa)1-21；SEQ ID NO：117)；无格式文本表示NKp46的胞内信号转导结构域(参见例如，SEQ ID NO：136的残基280-304)。
SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：117提供了示例性的NKp46跨膜结构域(例如，NKp46的残基259-279)的多核苷酸和氨基酸序列。
SEQ ID NO：115
SEQ ID NO：117
3.DNAM1
在任一方面的一些实施方式中，NK CAR多肽至少包括NK细胞受体DNAM1的跨膜结构域。DNAM1也可互换地称为DNAX辅助分子-1、CD226、T细胞系特异性活化抗原1抗原(TLiSA1)或血小板T细胞活化抗原1(PTA1)。DNAM1是在NK细胞、血小板、单核细胞和T细胞亚群的表面上表达的糖蛋白。它是包含V-set的2个Ig-样结构域的Ig-超家族成员。DNAM1参与细胞间粘附、淋巴细胞信号转导、细胞毒性及由细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)和NK细胞介导的淋巴细胞因子分泌。DNAM-1与NK细胞中的LFA-1相关，被PKC磷酸化，并与CD155和CD112结合。DNAM-1抗体抑制NK细胞对肿瘤细胞的细胞毒性。
在任一方面的一些实施方式中，DNAM1包括SEQ ID NO：137或与SEQ ID NO：137至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，该氨基酸序列保持与SEQ ID NO：137相同的功能(例如定位至细胞膜和/或胞内信号转导)。在任一方面的一些实施方式中，本文所述的NK-CAR包括DNAM1的跨膜结构域(例如SEQ ID NO：137)。在任一方面的一些实施方式中，跨膜结构域包括SEQ ID NO：118(即SEQ ID NO：137的残基255-275)或与SEQ ID NO：118至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，该氨基酸序列保持与SEQ ID NO：118相同的功能(例如定位至细胞膜)。
在任一方面的一些实施方式中，本文所述的NK-CAR包括DNAM1的跨膜结构域和DNAM1的胞内信号转导结构域(例如，SEQ IDNO：137)。在任一方面的一些实施方式中，跨膜和胞内信号转导结构域包括SEQ ID NO：31(即SEQ ID NO：137的残基255-336)或与SEQ IDNO：31至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，该氨基酸序列保持与SEQ ID NO：31相同的功能(例如，定位至细胞膜和/或胞内信号转导)。
在任一方面的一些实施方式中，本文所述的NK-CAR包括DNAM1的胞内信号转导结构域(例如，SEQ ID NO：136)。在任一方面的一些实施方式中，胞内信号转导结构域包括SEQID NO：137的残基276-336或与包括SEQ ID NO：137的残基276-336的序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，该氨基酸序列保持与SEQ IDNO：137的残基276-336相同的功能(例如，胞内信号转导)。
SEQ ID NO：137，CD226抗原亚型a前体[智人]，NCBI参考序列：NP_001290547.1，336aa
SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：31提供了示例性的DNAM1跨膜和胞内结构域的多核苷酸和氨基酸序列(例如，DNAM1的残基255-336；参见例如，SEQ ID NO：137的示例性全长DNAM1多肽序列)。
SEQ ID NO：27；粗体文本表示编码DNAM1的示例性跨膜区的序列(例如，SEQ IDNO：137的残基255-275；SEQ ID NO：27的核苷酸(nt)1-63；SEQ ID NO：116)；无格式文本表示编码DNAM1的胞内信号转导结构域的序列(参见例如，SEQ ID NO：137的残基276-336)。
SEQ ID NO：31；粗体文本表示DNAM1的示例性跨膜区(例如，SEQ ID NO：137的残基255-275；SEQ ID NO：31的氨基酸(aa)1-21；SEQ ID NO：118)。
SEQ ID NO：116和SEQ ID NO：118提供了示例性的DNAM1跨膜结构域的多核苷酸和氨基酸序列(例如，SEQ ID NO：137的残基255-275)；无格式文本表示DNAM1的胞内信号转导结构域(参见例如，SEQ ID NO：137的残基276-336)。
SEQ ID NO：116
SEQ ID NO：118
4.CD8
在任一方面的一些实施方式中，NK CAR多肽至少包括CD8的跨膜结构域。CD8形成二聚体，其由一对CD8链组成。CD8的最常见的形式是由CD8-α链和CD8-β链组成。因此，在任一方面的一些实施方式中，NK CAR多肽至少包括CD8α的跨膜结构域。CD8α也可互换地称为CD8a、T-淋巴细胞分化抗原T8/Leu-2或MAL。CD8在T细胞信号转导中发挥作用，并有助于细胞毒性T细胞抗原相互作用。CD8主要在细胞毒性T细胞表面上表达，但也可见于自然杀伤细胞、皮质胸腺细胞和树突细胞上。
在任一方面的一些实施方式中，CD8包括SEQ ID NO：138或与SEQ ID NO：138至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，该氨基酸序列保持与SEQ ID NO：138相同的功能(例如，定位至细胞膜和/或胞内信号转导)。在任一方面的一些实施方式中，本文所述的NK-CAR包括CD8的跨膜结构域(例如，SEQ ID NO：138)。在任一方面的一些实施方式中，跨膜结构域包括SEQ ID NO：32(即SEQ ID NO：138的残基183-206)或与SEQ ID NO：32至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，该氨基酸序列保持与SEQ ID NO：32相同的功能(例如，定位至细胞膜)。
SEQ ID NO：138，T-细胞表面糖蛋白CD8α链，UniProtKB-P01732(CD8A_HUMAN)，235aa
SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：32提供了示例性的CD8跨膜结构域的多核苷酸和氨基酸序列(例如，CD8的残基183-206；参见例如，SEQ ID NO：138的示例性全长CD8a多肽序列)。
SEQ ID NO：28
SEQ ID NO：32
胞外结构域
在几个方面中，本文所述为包括至少一个胞外结构域(本文中也称为胞外域)的NKCAR多肽。如本文进一步描述的，这样的胞外结构域可以包括但不限于：胞外结合结构域、信号肽、连接子结构域、可检测标志物和间隔区结构域。NK CAR多肽可以包括胞外结合结构域、信号肽、连接子结构域、可检测标志物和间隔区结构域的任何组合。例如，在本文考虑之列的是以下组合(参见例如，表8)：
表8：NK-CAR多肽中的胞外结构域的示例性组合。“EB”表示胞外结合结构域。“SI”表示信号肽。“LD”表示连接子结构域。“DM”表示可检测标志物。“SD”表示间隔区结构域。
在任一方面的一些实施方式中，CAR多肽包括1个、2个、3个、4个、5个或更多个胞外结构域。在任一方面的一些实施方式中，CAR多肽包括五个胞外结构域。在任一方面的一些实施方式中，CAR多肽包括四个胞外结构域。在包括多个胞外结构域的实施方式中，所述多个胞外结构域可以是不同的单个胞外结构域或相同的胞外结构域的多个拷贝，或前述的组合。
胞外结合结构域
在任一方面的一些实施方式中，本文所述的NK CAR多肽包括胞外结合结构域。在任一方面的一些实施方式中，胞外结合结构域识别并结合至肿瘤抗原或在肿瘤细胞上表达的细胞表面标志物。在任一方面的一些实施方式中，本文所述的CAR多肽包括至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个胞外结合结构域。在任一方面的一些实施方式中，CAR多肽或系统包括一个胞外结合结构域。在任一方面的一些实施方式中，CAR多肽包括两个胞外结合结构域。在包括多个胞外结合结构域的实施方式中，所述多个胞内结合结构域可以是不同的单个胞外结合结构域或相同的胞外结合结构域的多个拷贝，或前述的组合。
在任一方面的一些实施方式中，胞外结合结构域是抗体、其抗原结合片段、F(ab)片段、F(ab’)片段、单链抗体(scFv)或单域抗体(sdAb)。在任一方面的一些实施方式中，胞外结合结构域是单价、二价或多价的。在任一方面的一些实施方式中，胞外结合结构域包括人、人源化或嵌合的抗体构建体。此外，重组人源化抗体可被进一步优化，以降低潜在的免疫原性，同时保持功能活性，用于人类中的治疗。在这方面，功能活性是指能够显示与本文所述的重组抗体或其抗体试剂相关的一种或多种已知功能活性的多肽。这样的功能活性包括例如与靶标结合的能力。
对本文所述靶标和/或标志物(例如，肿瘤抗原)而言特异性的抗体试剂是本领域已知的。例如，这种试剂很容易商购得到。在任一方面的一些实施方式中，胞外结合结构域可为抗体试剂，其包括本文所述或本领域已知的任一抗体的一个或多个(例如，一个、两个、三个、四个、五个或六个)CDRs。在任一方面的一些实施方式中，对本文所述的靶标和/或标志物而言特异性的抗体试剂(例如，与本文所述的肿瘤抗原特异性结合的抗体试剂)可为包括本文所述或本领域已知的任何一种抗体的六个CDRs的抗体试剂。在任一方面的一些实施方式中，对本文所述的靶标和/或标志物而言特异性的抗体试剂(例如，与本文所述的肿瘤抗原特异性结合的抗体试剂)可为包括本文所述或本领域已知的任一种抗体的三个重链CDRs的抗体试剂。在任一方面的一些实施方式中，对本文所述的靶标和/或标志物而言特异性的抗体试剂(例如，与本文所述的肿瘤抗原特异性结合的抗体试剂)可为包括本文所述或本领域已知的任一种抗体的三个轻链CDRs的抗体试剂。在任一方面的一些实施方式中，对本文所述的靶标和/或标志物而言特异性的抗体试剂(例如，与本文所述的肿瘤抗原特异性结合的抗体试剂)可为包括本文所述或本领域已知的任一种抗体的VH和/或VL结构域的抗体试剂。在任一方面的一些实施方式中，对本文所述的靶标和/或标志物而言特异性的抗体试剂(例如，与本文所述的肿瘤抗原特异性结合的抗体试剂)可为包括本文所述或本领域已知的任一种抗体的VH和VL结构域的抗体试剂。这样的抗体试剂被特别考虑用于本文所述的方法和/或组合物中。
如本文所用，“抗体可变结构域”是指抗体分子的轻链和重链的部分，其包括互补性决定区(CDRs；即CDR1、CDR2和CDR3)和框架区(FRs)的氨基酸序列。VH是指重链的可变结构域。VL是指轻链的可变结构域。对于本文所述的方法和组合物，分配给CDRs和FRs的氨基酸位置可以根据Kabat(Sequences of Proteins of Immunological Interest(NationalInstitutes of Health，Bethesda,Md.，1987和1991))定义。抗体或抗原结合片段的氨基酸编号也依据Kabat的氨基酸编号。
本文可互换使用的术语“抗原结合片段”或“抗原结合结构域”用于指保留特异性结合至感兴趣靶标的能力的全长抗体的一个或多个片段。涵盖在全长抗体的术语“抗原结合片段”内的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包括通过铰链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，由VH和CH1结构域组成；(iv)Fv片段，由抗体单臂的VL和VH结构域组成；(v)dAb片段(Ward等，(1989)Nature 341：544-546；其通过引用整体并入本文)，其由VH或VL结构域组成；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)，其保留特异性的抗原结合功能。源自轻链和重链的序列可分别以N-末端至C-末端的顺序提供，或者以相反的顺序提供。
如本文所用，术语“连接子”是指共价连接两个多肽部分的化学或肽结构。例如，抗体的VH结构域和VL结构域可以通过肽连接子连接以形成VH/VL单链抗原结合结构域(例如，作为scFv)。连接子的长度可以变化以改变经连接的结构域形成例如分子内或分子间二聚体的能力。例如，双特异抗体包括VH和VL结构域之间的短连接子肽，通常为5个氨基酸，其将不允许VH和VL结构域配对以形成抗原结合结构域；具有这种短连接子排列的两种不同的VH-VL构建体在细胞中的表达允许第一VH-VL多肽链的VH结构域与第二VH-VL多肽链的VL结构域二聚化，并且允许第一VH-VL多肽链的相应VL结构域与第二VH-VL多肽链的VH结构域二聚化，从而产生双特异性构建体。相反，当VH和VL结构域被较长的肽连接子(通常为15-20个氨基酸)分隔开时，同一多肽链上的VH结构域和VL结构域可以二聚化以形成scFv。本文进一步描述了这种连接子的非限制性实例。
在任一方面的一些实施方式中，胞外结合结构域包括scFv。在任一方面的一些实施方式中，胞外结合结构域包括特异性地结合至肿瘤抗原的scFv。在任一方面的一些实施方式中，如本文所述的CAR多肽的胞外结合结构域特异性地结合至任何肿瘤抗原，包括本文所述那些。在任一方面的一些实施方式中，胞外结合结构域包括与本文所述的肿瘤抗原或表位结合的任何已知的单域抗体(sdAb)、抗体、其抗原结合片段、F(ab)片段、F(ab’)片段或单链抗体(scFv)。
可被靶向的肿瘤抗原的非限制性实例包括EphA2、HER2、AXL、GD2、Glypican-3、5T4、8H9、αvβ6整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CA9、CD19、CD20、CD22、κ轻链、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、ERBB3、ERBB4、ErbB3/4、FAP、FAR、FBP、胎儿AchR、叶酸受体a、GD2、GD3、HLA-AI MAGE Al、HLA-A2、ILl 1Ra、IL13Ra2、KDR、Lambda、Lewis-Y、MCSP、间皮素、Mucl、Mucl6、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSC1、PSMA、ROR1、SURVIVIN、TAG72、TEM1、TEM8、VEGRR2、癌胚抗原、HMW-MAA和VEGF受体。可以被靶向的其他示例性抗原是存在于肿瘤的胞外基质内的抗原，例如，肌腱蛋白、纤连蛋白的癌胚变体或肿瘤的坏死区。
可被靶向的额外的肿瘤选择性分子包括在肿瘤细胞中表达或过表达的任何膜蛋白或生物标志物，包括但不限于整合素(例如，整合素αvβ3、α5β1)、EGF受体家族(例如，EGFR2、Erbb2/HER2/neu、Erbb3、Erbb4)、蛋白聚糖(例如，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖)、二唾液酸神经节苷脂(例如，GD2、GD3)、B7-H3(又名CD276)、癌抗原125(CA-125)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、血管内皮生长因子受体1和2(VEGFR-1、VEGFR-2)、CD52、癌胚抗原(CEA)、肿瘤相关糖蛋白(例如，TAG-72)、分化簇19(CD19)、CD20、CD22、CD30、CD33、CD40、CD44、CD74、CD152、粘蛋白1(MUC1)、肿瘤坏死因子受体(例如，TRAIL-R2)、胰岛素样生长因子受体、叶酸受体a、跨膜糖蛋白NMB(GPNMB)、C-C趋化因子受体(如，CCR4)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、recepteur d'origine nantais(RON)受体、细胞毒性T-淋巴细胞抗原4(CTLA4)和其他肿瘤特异性受体或抗原。
肿瘤抗原的非限制性实例包括以下：分化抗原如MART-1/MelanA(MART-I)、gp100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2和肿瘤特异性多链抗原如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15；过表达的胚胎抗原如CEA；过表达的癌基因和突变的肿瘤抑制基因如p53、Ras、HER-2/neu；染色体易位产生的独特肿瘤抗原，如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR；以及病毒抗原，如EB病毒抗原EBVA以及人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。其他大的基于蛋白的抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-连环蛋白、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、α-胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA125、CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2结合蛋白\亲环素C-相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP和TPS。
在任一方面的一些实施方式中，肿瘤抗原是国际申请PCT/US2015/020606或美国专利申请US20170209492或US20170335281中描述的肿瘤抗原，其每一个的内容通过引用以其整体并入本文。在一些实施方式中，肿瘤抗原选自以下的一个或多个：CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS-1(也称为CD2亚群1、CRACC、SLAMF7、CD319和19A24)；C-型凝集素样分子-1(CLL-1或CLECL1)；CD33；表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)；神经节苷脂G2(GD2)；神经节苷脂GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDG1cp(1-1)Cer)；TNF受体家族成员B细胞成熟(BCMA)；Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr))；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)；Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；癌胚抗原(CEA)；上皮细胞粘附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；白细胞介素-13受体亚基α-2(IL-13Ra2或CD213A2)；间皮素；白细胞介素11受体α(IL-11Ra)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21(Testisin或PRSS21)；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；Lewis(Y)抗原；CD24；血小板衍生生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)；CD20；叶酸受体α；受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；粘蛋白1，细胞表面相关(MUC1)；表皮生长因子受体(EGFR)；神经细胞粘附分子(NCAM)；蛋白酶；前列腺酸性磷酸酶(PAP)；延伸因子2突变(ELF2M)；Ephrin B2；成纤维细胞活化蛋白α(FAP)；胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体)、碳酸酐酶IX(CAIX)；蛋白酶体(Prosome、Macropain)亚基，β型，9(LMP2)；糖蛋白100(gp100)；由裂点簇区(BCR)和Abelson鼠白血病病毒癌基因同源物1(Ab1)组成的癌基因融合蛋白(bcr-ab1)；酪氨酸酶；ephrin A型受体2(EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酸路易斯粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDG1cp(1-1)Cer)；谷胺酰胺转氨酶5(TGS5)；高分子量黑色素瘤相关抗原(HMWMAA)；O-乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)；叶酸受体β；肿瘤内皮标志物1(TEM1/CD248)；肿瘤内皮标志物7-相关(TEM7R)；claudin 6(CLDN6)；促甲状腺激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类5组，成员D(GPRC5D)；X染色体开放阅读框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；globoH糖神经酰胺的己糖部分(GloboH)；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；uroplakin 2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；pannexin3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合体，K 9位点(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ交替阅读框蛋白(TARP)；肾母细胞瘤蛋白(WT1)；癌/睾丸抗原1(NY-ESO-1)；癌/睾丸抗原2(LAGE-1a)；黑色素瘤相关抗原1(MAGE-A1)；ETS易位变体基因6，定位于染色体12p上(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族，成员1A(XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受体2(Tie2)；黑色素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑色素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；肿瘤蛋白p53(p53)；p53突变体；prostein；surviving；端粒酶；前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1或半乳糖凝集素8)，由T细胞识别的黑色素瘤抗原1(MelanA或MARTI)；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位裂点(translocation breakpoints)；黑色素瘤细胞凋亡抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶，丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V(NA17)；成对盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；v-myc禽骨髓细胞增多症病毒癌基因神经母细胞瘤衍生同源物(MYCN)；Ras同源家族成员C(RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)；细胞色素P4501B1(CYP1B1)；CCCTC-结合因子(锌指蛋白)-样(BORIS或印记位点调节物兄弟因子)，由T细胞识别的鳞状上皮细胞癌抗原3(SART3)；成对盒蛋白Pax-5(PAXS)；前顶体素(proacrosin)结合蛋白sp32(OY-TES1)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；A激酶锚定蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤，X裂点2(SSX2)；晚期糖基化终末产物受体(RAGE-1)；renal ubiquitous 1(RU1)；renal ubiquitous 2(RU2)；legumain；人乳头瘤病毒E6(HPV E6)；人乳头状瘤病毒E7(HPV E7)；肠羧基酯酶；热休克蛋白70-2突变(mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含EGF样模块粘蛋白样激素受体样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；Glypican-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；和免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)。在一些实施方式中，肿瘤抗原是GFRa4(参见例如，Spinasanta，“The EndocrineSociety's 97th Annual Meeting&Expo:Targeted Therapies in Medullary ThyroidCancer”，2015年3月13日)。
在任一方面的一些实施方式中，胞外结合结构域包括抗体或其胞外结合结构域(例如，抗原结合结构域)，所述抗体或其胞外结合结构域选自于由以下组成的组：20-(74)-(74)(milatuzumab；维妥珠单抗(veltuzumab))、20-2b-2b、3F8、74-(20)-(20)(milatuzumab；维妥珠单抗)、8H9、A33、AB-16B5、abagovomab、阿昔单抗、阿比妥珠单抗、ABP494(西妥昔单抗生物类似药)、abrilumab、ABT-700、ABT-806、Actimab-A(锕Ac-225lintuzumab)、actoxumab、阿达木单抗、ADC-1013、ADCT-301、ADCT-402、adecatumumab、aducanumab、afelimomab、AFM13、afutuzumab、AGEN1884、AGS15E、AGS-16C3F、AGS67E、alacizumab pegol、ALD518、阿仑单抗、阿利西尤单抗(alirocumab)、altumomabpentetate、amatuximab、AMG 228、AMG 820、anatumomab mafenatox、anetumabravtansine、anifrolumab、anrukinzumab、APN301、APN311、apolizumab、APX003/SIM-BD0801(sevacizumab)、APX005M、arcitumomab、ARX788、ascrinvacumab、aselizumab、ASG-15ME、atezolizumab、atinumab、ATL101、atlizumab(也称为托珠单抗)、atorolimumab、Avelumab、B-701、bapineuzumab、巴利昔单抗(basiliximab)、bavituximab、BAY1129980、BAY1187982、bectumomab、begelomab、belimumab、贝那利珠单抗(benralizumab)、bertilimumab、besilesomab、BETALUTIN(177Lu-tetraxetan-tetulomab)、bevaciztunab、BEVZ92(贝伐珠单抗生物类似物)、bezlotoxumab、BGB-A317、BHQ880、BI 836880、BI-505、biciromab、bimagnunab、比美吉珠单抗(bimekizumab)、bivatuzumab mertansine、BM-8962、blinatumomab、blosozumab、BMS-936559、BMS-986012、BMS-986016、BMS-986148、BMS-986178、BNC101、bococizumab、本妥昔单抗(brentuximab vedotin)、BREVAREX、briakinumab、brodaIumab、brolucizumab、brontictuzumab、C2-2b-2b、卡那单抗(canakinumab)、cantuzumab美登素、carttuzumab ravtansine、caplacizumab、卡罗单抗喷地肽(capromab pendetide)、carlumab、catumaxomab、CBR96-阿霉素免疫偶联物、CBT124(贝伐珠单抗)、CC-90002、CDX-014、CDX-1401、cedelizumab、培塞利珠单抗(certolizumabpegol)、西妥昔单抗(cetuximab)、CGEN-15001T、CGEN-15022、CGEN-15029、CGEN-15049、CGEN-15052、CGEN-15092、Ch.14.18、citatuzumab bogatox、cixutumumab、克拉扎珠单抗(clazakizumab)、clenoliximab、clivatuzumab tetraxetan、CM-24、codrituzumab、coltuximab ravtansine、conatutnumab、concizumab、COTARA(碘1-131美妥昔单抗生物素)、cR6261、crenezumab、DA-3111(曲妥珠单抗生物类似药)、dacetuzumab、达利珠单抗(daclizumab)、dalotuzumab、dapirolizumab pegol、达雷妥尤单抗、达雷妥尤单抗ENHANZE(daratumumab)、DARLEUKIN、dectrekumab、demcizumab、denintuzumab mafodotin、地诺单抗(denosumab)、Depatuxizumab、Depatuxizumab mafodotin、derlotuximab biotin、detumomab、DI-B4、dinutuximab、diridavtunab、DKN-01、DMOT4039A、dorlimomab aritox、drozittunab、DS-1123、DS-8895、杜力戈图单抗(duligotumab)、dupilumab、dmvalumab、dusigitumab、ecromeximab、依库珠单抗(eculizumab)、edobacomab、依决洛单抗(edrecolomab)、依法利珠单抗(efalizumab)、efinumab、eldelumab、elgemtumab、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)、elsilimomab、emactuzumab、emibetuzumab、enavatuzumab、enfortumabvedotin、enlimomab pegol、enoblituzumab、enokizumab、enoticumab、ensituximab、epitumomab cituxetan、依帕珠单抗(epratuzumab)、erliztunab、ertumaxomab、etaracizumab、etrolizumab、evinacumab、依洛尤单抗(evolocumab)、exbivinunab、fanolesomab、faralimomab、farletuzumab、fasinumab、FBTA05、felviztunab、fezakinumab、FF-21101、FGFR2抗体药物偶联物、FIBROMUN、ficlatuzumab、figitumumab、firivumab、flanvotumab、fletikumab、fontolizumab、foralumab、foravirumab、FPAI44、fresolimumab、FS102、fulranumab、futuximab、galiximab、ganitumab、gantenerumab、gavilimomab、吉妥珠单抗奥唑米星(gemtuzumab ozogamicin)、Gerilimzumab、吉伏珠单抗(gevokizumab)、girentuximab、glembatumumab vedotin、GNR-006、GNR-011、戈利木单抗(golimumab)、gomiliximab、GSK2849330、GSK2857916、GSK3I74998、GSK3359609、古塞奇尤单抗(guselkumab)、Hu14.18K322A MAb、hu3S193、Hu8F4、HuL2G7、HuMab-5B1、ibalizumab、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、icrucumab、idarucizumab、IGN002、IGN523、igovomab、IMAB362、IMAB362(claudiximab)、imalumab、IMC-CS4、IMC-D II、imciromab、imgatuzumab、IMGN529、IMMU-IO2(钇Y-90epmtuzumab tetraxetan)、IMM1J-114、ImmuTuneIMP701拮抗剂抗体、INCAGN1876、inclactunab、INCSHR1210、indatuximab ravtansine、indusaturnab vedotin、英夫利西单抗、inolimomab、inoturtunab ozogamicin、intetumumab、Ipafricept、IPH4102、伊匹单抗(ipilimumab)、iratumumab、艾萨妥昔单抗(isatuximab)、Istiratumab、itolizumab、依奇珠单抗(ixekizumab)、JNJ-56022473、JNJ-61610588、keliximab、KTN3379、L191L2/L19TNF、Labetuzumab、Labetuzumab Govitecan、LAG525、lambroliztunab、lampalizumab、L-D0S47、lebrikizumab、lemaIesomab、lenzilumab、lerdelimumab、Leukotuximab、lexattunumab、libivirumab、lifastuzumabvedotin、ligelizumab、lilotomab satetraxetan、lintuzumab、lirilumab、LICZ145、lodelcizumab、lokivetmab、lorvoturtunab mertansine、lucatttmumab、lulizumabpegol、lumiliximab、lumretuzumab、LY3164530、mapatumumab、margetuximab、maslimomab、matuzumab、mavrilimumab、MB311、MCS-110、MEDI0562、MEDI-0639、MEDT0680、MEDI-3617、MEDI-551(伊奈利珠单抗(inebilizumab))、MEDI-565、MEDI6469、美泊利珠单抗(mepolizumab)、metelimumab、MGB453、MGD006/S80880、MGD007、MGD009、MGD011、milaturttmab、Milatuzumab-SN-38、minretumomab、mirvetuximab soravtansine、mitumomab、MK-4166、MM-111、MM-151、MM-302、mogamuliztunab、M0R202、M0R208、MORAb-066、morolimumab、motavizumab、moxetumomab pasudotox、muromonab-CD3、nacolomabtafenatox、namilumab、naptumomab estafenatox、narnatumab、那他珠单抗、nebacumab、necitumumab、nemolizumab、nerelimomab、nesvacumab、尼妥珠单抗、纳武利尤单抗、nofetumomab merpentan、NOV-10、obiltoxaximab、奥妥珠单抗(obinutuzumab)、ocaratuzumab、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、odulimomab、奥法木单抗(ofatumumab)、奥拉单抗(olaratttmab)、olokizumab、ornalizumab、OMP-131R10、OMP-305B83、onartuzumab、ontuxizttmab、opicinumab、oportuzumab monatox、oregovomab、orticumab、otelixizumab、otlertuzumab、0X002/MEN1309、oxelumab、ozanezumab、ozoralizumab、pagibaximab、帕利珠单抗(palivizumab)、帕尼单抗、pankomab、PankoMab-GEX、panobacumab、parsatuzumab、pascolizttmab、pasotuxizutnab、pateclizumab、patrittunab、PAT-SC1、PAT-SM6、帕博利珠单抗、pemtumomab、perakizumab、帕妥珠单抗、pexelizumab、PF-05082566(utomilumab)、PF-06647263、PF-06671008、PF-06801591、pidilizumab、pinatuzumab vedotin、pintumomab、placulumab、polatuzumab vedotin、ponezumab、priliximab、pritoxaximab、prittunumab、PRO 140、PROXINIUM、PSMA ADC、quilizumab、racotumomab、radretumab、rafivirumab、ralpancizumab、雷莫芦单抗、兰尼单抗(ranibizumab)、瑞西巴库单抗(raxibacumab)、refanezumab、regavirumab、REGN1400、REGN2810/5AR439684、resliztunab、RFM-203、RG7356、RG7386、RG7802、RG7813、RG7841、RG7876、RG7888、RG7986、rilottunumab、rinucumab、利妥昔单抗、RM-1929、R07009789、robatumumab、roledumab、romosortunab、rontalizumab、rovelizumab、ruplizumab、戈沙妥珠单抗、samalizumab、5AR408701、5AR566658、sarilumab、SAT 012、satumomab pendetide、SCT200、SCT400、SEA-CD40、司库奇尤单抗、seribantumab、setoxaximab、sevirumab、SGN-CD19A、SGN-CD19B、SGN-CD33A、SGN-CD70A、SGN-LIVIA、sibrotuzumab、sifalimumab、司妥昔单抗、辛妥珠单抗(simtuzumab)、sipliztunab、sirukumab、sofituzumab vedotin、solanezumab、solitomab、sonepcizumab、sontuzumab、stamulumab、sulesomab、suvizumab、5YD985、SYM004(futuximab和modotuximab)、SYM015、TAB08、tabalumab、tacatuzumabtetraxetan、tadocizumab、talizumab、tanezumab、Tanibirumab、taplitumomab paptox、tarextumab、TB-403、tefibazumab、TELEUKIN、telimomab aritox、tenatumomab、teneliximab、teplizumab、teprotumumab、tesidolumab、tetulomab、TG-1303、TGN1412、钍-227-依帕珠单抗偶联物、替西木单抗(ticilimumab)、tigatuzumab、tildrakizumab、Tisotumab vedotin、TNX-650、托珠单抗、toralizumab、tosatoxumab、托西莫单抗(tosittunomab)、tovetumab、曲罗芦单抗(tralokinumab)、曲妥珠单抗、恩美曲妥珠单抗、TRBS07、TRC105、tregalizumab、替西木单抗(tremelimumab)、trevogrtunab、TRPH 011、TRX518、TSR-042、TTI-200.7、tucotuzumab celmoleukin、tuvirumab、U3-1565、U3-1784、ublituximab、ulocuplumab、urelumab、urtoxazumab、乌司奴单抗(ustekinumab)、Vadastuximab Talirine、vandortuzumab vedotin、vantictumab、vanucizumab、vapaliximab、varlilumab、vatelizumab、VB6-845、维多珠单抗(vedolizumab)、veltuzumab、vepalimomab、vesencumab、visilizumab、volociximab、vorseturtunabmafodotin、votumumab、YYB-101、zaluttunumab、zanolimumab、zatuximab、ziralimumab、和zolimomab aritox。
在任一方面的一些实施方式中，胞外结合结构域包括抗-CD19抗体，例如，抗-CD19scFV。CD19也可互换地称为B-淋巴细胞表面抗原B4或T细胞表面抗原Leu-12。由于CD19是B细胞的标志物，该蛋白已被用于诊断由这种类型的细胞引起的癌症，尤其是B细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)。大多数B细胞恶性肿瘤表达正常至高水平的CD19。抗-CD19抗体的非限制性实例包括A3B1、FMC63、FMC63-28Z、SEQ ID NO：35；参见例如，美国专利10221245、8906682、10421810、10639329，其各自的内容通过引用以其整体并入本文。
在任一方面的一些实施方式中，胞外结合结构域包括抗-CD33抗体，例如，抗-CD33scFV。CD33也可互换地称为唾液酸结合Ig样凝集素3(SIGLEC3)或Gp67。CD33是髓系特异性唾液酸结合受体，在约90％的急性髓性白血病(AML)患者的母细胞和AML干细胞上表达。抗-CD33抗体的非限制性实例包括SEQ ID NO：36、吉妥珠单抗、vadastuximab、2H12；参见例如，美国专利7557189、9815901、10556951、10787514，其各自的内容通过引用以其整体并入本文。
根据待靶向的期望的抗原，本文所述的CAR多肽可被工程化以包括对期望的抗原靶标而言特异性的合适的胞外结合结构域(例如，抗原结合部分)。例如，如果CD19是待靶向的期望抗原，则CD19的抗体或其胞外结合结构域(例如，抗原结合片段)可用作胞外结合结构域，以掺入本文所述的CAR多肽中。作为另一实例，如果CD33是待靶向的期望抗原，则CD33的抗体或其胞外结合结构域(例如，抗原结合片段)可用作胞外结合结构域，以掺入本文所述的CAR多肽中。
在任一方面的一些实施方式中，本文所述的CAR多肽的胞外结合结构域包括SEQID NOs：35-36中的一个，或与SEQ ID NOs：35-36中的一个序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，该氨基酸序列保持与SEQ ID NOs：35-36中的一个相同的功能(例如，肿瘤抗原结合)。
在任一方面的一些实施方式中，本文所述的CAR多肽的胞外结合结构域由如下编码：包括SEQ ID NOs：33-34的核酸序列，或保持相同功能的与SEQ ID NOs：33-34中的一个至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列，或SEQ ID NOs：33-34中的一个的密码子优化的版本。
SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：35提供了示例性的抗-CD19scFv的多核苷酸和氨基酸序列。
SEQ ID NO：33
SEQ ID NO：35
SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：36提供了示例性的抗-CD33 scFv的多核苷酸和氨基酸序列。
SEQ ID NO：34
SEQ ID NO：36
在任一方面的一些实施方式中，胞外结合结构域可靶向参与除癌症以外的疾病(例如感染性疾病等)的抗原。就此而言，在任一方面中的一些实施方式中，胞外结合结构域可靶向病毒抗原。在任一方面的一些实施方式中，胞外结合结构域可靶向细菌抗原。在任一方面的一些实施方式中，病毒靶抗原是病毒表面抗原，例如病毒糖蛋白。病毒糖蛋白的非限制性实例包括：呼吸道合胞病毒(RSV)F蛋白(例如F蛋白的位点II)；疱疹病毒糖蛋白B(gB)；乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原(HBsAg)；人类免疫缺陷病毒(HIV)糖蛋白120(gp120)(例如gp120CD4结合位点(CD4bs)；gp120第三可变区(V3))；流感病毒血凝素(HE，例如HE茎部；例如第1组(G1)或第2组(G2)HE茎部)等。
在任一方面的一些实施方式中，细菌靶抗原是细菌表面抗原，例如，细菌表面蛋白、脂质或多糖(即胞外多糖)。细菌表面抗原的非限制性实例包括：葡萄球菌(Staphylococcus species)蛋白A；葡萄球菌细胞壁磷壁酸；脂多糖(LPS)(例如，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)血清型O11 LPS)；藻酸盐/酯(例如，铜绿假单胞菌胞外褐藻胶)；艰难梭菌(Clostridium difficile)细胞壁多糖2(PsII)等。例如，参见Wagner等，Current Opinion in Chemical Engineering，19(2018)：131-141。在任一方面的一些实施方式中，胞外结合结构域可以使用生物素化的抗原特异性分子(例如，代替scFv)靶向其抗原。
信号肽
在任一方面的一些实施方式中，本文所述的NK CAR多肽包括信号肽，其也可称为信号、信号序列、前导序列、前导肽、靶向信号、定位信号、定位序列或转运肽。如本文所用，术语“信号肽”是指多肽的氨基末端序列，其将新合成的蛋白指向分泌途径。信号肽通常由13至36个相当疏水的氨基酸组成。信号肽具有共同的结构：短的带正电荷的氨基末端区(n区)；中心疏水区(h区)；以及含有由信号肽酶剪切的位点的极性更强的羧基末端区(c区)。在ER腔侧，信号肽通过信号肽酶剪切。在通过ER驻留伴侣和折叠酶将新生多肽成功折叠后，蛋白被进一步引导离开ER。这一过程可能得到N-末端前序列的支持。尽管大多数I型膜结合蛋白具有信号肽，但大多数II型和多跨膜结合蛋白通过其第一跨膜结构域而被靶向到分泌途径，该结构域在生物化学上类似于信号序列，只是其没有被剪切。
在任一方面的一些实施方式中，本文所述的NK CAR多肽包括1个、2个、3个、4个、5个或更多个信号肽。在任一方面的一些实施方式中，CAR多肽或系统在所有其他胞外结构域之前包括一个信号肽，例如，在多肽的N-末端。在包括多个信号肽的实施方式中，多个信号肽可以是不同的单个信号肽或相同信号肽的多个拷贝，或前述的组合。
在任一方面的一些实施方式中，信号肽是CD8a信号肽。在任一方面的一些实施方式中，信号肽包括SEQ ID NO：38或与SEQ ID NO：38的序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，该氨基酸序列保持与SEQ ID NO：38相同的功能(将跨膜蛋白靶向到分泌途径和细胞膜)。
在一些实施方式中，本文所述CAR多肽的信号肽由如下编码：包括SEQ ID NO：37的核酸序列，或保持相同功能的与SEQ ID NO：37至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列，或SEQ ID NOs：37的密码子优化的版本。
SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38提供了示例性的CD8信号肽的多核苷酸和氨基酸序列。
SEQ ID NO：37
SEQ ID NO：38
可检测标志物
在几个方面中，本文所述的为包括至少一种可检测标志物的NK CAR多肽。如本文所用，术语“可检测标志物”是指当连接到CAR多肽时，赋予该多肽或该多肽结合的另一分子可检测性的部分。在任一方面的一些实施方式中，CAR多肽包括1个、2个、3个、4个、5个或更多个可检测标志物。在任一方面的一些实施方式中，CAR多肽或系统包括一个可检测标志物。在包括多个可检测标志物的实施方式中，多个可检测标志物可以是不同的单个可检测标志物或相同的可检测标志物的多个拷贝，或前述的组合。
在任一方面的一些实施方式中，可检测标志物包括亲和标签。亲和标签的非限制性实例包括Strep-标签、几丁质结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、FLAG-标签、HA-标签、Myc-标签、多聚(His)-标签及其衍生物。在任一方面的一些实施方式中，可检测标志物是3×FLAG(即，FLAG基序，DYKDDDDK，SEQ ID NO：131，重复三次)。
在任一方面的一些实施方式中，本文所述的CAR多肽的可检测标志物包括SEQ IDNOs：40、122、131中的一个，或与SEQ ID NOs：40、122或131中的一个序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，该氨基酸序列保持与SEQ IDNOs：40、122或131中的一个相同的功能(例如，CAR多肽的检测)。
在任一方面的一些实施方式中，本文所述的CAR多肽的可检测标志物由如下编码：包括SEQ ID NOs：39、121中的一个核酸序列，或保持相同功能的与SEQ ID NOs：39或121中的一个至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列，或SEQID NOs：39或121中的一个的密码子优化的版本。
SEQ ID NOs：39、40、121和122提供了示例性的FLAG标签(例如，3×Flag)的多核苷酸和氨基酸序列。
SEQ ID NO：39
SEQ ID NO：40
SEQ ID NO：121
SEQ ID NO：122
在任一方面的一些实施方式中，荧光部分可用作可检测标志物，但可检测标志物还包括例如同位素、荧光蛋白和肽、酶、特异性结合对的组分、发色团、本文所述或本领域已知的亲和标签、抗体、胶体金属(即金)和量子点。可检测标志物可以是直接或间接可检测的。直接可检测标志物不需要额外的试剂或底物来产生可检测的信号。实例包括同位素和荧光团。间接可检测标志物需要一种或多种共因子或底物的存在或作用。实例包括酶如β-半乳糖苷酶(其可通过剪切底物时产生有色反应产物来检测，所述底物如发色团X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷))、辣根过氧化物酶(其可通过在底物二氨基联苯胺的存在下产生有色反应产物来检测)、以及碱性磷酸酶(其可通过在硝基蓝四氮唑和5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯的存在下产生有色反应产物来检测)。
在任一方面的一些实施方式中，可检测标志物可以位于本文所述的CAR多肽内的任何位置。在一个实施方式中，可检测标志物位于本文所述的CAR多肽的任何结构域之间，但未在功能结构域内发现，并且不破坏结构域的功能。在任一方面的一些实施方式中，可检测标志物邻近胞外结合结构域并位于其N-末端。这样的标志物可用于检测CAR多肽的表达，包括细胞表面的表达。在任一方面的一些实施方式中，可检测标志物邻近胞外结构域中的一个定位。在任一方面的一些实施方式中，可检测标志物邻近跨膜结构域定位。在任一方面的一些实施方式中，可检测标志物邻近胞内结构域中的一个定位。
在任一方面的一些实施方式中，本文所述的CAR多肽(特别是施用于受试者的那些或作为药物组合物一部分的那些)不包括免疫原性的可检测标志物。在任一方面的一些实施方式中，本文所述的CAR多肽不包括GFP、mCherry、HA1或任何其他免疫原性标志物。
连接子结构域
在几个方面中，本文所述的为包括至少一个连接子结构域的NK CAR多肽。如本文所用，“连接子结构域”(可与“肽连接子”或简称“连接子”互换使用)是指长度约为2个至100个氨基酸的寡聚或多肽区，其将本文所述结构域的任何序列连接在一起。在一些实施方式中，连接子可以包括如甘氨酸和丝氨酸的柔性残基或由其组成，使得相邻的蛋白结构域相对于彼此自由移动。当期望确保两个相邻的结构域彼此不会在空间上干扰时，可以使用较长的连接子。连接子可以是可裂解的(例如，被设计为包括特定蛋白酶的底物)或不可裂解的。
在任一方面的一些实施方式中，本文所述的NK CAR多肽包括1个、2个、3个、4个、5个或更多个连接子结构域。在任一方面的一些实施方式中，NK CAR多肽包括一个连接子结构域。在包括多个连接子结构域的实施方式中，多个连接子结构域可以是不同的单个连接子结构域或相同的连接子结构域的多个拷贝，或前述的组合。在任一方面的一些实施方式中，连接肽可以定位在本文所述的任何两个结构域之间：例如，在可检测标志物和间隔区结构域之间，和/或在VH/VL单链抗原结合结构域之间(例如，如在scFv中)。在任一方面的一些实施方式中，连接子结构域位于胞外结合结构域的远端(即，与之相比，远离跨膜结构域)。在任一方面的一些实施方式中，连接子结构域位于信号肽和/或可检测标志物的近端(即，与之相比，接近跨膜结构域)。
连接子结构域可包括1个或更多个氨基酸、5个或更多个氨基酸、10个或更多个氨基酸、15个或更多个氨基酸、20个或更多个氨基酸、25个或更多个氨基酸、30个或更多个氨基酸、35个或更多个氨基酸、40个或更多个氨基酸、45个或更多个氨基酸、50个或更多个氨基酸及以上。相反，连接子结构域可包括少于50个氨基酸、少于45个氨基酸、少于40个氨基酸、少于35个氨基酸、少于30个氨基酸、少于30个氨基酸、少于25个氨基酸、少于20个氨基酸、少于15个氨基酸或少于10个氨基酸。
在本文所述的各个方面的一些实施方式中，连接子结构域包括约5个氨基酸至约50个氨基酸。例如，连接子结构域可包括约5个氨基酸至约45个氨基酸、约5个氨基酸至约40个氨基酸、约5个氨基酸至约35个氨基酸、约10个氨基酸至30个氨基酸、或约15个氨基酸到约25个氨基酸。
示例性的连接子结构域包括由甘氨酸和丝氨酸残基组成的连接子结构域，即所谓的Gly-Ser多肽连接子。如本文所用，术语“Gly-Ser多肽连接子”是指由甘氨酸和丝氨酸残基组成的肽。在本文所述的各个方面的一些实施方式中，连接子结构域包括氨基酸序列(GlyxSer)n，其中x是2、3、4或5，并且n是1、2、3，4、5、6、7、8、9或10，例如，SEQ ID NOs：42、120、139-176(参见例如，表9)。
表9：示例性的连接子序列
在任一方面的一些实施方式中，本文所述的CAR多肽的连接子结构域包括SEQ IDNOs：42、120、139-176中的一个，或与SEQ ID NOs：42、120、139-176中的一个序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，该氨基酸序列保持与SEQ ID NOs：42、120、139-176中的一个相同的功能(例如，CAR多肽的结构域之间的柔性连接子)。
在任一方面的一些实施方式中，本文所述的CAR多肽的可检测标志物由如下编码：包括SEQ ID NOs：41、199中的一个核酸序列，或与SEQ ID NOs：41或199中的一个至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列，或SEQ ID NOs：41或199中的一个的密码子优化的版本。
SEQ ID NOs：41、42、119和120提供了示例性连接子的多核苷酸和氨基酸序列。SEQID NO：41：GGTGGAGGCGGTTCG；SEQ ID NO：42：GGGGS；SEQ ID NO：119：GGAGGCGGTTCG；SEQ IDNO：120：GGGS。
间隔区结构域
在任一方面的一些实施方式中，本文所述的NK CAR多肽包括间隔区结构域。在任一方面的一些实施方式中，间隔区结构域位于胞外结合结构域和跨膜结构域之间。在任一方面的一些实施方式中，间隔区结构域是胞外结合结构域的C-末端和跨膜结构域的N-末端。在任一方面的一些实施方式中，间隔区结构域是胞外结合结构域的N-末端和跨膜结构域的C-末端。在任一方面的一些实施方式中，间隔区结构域包括铰链结构域。在任一方面的一些实施方式中，本文所述的CAR多肽包括1个、2个、3个、4个、5个或更多个铰链结构域。在任一方面的一些实施方式中，CAR多肽或系统包括一个铰链结构域。在包括多个铰链结构域的实施方式中，多个铰链结构域可以是不同的单个铰链结构域或相同的铰链结构域的多个拷贝，或前述的组合。
在任一方面的一些实施方式中，铰链结构域包括基于免疫球蛋白G(IgG)的铰链或CD8α胞外结构域的衍生物。铰链结构域的掺入已被示出改善嵌合抗原受体T细胞的扩增并增加CAR T细胞的抗肿瘤功效(参见例如，Qin等，Journal of Hematology&Oncology第10卷，文章编号：68(2017)；Stoiber等，Cells，2019年5月，8(5)：472)。铰链结构域可衍生自IgG亚类(如IgG1和IgG4)、IgD和CD8结构域，其中IgG1已被最广泛地使用。铰链结构域优选提供以下四个方面：(1)降低的对Fcγ受体的结合亲和力，从而减少或消除脱靶活化；(2)增强的胞外结合结构域(例如，scFv)的柔性，从而缓解肿瘤抗原和CAR之间的空间限制，进而促进NK CAR细胞和靶细胞之间的突触形成；例如，为了克服MUC1-特异性CAR中的空间位阻，可以插入IgD同种型的柔性且细长的铰链；(3)胞外结合结构域(例如，scFv)与靶抗原或表位之间的减小的距离，例如，抗-CD22 CAR需要铰链结构域来发挥最佳的细胞毒性；以及(4)使用抗-Fc试剂的CAR表达的便利的检测。在任一方面的一些实施方式中，铰链结构域促进CAR二聚化。
在任一方面的一些实施方式中，铰链结构域包括CD8铰链结构域。在任一方面的一些实施方式中，铰链结构域包括CD8a铰链结构域。在任一方面的一些实施方式中，本文所述的CAR多肽的铰链结构域包括SEQ ID NO：44，或与SEQ ID NO：44的序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，该氨基酸序列保持与SEQ IDNO：44相同的功能(例如，显示胞外结合区)。
在任一方面的一些实施方式中，本文所述的CAR多肽的铰链结构域由如下编码：包括SEQ ID NO：43的核酸序列，或保持相同功能的与SEQ ID NO：43至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列，或SEQ ID NO：43的密码子优化的版本。
SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44提供了示例性的CD8a铰链结构域的多核苷酸和氨基酸序列(例如，CD8a的残基138-182；参见例如，SEQ ID NO：138的示例性全长CD8a多肽序列)。
SEQ ID NO：43
SEQ ID NO：44
示例性多肽
在本文所述的多个方面中，其是包括本文所述结构域的任何组合的NK CAR多肽。在一个方面，本文所述的是用于在自然杀伤(NK)细胞中表达的嵌合抗原受体(CAR)多肽，其包括：(a)胞外结合结构域；(b)跨膜结构域；和(c)胞内结构域，该胞内结构域包括以下中的至少一种：(i)来自NK细胞受体的胞内信号转导结构域；(ii)来自NK细胞膜结合信号转导接头蛋白的胞内信号转导结构域；和/或(iii)来自共刺激受体的胞内共刺激结构域。
在一个方面，本文所述的是用于在自然杀伤(NK)细胞中表达的嵌合抗原受体(CAR)多肽(例如，第I组NK CAR多肽)，其包括：(a)胞外结合结构域；(b)跨膜结构域；和(c)胞内结构域，该胞内结构域包括以下中的至少一种：(i)来自NK细胞膜结合信号转导接头蛋白的胞内信号转导结构域；和/或(ii)来自共刺激受体的胞内共刺激结构域。在一个方面，本文所述的是用于在自然杀伤(NK)细胞中表达的嵌合抗原受体(CAR)多肽(例如，第II-IV组NK CAR多肽)，其包括：(a)胞外结合结构域；(b)跨膜结构域；和(c)包括来自NK细胞受体的至少一个信号转导结构域的胞内结构域。
在任一方面的一些实施方式中，所述多肽从N-末端到C-末端包括：(a)胞外结合结构域；(b)跨膜结构域；和(c)胞内结构域；这样的多肽也可以称为I型跨膜蛋白。在任一方面的一些实施方式中，作为I型跨膜蛋白的CAR进一步包括N-末端信号肽。这类I型跨膜蛋白CARs的非限制性实例包括CC002、CC003、CC004、CC005、CC007、CC008、CC013、CC016、CC017、CC018、CC024、CC026、CC027、CC029、CC030、CC032、CC033、CC034、CC035、CC037、CC038、CC039、CC103、CC104、CC108、CC118、CC124、CC130、CC135，其分别对应于SEQ ID NOs：80-90、92-93、95-96、98-101、103-110和112-113。
在任一方面的一些实施方式中，所述多肽从C-末端到N-末端包括：(a)胞外结合结构域；(b)跨膜结构域；和(c)胞内结构域；这样的多肽也可以称为II型跨膜蛋白。在任一方面的一些实施方式中，作为II型跨膜蛋白的CAR不一定包括N-末端信号肽。这类II型跨膜蛋白CARs的非限制性实例包括CC025、CC028、CC031、CC036、CC125、CC136，它们分别对应于SEQID NOs：91、94、97、102、111、114。
在任一方面的一些实施方式中，多肽选自于由第Ic组(例如，CC005、CC007、CC008或CC108)、第IIa组(例如，CC024、CC025、CC124、CC125)或第IV组(例如，CC027、CC030、CC034、CC038或CC130)组成的组。在任一方面的一些实施方式中，多肽选自于由第Ic组(例如，CC005、CC007、CC008或CC108)、第IIa组(例如，CC024、CC025、CC124、CC125)或第IVd组(例如，CC030或CC130)组成的组。在任一方面的一些实施方式中，多肽选自于由第Ic组(例如，包括细胞因子，包括C007、CC008或CC108)、第IIa组(例如，CC024、CC025、CC124、CC125)或第IVd组(例如，CC030或CC130)组成的组。
在任一方面的一些实施方式中，CAR多肽包括SEQ ID NOs：80-114中的一个(参见例如，表6)，或与SEQ ID NOs：80-114中的一个序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列，该序列保持相同的功能(例如，抗原结合和胞内信号转导)。表6显示了示例性的CAR多肽及其胞外、跨膜和胞内结构域的特定顺序。
表6：构建体和结构域氨基酸SEQ ID NOs(“TM”表示跨膜结构域)
第I组NK CAR多肽
在一个方面中，本文所述的为第I组NK CAR多肽，其包括：(a)胞外结合结构域；(b)跨膜结构域；和(c)胞内结构域，该胞内结构域包括以下中的至少一种：(i)来自NK细胞膜结合信号转导接头蛋白的胞内信号转导结构域；和/或(ii)来自共刺激受体的胞内共刺激结构域。在任一方面的一些实施方式中，跨膜结构域包括CD8a的跨膜结构域。
在一个方面，本文描述的是第Ia组NK CAR多肽，其包括：(a)胞外结合结构域；(b)跨膜结构域；和(c)胞内结构域，该胞内结构域包括来自共刺激受体的胞内共刺激结构域。在任一方面的一些实施方式中，跨膜结构域包括CD8a的跨膜结构域。在任一方面的一些实施方式中，共刺激受体是4-1BB。在任一方面的一些实施方式中，将第Ia组NK CAR多肽用作对照或参考。
在一个方面，本文所述的为第Ib组NK CAR多肽，其包括：(a)胞外结合结构域；(b)跨膜结构域；和(c)胞内结构域，该胞内结构域包括(i)来自NK细胞膜结合信号转导接头蛋白的胞内信号转导结构域；和(ii)来自共刺激受体的胞内共刺激结构域。在任一方面的一些实施方式中，跨膜结构域包括CD8a的跨膜结构域。在任一方面的一些实施方式中，共刺激受体是4-1BB。在任一方面的一些实施方式中，接头蛋白是CD3ζ。在任一方面的一些实施方式中，将第Ib组NK CAR多肽用作对照或参考。
在一个方面，本文所述的为第Ic组NK CAR多肽，其包括：(a)胞外结合结构域；(b)跨膜结构域；和(c)胞内结构域，该胞内结构域包括(i)来自NK细胞膜结合信号转导接头蛋白的胞内信号转导结构域；和(ii)来自共刺激受体的胞内共刺激结构域。在任一方面的一些实施方式中，跨膜结构域包括CD8a的跨膜结构域。在任一方面的一些实施方式中，共刺激受体是4-1BB。在任一方面的一些实施方式中，接头蛋白是FcεRI。在任一方面的一些实施方式中，第Ic组NK CAR多肽进一步包括至少一种细胞因子(例如，IL-15和/或IL-21)和至少一种自剪切肽。
在一个方面中，本文所述的为第Id组NK CAR多肽，其包括：(a)胞外结合结构域；(b)跨膜结构域；和(c)胞内结构域，该胞内结构域包括(i)来自NK细胞膜结合信号转导接头蛋白的胞内信号转导结构域；和(ii)来自共刺激受体的两个胞内共刺激结构域。在任一方面的一些实施方式中，跨膜结构域包括CD8a的跨膜结构域。在任一方面的一些实施方式中，两种共刺激受体是4-1BB和IL2RB。在任一方面的一些实施方式中，接头蛋白是CD3ζ。
在一个方面，本文所述的为第Ie组NK CAR多肽，其包括：(a)胞外结合结构域；(b)跨膜结构域；和(c)胞内结构域，该胞内结构域包括(i)来自NK细胞膜结合信号转导接头蛋白的胞内信号转导结构域；和(ii)来自共刺激受体的两个胞内共刺激结构域。在任一方面的一些实施方式中，跨膜结构域包括CD8a的跨膜结构域。在任一方面的一些实施方式中，两种共刺激受体是4-1BB和IL2RB。在任一方面的一些实施方式中，接头蛋白是FcεRI。
在任一方面的一些实施方式中，第I组NK CAR多肽包括SEQ ID NOs：80-89或106-109中的一个，或与SEQ ID NOs：80-89或106-109中的一个序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列，该序列保持相同的功能(例如，抗原结合和胞内信号转导)。
在任一方面的一些实施方式中，第I组NK CAR多核苷酸包括：SEQ ID NOs：45-54或71-74中的一个，或作为多肽保持相同功能的与SEQ ID NOs：45-54或71-74中的一个序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列，或者SEQ ID NOs：45-54或71-74中的一个的密码子优化的版本。
抗-CD19第I组
对CD19而言特异性的第I组NK CARs的非限制性实例包括CC002、CC003、CC004、CC005、CC007、CC008、CC013、CC016、CC017或CC018，其分别对应于多核苷酸SEQ ID NOs：45-54和多肽SEQ ID NOs：80-89。应该理解的是，可通过将CD-19结合结构域转换为不同的肿瘤抗原结合结构域或细胞表面蛋白结合结构域来产生其他NK CARs。
CC002构建体包括从N末端到C末端的以下结构域：CD8信号肽–3*Flag–连接子(例如，GGGGS，SEQ ID NO：42)–抗-CD19scFv-CD8a铰链结构域–CD8跨膜结构域–4-1BB。参见例如，SEQ IDNO：45或SEQ ID NO：80。
SEQ ID NO：45，CC002
SEQ ID NO：80，CC002
CC003构建体包括从N末端到C末端的以下结构域：CD8信号肽–连接子(例如，GGGGS，SEQ ID NO：42)–抗-CD19 scFv-CD8a铰链结构域–CD8跨膜结构域–4-1BB–CD3z。参见例如，SEQ ID NO：46或SEQ ID NO：81。
SEQ ID NO：46，CC003
SEQ ID NO：81，CC003
CC004构建体包括从N末端到C末端的以下结构域：CD8信号肽–3*Flag–连接子(例如，GGGGS，SEQ ID NO：42)–抗-CD19scFv-CD8a铰链结构域–CD8跨膜结构域–4-1BB–CD3z。参见例如，SEQ ID NO：47或SEQ ID NO：82。
SEQ ID NO：47，CC004
SEQ ID NO：82，CC004
CC005构建体包括从N末端到C末端的以下结构域：CD8信号肽–3*Flag–连接子(例如，GGGGS，SEQ ID NO：42)–抗CD19scFv-CD8a铰链结构域–CD8跨膜结构域-4-1BB–FceR胞质结构域。参见例如，SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：83。
SEQ ID NO：48，CC005
SEQ ID NO：83，CC005
CC007构建体包括从N末端到C末端的以下结构域：CD8信号肽–3*Flag–连接子(例如，GGGGS，SEQ ID NO：42)–抗-CD19scFv-CD8a铰链结构域–CD8跨膜结构域-4-1BB–FceR胞质结构域–P2A肽–IL15亚型1。参见例如，SEQ ID NO：49或SEQ ID NO：84。
SEQ ID NO：49，CC007
SEQ ID NO：84，CC007
CC008构建体包括从N末端到C末端的以下结构域：CD8信号肽–3*Flag–连接子(例如，GGGGS，SEQ ID NO：42)–抗-CD19scFv-CD8a铰链结构域–CD8跨膜结构域-4-1BB–FceR胞质结构域–P2A肽–IL15亚型1-T2A-IL-21亚型1。参见例如，SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：85。
SEQ ID NO：50，CC008
SEQ ID NO：85，CC008
CC013构建体包括从N末端到C末端的以下结构域：CD8信号肽–3*Flag–连接子(例如，GGGGS，SEQ ID NO：42)–抗-CD19scFv-CD8a铰链结构域–CD8跨膜结构域-4-1BB–IL2RB胞质结构域-CD3z。参见例如，SEQ ID NO：51或SEQ ID NO：86。
SEQ ID NO：51，CC013
SEQ ID NO：86，CC013
CC016构建体包括从N末端到C末端的以下结构域：CD8信号肽–3*Flag–连接子(例如，GGGGS，SEQ ID NO：42)–抗-CD19scFv-CD8a铰链结构域–CD8跨膜结构域-IL2RB胞质结构域-4-1BB-CD3z。参见例如，SEQ ID NO：52或SEQ ID NO：87。
SEQ ID NO：52，CC016
SEQ ID NO：87，CC016
CC017构建体包括从N末端到C末端的以下结构域：CD8信号肽–3*Flag–连接子(例如，GGGGS，SEQ ID NO：42)–抗-CD19scFv-CD8a铰链结构域–CD8跨膜结构域-4-1BB–IL2RB胞质结构域-FceR胞质结构域。参见例如，SEQ ID NO：53或SEQ ID NO：88。
SEQ ID NO：53，CC017
SEQ ID NO：88，CC017
CC018构建体包括从N末端到C末端的以下结构域：CD8信号肽–3*Flag–连接子(例如，GGGGS，SEQ ID NO：42)–抗-CD19scFv-CD8a铰链结构域–CD8跨膜结构域-IL2RB胞质结构域-4-1BB-FceR胞质结构域。参见例如，SEQ ID NO：54或SEQ ID NO：89。
SEQ ID NO：54，CC018
SEQ ID NO：89，CC018
抗-CD33第I组
对CD33而言特异性的第I组NK CARs的非限制性实例包括CC103、CC104、CC108或CC118，其分别对应于多核苷酸SEQ ID NOs：71-74和多肽SEQ ID NOs：106-109。应该理解的是，可以通过将CD-33结合结构域转换为不同的肿瘤抗原结合结构域或细胞表面蛋白结合结构域来产生其他的NK CARs。
CC103构建体包括从N末端到C末端的以下结构域：CD8信号肽–连接子(例如，GGGGS，SEQ ID NO：42)–抗-CD33 scFv-CD8a铰链结构域–CD8跨膜结构域–4-1BB–CD3z。参见例如，SEQ ID NO：71或SEQ ID NO：106。
SEQ ID NO：71，CC103
SEQ ID NO：106，CC103
CC104构建体包括从N末端到C末端的以下结构域：CD8信号肽–3*Flag–连接子(例如，GGGGS，SEQ ID NO：42)–抗-CD33scFv-CD8a铰链结构域–CD8跨膜结构域–4-1BB–CD3z。参见例如，SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：107。
SEQ ID NO：72，CC104
SEQ ID NO：107，CC104
CC108构建体包括从N末端到C末端的以下结构域：CD8信号肽–3*Flag–连接子(例如，GGGGS，SEQ ID NO：42)–抗-CD33scFv-CD8a铰链结构域–CD8跨膜结构域-4-1BB–FceR胞质结构域–P2A肽–IL15亚型1-T2A-IL-21亚型1。参见例如，SEQ ID NO：73或SEQ ID NO：108。
SEQ ID NO：73，CC108
SEQ ID NO：108，CC108
CC118构建体包括从N末端到C末端的以下结构域：CD8信号肽–3*Flag–连接子(例如，GGGGS，SEQ ID NO：42)–抗-CD33scFv-CD8a铰链结构域–CD8跨膜结构域-IL2RB胞质结构域-4-1BB-FceR胞质结构域。参见例如，SEQ ID NO：74或SEQ ID NO：109。
SEQ ID NO：74，CC118
SEQ ID NO：109，CC118
第II-IV组NK CAR多肽
在一个方面，本文所述的为第II-IV组NK CAR多肽，其包括：(a)胞外结合结构域；(b)跨膜结构域；和(c)胞内结构域，该胞内结构域包括来自NK细胞受体的至少一个信号转导结构域。
在一个方面，本文所述的为第II组NK CAR多肽，包括：(a)胞外结合结构域；(b)跨膜结构域；和(c)胞内结构域，该胞内结构域包括来自NK细胞受体的至少一个信号转导结构域；其中所述跨膜结构域包括NKG2D的跨膜结构域。在一些实施方式中，NK细胞受体包括2B4(例如第IIa组)。在一些实施方式中，NK细胞受体包括NTB-A(例如第IIb组)。在一些实施方式中，NK细胞受体包括CD2(例如第IIc组)。在一些实施方式中，NK细胞受体包括CRACC(例如第IId组)。
在一个方面，本文所述的为第III组NK CAR多肽，其包括：(a)胞外结合结构域；(b)跨膜结构域；和(c)胞内结构域，该胞内结构域包括来自NK细胞受体的至少一个信号转导结构域；其中所述跨膜结构域包括NKp46的跨膜结构域。在一些实施方式中，NK CAR进一步包括NKp46的胞内信号转导结构域。在一些实施方式中，NK细胞受体包括2B4(例如，第IIIa组)。在一些实施方式中，NK细胞受体包括NTB-A(例如，第IIIb组)。在一些实施方式中，NK细胞受体包括CD2(例如，第IIIc组)。在一些实施方式中，NK细胞受体包括CRACC(例如，第IIId组)。
在一个方面，本文所述的为第IV组NK CAR多肽，其包括：(a)胞外结合结构域；(b)跨膜结构域；和(c)胞内结构域，该胞内结构域包括来自NK细胞受体的至少一个信号转导结构域；其中所述跨膜结构域包括DNAM1的跨膜结构域。在一些实施方式中，NK CAR进一步包括DNAM1的胞内信号转导结构域。在一些实施方式中，NK细胞受体包括2B4(例如，第IVa组)。在一些实施方式中，NK细胞受体包括NTB-A(例如，第IVb组)。在一些实施方式中，NK细胞受体包括CD2(例如，第IVc组)。在一些实施方式中，NK细胞受体包括CRACC(例如，第IVd组)。
在任一方面的一些实施方式中，第II-IV组NK CAR多肽包括SEQ ID NOs：90-105或110-114中的一个，或与SEQ ID NOs：90-105或110-114中的一个序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列，该序列保持相同的功能(例如，抗原结合和胞内信号转导)。
在任一方面的一些实施方式中，第II-IV组NK CAR多核苷酸包括：SEQ ID NOs：55-70或75-79中的一个，或作为多肽保持相同功能的与SEQ ID NOs：55-70或75-79中的一个序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列，或者SEQ IDNOs：55-70或75-79中的一个的密码子优化的版本。
抗-CD19第II-IV组
对CD19而言特异性的第II-IV组NK CARs的非限制性实例包括CC024、CC025、CC026、CC027、CC028、CC029、CC030、CC031、CC032、CC033、CC034、CC035、CC036、CC037、CC038或CC039，其分别对应于多核苷酸SEQ ID NOs：55-70和多肽SEQ ID NOs：90-105。应该理解的是，可以通过将CD-19结合结构域转换为不同的肿瘤抗原结合结构域或细胞表面蛋白结合结构域来产生其他的NK CARs。
CC024构建体包括从N末端到C末端的以下结构域：CD8信号肽–3*Flag–连接子(例如，GGGGS，SEQ ID NO：42)–抗-CD19scFv-CD8a铰链结构域–NKG2D跨膜结构域–2B4胞质结构域。参见例如，SEQ ID NO：55或SEQ ID NO：90。
SEQ ID NO：55，CC024
SEQ ID NO：90，CC024
CC025构建体(例如，CC024的反向结构域顺序，除了不包括CD8信号肽)包括从N末端到C末端的以下结构域：2B4胞质结构域-NKG2D跨膜结构域-CD8a铰链结构域-抗-CD19scFv–连接子(例如，GGGGS，SEQ ID NO：42)-3*Flag。参见例如，SEQ ID NO：56或SEQ ID NO：91。
SEQ ID NO：56，CC025
SEQ ID NO：91，CC025
CC026构建体包括从N末端到C末端的以下结构域：CD8信号肽–3*Flag–连接子(例如，GGGGS，SEQ ID NO：42)–抗-CD19scFv-CD8a铰链结构域–NKp46跨膜和胞质结构域–CD2胞质结构域。参见例如，SEQ ID NO：57或SEQ ID NO：92。
SEQ ID NO：57，CC026
SEQ ID NO：92，CC026
CC027构建体包括从N末端到C末端的以下结构域：CD8信号肽–3*Flag–连接子(例如，GGGGS，SEQ ID NO：42)–抗-CD19scFv-CD8a铰链结构域–DNAM1跨膜和胞质结构域–2B4胞质结构域。参见例如，SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：93。
SEQ ID NO：58，CC027
SEQ ID NO：93，CC027
CC028构建体(例如，CC039的反向结构域顺序，除了不包括CD8信号肽)包括从N末端到C末端的以下结构域：NTB-A胞质结构域-NKG2D跨膜结构域-CD8a铰链结构域-抗-CD19scFv–连接子(例如，GGGGS，SEQ ID NO：42)-3*Flag。参见例如，SEQ ID NO：59或SEQ ID NO：94。
SEQ ID NO：59，CC028
SEQ ID NO：94，CC028
CC029构建体包括从N末端到C末端的以下结构域：CD8信号肽–3*Flag–连接子(例如，GGGGS，SEQ ID NO：42)–抗-CD19scFv-CD8a铰链结构域–NKp46跨膜和胞质结构域–NTB-A胞质结构域。参见例如，SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：95。
SEQ ID NO：60，CC029
SEQ ID NO：95，CC029
CC030构建体包括从N末端到C末端的以下结构域：CD8信号肽–3*Flag–连接子(例如，GGGGS，SEQ ID NO：42)–抗-CD19scFv-CD8a铰链结构域–DNAM1跨膜和胞质结构域–CRACC胞质结构域。参见例如，SEQ ID NO：61或SEQ ID NO：96。
SEQ ID NO：61，CC030
SEQ ID NO：96，CC030
CC031构建体(例如，CC037的反向结构域顺序，除了不包括CD8信号肽)包括从N末端到C末端的以下结构域：CD2胞质结构域-NKG2D跨膜结构域-CD8a铰链结构域-抗-CD19scFv–连接子(例如，GGGGS，SEQ ID NO：42)-3*Flag。参见例如，SEQ ID NO：62或SEQ ID NO：97。
SEQ ID NO：62，CC031
SEQ ID NO：97，CC031
CC032构建体包括从N末端到C末端的以下结构域：CD8信号肽–3*Flag–连接子(例如，GGGGS，SEQ ID NO：42)–抗-CD19scFv-CD8a铰链结构域–NKp46跨膜和胞质结构域–2B4胞质结构域。参见例如，SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：98。
SEQ ID NO：63，CC032
SEQ ID NO：98，CC032
CC033构建体包括从N末端到C末端的以下结构域：CD8信号肽–3*Flag–连接子(例如，GGGGS，SEQ ID NO：42)–抗-CD19scFv-CD8a铰链结构域–NKp46跨膜和胞质结构域–CRACC胞质结构域。参见例如，SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：99。
SEQ ID NO：64，CC033
SEQ ID NO：99，CC033
CC034构建体包括从N末端到C末端的以下结构域：CD8信号肽–3*Flag–连接子(例如，GGGGS，SEQ ID NO：42)–抗-CD19scFv-CD8a铰链结构域–DNAM1跨膜和胞质结构域–CD2胞质结构域。参见例如，SEQ ID NO：65或SEQ ID NO：100。
SEQ ID NO：65，CC034
SEQ ID NO：100，CC034
CC035构建体包括从N末端到C末端的以下结构域：CD8信号肽–3*Flag–连接子(例如，GGGGS，SEQ ID NO：42)–抗-CD19scFv-CD8a铰链结构域–NKG2D跨膜结构域–CRACC胞质结构域。参见例如，SEQ ID NO：66或SEQ ID NO：101。
SEQ ID NO：66，CC035
SEQ ID NO：101，CC035
CC036(例如，CC035的反向结构域顺序，除了不包括CD8信号肽)构建体包括从N末端到C末端的以下结构域：CRACC胞质结构域-NKG2D跨膜结构域-CD8a铰链结构域-抗-CD19scFv–连接子(例如，GGGGS，SEQ ID NO：42)-3*Flag。参见例如，SEQ ID NO：67或SEQ ID NO：102。
SEQ ID NO：67，CC036
SEQ ID NO：102，CC036
CC037构建体包括从N末端到C末端的以下结构域：CD8信号肽–3*Flag–连接子(例如，GGGGS，SEQ ID NO：42)–抗-CD19scFv-CD8a铰链结构域–NKG2D跨膜结构域–CD2胞质结构域。参见例如，SEQ ID NO：68或SEQ ID NO：103。
SEQ ID NO：68，CC037
SEQ ID NO：103，CC037
CC038构建体包括从N末端到C末端的以下结构域：CD8信号肽–3*Flag–连接子(例如，GGGGS，SEQ ID NO：42)–抗-CD19scFv-CD8a铰链结构域–DNAM1跨膜和胞质结构域–NTB-A胞质结构域。参见例如，SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：104。
SEQ ID NO：69，CC038
SEQ ID NO：104，CC038
CC039构建体包括从N末端到C末端的以下结构域：CD8信号肽–3*Flag–连接子(例如，GGGGS，SEQ ID NO：42)–抗-CD19scFv-CD8a铰链结构域–NKG2D跨膜结构域–NTB-A胞质结构域。参见例如，SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：105。
SEQ ID NO：70，CC039
SEQ ID NO：105，CC039
抗-CD33第II-IV组
对CD33而言特异性的第II-IV组NK CARs的非限制性实例包括CC124、CC125、CC130、CC135或CC136，其分别对应于多核苷酸SEQ ID NOs：75-79和多肽SEQ ID NOs：110-114。应该理解的是，可以通过将CD-33结合结构域转换为不同的肿瘤抗原结合结构域或细胞表面蛋白结合结构域来产生其他的NK CARs。
CC124构建体包括从N末端到C末端的以下结构域：CD8信号肽–3*Flag–连接子(例如，GGGGS，SEQ ID NO：42)–抗-CD33scFv-CD8a铰链结构域–NKG2D跨膜结构域–2B4胞质结构域。参见例如，SEQ ID NO：75或SEQ ID NO：110。
SEQ ID NO：75，CC124
SEQ ID NO：110，CC124
CC125构建体(例如，CC124的反向结构域顺序，除了不包括CD8信号肽)包括从N末端到C末端的以下结构域：2B4胞质结构域-NKG2D跨膜结构域-CD8a铰链结构域-抗-CD33scFv–连接子(例如，GGGGS，SEQ ID NO：42)-3*Flag。参见例如，SEQ ID NO：76或SEQ ID NO：111。
SEQ ID NO：76，CC125
SEQ ID NO：111，CC125
CC130构建体包括从N末端到C末端的以下结构域：CD8信号肽–3*Flag–连接子(例如，GGGGS，SEQ ID NO：42)–抗-CD33scFv-CD8a铰链结构域–DNAM1跨膜和胞质结构域–CRACC胞质结构域。参见例如，SEQ ID NO：77或SEQ ID NO：112。
SEQ ID NO：77，CC130
SEQ ID NO：112，CC130
CC135构建体包括从N末端到C末端的以下结构域：CD8信号肽–3*Flag–连接子(例如，GGGGS，SEQ ID NO：42)–抗-CD33scFv-CD8a铰链结构域–NKG2D跨膜结构域–CRACC胞质结构域。参见例如，SEQ ID NO：78或SEQ ID NO：113。
SEQ ID NO：78，CC135
SEQ ID NO：113，CC135
CC136构建体(例如，CC135的反向结构域顺序，除了不包括CD8信号肽)包括从N末端到C末端的以下结构域：CRACC胞质结构域-NKG2D跨膜结构域-CD8a铰链结构域-抗-CD33scFv–连接子(例如，GGGGS，SEQ ID NO：42)-3*Flag。参见例如，SEQ ID NO：79或SEQ ID NO：114。
SEQ ID NO：79，CC136
SEQ ID NO：114，CC136
多核苷酸和载体
在多个方面中，本文所述的为编码NK CAR多肽的多核苷酸。在任一方面的一些实施方式中，CAR多核苷酸包括SEQ ID NOs：45-79中的一个(参见例如，表5)，或与SEQ IDNOs：45-79中的一个的序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列，该序列作为多肽保持相同的功能(例如，抗原结合和胞内信号转导；参见例如，SEQID NOs：80-114)。表5显示了示例性的CAR多核苷酸及其胞外、跨膜和胞内结构域的特定顺序。
表5：构建体和结构域核酸SEQ ID NOs(“TM”表示跨膜结构域)
在一些实施方式中，CAR多核苷酸是SEQ ID NOs：145-79的密码子优化的版本。在任一方面的一些实施方式中，本文所述的载体或核酸是密码子优化的，例如，核酸序列的天然或野生型序列已被改变或工程化以包括可替代的密码子，使得经改变或工程化的核酸编码与天然/野生型序列相同的多肽表达产物，但是将在期望的表达系统中以改进的效率转录和/或翻译。在任一方面的一些实施方式中，表达系统是除了天然/野生型序列来源之外的生物体(或从这样的生物体获得的细胞)。在任一方面的一些实施方式中，本文所述的载体和/或核酸序列是经密码子优化的，用于在哺乳动物或哺乳动物细胞(例如，小鼠、鼠细胞或人细胞)中表达。在任一方面的一些实施方式中，本文所述的载体和/或核酸序列对于在人细胞中的表达是经密码子优化的，用于在人细胞中表达。在任一方面的一些实施方式中，本文所述的载体和/或核酸序列是经密码子优化的，用于在酵母或酵母细胞中表达。在任一方面的一些实施方式中，本文所述的载体和/或核酸序列是经密码子优化的，用于在细菌细胞中表达。在任一方面的一些实施方式中，本文所述的载体和/或核酸序列是经密码子优化的，用于在大肠杆菌(E.coli)细胞中表达。
在一些实施方式中，本文所述的一种或多种基因在重组表达载体或质粒中表达。如本文所用，术语“载体”是指适用于将转基因转移到宿主细胞中的多核苷酸序列。载体还可以包括携带这种多核苷酸序列的病毒颗粒。载体包括例如质粒、微小染色体、噬菌体、裸DNA等。参见例如，美国专利号4,980,285、5,631,150、5,707,828、5,759,828、5,888,783和5,919,670，以及Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第2版，ColdSpring Harbor Press(1989)。一种载体是质粒，它指的是向其中连接额外DNA片段的圆形双链DNA环。另一种载体是病毒载体，其中额外的DNA片段连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们所被引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起源的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。此外，某些载体能够指导与其操作性地连接的基因的表达。这种载体在本文中被称为“表达载体”。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体通常处于质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本文所述的技术旨在包括其他形式的表达载体，例如，病毒载体(例如，复制缺陷逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，其起到同等功能并促进重组构建体递送至例如NK细胞。
克隆载体是能够在宿主细胞中复制或被整合到宿主细胞的基因组中的载体，并且其进一步特征在于一个或多个核酸内切酶限制性位点，在该位点载体可以以可确定的方式被剪切并且期望的DNA序列可以连接到该位点中，使得新的重组载体保持其在宿主细胞中复制的能力。在质粒的情况下，当质粒在宿主细胞(如宿主细菌)内的拷贝数增加时，期望的序列的复制可以发生多次，或者在宿主通过有丝分裂繁殖之前每个宿主只发生一次。在噬菌体的情况下，复制可以在裂解阶段主动发生，也可以在溶原阶段被动发生。
表达载体是可以通过限制和连接将期望的DNA序列插入其中的表达载体，从而使其与调控序列可操作地连接，并可以作为RNA转录物表达。载体可以进一步包括一个或多个标志物序列，所述标志物序列适用于鉴定已经或尚未用载体转化或转染的细胞。标志物包括例如编码增加或降低对抗生素或其他化合物的耐药性或敏感性的蛋白的基因，编码通过本领域已知的标准测定可检测其活性的酶(例如，β-半乳糖苷酶、荧光素酶或碱性磷酸酶)的基因，以及明显影响经转化或转染的细胞、宿主、菌落或噬菌斑的表型的基因(例如，绿色荧光蛋白)。在某些实施方式中，本文使用的载体能够自主复制和表达它们可操作地连接的DNA片段中存在的结构基因产物。
如本文所用，当编码序列和调控序列以将编码序列的表达或转录置于调控序列的影响或控制下的方式共价连接时，它们被称为“可操作地”连接。如果期望将编码序列翻译成功能蛋白，两个DNA序列被称为是可操作连接的，如果5′调控序列中启动子的诱导引起编码序列的转录，并且如果两个DNA序列之间的连接的性质不会(1)导致引入移码突变，(2)干扰启动子区域指导编码序列转录的能力，或(3)干扰相应RNA转录物翻译成蛋白的能力。因此，如果启动子区域能够影响该DNA序列的转录，使得所得到的转录物可以翻译成期望的蛋白或多肽，则启动子区域将可操作地连接到编码序列。
当编码本文所述的任何多肽的核酸分子在细胞中表达时，可以使用多种转录控制序列(例如，启动子/增强子序列)来指导其表达。启动子可以是天然启动子，即基因在其内源性环境中的启动子，其提供基因表达的正常调节。在一些实施方式中，启动子可以是组成型的，即启动子是不受调控的，允许其相关基因的连续转录。也可以使用多种条件启动子，例如，由分子的存在或不存在控制的启动子。
基因表达所需调控序列的精确性质可能因物种或细胞类型而异，但通常可根据需要包括分别参与转录和翻译起始的5′非转录和5′非翻译序列，如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。特别地，这样的5′非转录调控序列将包括启动子区，该启动子区包括用于可操作连接基因的转录控制的启动子序列。如所期望的，调控序列还可包括增强子序列或上游激活因子序列。本发明的载体可任选地包括5′前导序列或信号序列。适当载体的选择和设计在本领域普通技术人员的能力和判断范围内。
在任一方面的一些实施方式中，启动子是真核或人组成型启动子，包括但不限于EF-1α、SFFV、CMV等。在任一方面的一些实施方式中，载体包括人延伸因子-1α(EF-1α)启动子，其是可用于在各种体外和体内环境中驱动异位基因表达的人来源的组成型启动子。在任一方面的一些实施方式中，载体包括易于沉默的脾脏病灶形成病毒(silencing-pronespleen focus forming virus，SFFV)启动子，与CMV或EF1α启动子相比，其可产生更高水平的组成型转基因表达。在任一方面的一些实施方式中，载体包括Kozak序列(例如，GCCGCCACC)，其是在真核mRNA转录物中起到蛋白翻译起始位点作用的核酸基序。
含有用于表达的所有必要元件的表达载体是可商购得到的，并且是本领域技术人员已知的。参见例如，Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989。通过将异源DNA(RNA)引入细胞中来对细胞进行基因工程化。将该异源DNA(RNA)置于转录元件的可操作控制下，以允许异源DNA在宿主细胞中表达。
在任一方面的一些实施方式中，载体是慢病毒载体。术语“慢病毒”是指逆转录病毒科的属。慢病毒是逆转录病毒中唯一能够感染非分裂细胞的；它们可以将大量的遗传信息递送到宿主细胞的DNA中，因此它们提供了向例如哺乳动物细胞递送基因的最有效方法中的一个。HIV、SIV和FIV都是慢病毒的例子。术语“慢病毒载体”是指衍生自慢病毒基因组的至少一部分的载体，尤其包括Milone等，Mol.Ther.17(8)：1453-1464(2009)提供的自失活慢病毒载体。可用于临床的慢病毒载体的其他实例包括但不限于例如Oxford BioMedica的基因递送技术、Lentigen的LENTIMAXTM载体系统等。非临床类型的慢病毒载体也是可用的，并且对于本领域技术人员来说是已知的。
在任一方面的一些实施方式中，慢病毒载体包括中央多聚嘌呤区(cPPT)。中央多聚嘌呤区/中央终止序列产生“DNA flap”，其在靶细胞感染期间增加病毒基因组的核输入。cPPT/CTS元件提高了载体整合和转导效率。在任一方面的一些实施方式中，慢病毒载体包括土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)，其阻止poly(A)位点的通读，促进RNA加工和成熟，并增加RNA的核输出。在基因组转录物中，它增强了载体包装并提高了滴度。在经转导的靶细胞中，WPRE通过促进mRNA转录物成熟来推动转基因表达。
在一些实施方式中，载体包括选择性标志物，例如，用于在细菌中选择性扩增载体。用于细菌的选择性标志物基因的非限制性实例包括赋予对氨苄青霉素、四环素和卡那霉素抗性的抗生素抗性基因。四环素(tet)和氨苄青霉素(amp)抗性标志物基因可以从多种可商购载体中的任何一种获得，包括pBR322(可从New England BioLabs,Beverly,Mass.获得,货号303-3s)。tet编码序列包括在核苷酸86-476内；amp基因包括在核苷酸3295-4155中。卡那霉素(kan)基因的核苷酸序列可得自载体pACYC 177，来自New England BioLabs，货号401-L，GenBank登录号X06402。
在一些实施方式中，一个或多个重组表达的基因可以整合到细胞的基因组中。
可以使用本领域标准的方法和技术将编码本文所述NK CAR多肽的核酸分子引入到一个或多个细胞中。例如，核酸分子可以通过标准方法引入，如转化(包括化学转化)和电穿孔、转导、粒子轰击等。如本文所述的表达编码NK CAR多肽的核酸分子也可以通过将核酸分子整合到基因组中来实现。
细胞
在一个方面，本文所述的为包括本文所述的至少一种NK CAR多肽的细胞或其细胞群。在本文所述的一个方面中，是被工程化以表达CAR的细胞(例如，NK细胞)，其中CAR NK细胞表现出抗肿瘤特性。在一个方面，用CAR转化细胞，并且CAR在细胞表面上表达。在一些实施方式中，用编码CAR的病毒载体转导细胞(例如，NK细胞)。在一些实施方式中，病毒载体是逆转录病毒载体。在一些实施方式中，病毒载体是慢病毒载体。在一些这样的实施方式中，细胞可以稳定地表达CAR。在另一实施方式中，用编码CAR的核酸(例如，mRNA、cDNA、DNA)转染细胞(例如，NK细胞)。在一些这样的实施方式中，细胞可以瞬时表达CAR。
在任一方面的一些实施方式中，细胞包括免疫细胞。在任一方面的一些实施方式中，免疫细胞包括自然杀伤(NK)细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞或调节T细胞(Treg)。在任一方面的一些实施方式中，免疫细胞包括自然杀伤(NK)细胞。
在任一方面的一些实施方式中，细胞从受试者中分离。本文中使用的术语“分离”表示将细胞置于其自然环境以外的条件下。术语“分离”并不排除以后将这些细胞与其他细胞组合或混合使用。在任一方面的一些实施方式中，免疫细胞(例如NK细胞)是(a)从受试者中分离、(b)经基因修饰以表达如本文所述的CAR多肽、并(c)施用至受试者。在任一方面的一些实施方式中，从第一受试者分离细胞并施用至第二受试者。在任一方面的一些实施方式中，免疫细胞首先从来自受试者的体细胞样品分化，然后进行基因修饰以表达本文所述的CAR多肽。在其他实施方式中，免疫细胞(例如NK细胞)从来源于个体的诱导多能干细胞分化，例如，来自将被施用本文所述表达CAR的NK细胞的个体。
在一些实施方式中，对细胞进行基因修饰以表达CAR的方法可以包括但不限于：用编码CAR的载体转染或电穿孔细胞；用编码CAR的病毒载体(例如，逆转录病毒、慢病毒)转导；使用锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)、大范围核酸酶-TALENs或CRISPR-Cas进行基因编辑；或本领域已知的对细胞进行基因修饰以表达CAR的任何其他方法。
药物组合物和施用
在一些实施方式中，本文所述的方法涉及用本文所述NK CAR多肽对患有或诊断为患有疾病或疾患(例如，癌症、感染性疾病等)的受试者进行治疗。可由医师使用当前的癌症或感染性疾病诊断方法来识别患有此类疾病或疾患的受试者。表征这些病况并有助于诊断的症状和/或并发症是本领域已知的。癌症或感染性疾病家族史、或暴露于癌症或感染性疾病的风险因素也可有助于确定受试者是否可能患有此类疾病或疾患，或有助于诊断癌症或感染性疾病。
可将本文所述组合物施用至患有或诊断为患有癌症或感染性疾病的受试者。在一些实施方式中，本文所述的方法包括向受试者施用有效量的本文所述组合物(例如，本文所述的CAR多肽)，以缓解癌症或感染性疾病的症状。如本文所用，“缓解症状”是缓解与癌症或感染性疾病相关的任何病况或症状。与同等的未经处理的对照相比，如通过任何标准技术检测的，这种减少为至少5％、10％、20％、40％、50％、60％、80％、90％、95％、99％或更多。
本领域技术人员已知向受试者施用本文所述组合物的多种手段。药剂可通过注射或通过随时间逐渐输注来静脉内施用。对于用于给定途径的合适制剂，例如，用于本文所述方法和组合物中的药剂可通过静脉内、腹膜内、肌内、皮下、腔内、瘤内施用，并且如果期望的话可通过蠕动方式递送，或通过本领域技术人员已知的其他方式递送。特别考虑的是局部施用，例如直接局部施用至肿瘤或病变部位。
含有至少一种药剂的治疗组合物可以例如以单位剂量常规施用。当用于治疗组合物时，术语“单位剂量”是指适合作为用于受试者的单位剂量的物理学上离散的单位，每个单位包括预定量的活性物质，该活性物质被计算为与所需的生理学上可接受的稀释剂(即运载体或赋形剂)相关联地产生期望的治疗效果。
组合物以与剂型相容的方式且以治疗有效量施用。施用的量和时机取决于待治疗的受试者、受试者的系统利用活性成分的能力以及期望的治疗效果的程度。
本文使用的术语“有效量”是指缓解疾病或疾患的至少一种或多种症状所需的表达CAR的NK细胞的量，并涉及提供期望效果的足够量的药物组合物。因此，术语“治疗有效量”是指当施用至典型受试者时，足以提供特定的抗肿瘤效果(或抗感染性疾病效果)的如本文所述的表达CAR的NK细胞的量。在各种情况下，本文所使用的有效量还包括足以延缓疾病症状的发展、改变疾病症状的进程(例如但不限于，减缓疾病症状的进展)或逆转疾病症状的量。因此，通常不可能指定确切的“有效量”。然而，对于任何给定的情况，本领域的普通技术人员可以仅使用常规实验来确定适当的“有效量”。
有效量、毒性和治疗效果可以通过细胞培养物或实验动物中的标准方法来确定，例如，用于确定最小有效剂量和/或最大耐受剂量。剂量可以根据所使用的剂型和所利用的施用途径(例如，全身vs瘤内)而变化。治疗有效剂量可以从细胞培养测定中初步估计。此外，可以以动物模型来阐明剂量，以达到最小有效剂量和最大耐受剂量之间的剂量范围。任何特定剂量的效果都可以通过合适的生物测定来监测，例如，肿瘤生长和/或大小测定等。剂量可以由医师确定，并根据需要进行调整，以适应观察到的治疗效果。
通常可以说，包括本文所述细胞(例如，NK CAR细胞)的药物组合物可以以102至1010个细胞/kg体重、优选105至106个细胞/kg体重的剂量施用，包括这些范围内的所有整数值。细胞的数量将取决于组合物的最终用途以及其中所包括的细胞的类型。对于本文提供的用途，细胞的体积通常为1升或更小，可以为500mL或更小，甚至250mL或100mL或更小。因此，期望细胞的密度通常大于106个细胞/mL，并且通常大于107个细胞/mL、通常大于108个细胞/mL或更大。临床相关数量的免疫细胞可以被分配到累积等于或超过105、106、107、108、109、1010、1011或1012个细胞的多次输注中。在本发明的一些方面，特别是由于所有输注的细胞都将被重定向到特定的靶抗原，因此可以施用106/千克(每个患者106-1011)范围内的较低数量的细胞。在一些实施方式中，剂量可以是每kg体重约1×105个细胞至约1×108个细胞。在一些实施方式中，剂量可以是每kg体重约1×106个细胞至约1×107个细胞。在一些实施方式中，剂量可以是每kg体重约1×106个细胞。表达CAR的细胞组合物可以以这些范围内的剂量多次施用。对于接受治疗的患者来说，细胞可以是同种异体的、同源的、异种的或自体的。如果期望的话，治疗还可以包括施用本文所述的有丝分裂原(例如，PHA)或淋巴因子、细胞因子和/或趋化因子(例如，IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IFN-γ、GM-CSF、TGF-β、TNF-α和IFN-α等)，以增强免疫应答的诱导。在一些实施方式中，可以施用一剂细胞。在一些实施方式中，细胞的剂量可以重复，例如，一次、两次或更多次。在一些实施方式中，细胞的剂量可以例如每天、每周或每月施用。
在一些实施方式中，该剂量可以被静脉内施用。在一些实施方式中，静脉内施用可以是在约10分钟至约3小时的时间段内进行的输注。在一些实施方式中，静脉内施用可以是在约30分钟至约90分钟的时间段内进行的输注。
在一些实施方式中，该剂量可约每周施用。在一些实施方式中，该剂量可每周施用。在一些实施方式中，该剂量可每周施用约12周至约18周。在一些实施方式中，该剂量可约每2周施用。在一些实施方式中，该剂量可约每3周施用。在一些实施方式中，施用总共约2至约10剂。在一些实施方式中，施用总共4剂。在一些实施方式中，施用总共5剂。在一些实施方式中，施用总共6剂。在一些实施方式中，施用总共7剂。在一些实施方式中，施用总共8剂。在一些实施方式中，施用进行总共约4周至约12周。在一些实施方式中，施用进行总共约6周。在一些实施方式中，施用进行总共约8周。在一些实施方式中，施用进行总共约12周。在一些实施方式中，初始剂量可为后续剂量的约1.5至约2.5倍。
根据本文所述方法的治疗可降低病况的标志物或症状水平，例如，降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％或更多。
本文所述组合物的剂量可由医师确定，并根据需要进行调整，以适应观察到的治疗效果。关于治疗的持续时间和频率，熟练的临床医生通常监测受试者，以确定治疗何时提供治疗益处，并确定是否增加或减少剂量、增加或减少施用频率、停止治疗、恢复治疗或对治疗方案进行其他改变。
根据本文所述方法，施用CAR组合物或NK CAR细胞组合物的剂量范围取决于例如，CAR组合物的形式、其效价以及期望减少的本文所述病况的症状、标志物或指标的程度，例如，疾病或疾患(例如，癌症或感染性疾病)期望的减少百分比。剂量不应过大，以免引起不良副作用，如自身免疫。通常，剂量会随着患者的年龄、病况和性别而变化，并且可以由本领域的技术人员来确定。在任何并发症的情况下，剂量也可以由私人医生进行调整。
CAR组合物在例如治疗本文所述病况中的功效可由熟练的临床医师确定。然而，正如本文所用的术语，如果本文所述病况的一个或多个征象或症状以有益的方式改变，其他临床上认可的症状得到改善或甚至得到缓解，或者例如根据本文所述方法治疗后诱导了至少10％的期望的应答，治疗被认为是“有效的治疗”。功效可以例如通过测量根据本文所述方法治疗的病况的标志物、指标、症状和/或发病率或合适的任何其他可测量参数(例如肿瘤大小)进行评估。功效也可以通过住院评估的个体不再恶化或不再需要医疗干预(即疾病进展停止)来衡量。测量这些指标的方法是本领域技术人员已知的和/或本文描述的。治疗包括对个体或动物(一些非限制性实例包括人或动物)中的疾病的任何治疗，并且包括：(1)抑制疾病，例如，防止症状恶化(例如，疼痛或炎症)；或(2)减轻疾病的严重程度，例如，引起症状消退。用于治疗疾病的有效量是指当施用至有需要的受试者时，足以引起该疾病的有效治疗(如本文所定义的)的量。药剂的功效可以通过评估期望的应答或病况的物理指标(例如，肿瘤大小、或病原体滴度、或抗体滴度)来确定。通过测量这些参数中的任何一个或参数的任何组合来监测施用和/或治疗的功效完全在本领域技术人员的能力范围内。可在本文所述病况(例如，癌症治疗)的动物模型中评估功效。在使用实验动物模型时，当观察到标志物(例如，肿瘤大小、病原体滴度或抗体滴度)的统计学上显著变化时，就证明了治疗的功效。
本文提供了体外和动物模型测定，其允许评估给定剂量的CAR组合物。给定剂量组合的功效也可以在动物模型中进行评估，例如，特定的癌症动物模型。
在一个方面，本文所述的为药物组合物，其包括本文所述的至少一种CAR多肽、CAR多核苷酸、CAR载体或包括CAR的细胞，它们统称为“CAR组合物”。在任一方面的一些实施方式中，药物组合物可以包括本文所述的CAR多肽的任何组合。
在一些实施方式中，本文所述技术涉及药物组合物，所述药物组合物包括本文所述的CAR组合物和任选的药学上可接受的运载体。在一些实施方式中，药物组合物的活性成分包括本文所述的CAR多肽。药学上可接受的运载体和稀释剂包括盐水、水性缓冲溶液、溶剂和/或分散介质。这种运载体和稀释剂的用途在本领域是众所周知的。可用作药学上可接受的运载体的材料的一些非限制性实例包括：(1)糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如，玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素和醋酸纤维素；(4)黄蓍胶粉末；(5)麦芽；(6)明胶；(7)润滑剂，如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠和滑石；(8)辅料，如可可脂和栓剂蜡(suppository waxes)；(9)油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇，如丙二醇；(11)多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇(PEG)；(12)酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如，氢氧化镁和氢氧化铝；(15)褐藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；(22)填充剂(bulking agent)，例如，多肽和氨基酸；(23)血清成分，例如，血清白蛋白、HDL和LDL；(24)C2-C12醇，例如，乙醇；以及(25)用于药物制剂中的其他无毒相容物质。润湿剂、着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、调味剂、芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可以存在于制剂中。术语如“辅料”、“运载体”、“药学上可接受的运载体”等在本文中可互换使用。在一些实施方式中，运载体抑制活性剂(例如，本文所述的CAR多肽)的降解。
在一些实施方式中，包括本文所述CAR组合物的药物组合物可以是胃肠外剂型。由于胃肠外剂型的施用通常会绕过患者对污染物的自然防御，因此胃肠外剂型优选是无菌的或能够在施用至患者之前进行灭菌。胃肠外剂型的实例包括但不限于准备注射的溶液、准备裂解或悬浮在用于注射的药学上可接受的赋形剂中的干燥产品、准备注射的悬浮液和乳液。此外，可制备用于患者施用的控释胃肠外剂型，包括但不限于-型剂型和剂量倾泻。
本领域技术人员熟知可用于提供本文公开的CAR组合物的胃肠外剂型的合适的赋形剂。实例包括但不限于：无菌水；注射用水USP；盐水溶液；葡萄糖溶液；水性赋形剂，例如，但不限于氯化钠注射液、林格氏注射液、右旋糖注射液、右旋糖和氯化钠注射液以及乳酸盐林格氏注射液；水混溶性赋形剂，例如但不限于乙醇、聚乙二醇和丙二醇；以及非水性赋形剂，例如但不限于玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯和苯甲酸苄酯。
包括CAR组合物的药物组合物也可以配制成适合口服施用，例如，作为离散剂型，例如但不限于片剂(包括但不限于刻痕或包衣片剂)、丸剂、囊片剂、胶囊剂、咀嚼片剂、粉末包剂(powder packets)、扁囊剂、锭剂、糯米纸囊剂(wafers)、气溶胶喷雾剂或液体剂，例如但不限于糖浆剂、酏剂、处于水性液体、非水性液体、水包油乳液或油包水乳液的溶液或悬浮液。这样的组合物含有预定量的所公开的化合物的药学上可接受的盐，并且可以通过本领域技术人员熟知的药学方法制备。通常参见Remington:The Science and Practice ofPharmacy,21st Ed.,Lippincott,Williams,and Wilkins,Philadelphia PA.(2005)。
常规剂型通常提供从制剂中快速或立即的药物释放。根据药物的药理学和药代动力学，使用常规剂型可能会引起患者血液和其他组织中药物浓度的大幅波动。这些波动可以影响许多参数，例如，给药频率、起效时间、功效持续时间、治疗血液水平的维持、毒性、副作用等。有利地，控释制剂可用于控制药物的起效时间、作用持续时间、治疗窗口内的血浆水平和峰值血液水平。特别是，可以使用控释或迟释剂型或制剂来确保药物达到最大有效性，同时最小化潜在的不良反应和安全问题，这些不良反应和安全问题既可能发生在药物剂量不足(即低于最低治疗水平)的情况下，也可能发生在超过药物毒性水平的情况下。在一些实施方式中，所述组合物可以以缓释制剂的形式施用。
与其非控释对应物所实现的相比，控释药物产品具有改善药物治疗的共同目标。理想情况下，在医学治疗中使用最佳设计的控释制剂的特征是在最短的时间内使用最少的药物来治愈或控制病况。控释制剂的优点包括：1)延长了药物的活性；2)降低了剂量频率；3)提高了患者依从性；4)使用总量较少的药物；5)减少局部或全身性副作用；6)药物积累的最小化；7)降低血液水平波动；8)改善治疗功效；9)药物活性丧失或增强减少；以及10)提高疾病或病况的控制速度。Kim,Cherng-ju,Controlled Release Dosage Form Design,2(Technomic Publishing,Lancaster,Pa.:2000)。
大多数控释制剂被设计为最初释放一定量的药物(活性成分)，迅速产生期望的治疗效果，并逐渐且持续地释放其他量的药物，以在较长时间段内保持这种水平的治疗或预防效果。为了在体内保持这种恒定的药物水平，药物必须以如下的速率从剂型中释放出来，该速率将替代被代谢和排出体外的药物量。活性成分的控释可以通过各种条件刺激，包括但不限于pH、离子强度、渗透压、温度、酶、水和其他生理条件或化合物。
多种已知的控释或迟释剂型、制剂和装置可适用于本公开的盐和组合物。实例包括但不限于美国专利号3,845,770、3,916,899、3,536,809、3,598,123、4,008,719、5674,533、5,059,595、5,591,767、5,120,548、5,073,543、5,639,476、5,354,556、5,733,566和6,365,185B1中所述的，各自通过引用并入本文。这些剂型可用于使用如下来提供一种或多种活性成分的缓慢释放或控释，如羟丙基甲基纤维素、其他聚合物基质、凝胶、可渗透膜、渗透系统(如(Alza Corporation,Mountain View,Calif.USA))或其组合，以提供不同比例的期望释放曲线。
在任一方面的一些实施方式中，本文所述的CAR组合物作为单一疗法施用，例如，不将用于疾病或疾患(例如，癌症)的另一种治疗施用至受试者。
在任一方面的一些实施方式中，本文所述的方法可进一步包括向受试者施用第二药剂和/或治疗，例如，作为组合疗法的一部分。第二药剂和/或治疗的非限制性实例可包括放射治疗、外科手术、吉西他滨、顺铂、紫杉醇、卡铂、硼替佐米、AMG479、伏立诺他、利妥昔单抗、替莫唑胺、雷帕霉素、ABT-737、PI-103；烷化剂如噻替派和环磷酰胺；烷基磺酸酯如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；亚乙基亚胺和甲基三聚氰胺包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三亚乙基硫代磷酰胺)和三羟甲蜜胺；番荔枝内酯(acetogenins)(尤其是泡番荔枝辛(bullatacin)和bullatacinone)；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康)；苔藓抑素；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、carzelesin和比折来新(bizelesin)合成类似物)；cryptophycins(特别是cryptophycin 1和cryptophycin 8)；dolastatin；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；软珊瑚醇(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；spongistatin；氮芥，如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素如烯二炔抗生素(例如，卡奇霉素，特别是卡奇霉素γ(1)I、卡奇霉素θ(1)I和/或卡奇霉素ω(1)I(参见例如，Agnew,Chem.Intl.Ed.Engl.,33:183-186(1994))；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A；双磷酸盐(bisphosphonates)，如氯膦酸盐；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素发色团和相关的色蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素(authramycin)、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、carabicin、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素(包括吗啉代-阿霉素、氰基吗啉代-阿霉素、2-吡咯啉基-阿霉素和脱氧阿霉素)、表阿霉素、依索比星(esorubicin)、伊达比星、marcellomycin、丝裂霉素如丝裂霉素C、霉酚酸、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素、培洛霉素、potfiromycin、嘌呤霉素、quelamycin、rodorubicin、链黑菌素(streptonigrin)、链脲佐菌素、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物如二甲叶酸、甲氨蝶呤、pteropterin、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物如氟达拉滨、巯嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷；雄激素如卡鲁睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯；抗肾上腺素如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；eniluracil；安吖啶；阿莫司汀(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；defofamine；秋水仙胺；diaziquone；elformithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃博霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；lonidainine；美登素类如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；mopidanmol；nitraerine；喷司他丁；phenamet；；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基酰肼；甲苄肼；多糖复合物(JHS Natural Products,Eugene,Oreg.)；雷佐生；rhizoxin；sizofuran；锗螺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯类(特别是T-2毒素、verracurin A、杆孢菌素A(roridin A)和蛇形菌素(anguidine))；氨基甲酸酯；硫酸长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷(Ara-C)；环磷酰胺；噻替哌；紫杉烷类，例如，紫杉醇(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)，紫杉醇的无Cremophor的白蛋白-工程化的纳米颗粒制剂(American PharmaceuticalPartners,Schaumberg,Ill.)和多西他赛(Rhone-Poulenc Rorer,Antony,法国)；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，例如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；novantrone；替尼泊苷；依达曲沙(edatrexate)；柔红霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐(ibandronate)；伊立替康(Camptosar，CPT-11)(包括伊立替康联用5-FU和醛氢叶酸的治疗方案)；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇如视黄酸；卡培他滨；考布他汀；醛氢叶酸(LV)；奥沙利铂，包括奥沙利铂治疗方案(FOLFOX)；拉帕替尼减少细胞增殖的VEGF-A以及PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR的抑制剂(例如，厄洛替尼以及上述任何一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
本领域的技术人员可以容易地识别使用的化疗药物(例如，参见Physicians'Cancer Chemotherapy Drug Manual 2014,Edward Chu,Vincent T.DeVita Jr.,Jones&Bartlett Learning；Principles of Cancer Therapy,Chapter 85in Harrison'sPrinciples of Internal Medicine,18th edition；Therapeutic Targeting of CancerCells:Era of Molecularly Targeted Agents and Cancer Pharmacology,Chs.28-29inAbeloff’s Clinical Oncology,2013Elsevier；和Fischer D S(ed):The CancerChemotherapy Handbook,4th ed.St.Louis,Mosby-Year Book,2003)。
此外，治疗方法还可以包括使用放射或放射疗法。此外，治疗方法可以进一步包括使用外科治疗。
在任一方面的一些实施方式中，向受试者施用CAR组合物和抗微生物剂。如本文所用，术语“抗微生物剂”(本文中也称为抗菌剂、抗微生物治疗剂等)是指破坏微生物(即细菌、真菌、病毒、寄生虫和微生物孢子)或阻止或抑制其发育、增殖和/或致病作用的分子或组合物。因此，术语“抗菌剂”包括抗细菌剂、抗真菌剂和抗病毒剂。示例性抗微生物剂包括但不限于小的有机或无机分子；肽；蛋白；肽类似物和衍生物；拟肽；抗体(多克隆或单克隆的)；抗体的抗原结合片段；核酸；核酸类似物和衍生物；由细菌、植物、真菌或动物细胞等生物材料制成的提取物；动物组织；天然存在或合成的组合物；以及它们的任意组合。
在任一方面的一些实施方式中，抗微生物剂可以选自氨基糖苷类、安沙霉素类、β-内酰胺类、双缩二胍类、碳头孢烯类、碳青霉烯类、阳离子多肽类、头孢菌素类、氟喹诺酮类、糖肽类、铁螯合糖蛋白类(iron-sequestering glycoproteins)、linosamides、脂肽类、大环内酯类、单环β-内酰胺类、硝基呋喃类、噁唑烷酮类、青霉素类、多肽类、季铵类化合物、喹诺酮类、银化合物、磺胺类、四环素类及其任意组合。在任一方面的一些实施方式中，抗微生物剂可以包括抗生素。
在任一方面的一些实施方式中，向受试者施用CAR组合物和抗细菌剂。一些示例性的特异性抗细菌剂包括广谱青霉素、阿莫西林(例如氨苄青霉素、巴氨西林、卡茚西林、美洛西林、哌拉西林、替卡西林)、青霉素和β-内酰胺酶抑制剂(例如阿莫西林-克拉维酸、氨苄青霉素-舒巴坦、苄青霉素、氯唑西林、双氯西林、甲氧西林、苯唑西林、青霉素G、青霉素V、哌拉西林-他唑巴坦、替卡西林-克拉维酸、萘夫西林)、头孢菌素类(例如第一代头孢菌素、头孢羟氨苄、头孢唑林、头孢氨苄、头孢噻吩、头孢匹林、头孢拉定)、第二代头孢菌素(例如头孢克洛、头孢孟多、头孢尼西、头孢替坦、头孢西丁、头孢丙烯、头孢美唑、头孢呋辛、氯碳头孢)、第三代头孢菌素(例如头孢地尼、头孢布烯、头孢哌酮、头孢克肟、头孢噻肟、头孢泊肟酯、头孢他啶、头孢唑肟、头孢曲松)、第四代头孢菌素(例如头孢吡肟)、大环内酯类和林可酰胺类(例如阿奇霉素、克拉霉素、克林霉素、地红霉素、红霉、林可霉素(Lincomycin)、醋竹桃霉素)、喹诺酮类和氟喹诺酮类(例如西诺沙星、环丙沙星、依诺沙星、加替沙星、格帕沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、莫西沙星、萘啶酸、诺氟沙星、氧氟沙星司帕沙星、曲伐沙星、Oxolinic acid、吉米沙星、培氟沙星)、碳青霉烯类(例如亚胺培南-西司他丁、美罗培南)、单内酰胺类(例如氨曲南)、氨基糖苷类(例如阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、链霉素、妥布霉素、巴龙霉素)、糖肽类(例如替考拉宁、万古霉素)、四环素类(例如地美环素、多西环素、美他环素、米诺环素、氧四环素、四环素、金霉素)、磺胺类(例如磺胺米隆、磺胺嘧啶银、磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、柳氮磺胺吡啶、磺胺异噁唑、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑、磺胺甲二唑)、利福平(例如利福布汀、利福平、利福喷丁)、噁唑烷酮类(例如利奈唑胺、链阳霉素、奎奴普丁-达福普汀)、杆菌肽、氯霉素、磷霉素、异烟肼、乌洛托品、甲硝唑、莫匹罗星、呋喃妥因、呋喃西林、新生霉素、多粘菌素、大观霉素、甲氧苄啶、黏菌素、环丝氨酸、卷曲霉素、乙硫异烟胺、吡嗪酰胺、对氨水杨酸、琥乙红霉素等。
在任一方面的一些实施方式中，向受试者施用CAR组合物和抗病毒剂。在任一方面的一些实施方式中，抗病毒剂选自于由以下组成的组：阿巴卡韦、阿昔洛韦、阿德福韦、金刚烷胺、安普利近(ampligen)、amprenavir、抗逆转录病毒剂、阿比多尔、阿扎那韦、atripla、西多福韦、双汰芝、达芦那韦、地拉韦定、去羟肌苷、二十二醇、度鲁特韦、ecoliever、edoxudine、依非韦伦、恩曲他滨、恩夫韦肽、恩替卡韦、泛昔洛韦、法维拉韦、福米韦生(fomivirsen)、福沙那韦、膦甲酸(foscarnet)、fosfonet、融合抑制剂(fusioninhibitor)、更昔洛韦、羟氯喹、ibacitabine、碘苷、咪喹莫特、imunovir、茚地那韦、肌苷、整合酶抑制剂、干扰素、干扰素I型、干扰素II型、干扰素III型、拉米夫定、洛匹那韦、洛韦胺(loviride)、马拉韦罗、美替沙腙(methisazone)、吗啉胍、奈非那韦、奈韦拉平、nexavir、硝唑尼特、norvir、核苷类似物、奥司他韦(oseltamivir)(TAMIFLU)、聚乙二醇干扰素α-2a、喷昔洛韦、帕拉米韦、普来可那利(pleconaril)、鬼臼毒素、蛋白酶抑制剂、pyramidine、拉替拉韦、瑞德西韦、逆转录酶抑制剂、利巴韦林、金刚乙胺、利托那韦、沙奎那韦、索非布韦、司他夫定、特拉匹韦(telaprevir)、替诺福韦、替诺福韦二吡呋酯(tenofovir disoproxil)、替拉那韦、曲氟尿苷、三协唯、曲金刚胺、舒发泰、万乃洛韦(Valtrex)、缬更昔洛韦、vicriviroc、阿糖腺苷(vidarabine)、塔利韦林(viramidine)、扎西他滨、扎那米韦(RELENZA)和齐多夫定；参见例如，PCT专利申请WO2019018185A1、WO2019079339A1、WO2020055368A2、美国专利申请US20200017514A1；美国专利US8575195；其每一个的内容通过引用以其整体并入本文。还可以使用本领域已知的其他抗病毒剂。
治疗方法
可将本文所述的NK CAR组合物施用至有需要的受试者，尤其是癌症的治疗。在任一方面的一些实施方式中，可施用本文所述的CAR组合物以用于癌症或感染性疾病的治疗。可以用本文所述的CAR组合物治疗的感染性疾病包括具有可被靶向的特定微生物抗原的任何微生物；感染性疾病可以是病毒感染或细菌感染。
在一些实施方式中，治疗方法可包括对可受益于本文所述组合物治疗的受试者或患者进行初次诊断。在一些实施方式中，这种诊断包括检测或测量在来自受试者或患者的样品中的标志物(例如，本文所述的肿瘤抗原或来自病毒或细菌的抗原)的异常水平。在一些实施方式中，该方法还包括向患者施用本文所述的CAR组合物。
在一些实施方式中，受试者先前已被确定具有相对于参考的本文所述的分析物的异常水平。在一些实施方式中，参考水平可以是与样品/受试者具有相似细胞类型、样品类型、样品处理和/或从具有相似年龄、性别和其他人口统计学参数的受试者获得的样品中的水平。在一些实施方式中，测试样品和对照参考样品是相同类型的，即从相同的生物源获得，并且包括相同的组成，例如，相同数量和类型的细胞。
本文中使用的术语“样品”或“测试样品”表示从生物有机体中获取或分离的样品，例如，来自受试者的血液或血浆样品。在任一方面的一些实施方式中，本文所述的技术包括生物样品的多个实例。在任一方面的一些实施方式中，生物样品是细胞、或组织、或外周血、或体液。示例性生物样品包括但不限于活检样品、肿瘤样品、生物流体样品；血液；血清；血浆；尿；精液；黏液；组织活检样品；器官活检样品；滑液；胆汁；脑脊液；粘膜分泌物；积液(effusion)；汗液；唾液和/或组织样品等。该术语还包括上述样品的混合物。术语“测试样品”还包括未经处理或经预处理(或经预加工)的生物样品。在任一方面的一些实施方式中，测试样品可以包括来自受试者的细胞。
在任一方面的一些实施方式中，确定受试者是否具有异常水平的本文所述的分析物的步骤可以包括：i)从受试者获得或已经获得样品，以及ii)对从受试物获得的样品进行或已经进行测定，以确定/测量受试者中的分析物水平。在任一方面的一些实施方式中，确定受试者是否具有异常水平的本文所述的分析物的步骤可以包括对从受试者获得的样品进行或已经进行测定，以确定/测量受试者中的分析物水平。在任一方面的一些实施方式中，确定受试者是否具有异常水平的本文所述的分析物的步骤可以包括命令或请求对从受试者获得的样品进行测定，以确定/测量受试者中的分析物水平。在任一方面的一些实施方式中，确定受试者是否具有异常水平的本文所述的分析物的步骤可以包括接收对从受试者获得的样品的测定结果，以确定/测量受试者中的分析物水平。在任一方面的一些实施方式中，确定受试者是否具有异常水平的本文所述的分析物的步骤可以包括接收报告、结果或将受试者识别为具有降低水平的分析物的受试者的其他手段。
在一个方面，本文所述的是一种对需要基于CAR的治疗剂的受试者进行治疗的方法，包括向受试者施用治疗有效量的基于CAR的治疗剂，所述治疗剂选自于由以下组成的组：本文所述的NK CAR多肽、本文所述的NK CAR多核苷酸、本文所述的NK CAR载体、本文所述的NK CAR慢病毒、本文所述的NK CAR细胞或其细胞群、或本文所述的NK CAR药物组合物。
在任一实施方式的一个方面中，本文描述的是对有需要的受试者中的癌症或感染性疾病进行治疗的方法，该方法包括：a)确定受试者是否具有异常水平的分析物(例如，如本文所述的肿瘤、病毒或细菌抗原)；以及b)如果分析物的水平相对于参考增加或异常，则指示或指导对受试者施用本文所述的CAR组合物。在任一方面的一些实施方式中，指示或指导对受试者施用特定治疗的步骤可包括提供测定结果的报告。在任一方面的一些实施方式中，指示或指导对受试者施用特定治疗的步骤可包括提供测定结果的报告和/或鉴于测定结果的治疗建议。在任一方面的一些实施方式中，基于CAR的治疗剂的施用引起由CAR靶向的癌细胞的特异性裂解增加。在任一方面的一些实施方式中，基于CAR的治疗剂的施用引起由CAR靶向的感染细胞的特异性裂解增加。
在本文所述的一个方面中，是一种增加NK细胞或其细胞群的活化的方法，包括使所述细胞或其细胞群与本文所述的NK CAR多肽、本文所述的NK CAR多核苷酸、本文所述的NK CAR载体或本文所述的NK CAR慢病毒接触。
在任一方面的一些实施方式中，与接触多肽、多核苷酸、载体或慢病毒之前相比，将NK细胞或其细胞群与多肽、多核苷酸、载体或慢病毒接触使NK细胞的活性增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少200％、至少300％、至少400％或至少500％。在任一方面的一些实施方式中，NK细胞或其细胞群的增加的活化包括选自于由TNFα、IFNγ、GM-CSF和颗粒酶B组成的组中的细胞因子或颗粒酶的表达增加。
在任一方面的一些实施方式中，NK细胞或其细胞群的增加的活化引起靶细胞的特异性裂解增加。在任一方面的一些实施方式中，靶细胞表达特异性地结合至多肽的胞外结合结构域的表面抗原。在任一方面的一些实施方式中，靶细胞是癌细胞。在任一方面的一些实施方式中，靶细胞是被病毒或细菌感染的细胞。
在另一个方面，本文所述的是制备治疗组合物的方法，该方法包括在允许NK CAR多肽在细胞中表达的条件下，将本文所述的NK CAR多肽、本文所述的NK CAR多核苷酸、本文所述的NK CAR载体或本文所述的NK CAR慢病毒引入NK细胞。
在任一方面的一些实施方式中，在引入核酸、多核苷酸、载体或慢病毒之前，从需要治疗组合物的受试者中移除NK细胞。在任一方面的一些实施方式中，在引入核酸、多核苷酸、载体或慢病毒后，将NK细胞返回受试者。
癌症
在本文所述各个方面的一些实施方式中，本文所述的CAR多肽可用于治疗癌症。如本文所用，术语“癌症”通常涉及一类疾病或病况，其中异常细胞在不受控制的情况下分裂，并可侵入附近组织。癌细胞也可以通过血液和淋巴系统传播到身体的其他部位。癌症有几种主要类型。癌(carcinoma)是始于皮肤或者始于内衬于或包覆内脏的组织的癌症。肉瘤是始于骨骼、软骨、脂肪、肌肉、血管或其他结缔组织或支持组织的癌症。白血病是始于骨髓等造血组织的癌症，并且引起大量的异常血细胞产生并进入血液。淋巴瘤和多发性骨髓瘤是始于免疫系统的细胞的癌症。中枢神经系统癌症是始于大脑和脊髓组织的癌症。
在任一方面的一些实施方式中，癌症是原发性癌症。在任一方面的一些实施方式中，癌症是恶性癌症。如本文所用，术语“恶性”是指如下的癌症，其中一组肿瘤细胞表现出一种或多种不受控制的生长(即分裂超出正常极限)、侵袭(即侵入和破坏相邻组织)和转移(即通过淋巴或血液扩散到体内其他位置)。如本文所用，术语“转移”是指癌症从身体的一个部分扩散到另一个部分。由扩散的细胞形成的肿瘤被称为“转移性肿瘤”或“转移瘤”。转移性肿瘤包括与原始(原发)肿瘤中的细胞相似的细胞。如本文所用，术语“良性”或“非恶性”是指可能生长得更大但不会扩散到身体其他部位的肿瘤。良性肿瘤是自我限制的，并且通常不会侵袭或转移。
“癌细胞”或“肿瘤细胞”是指癌性生长物或组织的单个细胞。肿瘤通常是指由细胞异常生长形成的肿胀或病变，其可能是良性、恶性前期或恶性的。大多数癌细胞形成肿瘤，但有些细胞(例如，白血病)不一定形成肿瘤。对于那些形成肿瘤的癌细胞，术语癌症(细胞)和肿瘤(细胞)互换使用。
如本文所用，术语“赘生物(neoplasm)”是指任何新的和异常的组织生长，例如，异常的组织块，其生长超过正常组织的生长并且与正常组织不协调。因此，赘生物可以是良性赘生物、恶性前期赘生物或恶性赘生物。
患有癌症或肿瘤的受试者是在受试者体内存在客观可测量的癌细胞的受试者。这一定义包括恶性、活跃增殖性癌症、以及潜在的休眠性肿瘤或微转移。从其原始位置迁移并植入其他重要器官的癌症可最终通过受影响器官的功能恶化导致受试者死亡。
癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤、白血病、基底细胞癌、胆管癌；膀胱癌；骨癌；脑与中枢神经系统癌症；乳腺癌；腹膜癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结直肠癌；结缔组织癌症；消化系统癌症；子宫内膜癌；食管癌；眼癌；头颈部癌；胃癌(包括胃肠道癌)；胶质母细胞瘤(GBM)；肝癌；肝细胞癌；上皮内瘤；肾癌或肾脏癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如，小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)；淋巴瘤，包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤；黑色素瘤；骨髓瘤；神经母细胞瘤；口腔癌(如唇、舌、口和咽部)；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸系统癌症；唾液腺癌；肉瘤；皮肤癌；鳞状细胞癌；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫或子宫内膜癌；泌尿系统癌症；外阴癌；以及其他癌和肉瘤；以及B细胞淋巴瘤(包括低度/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞性(SL)NHL；中度/滤泡性NHL；中度弥漫性NHL；高度成免疫细胞性NHL；高度成淋巴细胞性NHL；高度小无核裂细胞性NHL；巨块疾病NHL；套细胞淋巴瘤；艾滋病相关淋巴瘤；以及Waldenstrom巨球蛋白血症)；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性成淋巴细胞白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性粒细胞白血病；和移植后淋巴组织增生性疾病(PTLD)，以及与斑痣性错构瘤病(phakomatoses)、水肿(如与脑肿瘤相关的水肿)和Meigs综合征相关的异常血管增生。
在任一方面的一些实施方式中，受试者患有或已经被诊断患有肾上腺癌、肛门癌、阑尾癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、胆囊癌、妊娠滋养细胞疾病、头颈部癌、霍奇金淋巴瘤、肠癌、肾癌、白血病、肝癌、肺癌、黑色素瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、多发性骨髓瘤、神经内分泌肿瘤、非霍奇金淋巴瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、鼻窦癌、皮肤癌、肉瘤、软组织肉瘤、脊柱癌、胃癌、睾丸癌、喉癌、肿瘤、甲状腺癌、子宫癌、阴道癌或外阴癌。
“癌细胞”是在体内、离体或组织培养物中的癌、癌前或经转化的细胞，具有自发或诱导的表型变化，不一定涉及新的遗传物质的吸收。尽管转化可以由感染转化病毒和掺入新的基因组核酸或摄取外源核酸引起，但它也可以自发发生或在暴露至致癌物后发生，从而使内源性基因突变。转化/癌症与如下有关，例如形态变化、细胞永生化、异常生长控制、病灶形成、锚着非依赖性、恶性肿瘤、接触抑制丧失和生长密度限制、生长因子或血清非依赖性、肿瘤特异性标志物、侵袭性或转移以及适当的动物宿主(如裸鼠)中的肿瘤生长。
感染性疾病
在本文所述各个方面的一些实施方式中，本文所述的CAR多肽可用于治疗感染性疾病。在本文所述的各个方面的一些实施方式中，感染性疾病是细菌感染。在本文所述的各个方面的一些实施方式中，感染性疾病是病毒感染。
致病菌的非限制性实例包括螺旋菌(例如，疏螺旋体属(Borrelia))、放线菌(例如，放线菌属(Actinomyces))、支原体、立克次氏体、革兰氏阴性好氧杆菌、革兰氏阴性好氧球菌、革兰氏阴性兼性厌氧杆菌(例如，欧文氏菌属(Erwinia)和耶尔森氏菌属(Yersinia))、革兰氏阴性球菌、革兰氏阴性球杆菌和革兰氏阳性球菌(例如，葡萄球菌属(Staphylococcus)和链球菌属(Streptococcus))、形成内生孢子的杆菌、形成内生孢子的球菌。细菌病原体的进一步的非限制性实例包括属于如下的那些细菌病原体：杆菌属(Bacillus)、布鲁氏菌属(Brucella)、伯克氏菌属(Burkholderia)、弗朗西斯氏菌属(Francisella)、耶尔森氏菌属、链球菌属、嗜血杆菌属(Haemophilus)、奈瑟氏菌属(Nisseria)、李斯特菌属(Listeria)、梭菌属(Clostridium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、军团菌属(Legionella)、埃希氏菌属(Escherichia)(例如，大肠杆菌(E.coli))、分枝杆菌属(Mycobacterium)、葡萄球菌属、弯曲杆菌属(Campylobacter)、弧菌属(Vibrio)和沙门氏菌属(Salmonella)，以及这些致病菌的耐药菌株和多重耐药菌株及高毒力菌株。已知的食源性细菌病原体的非限制性实例包括属于沙门氏菌属、梭菌属、弯曲杆菌属(Campylobacter spp.)、葡萄球菌属、沙门氏菌属、埃希氏菌属(例如，大肠杆菌)和李斯特菌属的那些病原体。在一些实施方式中，细菌病原体的非限制性实例包括炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、流产布鲁氏杆菌(Brucella abortus)、羊布鲁氏杆菌(Brucellamelitensis)、猪布鲁氏杆菌(Brucella suis)、鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderiamallei)、类鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pseudomallei)、土拉热弗朗西斯菌(Francisella tularensis)、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)、A群和B群链球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)、脑膜炎奈瑟氏菌(Nisseria meningitides)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytegenes)、艰难梭菌、克雷伯氏菌，结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、弯曲杆菌属、沙门氏菌属(Salmonella spp.)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)和大肠杆菌的高毒力致病菌株，以及这些致病细菌的耐药菌株和多重耐药菌株及高毒力菌株。在一些实施方式中，已知的食源性细菌病原体的非限制性实例包括沙门氏菌属、非伤寒产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、弯曲杆菌属、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌属、非伤寒弯曲杆菌属、大肠杆菌(STEC)0157和单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)。
在任一方面的一些实施方式中，本文所述的CAR多肽用于治疗RNA病毒。作为非限制性实例，RNA病毒是第III组(dsRNA)病毒、第IV组(+ssRNA)病毒、第V组(-ssRNA)病毒或第VI组(逆转录酶)病毒。
在任一方面的一些实施方式中，RNA病毒是第III组(即，双链RNA(dsRNA))病毒。在任一方面的一些实施方式中，第III组RNA病毒属于选自于由以下组成的组中的病毒科：混合病毒科(Amalgaviridae)、双核糖核酸病毒科(Birnaviridae)、金色病毒科(Chrysoviridae)、囊病毒科(Cystoviridae)、内核核糖核酸病毒科(Endornaviridae)、低毒性病毒科(Hypoviridae)、巨大双分核糖核酸病毒科(Megabirnaviridae)、双分病毒科(Partitiviridae)、小双节病毒科(Picobirnaviridae)、呼肠孤病毒科(Reoviridae)(例如，轮状病毒(Rotavirus))、整体病毒科(Totiviridae)、Quadriviridae。在任一方面的一些实施方式中，第III组RNA病毒属于Botybirnavirus属。在任一方面的一些实施方式中，第III组RNA病毒是选自于由以下组成的组中的未指定物种：Botrytis porri RNA virus 1、甜菜叶蝉病毒1型(Circulifer tenellus virus 1)、茶树叶枯病丝状病毒1型(Colletotrichum camelliae filamentous virus 1)、南瓜黄化相关病毒(Cucurbityellows associated virus)、核盘菌衰退相关病毒(Sclerotinia sclerotiorumdebilitation-associated virus)和Spissistilus festinus virus 1。
在任一方面的一些实施方式中，RNA病毒是第IV组(即，正义单链(ssRNA))病毒。在任一方面的一些实施方式中，第IV组RNA病毒属于选自于由以下组成的组的病毒目：套式病毒目(Nidovirales)、小核糖核酸病毒目(Picornavirales)和芜菁黄花叶病毒目(Tymovirales)。在任一方面的一些实施方式中，第IV组RNA病毒属于选自于由以下组成的组的病毒科：动脉病毒科(Arteriviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)(例如，冠状病毒(Coronavirus)、SARS-CoV)、Mesoniviridae、Roniviridae、二顺反子病毒科(Dicistroviridae)、Iflaviridae、Marnaviridae、小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)(例如，脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)、鼻病毒(Rhinovirus)(普通感冒病毒)、甲型肝炎病毒(Hepatitis A virus))、伴生豇豆病毒科(Secoviridae)(例如，豇豆花叶病毒亚科(subComovirinae))、甲型线形病毒科(Alphaflexiviridae)、乙型线形病毒科(Betaflexiviridae)、丙型线形病毒科(Gammaflexiviridae)、芜菁发黄镶嵌病毒科(Tymoviridae)、Alphatetraviridae、Alvernaviridae、星形病毒科(Astroviridae)、杆状RNA病毒科(Barnaviridae)、Benyviridae、雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)、杯状病毒科(Caliciviridae)(例如，诺瓦克病毒(Norwalk virus))、Carmotetraviridae、长线形病毒科(Closteroviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)(例如，黄热病病毒(Yellow fevervirus)、西尼罗病毒(West Nile virus)、丙型肝炎病毒(Hepatitis Cvirus)、登革热病毒(Dengue fever virus)、寨卡病毒(Zika virus))、Fusariviridae、肝炎病毒科(Hepeviridae)、低毒性病毒科(Hypoviridae)、光滑噬菌体科(Leviviridae)、黄症病毒科(Luteoviridae)(例如，大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf virus))、Polycipiviridae、裸露RNA病毒科(Narnaviridae)、诺达病毒科(Nodaviridae)、Permutotetraviridae、马铃薯Y病毒科(Potyviridae)、Sarthroviridae、Statovirus、披膜病毒科(Togaviridae)(例如，风疹病毒(Rubella virus)、罗斯河病毒(Ross River virus)、辛德毕斯病毒(Sindbisvirus)、基孔肯雅病毒(Chikungunya virus))、番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)和帚状病毒科(Virgaviridae)。在任一方面的一些实施方式中，第IV组RNA病毒属于选自于由以下组成的组的病毒属：Bacillariornavirus、Dicipivirus、Labyrnavirus、伴生病毒科(Sequiviridae)、Blunervirus、Cilevirus、Higrevirus、悬钩子病毒属(Idaeovirus)、Negevirus、欧尔密病毒属(Ourmiavirus)、Polemovirus、Sinaivirus和南方菜豆花叶病毒属(Sobemovirus)。在任一方面的一些实施方式中，第IV组RNA病毒是选自于由以下组成的组的未指定物种：Acyrthosiphon pisum病毒、Bastrovirus、Blackford病毒、蓝莓坏死环斑病毒(Blueberry necrotic ring blotch virus)、Cadicistrovirus、澳大利亚轮藻病毒(Chara australis virus)、超小病毒(Extra small virus)、枸杞黄化病毒(Goji berrychlorosis virus)、Hepelivirus、荆门蜱病毒(Jingmen tick virus)、Le Blanc病毒、Nedicistrovirus、烟盲蝽病毒1型(Nesidiocoris tenuis virus 1)、Niflavirus、Nylanderia fulva virus 1、Orsay病毒、Osedax japonicus RNA病毒1型、Picalivirus、霍尔斯单轴霉病毒(Plasmopara halstedii virus)、Rosellinia necatrix fusarivirus 1、Santeuil病毒、Secalivirus、红火蚁病毒3型(Solenopsis invicta virus 3)、Wuhan大型猪圆虫病毒。在任一方面的一些实施方式中，第IV组RNA病毒是选自于由以下组成的组中的卫星病毒：Sarthroviridae科、Albetovirus属、Aumaivirus属、Papanivirus属、Virtovirus属和慢性蜜蜂麻痹病毒(Chronic bee paralysis virus)。
在任一方面的一些实施方式中，RNA病毒是第V组(即，反义ssRNA)病毒。在任一方面的一些实施方式中，第V组RNA病毒属于选自于由以下组成的组中的病毒门或亚门：Negarnaviricota、Haploviricotina和Polyploviricotina。在任一方面的一些实施方式中，第V组RNA病毒属于选自于由以下组成的组中的病毒纲：春秋病毒纲(Chunqiuviricetes)、Ellioviricetes、Insthoviricetes、Milneviricetes、单荆病毒纲(Monjiviricetes)和允常病毒纲(Yunchangviricetes)。在任一方面的一些实施方式中，第V组RNA病毒属于选自于由以下组成的组中的病毒目：Articulavirales、布尼亚病毒目(Bunyavirales)、勾践病毒目(Goujianvirales)、荆楚病毒目(Jingchuvirales)、单分子负链RNA病毒目(Mononegavirales)、Muvirales和Serpentovirales。在任一方面的一些实施方式中，第V组RNA病毒属于选自于由以下组成的组中的病毒科：Amnoonviridae(例如，Taastrup病毒)、沙粒病毒科(Arenaviridae)(例如，拉沙病毒(Lassa virus))、Aspiviridae、博尔纳病毒科(Bornaviridae)(例如，博尔纳病病毒(Borna diseasevirus))、Chuviridae、Cruliviridae、Feraviridae、丝状病毒科(Filoviridae)(例如，埃博拉病毒(Ebola virus)、马尔堡病毒(Marburg virus))、Fimoviridae、汉坦病毒科(Hantaviridae)、Jonviridae、Mymonaviridae、Nairoviridae、Nyamiviridae、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(例如，流感病毒(Influenza viruses))、副粘病毒科(Paramyxoviridae)(例如，麻疹病毒(Measles virus)、腮腺炎病毒(Mumps virus)、尼帕病毒(Nipah virus)、亨德拉病毒(Hendra virus)和NDV)、Peribunyaviridae、Phasmaviridae、Phenuiviridae、Pneumoviridae(例如，RSV和偏肺病毒(Metapneumovirus))、秦病毒科(Qinviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)(例如，狂犬病病毒(Rabies virus))、Sunviridae、Tospoviridae和Yueviridae。在任一方面的一些实施方式中，第V组RNA病毒属于选自于由以下组成的组中的病毒属：Anphevirus、Arlivirus、Chengtivirus、Crustavirus、Tilapineviridae、Wastrivirus和德尔塔病毒(Deltavirus)(例如，丁型肝炎病毒(Hepatitis D virus))。
在任一方面的一些实施方式中，RNA病毒是第VI组RNA病毒，其包括病毒编码的逆转录酶。在任一方面的一些实施方式中，第VI组RNA病毒属于Ortervirales病毒目。在任一方面的一些实施方式中，第VI组RNA病毒属于选自于由以下组成的组中的病毒科或亚科：Belpaoviridae、花椰菜花叶病毒科(Caulimoviridae)、转座病毒科(Metaviridae)、假病毒科(Pseudoviridae)和逆转录病毒科(Retroviridae)(例如，逆转录病毒(Retroviruses)，例如，HIV)、正逆转录病毒亚科(Orthoretrovirinae)和泡沫逆转录病毒亚科(Spumaretrovirinae)。在任一方面的一些实施方式中，第VI组RNA病毒属于选自于由以下组成的组中的病毒属：α逆转录病毒属(Alpharetrovirus)(例如，禽白血病病毒(Avianleukosis virus)；劳氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus))、β逆转录病毒属(Betaretrovirus)(例如，小鼠乳腺瘤病毒(Mouse mammary tumour virus))、Bovispumavirus(例如，牛泡沫病毒(Bovine foamy virus))、δ逆转录病毒属(Deltaretrovirus)(例如，牛白血病病毒(Bovine leukemia virus)；人类嗜T淋巴细胞病毒(Human T-lymphotropic virus))、ε逆转录病毒(Epsilonretrovirus)(例如，大眼鲈真皮肉瘤病毒(Walleye dermal sarcoma virus))、Equispumavirus(例如，马泡沫病毒(Equine foamy virus))、Felispumavirus(例如，猫泡沫病毒(Feline foamy virus))，γ逆转录病毒属(Gammaretrovirus)(例如，鼠白血病病毒(Murine leukemia virus)；猫白血病病毒(Feline leukemia virus))、慢病毒属(Lentivirus)(例如，人类免疫缺陷病毒1型(Human immunodeficiency virus 1)；猴免疫缺陷病毒(Simian immunodeficiencyvirus)；猫免疫缺陷病毒(Feline immunodeficiency virus))，Prosimiispumavirus(例如，棕色大加拉戈原猴泡沫病毒(Brown greater galago prosimian foamy virus))和Simiispumavirus(例如，东部黑猩猩泡沫病毒(Eastern chimpanzee simian foamyvirus))。在任一方面的一些实施方式中，病毒是内源性逆转录病毒(ERV；例如，内源性逆转录病毒W组包膜成员1(endogenous retrovirus group W envelope member 1，ERVWE1)；HCP5(HLA复合体P5)；人畸胎瘤衍生病毒(Human teratocarcinoma-derived virus))，其是与逆转录病毒非常相似并可衍生自逆转录病毒的基因组中的内源性病毒元件。
在任一方面的一些实施方式中，本文所述的CAR多肽用于治疗DNA病毒。作为非限制性实例，DNA病毒是第I组(dsDNA)病毒、第II组(ssDNA)病毒或第VII组(dsDNA-RT)病毒。
在任一方面的一些实施方式中，DNA病毒是第I组(即dsDNA)病毒。在任一方面的一些实施方式中，第I组dsDNA病毒属于选自于由以下组成的组中的病毒目：有尾噬菌体目(Caudovirales)；疱疹病毒目(Herpesvirales)和线状病毒目(Ligamenvirales)。在任一方面的一些实施方式中，第I组dsDNA病毒属于选自于由以下组成的组的病毒科：腺病毒科(Adenoviridae)(例如，腺病毒(adenoviruses))、异疱疹病毒科(Alloherpesviridae)、Ampullaviridae、囊泡病毒科(Ascoviridae)、非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)(例如，非洲猪瘟病毒(African swine fever virus))、杆状病毒科(Baculoviridae)、Bicaudaviridae、Clavaviridae、覆盖噬菌体科(Corticoviridae)、Fuselloviridae、球状病毒科(Globuloviridae)、Guttaviridae、疱疹病毒科(Herpesviridae)(例如，人类疱疹病毒(human herpesviruses)、水痘带状疱疹病毒(Varicella Zoster virus))、Hytrosaviridae、虹彩病毒科(Iridoviridae)、Lavidaviridae、脂毛噬菌体科(Lipothrixviridae)、软体动物疱疹病毒科(Malacoherpesviridae)、Marseilleviridae、拟菌病毒科(Mimiviridae)、肌尾噬菌体科(Myoviridae)(例如，肠道细菌噬菌体T4(Enterobacteria phage T4))、Nimaviridae、Nudiviridae、潘多拉病毒科(Pandoraviridae)、乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)、藻类DNA病毒科(Phycodnaviridae)、芽生噬菌体科(Plasmaviridae)、短尾噬菌体科(Podoviridae)(例如，肠道细菌噬菌体T7(Enterobacteria phage T7))、Polydnaviruses、多瘤病毒科(Polyomaviridae)(例如，猴病毒40(Simian virus 40)、JC病毒、BK病毒)、痘病毒科(Poxviridae)(例如，牛痘病毒(Cowpox virus)、天花病毒(smallpox))、古噬菌体科(Rudiviridae)、长尾噬菌体科(Siphoviridae)(例如，肠道细菌噬菌体λ(Enterobacteriaphageλ))、Sphaerolipoviridae、复层噬菌体科(Tectiviridae)、Tristromaviridae和Turriviridae。在任一方面的一些实施方式中，第I组dsDNA病毒属于选自于由以下组成的组的病毒属：Dinodnavirus、Rhizidiovirus和Salterprovirus。在任一方面的一些实施方式中，第I组dsDNA病毒属于选自于由以下组成的组中的未指定病毒种：鲍肌肉萎缩症病毒(Abalone shriveling syndrome-associated virus)、蜜蜂丝状病毒(Apis melliferafilamentous virus)、袋狸乳头状瘤癌病毒(Bandicoot papillomatosis carcinomatosisvirus)、Cedratvirus、Kaumoebavirus、KIs-V、Lentille病毒、Leptopilina boulardi丝状病毒、巨大病毒(Megavirus)、Metallosphaera turreted icosahedral病毒、Methanosarcina球形病毒、西伯利亚软体病毒(Mollivirus sibericum virus)、Orpheovirus IHUMI-LCC2、Phaeocystis globosa病毒和阔口罐病毒(Pithovirus)。在任一方面的一些实施方式中，第I组dsDNA病毒是选自于由以下组成的组中的噬病毒体：有机湖噬病毒体(Organic Lake virophage)、Ace Lake Mavirus噬病毒体、滴水湖噬病毒体1型(Dishui Lake virophage 1)、Guarani噬病毒体、Phaeocystis globosa virus噬病毒体、内格罗河噬病毒体(Rio Negro virophage)、卫星噬病毒体2型(Sputnik virophage 2)、黄石湖噬病毒体1型(Yellowstone Lake virophage 1)、黄石湖噬病毒体2型、黄石湖噬病毒体3型、黄石湖噬病毒体4型、黄石湖噬病毒体5型、黄石湖噬病毒体6型、黄石湖噬病毒体7型和Zamilon噬病毒体2型。
在任一方面的一些实施方式中，DNA病毒是第II组(即ssDNA)病毒。在任一方面的一些实施方式中，第II组ssDNA病毒属于选自于由以下组成的组的病毒科：指环病毒科(Anelloviridae)、Bacilladnaviridae、二分DNA病毒科(Bidnaviridae)、圆环病毒科(Circoviridae)、双生病毒科(Geminiviridae)、类双生病毒科(Genomoviridae)、丝状噬菌体科(Inoviridae)、Microviridae、矮缩病毒科(Nanoviridae)、细小病毒科(Parvoviridae)、Smacoviridae和Spiraviridae。
在任一方面的一些实施方式中，DNA病毒是第VII组(即dsDNA-RT)病毒。在任一方面的一些实施方式中，第VII组dsDNA-RT病毒属于Ortervirales目。在任一方面的一些实施方式中，第VII组dsDNA-RT病毒属于花椰菜花叶病毒科或嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)(例如，乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus))。在任一方面的一些实施方式中，第VII组dsDNA-RT病毒属于选自于由以下组成的组中的病毒属：杆状DNA病毒属(Badnavirus)、花椰菜花叶病毒属(Caulimovirus)、木薯脉花叶病毒属(Cavemovirus)、Petuvirus、Rosadnavirus、Solendovirus、Soymovirus、东格鲁病毒属(Tungrovirus)、禽嗜肝DNA病毒属(Avihepadnavirus)和正嗜肝DNA病毒属(Orthohepadnavirus)。
定义
为了方便起见，下文提供了说明书、实施例和所附权利要求中使用的一些术语和短语的含义。除非另有说明或上下文隐含，否则以下术语和短语包括下文提供的含义。提供这些定义以帮助描述特定的实施方式，而并不旨在为了限制要求保护的发明，因为本发明的范围仅由权利要求限制。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。如果本领域术语的用法与其在此提供的定义之间存在明显差异，则应以说明书中提供的定义为准。
为了方便起见，此处汇集了说明书、实施例和所附权利要求中使用的某些术语。
本文中使用的术语“降低”、“减少”、“减小”或“抑制”均指统计学上显著的量的减少。在一些实施方式中，“减少”、“减小”或“降低”或“抑制”通常是指与参考水平(例如，不存在给定的治疗或药剂)相比降低至少10％，并且可以包括例如，降低至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或更多。如本文所用，与参考水平相比，“减少”或“抑制”并不包括完全的抑制或减少。与参考水平相比，“完全抑制”是100％的抑制。减少可以优选地降至正常范围内可接受的水平，例如，对于没有给定疾患的个体。
本文中使用的术语“增加”、“增多”、“增强”或“活化”都是指统计学上显著量的增加。在一些实施方式中，术语“增加”、“增多”、“增强”或“活化”可以是指与参考水平相比增加至少10％，例如，与参考水平相比增加至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或高达并包括100％的增加或10％-100％之间的任何增加，或与参考水平相比至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍或至少约10倍的增加，或2倍至10倍或更大之间的任何增加。在标志物或症状的背景下，“增加”是指该水平在统计学上的显著增加。
如本文所用，“受试者”是指人或动物。通常动物是脊椎动物，如灵长类动物、啮齿动物、家畜或狩猎动物。灵长类动物包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴(例如，恒河猴)。啮齿动物包括小鼠、大鼠、土拨鼠、雪貂、兔和仓鼠。家畜和狩猎动物包括奶牛、马、猪、鹿、野牛、水牛、猫科动物(例如，家猫)、犬科动物(例如，狗、狐狸、狼)、鸟类(例如，鸡、鸸鹋、鸵鸟)和鱼类(例如，鳟鱼、鲇鱼和鲑鱼)。在一些实施方式中，受试者是哺乳动物，例如，灵长类动物，例如，人类。术语“个体”、“患者”和“受试者”在本文中可互换使用。
受试者优选是哺乳动物。哺乳动物可以是人类、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或奶牛，但不限于这些实例。非人类的哺乳动物可以有利地用作代表癌症或感染性疾病动物模型的受试者。受试者可以是雄性或雌性。
受试者可以是如下的受试者，其先前被诊断患有或被识别患有或具有需要治疗的病况(例如，癌症或感染性疾病)或与此类病况相关的一种或多种并发症，并且任选地已经接受过疾病或疾患(例如，癌症或感染性疾病)或者与疾病或疾患(例如，癌症或感染性疾病)相关的一种或多种并发症的治疗。或者，受试者也可以是先前未被诊断患有疾病或疾患(例如，癌症或感染性疾病)或者与疾病或疾患(例如，癌症或感染性疾病)相关的一种或多种并发症的受试者。例如，受试者可以是表现出疾病或疾患(例如，癌症或感染性疾病)或者与疾病或疾患(例如，癌症或感染性疾病)相关的一种或多种并发症的一个或多个风险因素的受试者或不表现出风险因素的受试者。
对特定病况的治疗“有需要的受试者”可以是患有该病况、被诊断为患有该病况或处于发展出该病况的增高的风险的受试者。
如本文所用，术语“蛋白”和“多肽”可互换使用，表示一系列氨基酸残基，通过相邻残基的α-氨基和羧基之间的肽键彼此连接。术语“蛋白”和“多肽”是指氨基酸的聚合物，包括经修饰的氨基酸(例如，磷酸化的、糖化的、糖基化的等)和氨基酸类似物，无论其大小或功能如何。“蛋白”和“多肽”通常用于指代相对较大的多肽，而术语“肽”通常用于指代小的多肽，但这些术语在本领域中的使用重叠。当提及基因产物及其片段时，术语“蛋白”和“多肽”在本文中可互换使用。因此，示例性的多肽或蛋白包括上述的基因产物、天然存在的蛋白、同源物、直系同源物、旁系同源物、片段和其他等同物、变体、片段和类似物。
在本文所述的各种实施方式中，进一步考虑的是包括所述任何特定多肽的变体(天然存在或以其他方式)、等位基因、同源物、保守修饰的变体和/或保守替代变体。关于氨基酸序列，本领域技术人员将认识到，对核酸、肽、多肽或蛋白序列的个别替代、缺失或添加(其改变经编码的序列中单个氨基酸或一小部分氨基酸)是“保守修饰的变体”，其中，所述改变使得氨基酸被化学相似的氨基酸替代，并保留多肽的期望活性。这种保守修饰的变体是对与本公开内容一致的多态性变体、种间同源物和等位基因的补充，但不排除这些变体。
可能耐受变异的特定的氨基酸残基、区域或多肽结构域可以通过多肽(例如，本文所述的NK细胞受体、NK细胞膜结合信号转导接头蛋白或共刺激受体)或其结构域(例如，胞内信号转导结构域、共刺激结构域、跨膜结构域等)的不同的种内或种间变体的比对来鉴定。表现出最小的种内和/或种间变异的结构域、区域或氨基酸残基代表可能不能容忍实质变异或突变的保守序列，或者可能只能容忍保守性替代。表现出种内和/或种间变异的结构域、区域或氨基酸残基代表可能耐受变异或突变的非保守序列(例如，非保守性替代或保守性替代)。
给定的氨基酸可以被具有相似理化特性的残基替代，例如，用一个脂族残基替代另一个(例如，Ile、Val、Leu或Ala相互替代)，或用一个极性残基替代另一个(例如，Lys和Arg之间；Glu和Asp之间；或Gln和Asn之间)。其他这样的保守替代(例如，具有相似疏水性特征的整个区域的替代)是众所周知的。包括保守氨基酸替代的多肽可以在本文所述的任何一种测定中进行测试，以确认保留了期望的活性(例如，天然或参考多肽的功能和特异性)。
氨基酸可以根据其侧链性质的相似性进行分组(见于A.L.Lehninger，Biochemistry，第二版，第73-75页，Worth Publishers，New York(1975))：(1)非极性：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)；(2)极性不带电荷：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)；(3)酸性：Asp(D)、Glu(E)；(4)碱性：Lys(K)、Arg(R)、His(H)。或者，天然存在的残基可以根据常见的侧链性质分入下组：(1)疏水性：正亮氨酸(Norleucine)、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)碱性：His、Lys、Arg；(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；(6)芳香的：Trp、Tyr、Phe。非保守性替代需要将这些类别中的一个的成员替代为另一类别。特别保守的替代包括例如，Ala替代为Gly或替代为Ser；Arg替代为Lys；Asn替代为Gln或替代为His；Asp替代为Glu；Cys替代为Ser；Gln替代为Asn；Glu替代为Asp；Gly替代为Ala或替代为Pro；His替代为Asn或替代为Gln；Ile替代为Leu或替代为Val；Leu替代为Ile或替代为Val；Lys替代为Arg、替代为Gln或替代为Glu；Met替代为Leu、替代为Tyr或替代为Ile；Phe替代为Met、替代为Leu或替代为Tyr；Ser替代为Thr；Thr替代为Ser；Trp替代为Tyr；Tyr替代为Trp；和/或Phe替代为Val、替代为Ile或替代为Leu。
在一些实施方式中，本文所述的多肽(或编码这种多肽的核酸)可以是本文所述的氨基酸序列中的一个的功能片段。如本文所用，“功能片段”是根据本领域已知或如本文所述的测定保留至少50％野生型参考多肽活性的肽的片段或区段。功能片段可以包括本文公开的序列的一个或多个保守性替代。在任一方面的一些实施方式中，多肽可以包括第一N-末端氨基酸甲硫氨酸。在多肽不包括第一N-末端甲硫氨酸的实施方式中，应当理解的是，多肽的变体确实包括第一N-端甲硫氨酸。
在一些实施方式中，本文所述的多肽可以是本文所述序列的变体。在一些实施方式中，该变体是保守修饰的变体。例如，保守性替代变体可以通过天然核苷酸序列的突变获得。本文提及的“变体”是与天然或参考多肽实质上同源的多肽，但由于一个或多个缺失、插入或替代，其氨基酸序列与天然或参考多肽的氨基酸序列不同。编码变体多肽的DNA序列涵盖如下的序列：与天然或参考的DNA序列相比时包含一个或多个核苷酸的插入、缺失或替代，但编码保留活性的变体蛋白或其片段。多种基于PCR的位点特异性诱变方法是本领域已知的，并且可以由普通技术人员施用。
变体氨基酸或DNA序列可以与天然或参考序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更多相同。天然序列和突变序列之间的同源性程度(同一性百分比)可通过例如使用万维网上通常用于此目的的免费可用的计算机程序(例如，具有默认设置的BLASTp或BLASTn)比较这两个序列来确定。
变体氨基酸序列可以是与天然或参考序列至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更多相似。如本文所用，“相似性”是指相同的氨基酸或保守性替代的氨基酸，如本文所述。因此，“序列相似性”的百分比是相同或保守性改变的氨基酸的百分比；例如，“序列相似性”＝(序列同一性％)+(保守性改变％)。应当理解，与参考序列具有指定百分比相似性的序列必然包括与该参考序列具有相同指定百分比同一性的序列。本领域技术人员知道使用不同数学算法的多个不同的计算机程序，这些程序可用于确定两个序列之间的同一性或相似性。例如，可以使用采用Needleman和Wunsch算法的计算机程序(Needleman等(1970))；Accelrys GCG软件包中的GAP程序(Accelerys Inc.,San DiegoU.S.A.)；E.Meyers和W.Miller的算法(Meyers等(1989))，该算法已被并入ALIGN程序(2.0版)；或者更优选BLAST(使用默认参数的基本局部比对工具)；参见例如美国专利10,023,890，其内容通过引用整体并入本文。
天然氨基酸序列的改变可以通过本领域技术人员已知的多种技术中的任何一种来实现。例如，可以通过合成含有突变序列的寡核苷酸在特定位点引入突变，所述突变序列侧接有使得能够连接到天然序列片段的限制性位点。连接后，得到的重构建的序列编码具有期望的氨基酸插入、替代或缺失的类似物。或者，可以采用寡核苷酸定向的位点特异性诱变程序来提供具有根据所需的替代、缺失或插入而改变的特定密码子的改变的核苷酸序列。用于进行这种改变的技术是非常成熟的，并且包括例如Walder等(Gene 42:133,1986)；Bauer等(Gene 37:73,1985)；Craik(BioTechniques,January 1985,12-19)；Smith等(Genetic Engineering:Principles and Methods,Plenum Press,1981)，以及美国专利号4,518,584和4,737,462公开的那些，将其通过引用以其整体并入本文。不参与维持多肽适当构象的任意半胱氨酸残基也可以被替代，通常用丝氨酸替代，以提高分子的氧化稳定性并防止异常交联。相反，可将半胱氨酸键添加到多肽以提高其稳定性或促进寡聚化。
如本文所用，术语“核酸”或“核酸序列”是指并入有核糖核酸、脱氧核糖核酸或其类似物的单元的任何分子，优选聚合物分子。核酸可为单链的或双链的。单链核酸可为变性的双链DNA的一条核酸链。或者，它可为不来源于任何双链DNA的单链核酸。在一个方面，核酸可以是DNA。在另一个方面，核酸可为RNA。合适的DNA可包括例如基因组DNA、cDNA或载体DNA。合适的RNA可包括例如mRNA。
术语“表达”是指参与产生RNA和蛋白以及适当时分泌蛋白的细胞过程，包括(当可适用时)但不限于例如转录、转录加工、翻译和蛋白折叠、修饰和加工。表达可以指源自一个或多个核酸片段的正义(例如，mRNA)或反义RNA的稳定积累和转录，和/或指mRNA翻译成多肽。
如本文所用，术语“检测”或“测量”是指观察来自例如探针、标记或靶分子的信号以指示样品中的分析物的存在。本领域中已知的用于检测特定标记部分的任何方法都可以用于检测。示例性检测方法包括但不限于光谱、荧光、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学方法。在任一方面的一些实施方式中，测量可以是定量观测。
在任一方面的一些实施方式中，本文所述的多肽、核酸或细胞可以被工程化。如本文所用，“经工程化的”是指被人工操纵的方面。例如，当多肽的至少一个方面例如其序列被人工操纵以与自然界中存在的方面不同时，多肽被认为是“工程化的”。正如常见的实践和本领域技术人员所理解的那样，经工程化的细胞的子代通常仍被称为“经工程化的”，即使实际操作是针对先前的实体执行的。
在任一方面的一些实施方式中，本文所述的CAR多肽是外源性的。在任一方面的一些实施方式中，本文所述的CAR多肽是异位的。在任一方面的一些实施方式中，本文所述的CAR多肽不是内源性的。
术语“外源性的”是指存在于细胞中的物质，而不是其天然来源。本文中使用的术语“外源性的”可指核酸(例如，编码多肽的核酸)或多肽，其已通过涉及人工操纵的过程被引入生物系统中，所述生物系统例如通常在其中未发现该核酸或多肽的细胞或生物体，并且人们希望将该核酸或多肽引入这样的细胞或生物体。或者，“外源性的”可指通过涉及人工操纵的过程引入生物系统(如细胞或生物体)中的核酸或多肽，该核酸或多肽以相对低的量见于该生物系统中，并且人们希望增加细胞或生物体中的该核酸或多肽的量，例如，以产生异位表达或水平。相反，术语“内源性的”指的是源于生物系统或细胞的物质。如本文所用，“异位”是指以不寻常的位置和/或量发现的物质。异位物质可为通常见于给定细胞中、但处于低得多的量和/或不同的时间的物质。异位还包括在给定细胞的自然环境中未天然发现或表达的物质，如多肽或核酸。
如本文所述，“抗原”是通过抗体试剂上的结合位点结合的分子(例如，包括抗体衍生结构的胞外结合结构域)。通常，抗原通过抗体配体结合，并且能够在体内产生抗体应答。抗原可以是多肽、蛋白、核酸或其其他分子或部分。术语“抗原决定簇”是指由抗原结合分子识别的抗原上的表位，并且更特别地，由所述分子的抗原结合位点识别。
在一些实施方式中，编码本文所述多肽(例如，CAR多肽)的核酸包括于载体中。在本文所述的一些方面中，编码本文所述给定多肽的核酸序列或其任何模块可操作地连接到载体。本文所用的术语“载体”是指被设计用于递送至宿主细胞或用于在不同宿主细胞之间转移的核酸构建体。如本文所用，载体可以是病毒性的或非病毒性的。术语“载体”涵盖与适当的控制元件结合时能够复制并能够将基因序列转移到细胞的任何遗传元件。载体可以包括但不限于克隆载体、表达载体、质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、病毒、病毒粒子等。
在任一方面的一些实施方式中，载体是重组的(例如，它包括源自至少两种不同来源的序列)，或者是通过人工修饰的。在任何方面的一些实施方式中，载体包括源自至少两个不同物种的序列。在任一方面的一些实施方式中，载体包括源自至少两个不同基因的序列，例如，其包括编码表达产物的核酸或融合蛋白，所述表达产物与至少一种非天然(例如，异源)遗传控制元件(例如，启动子、抑制子(suppressor)、激活子(activator)、增强子、应答元件等)可操作地连接。
如本文所用，术语“表达载体”是指指导RNA或多肽从与载体上的转录调控序列相连的序列表达的载体。所表达的序列通常但不一定是对细胞而言异源的序列。表达载体可以包括额外的元件，例如，表达载体可以具有两个复制系统，从而允许其被保持在两种生物体中，例如，在用于表达的人类细胞中以及在用于克隆和扩增的原核宿主中。
如本文所用，术语“病毒载体”是指核酸载体构建体，包括病毒来源的至少一种元件，并具有包装成病毒载体颗粒的能力。病毒载体可包括编码本文所述多肽的核酸，以代替非必需的病毒基因。载体和/或颗粒可用于在体外或体内将任何核酸转移到细胞中的目的。本领域已知多种形式的病毒载体。可用于结合本文公开的技术的病毒载体的非限制性实例包括AAV载体、腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、疱疹病毒载体、α病毒载体、痘病毒载体、杆状病毒载体和嵌合病毒载体。
应该理解的是，在一些实施方式中，本文所述的载体可以与其他合适的组合物和疗法组合。在一些实施方式中，载体是附加型的。合适的附加型载体的使用提供了将受试者中感兴趣的核苷酸维持在高拷贝数的染色体外DNA中的手段，从而消除染色体整合的潜在影响。
如本文所用，术语“治疗(treat、treatment、treating)”或“改善”是指治疗性处理，其目的是逆转、缓解、改善、抑制、减缓或停止与疾病或疾患(例如，癌症或感染性疾病)相关的病况的进展或严重程度。术语“治疗”包括减少或缓解病况、疾病或疾患(例如，癌症或感染性疾病)的至少一种不利影响或症状。如果一种或多种症状或临床标志物减少，治疗通常是“有效的”。或者，如果疾病进展减少或中止，治疗是“有效”的。也就是说“治疗”不仅包括症状或标志物的改善，还包括与在没有治疗的情况下预期的症状相比，症状的进展或恶化的终止、或至少减缓。有益或期望的临床结果包括但不限于一种或多种症状的缓解，疾病程度的减轻，疾病的稳定(即不恶化)状态、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改进或缓和、舒缓(无论是部分还是全部)和/或死亡率降低，无论是可检测的或不可检测的。术语疾病的“治疗”还包括提供疾病的症状或副作用的消除(包括姑息治疗)。
如本文所用，术语“药物组合物”是指活性剂与药学上可接受的运载体(例如，制药工业中常用的运载体)组合。本文中使用的短语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内，适用于与人和动物的组织接触而没有过度毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的收益/风险比率相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。在任一方面的一些实施方式中，药学上可接受的运载体可以是除水以外的运载体。在任一方面的一些实施方式中，药学上可接受的运载体可以是人工或经工程化的运载体，例如，活性成分在天然不被发现存在于其中或其内的运载体。
如本文所用，术语“施用”是指通过如下的方法或途径将本文所公开的化合物放入受试者中，该方法或途径使得药剂在期望部位至少部分递送。包括本文公开的组合物的药物组合物可以通过任何适当的途径施用，从而在受试者中产生有效的治疗。在一些实施方式中，施用包括人体活动，例如，注射、应用行为和/或递送装置或机器的操作。这种活动可以通过例如医学专业人员和/或正在接受治疗的受试者实施。
如本文所用，“接触”是指用于将药剂递送或暴露于至少一个细胞的任何合适手段。示例性的递送方法包括但不限于直接递送至细胞培养基、转染、转导、灌注、注射或本领域技术人员已知的其他递送方法。在一些实施方式中，接触包括人体活动，例如，注射；分配、混合和/或倾泻(decanting)的行为；和/或递送装置或机器的操作。
术语“统计学上显著的”或“显著地”是指统计学显著性，并且通常意指两个标准差(2SD)或更大的差异。
除操作实例外、或在另有指示的情况下，本文中使用的表示成分量或反应条件的所有数字在所有情况下都应被理解为由术语“约”修饰。当与百分比一起使用时，术语“约”可以指±1％。
如本文所用，术语“包括”是指除了所呈现的定义的要素之外，还可以存在其他要素。“包括”的使用表示包含而非限制。
术语“由……组成”是指如本文所述的组合物、方法及其各自的组分，其不包括在实施方式的描述中未列举的任何要素。
如本文所用，术语“基本上由……组成”是指给定实施方式所需的那些要素。该术语允许存在不会实质上影响本发明的实施方式的基本和新颖或功能特性的额外要素。
如本文所用，术语“对应于”是指第一多肽或核酸中的列举位置处的氨基酸或核苷酸，或与第二多肽或核酸的列举的氨基酸或核苷酸等同的氨基酸或核苷酸。等同的列举的氨基酸或核苷酸可通过使用本领域已知的同源程度的程序(例如BLAST)对候选序列进行比对来确定。
如本文所用，术语“特异性结合”是指两个分子、化合物、细胞和/或颗粒之间的化学相互作用，其中第一实体与第二靶实体结合的特异性和亲和力大于其与作为非靶的第三实体的结合。在一些实施方式中，特异性结合可以指第一实体对第二靶实体的亲和力，其比对第三非靶实体的亲和力大至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍、至少1000倍或更多倍。对给定靶标特异性的试剂是在所使用的测定条件下对该靶标表现出特异性结合的试剂。
除非上下文另有明确指示，否则单数术语“一、该和所述(a、an和“the)”包括复数指代物。类似地，除非上下文另有明确说明，“或”一词意在包括“和”。尽管在本公开的实践或测试中可以使用与本文所述方法和材料类似或等同的方法和材料，但下文描述了合适的方法和材料。缩写“例如(e.g.)”源自拉丁语exempli gratia，并在此用于表示非限制性实例。因此，缩写“例如(e.g.)”与术语“例如(for example)”同义
本文公开的发明的替代要素或实施方式的分组不应被解释为限制。每个组成员可被单独地或以与该组的其他成员或本文中发现的其他要素的任何组合来提及和要求保护。出于方便和/或可专利性的原因，组的一个或多个成员可以被包括在组中、或者从组中删除。当出现任何这样的包括或删除时，说明书在本文中被视为包括修改后的组，从而满足所附权利要求中使用的所有马库什组的书面描述。
除非本文另有定义，否则与本申请结合使用的科学和技术术语应具有本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义。应当理解，本发明不限于本文所述的特定方法学、方案和试剂等，并因此可变化。本文中使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，而不旨在限制本发明的范围，该范围仅由权利要求限定。免疫学和分子生物学中常见术语的定义可见于The Merck Manual of Diagnosis and Therapy，第20版，Merck Sharp&Dohme Corp.出版，2018(ISBN 0911910190，978-0911910421)；Robert S.Porter等(eds.)，TheEncyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine，BlackwellScience Ltd.出版，1999-2012(ISBN 9783527600908)；和Robert A.Meyers(ed.)，Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference，VCHPublishers,Inc.出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)；Immunology by Werner Luttmann，Elsevier出版，2006；Janeway's Immunobiology，Kenneth Murphy，Allan Mowat，CaseyWeaver(eds.)，W.W.Norton&Company，2016(ISBN 0815345054，978-0815345053)；Lewin'sGenes XI，Jones&Bartlett Publishers出版，2014(ISBN-1449659055)；Michael RichardGreen and Joseph Sambrook，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第4版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，USA(2012)(ISBN1936113414)；Davis等，Basic Methods in Molecular Biology，Elsevier SciencePublishing,Inc.，New York，USA(2012)(ISBN 044460149X)；Laboratory Methods inEnzymology:DNA，Jon Lorsch(ed.)Elsevier，2013(ISBN 0124199542)；CurrentProtocols in Molecular Biology(CPMB)，Frederick M.Ausubel(ed.)，John Wiley andSons，2014(ISBN 047150338X，9780471503385)，Current Protocols in Protein Science(CPPS)，John E.Coligan(ed.)，John Wiley and Sons,Inc.，2005；和Current Protocolsin Immunology(CPI)(John E.Coligan,ADA M Kruisbeek，David H Margulies，Ethan MShevach，Warren Strobe，(eds.)John Wiley and Sons,Inc.，2003(ISBN 0471142735，9780471142737)，其内容均通过引用并入本文中。
在任一方面的一些实施方式中，本文所述的公开内容不涉及克隆人的方法、改变人生殖系遗传同一性的方法、人胚胎的工业或商业目的的应用，或可能导致动物痛苦而对人或动物没有实质性医疗益处的改变动物遗传同一性的方法等，以及由这些方法产生的动物。
在本发明的各个方面的描述中定义了其他术语。
为了描述和公开的目的，将在本申请全文中引用的所有专利和其他出版物(包括参考文献、授权专利、已公布的专利申请和待审的专利申请)、例如可结合本文所述技术使用的此类出版物中描述的方法学通过引用而明确地并入本文。这些出版物仅由于其公开早于在本申请的申请日而提供。在这方面的任何内容都不应被解释为承认发明人无权凭借现有发明或任何其他原因而将该公开提前。关于这些文件的日期的所有声明或关于内容的陈述均基于申请人可获得的信息，而不构成对这些文件的日期或内容正确性的任何承认。
本公开的实施方式的描述并非旨在穷举或将本公开限制为所公开的精确形式。尽管本文出于说明目的描述了本公开的具体实施方式和实施例，但如相关领域的技术人员将认识到的，在本公开的范围内各种等同的修改是可能的。例如，虽然方法步骤或功能以给定的顺序呈现，但是替代实施方式可以以不同的顺序执行功能，或者功能可以实质上并行地执行。适当时，可将本文提供的本公开的教导应用于其他程序或方法。本文描述的各种实施方式可以被组合以提供进一步的实施方式。如果需要，可以修改本公开的各方面，以采用上述参考文献和申请的组合物、功能和构思来提供本公开的又一实施方式。此外，出于生物功能等同性的考虑，可以在不影响生物或化学作用的种类或量的情况下对蛋白结构进行一些改变。可以根据详细描述对本公开进行这些和其他改变。所有这样的修改旨在被包括在所附权利要求的范围内。
前述实施方式中的任何的特定要素可以被组合或替代其他实施方式中的要素。此外，尽管已经在这些实施方式的上下文中描述了与本公开的某些实施方式相关联的优势，但是其他实施方式也可以展现这样的优势，并且并非所有实施方式都必须展现这样的优势以落入本公开的范围内。
本文所述技术的一些实施方式可以根据以下编号段落中的任一段进行定义：
1.一种用于在自然杀伤(NK)细胞中表达的嵌合抗原受体(CAR)多肽，包括：
a)胞外结合结构域；
b)跨膜结构域；和
c)胞内结构域，其包括以下中的至少一种：
i)来自NK细胞受体的胞内信号转导结构域；
ii)来自NK细胞膜结合信号转导接头蛋白的胞内信号转导结构域；和/或
iii)来自共刺激受体的胞内共刺激结构域。
2.段落1所述的多肽，其中，所述NK细胞受体：
a)选自于由以下组成的组：i)自然杀伤细胞受体2B4；ii)自然杀伤细胞、T细胞和B细胞抗原(NTB-A)；iii)CD2样细胞毒性细胞活化受体(CRACC)；和iv)分化簇2(CD2)；或
b)胞内信号转导结构域，其包括SEQ ID NOs：7-10中的一个的氨基酸序列或与SEQID NOs：7-10中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
3.段落1所述的多肽，其中，所述NK细胞膜结合信号转导接头蛋白：
a)选自于由以下组成的组：i)高亲和力IgE受体(FcεR1)；和ii)CD3-zeta(CD3ζ)；或
b)胞内信号转导结构域，其包括SEQ ID NOs：11-12中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：11-12中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
4.段落1所述的多肽，其中，所述共刺激受体：
a)是4-1BB和/或IL2受体β(IL2RB)；或
b)胞内共刺激结构域，其包括SEQ ID NOs：15-16中的一个的氨基酸序列或与SEQID NOs：15-16中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
5.段落1所述的多肽，其中，所述胞内结构域进一步包括至少一个自剪切肽和/或细胞因子。
6.段落5所述的多肽，其中，所述自剪切肽：
a)是T2A、P2A、E2A或F2A；或
b)包括SEQ ID NOs：19-20中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：19-20中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
7.段落5所述的多肽，其中，所述细胞因子：
a)是IL-15或IL-21；
b)包括SEQ ID NOs：23-24中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：23-24中的一个至少80％相同的氨基酸序列；或
c)相邻并处于自剪切肽的远端，使得细胞因子通过自剪切肽与多肽分隔开。
8.段落1所述的多肽，其中，所述跨膜结构域包括：
a)天然NK细胞受体的跨膜结构域；
b)CD8的跨膜结构域；或
c)SEQ ID NOs：29-32或117-118中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：29-32或117-118中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
9.段落8所述的多肽，其中，所述天然NK细胞受体的跨膜结构域选自于由自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)、自然杀伤细胞P46相关蛋白(NKp46)、和DNAX辅助分子-1(DNAM1)组成的组。
10.段落1所述的多肽，其中，所述胞外结合结构域：
a)是抗体、其抗原结合片段、F(ab)片段、F(ab’)片段、单链抗体(scFv)或单域抗体(sdAb)；
b)特异性地结合至肿瘤相关抗原；或
c)包括SEQ ID NOs：35-36中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：35-36中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
11.段落1所述的多肽，其进一步包括位于胞外结合结构域的N-末端的信号肽。
12.段落11所述的多肽，其中，所述信号肽：
a)是CD8信号肽；或
b)包括SEQ ID NO：38的氨基酸序列或与SEQ ID NO：38至少80％相同的氨基酸序列。
13.段落1所述的多肽，其进一步包括位于所述胞外结合结构域远端的可检测标志物。
14.段落11所述的多肽，其进一步包括位于所述胞外结合结构域远端和/或位于所述信号肽近端的连接子结构域。
15.段落1所述的多肽，其进一步包括位于胞外结合结构域和跨膜结构域之间的间隔区结构域。
16.段落15所述的多肽，其中，所述间隔区结构域包括：
a)CD8铰链结构域；或
b)SEQ ID NO：44的氨基酸序列或与SEQ ID NO：44至少80％相同的氨基酸序列。
17.段落1所述的CAR多肽，其中，所述多肽包括SEQ ID NOs：80-114中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：80-114中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
18.一种自然杀伤(NK)细胞或细胞群，其包括段落1所述的多肽的。
19.一种增加NK细胞或其细胞群的活化的方法，包括使所述细胞或其细胞群与段落1所述的多肽接触。
20.一种对需要基于CAR的治疗剂的受试者进行治疗的方法，包括向受试者施用治疗有效量的包括段落1所述的多肽的基于CAR的治疗剂。
21.一种用于在自然杀伤(NK)细胞中表达的嵌合抗原受体(CAR)多肽，包括：
a)胞外结合结构域；
b)跨膜结构域；和
c)胞内结构域，其包括以下中的至少一个：
i)来自NK细胞受体的胞内信号转导结构域；
ii)来自NK细胞膜结合信号转导接头蛋白的胞内信号转导结构域；和/或
iii)来自共刺激受体的胞内共刺激结构域。
22.段落21所述的多肽，其中，所述多肽从N-末端到C-末端包括：
a)胞外结合结构域；
b)跨膜结构域；和
c)胞内结构域。
23.段落21所述的多肽，其中，所述多肽从C-末端到N-末端包括：
a)胞外结合结构域；
b)跨膜结构域；和
c)胞内结构域。
24.段落21-23中任一段所述的多肽，其中，所述NK细胞受体或NK细胞膜结合信号转导接头蛋白选自于由以下组成的组：
a)自然杀伤细胞受体2B4；
b)自然杀伤细胞、T细胞和B细胞抗原(NTB-A)；
c)CD2样细胞毒性细胞活化受体(CRACC)；
d)分化簇2(CD2)；
e)高亲和力IgE受体(FcεR1)；和
f)CD3-zeta(CD3ζ)。
25.段落21-24中任一段所述的多肽，其中，所述NK细胞受体选自于由2B4、NTB-A、CRACC和CD2组成的组。
26.段落21-25中任一段所述的多肽，其中，所述NK细胞受体是2B4。
27.段落21-26中任一段所述的多肽，其中，所述NK细胞受体是NTB-A。
28.段落21-27中任一段所述的多肽，其中，所述NK细胞受体是CRACC。
29.段落21-28中任一段所述的多肽，其中，所述NK细胞受体是CD2。
30.段落21-29中任一段所述的多肽，其中，所述NK细胞膜结合信号转导接头蛋白是CD3ζ或FcεR1。
31.段落21-30中任一段所述的多肽，其中，来自NK细胞受体的胞内信号转导结构域或来自NK细胞膜结合信号转导接头蛋白的胞内信号转导结构域包括SEQ ID NOs：7-12中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：7-12中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
32.段落21-31中任一段所述的多肽，其中，所述共刺激受体是4-1BB和/或IL2受体β(IL2RB)。
33.段落32所述的多肽，其中，来自共刺激受体的胞内共刺激结构域包括SEQ IDNOs：15-16中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：15-16中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
34.段落21-33中任一段所述的多肽，其中，所述胞内结构域进一步包括至少一种自剪切肽。
35.段落34所述的多肽，其中，所述自剪切肽是T2A、P2A、E2A或F2A。
36.段落34或35所述的多肽，其中，所述自剪切肽包括SEQ ID NOs：19-20中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：19-20中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
37.段落21-36中任一段所述的多肽，其中，所述胞内结构域进一步包括细胞因子。
38.段落37的所述多肽，其中，所述细胞因子是IL-15或IL-21。
39.段落37或38所述的多肽，其中，所述细胞因子包括SEQ ID NOs：23-24中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：23-24中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
40.段落21-39中任一段所述的多肽，其中，所述胞内结构域进一步包括至少一种自剪切肽和至少一种细胞因子。
41.段落40所述的多肽，其中，所述细胞因子与自剪切肽相邻且位于自剪切肽远端，使得细胞因子通过自剪切肽与多肽分隔开。
42.段落21-41中任一段所述的多肽，其中，所述跨膜结构域包括天然NK细胞受体的跨膜结构域。
43.段落21-42中任一段所述的多肽，其中，所述天然NK细胞受体的跨膜结构域选自于由自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)、自然杀伤细胞P46相关蛋白(NKp46)、和DNAX辅助分子-1(DNAM1)组成的组。
44.段落21-43中任一段所述的多肽，其中，所述跨膜结构域包括CD8的跨膜结构域。
45.段落21-44中任一段所述的多肽，其中，所述跨膜结构域包括SEQ ID NOs：29-32或117-118中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：29-32或117-118中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
46.段落21-45中任一段所述的多肽，其中，所述胞外结合结构域是抗体、其抗原结合片段、F(ab)片段、F(ab’)片段、单链抗体(scFv)或单域抗体(sdAb)。
47.段落21-46中任一段所述的多肽，其中，所述胞外结合结构域包括scFv。
48.段落21-47中任一段所述的多肽，其中，所述胞外结合结构域特异性地结合至肿瘤相关抗原。
49.段落21-48中任一段所述的多肽，其中，所述肿瘤相关抗原是CD19。
50.段落21-49中任一段所述的多肽，其中，所述肿瘤相关抗原是CD33。
51.段落21-50中任一段所述的多肽，其中，所述胞外结合结构域包括SEQ ID NOs：35-36中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：35-36中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
52.段落21-51中任一段所述的多肽，其进一步包括位于胞外结合结构域的N-末端的信号肽。
53.段落52所述的多肽，其中，所述信号肽是CD8信号肽。
54.段落52或53所述的多肽，其中，所述信号肽包括SEQ ID NO：38的氨基酸序列或与SEQ ID NO：38至少80％相同的氨基酸序列。
55.段落21-54中任一段所述的多肽，其进一步包括位于所述胞外结合结构域远端的可检测标志物。
56.段落55所述的多肽，其中，所述可检测标志物是3×FLAG。
57.段落55或56所述的多肽，其中，所述可检测标志物包括SEQ IDNO：40的氨基酸序列或与SEQ ID NO：40至少80％相同的氨基酸序列。
58.段落21-57中任一段所述的多肽，其进一步包括位于胞外结合结构域远端和/或位于信号肽和/或可检测标志物近端的连接子结构域。
59.段落58所述的多肽，其中，所述连接子包括SEQ ID NO：42的氨基酸序列或与SEQ ID NO：42至少80％相同的氨基酸序列。
60.段落21-59中任一段所述的多肽，其进一步包括位于胞外结合结构域和跨膜结构域之间的间隔区结构域。
61.段落60所述的多肽，其中，所述间隔区结构域包括CD8铰链结构域。
62.段落60或61所述的多肽，其中，所述间隔区包括SEQ ID NO：44的氨基酸序列或与SEQ ID NO：44至少80％相同的氨基酸序列。
63.段落21-62中任一段所述的CAR多肽，其中，所述多肽包括SEQ ID NOs：80-114中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：80-114中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
64.一种用于在自然杀伤(NK)细胞中表达的嵌合抗原受体(CAR)多肽，包括：
a)胞外结合结构域；
b)跨膜结构域；和
c)胞内结构域，所述胞内结构域包括来自NK细胞受体的至少一个胞内信号转导结构域。
65.段落64所述的多肽，其中，所述多肽从N-末端到C-末端包括：
a)胞外结合结构域；
b)跨膜结构域；和
c)胞内结构域。
66.段落64所述的多肽，其中，所述多肽从C-末端到N-末端包括：
a)胞外结合结构域；
b)跨膜结构域；和
c)胞内结构域。
67.段落64-66中任一段所述的多肽，其中，所述NK细胞受体选自于由2B4、NTB-A、CRACC和CD2组成的组。
68.段落64-67中任一段所述的多肽，其中，所述NK细胞受体是2B4。
69.段落64-68中任一段所述的多肽，其中，所述NK细胞受体是NTB-A。
70.段落64-69中任一段所述的多肽，其中，所述NK细胞受体是CRACC。
71.段落64-70中任一段所述的多肽，其中，所述NK细胞受体是CD2。
72.段落64-71中任一段所述的多肽，其中，来自NK细胞受体的胞内信号转导结构域包括SEQ ID NOs：7-10中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：7-10中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
73.段落64-72中任一段所述的多肽，其中，所述跨膜结构域包括天然NK细胞受体的跨膜结构域。
74.段落64-73中任一段所述的多肽，其中，所述天然NK细胞受体的跨膜结构域选自于由自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)、自然杀伤细胞P46相关蛋白(NKp46)、和DNAX辅助分子-1(DNAM1)组成的组。
75.段落64-74中任一段所述的多肽，其中，所述跨膜结构域包括SEQ ID NOs：29-31或117-118中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：29-31或117-118中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
76.段落64-75中任一段所述的多肽，其中，所述胞外结合结构域是抗体、其抗原结合片段、F(ab)片段、F(ab’)片段、单链抗体(scFv)或单域抗体(sdAb)。
77.段落64-76中任一段所述的多肽，其中，所述胞外结合结构域包括scFv。
78.段落64-77中任一段所述的多肽，其中，所述胞外结合结构域特异性地结合至肿瘤相关抗原。
79.段落64-78中任一段所述的多肽，其中，所述肿瘤相关抗原是CD19。
80.段落64-79中任一段所述的多肽，其中，所述肿瘤相关抗原是CD33。
81.段落64-80中任一段所述的多肽，其中，所述胞外结合结构域包括SEQ ID NOs：35-36中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：35-36中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
82.段落64-81中任一段所述的多肽，其进一步包括位于胞外结合结构域的N-末端的信号肽。
83.段落82所述的多肽，其中，所述信号肽是CD8信号肽。
84.段落82或83所述的多肽，其中，所述信号肽包括SEQ ID NO：38的氨基酸序列或与SEQ ID NO：38至少80％相同的氨基酸序列。
85.段落64-84中任一段所述的多肽，其进一步包括位于所述胞外结合结构域远端的可检测标志物。
86.段落85所述的多肽，其中，所述可检测标志物是3×FLAG。
87.段落85或86所述的多肽，其中，所述可检测标志物包括SEQ ID NO：40的氨基酸序列或与SEQ ID NO：40至少80％相同的氨基酸序列。
88.段落64-87中任一段所述的多肽，其进一步包括位于胞外结合结构域远端和/或位于信号肽和/或可检测标志物近端的连接子结构域。
89.段落所述88的多肽，其中，所述连接子包括SEQ ID NO：42的氨基酸序列或与SEQ ID NO：42至少80％相同的氨基酸序列。
90.段落64-89中任一段所述的多肽，其进一步包括位于胞外结合结构域和跨膜结构域之间的间隔区结构域。
91.段落90所述的多肽，其中，所述间隔区结构域包括CD8铰链结构域。
92.段落90或91所述的多肽，其中，所述间隔区包括SEQ ID NO：44的氨基酸序列或与SEQ ID NO：44至少80％相同的氨基酸序列。
93.段落64-92中任一段所述的CAR多肽，其中，所述多肽包括SEQ ID NOs：90-105或SEQ ID NOs：110-114中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：90-105或SEQ ID NOs：110-114中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
94.一种用于在自然杀伤(NK)细胞中表达的嵌合抗原受体(CAR)多肽，包括：
a)胞外结合结构域；
b)跨膜结构域；和
c)胞内结构域，其包括以下中的至少一种：
i)来自NK细胞膜结合信号转导接头蛋白的胞内信号转导结构域；和/或
ii)来自共刺激受体的胞内共刺激结构域。
95.段落94所述的多肽，其中，所述多肽从N-末端到C-末端包括：
a)胞外结合结构域；
b)跨膜结构域；和
c)胞内结构域。
96.段落94所述的多肽，其中，所述多肽从C-末端到N-末端包括：
a)胞外结合结构域；
b)跨膜结构域；和
c)胞内结构域。
97.段落94-96中任一段所述的多肽，其中，所述NK细胞膜结合信号转导接头蛋白是CD3ζ或FcεR1。
98.段落94-97中任一段所述的多肽，其中，来自NK细胞膜结合信号转导接头蛋白的胞内信号转导结构域包括SEQ ID NOs：11-12中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：11-12中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
99.段落94-98中任一段所述的多肽，其中，所述共刺激受体是4-1BB和/或IL2受体β(IL2RB)。
100.段落99所述的多肽，其中，来自共刺激受体的胞内共刺激结构域包括SEQ IDNOs：15-16中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：15-16中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
101.段落94-100中任一段所述的多肽，其中，所述胞内结构域进一步包括至少一种自剪切肽。
102.段落101所述的多肽，其中，所述自剪切肽是T2A、P2A、E2A或F2A。
103.段落101或102所述的多肽，其中，所述自剪切肽包括SEQ ID NOs：19-20中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：19-20中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
104.段落94-103中任一段所述的多肽，其中，所述胞内结构域进一步包括细胞因子。
105.段落104所述的多肽，其中，所述细胞因子是IL-15或IL-21。
106.段落104或105所述的多肽，其中，所述细胞因子包括SEQ ID NOs：23-24中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：23-24中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
107.段落94-106中任一段所述的多肽，其中，所述胞内结构域进一步包括至少一个自剪切肽和至少一个细胞因子。
108.段落107所述的多肽，其中，所述细胞因子与自剪切肽相邻并位于自剪切肽远端，使得细胞因子通过自剪切肽与多肽分隔开。
109.段落94-108中任一段所述的多肽，其中，所述跨膜结构域包括CD8的跨膜结构域。
110.段落94-109中任一段所述的多肽，其中，所述跨膜结构域包括SEQ ID NO：32的氨基酸序列或与SEQ ID NO：32至少80％相同的氨基酸序列。
111.段落94-110中任一段所述的多肽，其中，所述胞外结合结构域是抗体、其抗原结合片段、F(ab)片段、F(ab’)片段、单链抗体(scFv)或单域抗体(sdAb)。
112.段落94-111中任一段所述的多肽，其中，所述胞外结合结构域包括scFv。
113.段落94-112中任一段所述的多肽，其中，所述胞外结合结构域特异性地结合至肿瘤相关抗原。
114.段落94-113中任一段所述的多肽，其中，所述肿瘤相关抗原是CD19。
115.段落94-114中任一段所述的多肽，其中，所述肿瘤相关抗原是CD33。
116.段落94-115中任一段所述的多肽，其中，所述胞外结合结构域包括SEQ IDNOs：35-36中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：35-36中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
117.段落94-116中任一段所述的多肽，其进一步包括位于胞外结合结构域的N-末端的信号肽。
118.段落117所述的多肽，其中，所述信号肽是CD8信号肽。
119.段落117或118所述的多肽，其中，所述信号肽包括SEQ ID NO：38的氨基酸序列或与SEQ ID NO：38至少80％相同的氨基酸序列。
120.段落94-119中任一段所述的多肽，其进一步包括位于所述胞外结合结构域远端的可检测标志物。
121.段落120所述的多肽，其中，所述可检测标志物是3×FLAG。
122.段落120或121所述的多肽，其中，所述可检测标志物包括SEQ ID NO：40的氨基酸序列或与SEQ ID NO：40至少80％相同的氨基酸序列。
123.段落94-122中任一段所述的多肽，其进一步包括位于胞外结合结构域远端和/或位于信号肽和/或可检测标志物近端的连接子结构域。
124.段落123所述的多肽，其中，所述连接子包括SEQ ID NO：42的氨基酸序列或与SEQ ID NO：42至少80％相同的氨基酸序列。
125.段落74-104中任一段所述的多肽，其进一步包括位于胞外结合结构域和跨膜结构域之间的间隔区结构域。
126.段落125所述的多肽，其中，所述间隔区结构域包括CD8铰链结构域。
127.段落125或126所述的多肽，其中，所述间隔区包括SEQ ID NO：44的氨基酸序列或与SEQ ID NO：44至少80％相同的氨基酸序列。
128.段落94-127中任一段所述的多肽，其中，所述多肽包括SEQ ID NOs：80-89或SEQ ID NOs：106-109中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：80-89或SEQ ID NOs：106-109中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
129.一种多核苷酸，其编码段落1-17或21-128中任一段所述的多肽。
130.段落129所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸包括SEQ ID NOs：45-79中的一个、或与SEQ ID NOs：45-79中一个至少80％相同的核酸序列。
131.一种载体，其包括段落129或130所述的多核苷酸。
132.段落131所述的载体，其中，所述载体包括慢病毒载体。
133.一种慢病毒，其包括段落1-17或21-128中任一段所述的多肽、段落129-130中任一段所述的多核苷酸或段落131-132中任一段所述的载体。
134.一种细胞或其细胞群，包括段落1-17或21-128中任一段所述的多肽、段落129-130中任一段所述的多核苷酸、段落131-132中任一段所述的载体或段落133所述的慢病毒。
135.段落134所述的细胞，其中，所述细胞包括免疫细胞。
136.段落135所述的细胞，其中，所述免疫细胞包括自然杀伤(NK)细胞。
137.一种药物组合物，包括段落1-17或21-128中任一段所述的多肽、段落129-130中任一段所述的多核苷酸、段落131-132中任一段所述的载体、段落133所述的慢病毒或者段落18或134-136中任一段所述的细胞，以及药学上可接受的运载体。
138.一种增加NK细胞或其细胞群的活化的方法，包括使所述细胞或其细胞群与段落1-17或21-128中任一段所述的多肽、段落129-130中任一段所述的多核苷酸、段落131-132中任一段所述的载体或段落133所述的慢病毒接触。
139.段落138所述的方法，其中，与接触多肽、多核苷酸、载体或慢病毒之前相比，将NK细胞或其细胞群与多肽、多核苷酸、载体或慢病毒接触使NK细胞的活性增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少200％、至少300％、至少400％或至少500％。
140.段落138-139中任一段所述的方法，其中，所述NK细胞或其细胞群的增加的活化包括选自于由TNFα、IFNγ、GM-CSF和颗粒酶B组成的组中的细胞因子或颗粒酶的表达增加。
141.段落138-140中任一段所述的方法，其中，所述NK细胞或其细胞群的增加的活化引起靶细胞的特异性裂解增加。
142.段落138-141中任一段所述的方法，其中，所述靶细胞表达特异性地结合至多肽的胞外结合结构域的表面抗原。
143.段落138-142中任一段所述的方法，其中，所述靶细胞是癌细胞。
144.段落138-143中任一段所述的方法，其中，所述靶细胞是被病毒或细菌感染的细胞。
145.一种对需要基于CAR的治疗剂的受试者进行治疗的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的选自于由以下组成的组中的基于CAR的治疗剂：段落1-17或21-128中任一段所述的多肽、段落129-130中任一段所述的多核苷酸、段落131-132中任一段所述的载体、段落133所述的慢病毒、段落18或134-136中任一段所述的细胞或其细胞群以及段落137所述的药物组合物。
146.段落145所述的方法，其中，所述受试者患有癌症或被诊断患有癌症。
147.段落145或146所述的方法，其中，所述受试者患有或已经被诊断患有肾上腺癌、肛门癌、阑尾癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、胆囊癌、妊娠滋养细胞疾病、头颈部癌、霍奇金淋巴瘤、肠癌、肾癌、白血病、肝癌、肺癌、黑色素瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、多发性骨髓瘤、神经内分泌肿瘤、非霍奇金淋巴瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、鼻窦癌、皮肤癌、肉瘤、软组织肉瘤、脊柱癌、胃癌、睾丸癌、喉癌、肿瘤、甲状腺癌、子宫癌、阴道癌或外阴癌。
148.段落145-147中任一段所述的方法，其中，所述基于CAR的治疗剂的施用引起由CAR靶向的癌细胞的特异性裂解增加。
149.段落145-148中任一段所述的方法，其中，所述受试者患有感染性疾病或已被诊断患有感染性疾病。
150.段落145-149中任一段所述的方法，其中，所述感染性疾病是病毒性或细菌性疾病。
151.段落145-150中任一段所述的方法，其中，施用所述基于CAR的治疗剂引起由所述CAR靶向的感染细胞的特异性裂解增加。
152.一种制备治疗组合物的方法，该方法包括：在允许多肽于NK细胞中表达的条件下，将编码段落1-17或21-128中任一段所述的多肽的核酸、段落129-130中任一段所述的多核苷酸、段落131-132中任一段所述的载体或段落133所述的慢病毒引入NK细胞。
153.段落152所述的方法，其中，在引入所述核酸、多核苷酸、载体或慢病毒之前，从需要治疗组合物的受试者中移除NK细胞。
154.段落152或153所述的方法，其中，在引入所述核酸、多核苷酸、载体或慢病毒后，将NK细胞返回受试者。
通过下面的实施例进一步说明了本文描述的技术，这些实施例决不应被解释为进一步的限制。
实施例
实施例1
CD19 CAR-NK构建体和实施方式
表1和表2显示了示例性的CD19 CAR-NK构建体。关于示例性的CD19 CAR-NK的数据，参见例如实施例1-实施例7或图1-图17。
表1：具有不同的跨膜结构域(TD)+共刺激结构域(CD)+信号转导结构域(SD)的CD19 CAR-NK构建体
构建体 描述
CC001 pSIH1-hEF1a-GFP
CC002 pSIH1-hEF1a-CD19-CD84-1BB
CC003 CC004(无3*Flag)
CC004 pSIH1-hEF1a-CD19FN CD8-4-1BB-CD3z
CC005 pSIH1-hEF1a-CD19FN CD8-4-1BB-FcRIgE
CC007 pSIH1-hEF1a-CD19FN CD8-4-1BB-FcRIgE-P2A-IL15
CC008 pSIH1-hEF1a-CD19FN CD8-4-1BB-FcRIgE-P2A-IL15-IL21
CC013 pSIH1-hEF1a-CD19FN CD8-4-1BB-IL2RB-CD3z
CC016 pSIH1-hEF1a-CD19FN CD8-IL2RB-4-1BB-CD3z
CC017 pSIH1-hEF1a-CD19FN CD8-4-1BB-IL2RB-FcR IgE
CC018 pSIH1-hEF1a-CD19FN CD8 IL2RB-4-1BB-FcR IgE
CC024 pSIH1-hEF1a-CD19FNN NKG2D-2B4
CC025 pSIH1-hEF1a-CD19FCN NKG2D-2B4
CC026 pSIH1-hEF1a-CD19FNN NKp46-CD2
CC027 pSIH1-hEF1a-CD19FNN DNAM1-2B4
CC028 pSIH1-hEF1a-CD19FCN NKG2D-NTB-A
CC029 pSIH1-hEF1a-CD19FNN NKp46-NTB-A
CC030 pSIH1-hEF1a-CD19FNN DNAM1-CRACC
CC031 pSIH1-hEF1a-CD19FCN NKG2D-CD2
CC032 pSIH1-hEF1a-CD19FNN NKp46-2B4
CC033 pSIH1-hEF1a-CD19FNN NKp46-CRACC
CC034 pSIH1-hEF1a-CD19FNN DNAM1-CD2
CC035 pSIH1-hEF1a-CD19FNN NKG2D-CRACC
CC036 pSIH1-hEF1a-CD19FCN NKG2D-CRACC
CC037 pSIH1-hEF1a-CD19FNN NKG2D-CD2
CC038 pSIH1-hEF1a-CD19FNN DNAM1-NTB-A
CC039 pSIH1-hEF1a-CD19FNN NKG2D-NTB-A
表2：CD19 CAR-NK构建体
本研究比较了示例性的NK CARs CC008、CC024、CC025和CC033与对照CARs CC002和CC004的细胞毒性。使用基于慢病毒的方法将CARs转染到NK92细胞中。对于慢病毒制备，首先将CAR构建体克隆到质粒pSIH1(SBI Cat#CD510B-1)中，然后使用CaCl2介导的转染方法将其与辅助质粒pMDL、VSVG和REV一起转染到293FT包装细胞中。48h后收集培养上清液，过滤(0.22μm)并在-80℃下储存。使用Lenti-X p24快速滴定试剂盒(NovoproteinTM)确定LV颗粒的滴度。对于NK92细胞的转导，将NK92细胞装入24孔板中，然后在8μg/mL聚凝胺的存在下，以20的感染复数(MOI)加入慢病毒，并在37℃下孵育48h。使用Guava EasycyteTM流式细胞仪确定CAR转导效率，使用荧光标记的抗-flag tag抗体测量Flag-tag的表达。
使用表达CD19的A549细胞系作为靶细胞并使用CAR转染的NK92细胞作为效应细胞，以实时细胞测定(RTCA)评估每种CAR的细胞毒性。为了测量靶细胞的特异性裂解(％)，首先将表达CD19的A549靶细胞(即肿瘤细胞)接种在电子微量滴定板的孔中，以使细胞沉淀并使靶细胞附着。第二天，从孔中移出培养基，并将效应细胞添加到板中，并在37℃下再孵育2-5天。使用xCELLigenceTMRTCA仪器检测靶细胞的实时杀伤，并使用xCELLigenceTM软件分析数据。
如图1所示，CC008 CAR构建体的细胞毒性显著高于对照CARs CC002和CC004。
实施例2
本研究比较了示例性的NK CARs CC005、CC007、CC008、CC013、CC016、CC017、CC018和CC024与未经CAR转导的NK92对照的细胞毒性。使用基于慢病毒的方法将CARs转染到NK92细胞中。对于慢病毒的制备，首先将CAR构建体克隆到质粒pSIH1(SBI Cat#CD510B-1)中，然后使用CaCl2介导的转染方法将其与辅助质粒pMDL、VSVG和REV一起转染到293FT包装细胞中。48h后收集培养上清液，过滤(0.22μm)并在-80℃下储存。使用Lenti-X p24快速滴定试剂盒(NovoproteinTM)确定LV颗粒的滴度。对于NK92细胞的转导，将NK92细胞装入24孔板中，然后在8μg/mL聚凝胺的存在下，以20的MOI加入慢病毒，并在37℃下孵育48h。使用GuavaEasycyteTM流式细胞仪确定CAR转导效率，使用荧光标记的抗-flag tag抗体测量Flag-tag的表达。
使用Raji细胞系作为靶细胞并使用CAR转染的NK92细胞作为效应细胞，以钙黄绿素-AM测定评估每种CAR的细胞毒性。为了测量靶细胞的特异性裂解(％)，将1×106个效应细胞在NK92培养基中用0.15μM钙黄绿素-AM在37℃、10mL的体积下染色25分钟(min)。然后将细胞在NK92培养基中洗涤两次，并以5×104个细胞/mL的浓度三重复地加入96孔圆底板中，并以效应细胞与靶细胞(E:T)为5:1的比例加入效应细胞。将板以300rpm离心1min，并在37℃下孵育4h。将细胞以400g离心5min，并将上清液转移到96孔的白色平板中。使用2％TRITON X100处理的细胞的荧光(Ex 495nm，Em 520nm)作为最大细胞死亡，使用未处理的细胞作为自发细胞死亡，并使用如下公式计算特异性裂解百分比：特异性裂解％＝100×[(实验数据-自发细胞死亡)/(最大细胞死亡-自发细胞死亡)]。
如图2所示的结果表明，并入了FceRI胞内结构域的CC005/CC007/CC008 CAR构建体的细胞毒活性高于所评估的其他CAR构建体。
实施例3
本研究比较了示例性的NK CARs CC008和CC026-CC039与对照CARs CC002和CC004的细胞毒性。使用基于慢病毒的方法将CARs转染到NK92细胞中。对于慢病毒的制备，首先将CAR构建体克隆到质粒pSIH1(SBI Cat#CD510B-1)中，然后使用CaCl2介导的转染方法将其与辅助质粒pMDL、VSVG和REV一起转染到293FT包装细胞中。48h后收集培养上清液，过滤(0.22μm)并在-80℃下储存。使用Lenti-Xp24快速滴定试剂盒(NovoproteinTM)确定LV颗粒的滴度。对于NK92细胞的转导，将NK92细胞装入24孔板中，然后在8μg/mL聚凝胺的存在下，以20的MOI加入慢病毒，并在37℃下孵育48h。使用Guava EasycyteTM流式细胞仪确定CAR转导效率，使用荧光标记的抗-flag tag抗体测量Flag-tag的表达。
使用Raji细胞系作为靶细胞并使用CAR转染的NK92细胞作为效应细胞，以钙黄绿素-AM测定评估每种CAR的细胞毒性。为了测量靶细胞的特异性裂解(％)，将1×106个效应细胞在NK92培养基中用0.15μM钙黄绿素-AM在37℃、10mL的体积下染色25min。然后将细胞在NK92培养基中洗涤两次，并以5×104个细胞/mL的浓度三重复地加入96孔圆底板中，并以效应细胞与靶细胞(E:T)为5:1的比例加入效应细胞。将板以300rpm离心1min，并在37℃下孵育4h。将细胞以400g离心5min，并将上清液转移到96孔的白色平板中。使用2％TRITONX100处理的细胞的荧光(Ex 495nm，Em 520nm)作为最大细胞死亡，使用未处理的细胞作为自发细胞死亡，并使用如下公式计算特异性裂解百分比：特异性裂解％＝100×[(实验数据-自发细胞死亡)/(最大细胞死亡-自发细胞死亡)]。
如图3所示，并入了DNAM1胞内结构域的CC027/CC030/CC034/CC038 CAR构建体、并入了NKp46和CD2胞内结构域的CC026构建体以及并入了NKG2D和CRACC胞内结构域的CC028/CC035/CC036构建体显示出针对Raji肿瘤细胞靶标的强的细胞毒活性。
使用Nalm6-GFP-荧光素酶细胞系作为靶细胞并使用CAR转染的NK92细胞作为效应细胞，以生物发光测定进一步评估每种CAR的细胞毒性。为了测量靶细胞的特异性裂解(％)，将表达荧光素酶的肿瘤细胞以5×105个细胞/mL的浓度三重复地加入96孔圆底板中，并以效应细胞与靶细胞(E:T)为1:1的比例加入效应细胞。将板以300rpm离心1min，并在37℃下分别孵育24h、48h和72h。孵育完成后，将D-荧光素(Perkin ElmerTM)以0.14mg/mL的终浓度添加到每个孔中，并在37℃下孵育10min。然后将细胞混合并转移到96孔的白色平板中。用光度计(TecanTM，SparkTM)测量生物发光成像(BLI)1秒。使用如下公式计算特异性裂解百分比：特异性裂解％＝100×[(自发细胞数据-实验数据)/(自发细胞数据-培养基对照数据)]。
如图4A和图4B所示，并入了NKG2D加上CRACC或NTB-A胞内结构域的CC028/CC039/CC035 CAR构建体和并入了DNAM1加上CRACC或NTB-A胞内结构域的CC030/CC038构建体显示出针对Nalm6-GFP-荧光素酶肿瘤细胞靶标的强的细胞毒活性。
实施例4
本研究比较了示例性的NK CARs CC005、CC007、CC008、CC016、CC018、CC024、CC025、CC028、CC030、CC035、CC036、CC038和CC039与对照CARs CC002和CC004的细胞毒性。使用基于慢病毒的方法将CARs转染到NK92细胞中。对于慢病毒的制备，首先将CAR构建体克隆到质粒pSIH1(SBI Cat#CD510B-1)中，然后使用CaCl2介导的转染方法将其与辅助质粒pMDL、VSVG和REV一起转染到293FT包装细胞中。48h后收集培养上清液，过滤(0.22μm)并在-80℃下储存。使用Lenti-X p24快速滴定试剂盒(NovoproteinTM)确定LV颗粒的滴度。对于NK92细胞的转导，将NK92细胞装入24孔板中，然后在8μg/mL聚凝胺的存在下，以20的MOI加入慢病毒，并在37℃下孵育48h。使用Guava EasycyteTM流式细胞仪确定CAR转导效率，使用荧光标记的抗-flag tag抗体测量Flag-tag的表达。
使用Raji细胞系作为靶细胞并使用CAR转染的NK92细胞作为效应细胞，以钙黄绿素-AM测定评估每种CAR的细胞毒性。为了测量靶细胞的特异性裂解(％)，将1×106个效应细胞在NK92培养基中用0.15μM钙黄绿素-AM在37℃、10mL的体积下染色25min。然后将细胞在NK92培养基中洗涤两次，并以5×104个细胞/mL的浓度三重复地加入96孔圆底板中，并以效应细胞与靶细胞(E:T)为5:1的比例加入效应细胞。将板以300rpm离心1min，并在37℃下孵育4h。将细胞以400g离心5min，并将上清液转移到96孔的白色平板中。使用2％TRITONX100处理的细胞的荧光(Ex 495nm，Em 520nm)作为最大细胞死亡，使用未处理的细胞作为自发细胞死亡，并使用如下公式计算特异性裂解百分比：特异性裂解％＝100×[(实验数据-自发细胞死亡)/(最大细胞死亡-自发细胞死亡)]。
如图5所示，并入了CD8和FceRI胞内结构域的CC005/CC007/CC008 CAR构建体、并入了NKG2D胞内结构域的CC024/CC028/CC035/CC036构建体和并入了DNAM1胞内结构域的CC030/CC038显示出针对Raji肿瘤细胞靶标的强的细胞毒活性。
使用Nalm6-GFP-荧光素酶细胞系作为靶细胞并使用CAR转染的NK92细胞作为效应细胞，以生物发光测定进一步评估每种CAR的细胞毒性。为了测量靶细胞的特异性裂解(％)，将表达荧光素酶的肿瘤细胞以5×105个细胞/mL的浓度三重复地加入96孔圆底板中，并以效应细胞与靶细胞(E:T)为1:1的比例加入效应细胞。将板以300rpm离心1min，并在37℃下分别孵育24h、48h和72h。孵育完成后，将D-荧光素(Perkin ElmerTM)以0.14mg/mL的终浓度添加到每个孔中，并在37℃下孵育10min。然后将细胞混合并转移到96孔的白色平板中。用光度计(TecanTM，SparkTM)测量生物发光成像(BLI)1秒。使用如下公式计算特异性裂解百分比：特异性裂解％＝100×[(自发细胞数据-实验数据)/(自发细胞数据-培养基对照数据)]。
如图6A和图6B所示，并入了CD8和FceRI胞内结构域的CC005/CC007/CC008 CAR构建体和并入了NKG2D胞内结构域的CC024/CC036/CC039显示出针对Nalm6-GFP-荧光素酶肿瘤细胞靶标的强的细胞毒活性。
实施例5
本研究比较了示例性的NK CARs CC005、CC007、CC008、CC024、CC030、CC035和CC036与对照CARs CC002和CC004的细胞毒性。使用基于慢病毒的方法将CARs转染到NK92细胞中。对于慢病毒的制备，首先将CAR构建体克隆到质粒pSIH1(SBI Cat#CD510B-1)中，然后使用CaCl2介导的转染方法将其与辅助质粒pMDL、VSVG和REV一起转染到293FT包装细胞中。48h后收集培养上清液，过滤(0.22μm)并在-80℃下储存。使用Lenti-X p24快速滴定试剂盒(NovoproteinTM)确定LV颗粒的滴度。对于NK92细胞的转导，将NK92细胞装入24孔板中，然后在8μg/mL聚凝胺的存在下，以20的MOI加入慢病毒，并在37℃下孵育48h。使用GuavaEasycyteTM流式细胞仪确定CAR转导效率，使用荧光标记的抗-flag tag抗体测量Flag-tag的表达。
使用Raji细胞系作为靶细胞并使用CAR转染的NK92细胞作为效应细胞，以钙黄绿素-AM测定评估每种CAR的细胞毒性。为了测量靶细胞的特异性裂解(％)，将1×106个效应细胞在NK92培养基中用0.15μM钙黄绿素-AM在37℃、10mL的体积下染色25min。然后将细胞在NK92培养基中洗涤两次，并以5×104个细胞/mL的浓度三重复地加入96孔圆底板中，并以效应细胞与靶细胞(E:T)为5:1的比例加入效应细胞。将板以300rpm离心1min，并在37℃下孵育4h。将细胞以400g离心5min，并将上清液转移到96孔的白色平板中。使用2％TRITONX100处理的细胞的荧光(Ex 495nm，Em 520nm)作为最大细胞死亡，使用未处理的细胞作为自发细胞死亡，并使用如下公式计算特异性裂解百分比：特异性裂解％＝100×[(实验数据-自发细胞死亡)/(最大细胞死亡-自发细胞死亡)]。
如图7所示，并入了CD8和FceRI胞内结构域的CC007/CC008 CAR构建体、并入了NKG2D胞内结构域的CC024/CC035/CC036构建体和并入了DNAM1胞内结构域的CC030显示出针对Raji肿瘤细胞靶标的强的细胞毒活性。
使用Nalm6-GFP-荧光素酶细胞系作为靶细胞并使用CAR转染的NK92细胞作为效应细胞，以生物发光测定进一步评估每种CAR的细胞毒性。为了测量靶细胞的特异性裂解(％)，将表达荧光素酶的肿瘤细胞以5×105个细胞/mL的浓度三重复地加入96孔圆底板中，并以效应细胞与靶细胞(E:T)为1:1的比例加入效应细胞。将板以300rpm离心1min，并在37℃下分别孵育24h、48h和72h。孵育完成后，将D-荧光素(Perkin ElmerTM)以0.14mg/mL的终浓度添加到每个孔中，并在37℃下孵育10min。然后将细胞混合并转移到96孔的白色平板中。用光度计(TecanTM，SparkTM)测量BLI 1秒。使用如下公式计算特异性裂解百分比：特异性裂解％＝100×[(自发细胞数据-实验数据)/(自发细胞数据-培养基对照数据)]。
如图8所示，并入了CD8和FceRI胞内结构域的CC005/CC007/CC008 CAR构建体和并入了NKG2D胞内结构域的CC024/CC035/CC036显示出针对Nalm6-GFP-荧光素酶肿瘤细胞靶标的强的细胞毒活性。
实施例6
本研究比较了示例性的NK CARs CC005、CC007、CC008、CC018、CC024、CC028、CC030、CC035和CC036与对照CAR CC004和NK92空白对照的细胞毒性。使用基于慢病毒的方法将CARs转染到NK92细胞中。对于慢病毒的制备，首先将CAR构建体克隆到质粒pSIH1(SBICat#CD510B-1)中，然后使用CaCl2介导的转染方法将其与辅助质粒pMDL、VSVG和REV一起转染到293FT包装细胞中。48h后收集培养上清液，过滤(0.22μm)并在-80℃下储存。使用Lenti-X p24快速滴定试剂盒(NovoproteinTM)确定LV颗粒的滴度。对于NK92细胞的转导，将NK92细胞装入24孔板中，然后在8μg/mL聚凝胺的存在下，以20的MOI加入慢病毒，并在37℃下孵育48h。使用Guava EasycyteTM流式细胞仪确定CAR转导效率，使用荧光标记的抗-flagtag抗体测量Flag-tag的表达。
使用Raji细胞系作为靶细胞并使用CAR转染的NK92细胞作为效应细胞，以钙黄绿素-AM测定评估每种CAR的细胞毒性。为了测量靶细胞的特异性裂解(％)，将1×106个效应细胞在NK92培养基中用0.15μM钙黄绿素-AM在37℃、10mL的体积下染色25min。然后将细胞在NK92培养基中洗涤两次，并以5×104个细胞/mL的浓度三重复地加入96孔圆底板中，并以效应细胞与靶细胞(E:T)为5:1的比例加入效应细胞。将板以300rpm离心1min，并在37℃下孵育4h。将细胞以400g离心5min，并将上清液转移到96孔的白色平板中。使用2％TRITONX100处理的细胞的荧光(Ex 495nm，Em 520nm)作为最大细胞死亡，使用未处理的细胞作为自发细胞死亡，并使用如下公式计算特异性裂解百分比：特异性裂解％＝100×[(实验数据-自发细胞死亡)/(最大细胞死亡-自发细胞死亡)]。
如图9所示，并入了FceRI胞内结构域的CC007/CC008/CC018 CAR构建体、并入了NKG2D和CRACC或NTB-A胞内结构域的CC028/CC035/CC036构建体显示出针对Raji肿瘤细胞靶标的强的细胞毒活性。
使用Nalm6-GFP-荧光素酶细胞系作为靶细胞并使用CAR转染的NK92细胞作为效应细胞，以生物发光测定进一步评估每种CAR的细胞毒性。为了测量靶细胞的特异性裂解(％)，将表达荧光素酶的肿瘤细胞以5×105个细胞/mL的浓度三重复地加入96孔圆底板中，并以效应细胞与靶细胞(E:T)为1:1的比例加入效应细胞。将板以300rpm离心1min，并在37℃下分别孵育24h、48h和72h。孵育完成后，将D-荧光素(Perkin ElmerTM)以0.14mg/mL的终浓度添加到每个孔中，并在37℃下孵育10min。然后将细胞混合并转移到96孔的白色平板中。用光度计(TecanTM，SparkTM)测量BLI 1秒。使用如下公式计算特异性裂解百分比：特异性裂解％＝100×[(自发细胞数据-实验数据)/(自发细胞数据-培养基对照数据)]。
如图10所示，并入了FceRI胞内结构域的CC005/CC007/CC008/CC018 CAR构建体、并入了NKG2D胞内结构域的CC028/CC035/CC036 CAR构建体和并入了DNAM1和CRACC胞内结构域的CC030 CAR构建件显示出针对Nalm6-GFP-荧光素酶肿瘤细胞靶标的强的细胞毒活性。
实施例7
本研究比较了示例性的NK CARs CC008、CC018、CC024、CC030、CC035和CC036与对照CARs CC002-CC004的细胞因子和颗粒酶释放。使用HTRF(均相时间分辨荧光)技术以CisbioTM生物测定来分析细胞因子TNF-α、IFN-γ、颗粒酶B和GM-CSF的释放。
除CAR构建体CC008外，所有其他评估的CARs均显示出低水平的细胞因子释放。参见例如图11-图14。
实施例8
CD33 CAR-NK构建体和实施方式
表3和表4显示了示例性的CD33 CAR-NK构建体。关于示例性的CD33 CAR-NK数据，参见例如实施例8或图17-图24B。
表3：CD33 CAR-NK构建体具有不同的跨膜结构域(TD)+共刺激结构域(CD)+信号转导结构域(SD)
构建体 描述
CC103 CC104(无3*Flag)
CC104 pSIH1-hEF1a-CD33FN CD8-4-1BB-CD3z
CC108 pSIH1-hEF1a-CD33FN CD8-4-1BB-FcRIgE-P2A-IL15-IL21
CC118 pSIH1-hEF1a-CD33FN CD8 IL2RB-4-1BB-FcR IgE
CC124 pSIH1-hEF1a-CD33FNN NKG2D-2B4
CC125 pSIH1-hEF1a-CD33FCN NKG2D-2B4
CC130 pSIH1-hEF1a-CD33FNN DNAM1-CRACC
CC135 pSIH1-hEF1a-CD33FNN NKG2D-CRACC
CC136 pSIH1-hEF1a-CD33FCN NKG2D-CRACC
表4：CD33 CAR-NK构建体
本研究比较了示例性的NK CARs CC104、CC108、CC118、CC124、CC125、CC130、CC135和CC136与对照CARs CC103和CC104的细胞毒性。使用基于慢病毒的方法将CARs转染到NK92细胞中。对于慢病毒的制备，首先将CAR构建体克隆到质粒pSIH1(SBI Cat#CD510B-1)中，然后使用CaCl2介导的转染方法将其与辅助质粒pMDL、VSVG和REV一起转染到293FT包装细胞中。48h后收集培养上清液，过滤(0.22μm)并在-80℃下储存。使用Lenti-X p24快速滴定试剂盒(NovoproteinTM)确定LV颗粒的滴度。对于NK92细胞的转导，将NK92细胞装入24孔板中，然后在8μg/mL聚凝胺的存在下，以20的MOI加入慢病毒，并在37℃下孵育48h。使用GuavaEasycyteTM流式细胞仪确定CAR转导效率，使用荧光标记的抗-flag tag抗体测量Flag-tag的表达。
使用U937细胞系作为靶细胞并使用CAR转染的NK92细胞作为效应细胞，以钙黄绿素-AM测定评估每种CAR的细胞毒性。为了测量靶细胞的特异性裂解(％)，将1×106个效应细胞在NK92培养基中用0.15μM钙黄绿素-AM在37℃、10mL的体积下染色25min。然后将细胞在NK92培养基中洗涤两次，并以5×104个细胞/mL的浓度三重复地加入96孔圆底板中，并以效应细胞与靶细胞(E:T)为1:1或1:4的比例加入效应细胞。将板以300rpm离心1min，并分别在37℃下孵育24h和48h。将细胞以400g离心5min，并将上清液转移到96孔的白色平板中。使用2％ TRITON X100处理的细胞的荧光(Ex 495nm，Em 520nm)作为最大细胞死亡，使用未处理的细胞作为自发细胞死亡，并使用如下公式计算特异性裂解百分比：特异性裂解％＝100×[(实验数据-自发细胞死亡)/(最大细胞死亡-自发细胞死亡)]。
如图19所示，CC108 CAR构建体的细胞毒性显著高于对照CARs CC103和CC104。CAR构建体CC124和CC135比起对照CARs CC103和CC104也具有增强的细胞毒性。
以基于流式细胞术的方法进一步评估每种CAR的细胞毒性。首先，将U937靶细胞与效应细胞以效应细胞与靶细胞(E:T)为1:1或1:4的比例在37℃下分别孵育24h和48h。然后将PE偶联的抗-CD33抗体、APC偶联的抗-CD56抗体和7AAD溶液添加到每个样品中，并在4℃下孵育30min，然后在Guava EasycyteTM流式细胞仪中进行流式细胞分析。死亡的靶细胞被鉴别为7AAD阳性。
如图20A-图20E、图21A-图21D、图22A-图22E、图23A-图23D和图24A-图24B所示，以下的CAR构建体显示出对U937肿瘤细胞靶标的强的细胞毒活性：并入了CD8和FceRI胞内结构域以及IL15和IL21的CC008 CAR构建体；并入了NKG2D和2B4胞内结构域的CC124/CC125构建体；并入了DNAM1和CRACC胞内结构域的CC130构建体；以及并入了NKG2D和CRACC胞内结构域的CC135构建体。
实施例9：方法
细胞培养
将NK92细胞在补充有100IU/mL重组人IL-2的培养基(CytocaresTM)中培养。将Raji、U937、Nalm6-GFP-荧光素酶细胞在补充有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素/链霉素的1640培养基(GibcoTM)中培养。将A549-CD19细胞在补充有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基(GibcoTM)中培养。关于外周血自然杀伤细胞(PB-NK)的制备，使用Ficoll-Paque PLUSTM(GE HealthcareTM)从健康供体的外周血中分离外周血单核细胞(PBMCs)，并在具有各种细胞因子和抗体的干细胞生长培养基(SCGM)中培养两周，以获得高纯度的原代NK细胞。
慢病毒制备与NK细胞转导
为了制备慢病毒颗粒，将含有示例性CARs的质粒随着pMDL、VSVG和REV转导入293FT细胞中。转染后48小时，收获病毒上清液，过滤并浓缩。将病毒储存在-80℃下，并使用Lenti-X p24快速滴定试剂盒TM(NovoproteinTM)确定滴度。将NK92细胞装入24孔板中，然后在8μg/mL聚凝胺的存在下，以20的MOI加入慢病毒，并在37℃下孵育48h。在终点，在GuavaEasycyteTM流式细胞仪中进行流式细胞分析来测定CAR转导效率之前30min，添加7AAD(7-氨基-放线菌素D)和flag tag抗体。
使用RTCA(实时细胞分析)的特异性裂解：
首先将粘附靶细胞(例如，肿瘤细胞)接种在电子微量滴定板(“S16板”或“S16孔”)的孔中，使细胞沉淀；监测靶细胞的附着和增殖。第二天，从仪器中移出S16板，并从孔中移出培养基。然后将效应细胞加入S16孔中，并在37℃下再孵育2-5天。使用xCELLigenceTM软件分析数据。
使用钙黄绿素-AM测定的特异性裂解：
将1×106个效应细胞在NK92培养基中用0.15μM钙黄绿素-AM在37℃、10mL的体积下染色25min。然后将细胞在NK92培养基中洗涤两次，并以5×104个细胞/mL的浓度三重复地加入96孔圆底板中，并以效应细胞与靶细胞(E:T)为1:1的比例加入效应细胞。将板以300rpm离心1min，并在37℃下孵育4h。将细胞以400g离心5min，并将上清液转移到96孔的白色平板中。使用2％ TRITON X100处理的细胞的荧光(Ex 495nm，Em 520nm)作为最大细胞死亡，使用未处理的细胞作为自发细胞死亡，并使用如下公式计算特异性裂解百分比：特异性裂解％＝100×[(实验数据-自发细胞死亡)/(最大细胞死亡-自发细胞死亡)]。
使用生物发光测定的特异性裂解：
将表达荧光素酶的肿瘤细胞以5×105个细胞/mL的浓度三重复地加入96孔圆底板中，并以效应细胞与靶细胞(E:T)为1:1的比例加入效应细胞。将板以300rpm离心1min，并在37℃下分别孵育24h、48h和72h。在终点，将D-荧光素(Perkin ElmerTM)以0.14mg/mL的终浓度添加到每个孔中，并在37℃下孵育10min。然后将细胞混合并转移到96孔的白色平板中。用光度计(TecanTM，SparkTM)测量BLI 1秒。使用如下公式计算特异性裂解百分比：特异性裂解％＝100×[(自发细胞数据-实验数据)/(自发细胞数据-培养基对照数据)]。
使用CisbioTM的细胞因子释放：
遵循CisbioTM规程，使用HTRF(均相时间分辨荧光)技术进行CisbioTM生物测定。参见例如Degorce等人，HTRF:A Technology Tailored for Drug Discovery–A Review ofTheoretical Aspects and Recent Applications，Curr Chem Genomics.2009；3:22-32；其内容通过引用整体并入本文。
FACS：
将靶细胞与效应细胞以不同的效应细胞与靶细胞(E/T)比例在37℃下分别孵育24h和48h。然后将各种抗体溶液添加到每个样品中，并在4℃下孵育30min，然后在GuavaEasycyteTM流式细胞仪中进行流式细胞分析。死亡的靶细胞被鉴别为7AAD阳性。
序列表
<110> 惠和生物技术有限公司（CYTOCARES, INC.）
<120> 嵌合抗原受体（CAR）构建体和表达CAR构建体的NK细胞
<130> 087825-000003WOPT
<150> 63/141,621
<151> 2021-01-26
<160> 176
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 1
tggaggagga aaaggaagga gaagcagtcc gagacatccc ccaaagagtt tttaaccatt 60
tatgaggacg tgaaggacct caagaccaga aggaaccacg agcaagaaca gacctttccc 120
ggcggcggat ccaccatcta cagcatgatc cagagccaga gctccgcccc tacaagccaa 180
gaacccgctt acactttata ttctttaatc cagccttctc gtaagagcgg ctcccgtaag 240
aggaaccaca gccccagctt taatagcacc atttacgagg tcatcggcaa gtcccagcct 300
aaggcccaaa accccgctcg tctctctcgt aaggagctgg agaatttcga cgtgtacagc 360
<210> 2
<211> 264
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 2
tggtttctga agagagagag gcaagaggag tacatcgagg agaagaagag ggtggacatc 60
tgcagagaga cccccaacat ctgcccccat tccggcgaga acaccgagta cgacaccatc 120
ccccacacca acagaaccat tctgaaggag gaccccgcca acaccgtgta cagcaccgtg 180
gagatcccca agaagatgga gaatccccac tctctgctga ccatgcccga cacccccaga 240
ctgttcgcct atgagaatgt tatc 264
<210> 3
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 3
aagaggaaga agcagaggtc tagaagaaac gacgaggagc tcgagacaag agcccacaga 60
gtggctaccg aagagagagg cagaaagccc caccagatcc ccgccagcac accccagaac 120
cccgccacaa gccagcatcc cccccctcct cccggccaca gatcccaagc tcccagccac 180
agacctcctc cccccggcca tagggtgcag catcagcccc agaaaagacc tcccgccccc 240
agcggaaccc aagtgcatca gcagaagggc cctcctctgc ccagacctag ggtgcaaccc 300
aagccccctc atggcgctgc cgagaactct ctgagcccta gcagcaac 348
<210> 4
<211> 252
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 4
ctgagaaaga gaagagactc tctgtctctg agcacccaaa gaacacaagg ccccgagagc 60
gccagaaatc tggagtacgt gagcgtgagc cccaccaaca acaccgtgta cgccagcgtg 120
acccacagca acagagagac cgagatctgg acccctagag agaacgacac catcaccatc 180
tacagcacca tcaaccacag caaggagagc aagcccacat tctctagagc caccgctctg 240
gataacgtgg tg 252
<210> 5
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 5
agagtcaagt tctccaggtc cgccgacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 6
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 6
cgtctgaaga tccaagttag gaaggccgcc atcacctcct acgagaagag cgacggcgtg 60
tacaccggtt taagcacaag gaaccaagaa acctacgaga ctttaaagca cgagaagccc 120
ccccag 126
<210> 7
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 7
Trp Arg Arg Lys Arg Lys Glu Lys Gln Ser Glu Thr Ser Pro Lys Glu
1 5 10 15
Phe Leu Thr Ile Tyr Glu Asp Val Lys Asp Leu Lys Thr Arg Arg Asn
20 25 30
His Glu Gln Glu Gln Thr Phe Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ile Tyr Ser
35 40 45
Met Ile Gln Ser Gln Ser Ser Ala Pro Thr Ser Gln Glu Pro Ala Tyr
50 55 60
Thr Leu Tyr Ser Leu Ile Gln Pro Ser Arg Lys Ser Gly Ser Arg Lys
65 70 75 80
Arg Asn His Ser Pro Ser Phe Asn Ser Thr Ile Tyr Glu Val Ile Gly
85 90 95
Lys Ser Gln Pro Lys Ala Gln Asn Pro Ala Arg Leu Ser Arg Lys Glu
100 105 110
Leu Glu Asn Phe Asp Val Tyr Ser
115 120
<210> 8
<211> 88
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 8
Trp Phe Leu Lys Arg Glu Arg Gln Glu Glu Tyr Ile Glu Glu Lys Lys
1 5 10 15
Arg Val Asp Ile Cys Arg Glu Thr Pro Asn Ile Cys Pro His Ser Gly
20 25 30
Glu Asn Thr Glu Tyr Asp Thr Ile Pro His Thr Asn Arg Thr Ile Leu
35 40 45
Lys Glu Asp Pro Ala Asn Thr Val Tyr Ser Thr Val Glu Ile Pro Lys
50 55 60
Lys Met Glu Asn Pro His Ser Leu Leu Thr Met Pro Asp Thr Pro Arg
65 70 75 80
Leu Phe Ala Tyr Glu Asn Val Ile
85
<210> 9
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 9
Lys Arg Lys Lys Gln Arg Ser Arg Arg Asn Asp Glu Glu Leu Glu Thr
1 5 10 15
Arg Ala His Arg Val Ala Thr Glu Glu Arg Gly Arg Lys Pro His Gln
20 25 30
Ile Pro Ala Ser Thr Pro Gln Asn Pro Ala Thr Ser Gln His Pro Pro
35 40 45
Pro Pro Pro Gly His Arg Ser Gln Ala Pro Ser His Arg Pro Pro Pro
50 55 60
Pro Gly His Arg Val Gln His Gln Pro Gln Lys Arg Pro Pro Ala Pro
65 70 75 80
Ser Gly Thr Gln Val His Gln Gln Lys Gly Pro Pro Leu Pro Arg Pro
85 90 95
Arg Val Gln Pro Lys Pro Pro His Gly Ala Ala Glu Asn Ser Leu Ser
100 105 110
Pro Ser Ser Asn
115
<210> 10
<211> 84
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 10
Leu Arg Lys Arg Arg Asp Ser Leu Ser Leu Ser Thr Gln Arg Thr Gln
1 5 10 15
Gly Pro Glu Ser Ala Arg Asn Leu Glu Tyr Val Ser Val Ser Pro Thr
20 25 30
Asn Asn Thr Val Tyr Ala Ser Val Thr His Ser Asn Arg Glu Thr Glu
35 40 45
Ile Trp Thr Pro Arg Glu Asn Asp Thr Ile Thr Ile Tyr Ser Thr Ile
50 55 60
Asn His Ser Lys Glu Ser Lys Pro Thr Phe Ser Arg Ala Thr Ala Leu
65 70 75 80
Asp Asn Val Val
<210> 11
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 11
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 12
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 12
Arg Leu Lys Ile Gln Val Arg Lys Ala Ala Ile Thr Ser Tyr Glu Lys
1 5 10 15
Ser Asp Gly Val Tyr Thr Gly Leu Ser Thr Arg Asn Gln Glu Thr Tyr
20 25 30
Glu Thr Leu Lys His Glu Lys Pro Pro Gln
35 40
<210> 13
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 13
aaaaggggca gaaagaaact gctctacatc ttcaagcagc ccttcatgag gcccgtccaa 60
accacccagg aggaggacgg atgcagctgt agattccccg aagaggagga aggcggctgc 120
gagctg 126
<210> 14
<211> 282
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 14
aactgcagga acaccgggcc atggctgaag aaggtcctga agtgtaacac cccagacccc 60
tcgaagttct tttcccagct gagctcagag catggaggag acgtccagaa gtggctctct 120
tcgcccttcc cctcatcgtc cttcagccct ggcggcctgg cacctgagat ctcgccacta 180
gaagtgctgg agagggacaa ggtgacgcag ctgctccccc tgaacactga tgcctacttg 240
tccctccaag aactccaggg tcaggaccca actcacttgg tg 282
<210> 15
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 15
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 16
<211> 94
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 16
Asn Cys Arg Asn Thr Gly Pro Trp Leu Lys Lys Val Leu Lys Cys Asn
1 5 10 15
Thr Pro Asp Pro Ser Lys Phe Phe Ser Gln Leu Ser Ser Glu His Gly
20 25 30
Gly Asp Val Gln Lys Trp Leu Ser Ser Pro Phe Pro Ser Ser Ser Phe
35 40 45
Ser Pro Gly Gly Leu Ala Pro Glu Ile Ser Pro Leu Glu Val Leu Glu
50 55 60
Arg Asp Lys Val Thr Gln Leu Leu Pro Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu
65 70 75 80
Ser Leu Gln Glu Leu Gln Gly Gln Asp Pro Thr His Leu Val
85 90
<210> 17
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 17
ggcagcggcg ccaccaactt ctctttactg aagcaagctg gcgacgtgga ggagaatccc 60
ggtccc 66
<210> 18
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 18
ggcagcggaa gagccgaggg aagaggctct ttactgactt gtggcgacgt ggaagagaat 60
cccggcccc 69
<210> 19
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 19
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 20
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 20
Gly Ser Gly Arg Ala Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 21
<211> 486
<212> DNA
<213> 智人
<400> 21
atgaggatca gcaagcccca tttaaggagc atctccatcc agtgctattt atgtttactg 60
ctgaacagcc attttttaac cgaggccggc atccacgtgt tcattttagg ctgcttttcc 120
gccggtttac ccaagaccga ggctaactgg gtgaacgtga tcagcgattt aaagaagatc 180
gaggatttaa tccagagcat gcacatcgat gccactttat ataccgagag cgacgtgcac 240
cccagctgca aggtgaccgc catgaagtgt tttttactgg agctgcaagt tatctcttta 300
gagagcggcg acgccagcat ccacgacacc gtggagaatt taatcatttt agccaacaac 360
agcctctcca gcaacggcaa tgtgacagag agcggctgca aggagtgcga ggagctggag 420
gagaagaaca tcaaggagtt tttacagagc ttcgtgcaca tcgtgcagat gttcatcaac 480
accagc 486
<210> 22
<211> 465
<212> DNA
<213> 智人
<400> 22
atggagagaa tcgtgatctg tttaatggtg atctttttag gcactttagt gcacaagtcc 60
agctcccaag gtcaagatag acacatgatt cgtatgaggc agctgatcga catcgtggac 120
cagctgaaga actacgtgaa cgatttagtg cccgaatttt tacccgctcc cgaggacgtg 180
gagaccaact gcgagtggag cgccttctct tgtttccaga aggctcagct gaagagcgcc 240
aacaccggca acaacgagag gattatcaac gtgtccatca agaagctgaa gaggaagcct 300
ccctccacca acgccggcag aaggcagaag cacagactga cttgtccctc ttgtgacagc 360
tacgagaaga agccccctaa ggagttttta gagagattca agtctttact gcagaagatg 420
atccaccagc atttaagctc tcgtacccac ggcagcgagg attcc 465
<210> 23
<211> 162
<212> PRT
<213> 智人
<400> 23
Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr
1 5 10 15
Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His
20 25 30
Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala
35 40 45
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
50 55 60
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
65 70 75 80
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
85 90 95
Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
100 105 110
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
115 120 125
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
130 135 140
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
145 150 155 160
Thr Ser
<210> 24
<211> 155
<212> PRT
<213> 智人
<400> 24
Met Glu Arg Ile Val Ile Cys Leu Met Val Ile Phe Leu Gly Thr Leu
1 5 10 15
Val His Lys Ser Ser Ser Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met
20 25 30
Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp
35 40 45
Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys
50 55 60
Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala
65 70 75 80
Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu
85 90 95
Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg
100 105 110
Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu
115 120 125
Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His
130 135 140
Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser Glu Asp Ser
145 150 155
<210> 25
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 25
cctttcttct tctgctgctt catcgccgtg gccatgggca ttcgtttcat catcatggtg 60
gcc 63
<210> 26
<211> 138
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 26
atgggactgg cctttctggt gctggtggct ctggtgtggt ttctggtgga ggactggctg 60
agcagaaaga ggaccagaga gagagccagc agagccagca catgggaggg cagaaggaga 120
ctgaacaccc agaccctg 138
<210> 27
<211> 246
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 27
ggcggcaccg tgctgctgct gctgttcgtg atctccatca ccaccatcat cgtcatcttt 60
ctgaacagaa ggaggagaag ggagaggagg gatctgttca ccgagagctg ggacacccag 120
aaggccccca acaactatag aagccccatc agcaccagcc agcccaccaa ccagagcatg 180
gacgacacca gagaggacat ctacgtgaac taccccacct tcagcagaag acccaagacc 240
agagtg 246
<210> 28
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 28
atctacatct gggcccctct ggctggcaca tgtggcgtgc tgctgctctc cctggtgatc 60
accctgtact gc 72
<210> 29
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 29
Pro Phe Phe Phe Cys Cys Phe Ile Ala Val Ala Met Gly Ile Arg Phe
1 5 10 15
Ile Ile Met Val Ala
20
<210> 30
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 30
Met Gly Leu Ala Phe Leu Val Leu Val Ala Leu Val Trp Phe Leu Val
1 5 10 15
Glu Asp Trp Leu Ser Arg Lys Arg Thr Arg Glu Arg Ala Ser Arg Ala
20 25 30
Ser Thr Trp Glu Gly Arg Arg Arg Leu Asn Thr Gln Thr Leu
35 40 45
<210> 31
<211> 82
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 31
Gly Gly Thr Val Leu Leu Leu Leu Phe Val Ile Ser Ile Thr Thr Ile
1 5 10 15
Ile Val Ile Phe Leu Asn Arg Arg Arg Arg Arg Glu Arg Arg Asp Leu
20 25 30
Phe Thr Glu Ser Trp Asp Thr Gln Lys Ala Pro Asn Asn Tyr Arg Ser
35 40 45
Pro Ile Ser Thr Ser Gln Pro Thr Asn Gln Ser Met Asp Asp Thr Arg
50 55 60
Glu Asp Ile Tyr Val Asn Tyr Pro Thr Phe Ser Arg Arg Pro Lys Thr
65 70 75 80
Arg Val
<210> 32
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 32
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 33
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 33
gacatccaga tgacccagac caccagcagc ctgagcgcta gcctgggcga tagagtgacc 60
atcagctgca gagccagcca ggacatcagc aagtacctga actggtacca gcagaagccc 120
gacggcacag tgaaactgct gatctaccac acctccagac tgcatagcgg cgtgcctagc 180
aggttttccg gcagcggcag cggaaccgac tactccctga ccatcagcaa cctggagcag 240
gaggacatcg ctacctactt ttgtcagcag ggcaacaccc tgccttacac ctttggcggc 300
ggaacaaagc tggagattac cggcggcgga ggcagcggcg gcggaggctc cggaggcgga 360
ggatccgagg tgaagctgca ggaaagcgga cctggactgg tcgcccctag ccagagcctg 420
agcgtgacct gtaccgtgag cggagtgagc ctgcccgatt acggcgtgtc ctggatcagg 480
cagcccccca ggaagggact ggaatggctg ggcgtcatct ggggctccga gacaacctac 540
tacaacagcg ccctcaagtc caggctcacc attatcaagg acaatagcaa gagccaggtg 600
ttcctgaaga tgaacagcct gcagaccgac gacacagcca tttattactg cgccaagcac 660
tattattacg gcggcagcta cgccatggac tattggggcc agggaacaag cgtgaccgtc 720
agcagc 726
<210> 34
<211> 735
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 34
gaagtgcagc tggtgcagag cggagcagaa gtgaagaagc ccggaagcag cgtgaaggtg 60
tcttgcaagg ccagcggcta caccatcacc gacagcaaca tccattgggt ccggcaggct 120
ccaggacagt ctctggagtg gatcggctac atctacccct acaacggcgg caccgactac 180
aaccagaagt tcaagaaccg ggccaccctg accgtggata accccaccaa caccgcctac 240
atggagctga gcagcctgag aagcgaggac accgccttct actattgcgt gaacggcaac 300
ccttggctgg cctattgggg acagggaaca ctggtgaccg tgtcctctgg cggcggaggc 360
agcggcggcg gaggctccgg aggcggagga tccgacatcc agctgaccca gtctcctagc 420
accctgagcg ctagcgtggg agatagagtg accatcactt gcagagccag cgagagcctg 480
gacaactacg gcatccggtt cctgacttgg ttccagcaga aacccggcaa ggcccctaaa 540
ctgctgatgt acgccgcctc taaccaggga agcggagtgc ctagcagatt cagcggcagc 600
ggaagcggaa ccgagttcac cctgaccatc agctctctgc agccagacga cttcgccacc 660
tactactgcc agcagaccaa ggaggtgcct tggagcttcg gccagggaac caaggtggaa 720
gtgaagcgga cagtg 735
<210> 35
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 35
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu
115 120 125
Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys
130 135 140
Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg
145 150 155 160
Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser
165 170 175
Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile
180 185 190
Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln
195 200 205
Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly
210 215 220
Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser
<210> 36
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 36
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Ile Thr Asp Ser
20 25 30
Asn Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Asn Pro Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Asn Gly Asn Pro Trp Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala
130 135 140
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Leu
145 150 155 160
Asp Asn Tyr Gly Ile Arg Phe Leu Thr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Met Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly
180 185 190
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu
195 200 205
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
210 215 220
Gln Thr Lys Glu Val Pro Trp Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
225 230 235 240
Val Lys Arg Thr Val
245
<210> 37
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 37
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccg 63
<210> 38
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 38
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 39
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 39
gattacaagg atgacgacga taaggactat aaggacgacg acgataagga ttataaagac 60
gatgacgaca aa 72
<210> 40
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 40
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5 10 15
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
20
<210> 41
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 41
ggtggaggcg gttcg 15
<210> 42
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 42
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
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<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 43
accacaaccc ctgcccccag acctcccaca cccgccccta ccatcgctag ccagcctctg 60
agcctgaggc ccgaggcttg cagacctgct gctggaggcg ccgtgcacac cagaggactg 120
gatttcgcct gcgac 135
<210> 44
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 44
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 45
<211> 1212
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 45
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggattaca aggatgacga cgataaggac tataaggacg acgacgataa ggattataaa 120
gacgatgacg acaaaggtgg aggcggttcg gacatccaga tgacccagac caccagcagc 180
ctgagcgcta gcctgggcga tagagtgacc atcagctgca gagccagcca ggacatcagc 240
aagtacctga actggtacca gcagaagccc gacggcacag tgaaactgct gatctaccac 300
acctccagac tgcatagcgg cgtgcctagc aggttttccg gcagcggcag cggaaccgac 360
tactccctga ccatcagcaa cctggagcag gaggacatcg ctacctactt ttgtcagcag 420
ggcaacaccc tgccttacac ctttggcggc ggaacaaagc tggagattac cggcggcgga 480
ggcagcggcg gcggaggctc cggaggcgga ggatccgagg tgaagctgca ggaaagcgga 540
cctggactgg tcgcccctag ccagagcctg agcgtgacct gtaccgtgag cggagtgagc 600
ctgcccgatt acggcgtgtc ctggatcagg cagcccccca ggaagggact ggaatggctg 660
ggcgtcatct ggggctccga gacaacctac tacaacagcg ccctcaagtc caggctcacc 720
attatcaagg acaatagcaa gagccaggtg ttcctgaaga tgaacagcct gcagaccgac 780
gacacagcca tttattactg cgccaagcac tattattacg gcggcagcta cgccatggac 840
tattggggcc agggaacaag cgtgaccgtc agcagcacca caacccctgc ccccagacct 900
cccacacccg cccctaccat cgctagccag cctctgagcc tgaggcccga ggcttgcaga 960
cctgctgctg gaggcgccgt gcacaccaga ggactggatt tcgcctgcga catctacatc 1020
tgggcccctc tggctggcac atgtggcgtg ctgctgctct ccctggtgat caccctgtac 1080
tgcaaaaggg gcagaaagaa actgctctac atcttcaagc agcccttcat gaggcccgtc 1140
caaaccaccc aggaggagga cggatgcagc tgtagattcc ccgaagagga ggaaggcggc 1200
tgcgagctgt aa 1212
<210> 46
<211> 1476
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 46
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgggtggag gcggttcgga catccagatg acccagacca ccagcagcct gagcgctagc 120
ctgggcgata gagtgaccat cagctgcaga gccagccagg acatcagcaa gtacctgaac 180
tggtaccagc agaagcccga cggcacagtg aaactgctga tctaccacac ctccagactg 240
catagcggcg tgcctagcag gttttccggc agcggcagcg gaaccgacta ctccctgacc 300
atcagcaacc tggagcagga ggacatcgct acctactttt gtcagcaggg caacaccctg 360
ccttacacct ttggcggcgg aacaaagctg gagattaccg gcggcggagg cagcggcggc 420
ggaggctccg gaggcggagg atccgaggtg aagctgcagg aaagcggacc tggactggtc 480
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ggcgtgtcct ggatcaggca gccccccagg aagggactgg aatggctggg cgtcatctgg 600
ggctccgaga caacctacta caacagcgcc ctcaagtcca ggctcaccat tatcaaggac 660
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tattactgcg ccaagcacta ttattacggc ggcagctacg ccatggacta ttggggccag 780
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gaggaggacg gatgcagctg tagattcccc gaagaggagg aaggcggctg cgagctgaga 1140
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<210> 47
<211> 1548
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 47
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggattaca aggatgacga cgataaggac tataaggacg acgacgataa ggattataaa 120
gacgatgacg acaaaggtgg aggcggttcg gacatccaga tgacccagac caccagcagc 180
ctgagcgcta gcctgggcga tagagtgacc atcagctgca gagccagcca ggacatcagc 240
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cctggactgg tcgcccctag ccagagcctg agcgtgacct gtaccgtgag cggagtgagc 600
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cccacacccg cccctaccat cgctagccag cctctgagcc tgaggcccga ggcttgcaga 960
cctgctgctg gaggcgccgt gcacaccaga ggactggatt tcgcctgcga catctacatc 1020
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ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa 1440
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<210> 48
<211> 1338
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 48
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggattaca aggatgacga cgataaggac tataaggacg acgacgataa ggattataaa 120
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acctccagac tgcatagcgg cgtgcctagc aggttttccg gcagcggcag cggaaccgac 360
tactccctga ccatcagcaa cctggagcag gaggacatcg ctacctactt ttgtcagcag 420
ggcaacaccc tgccttacac ctttggcggc ggaacaaagc tggagattac cggcggcgga 480
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ggcgtcatct ggggctccga gacaacctac tacaacagcg ccctcaagtc caggctcacc 720
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cctgctgctg gaggcgccgt gcacaccaga ggactggatt tcgcctgcga catctacatc 1020
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gagaagcccc cccagtaa 1338
<210> 49
<211> 1890
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 49
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggattaca aggatgacga cgataaggac tataaggacg acgacgataa ggattataaa 120
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acctccagac tgcatagcgg cgtgcctagc aggttttccg gcagcggcag cggaaccgac 360
tactccctga ccatcagcaa cctggagcag gaggacatcg ctacctactt ttgtcagcag 420
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attatcaagg acaatagcaa gagccaggtg ttcctgaaga tgaacagcct gcagaccgac 780
gacacagcca tttattactg cgccaagcac tattattacg gcggcagcta cgccatggac 840
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<210> 50
<211> 2424
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 50
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tactccctga ccatcagcaa cctggagcag gaggacatcg ctacctactt ttgtcagcag 420
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ggcagcggcg gcggaggctc cggaggcgga ggatccgagg tgaagctgca ggaaagcgga 540
cctggactgg tcgcccctag ccagagcctg agcgtgacct gtaccgtgag cggagtgagc 600
ctgcccgatt acggcgtgtc ctggatcagg cagcccccca ggaagggact ggaatggctg 660
ggcgtcatct ggggctccga gacaacctac tacaacagcg ccctcaagtc caggctcacc 720
attatcaagg acaatagcaa gagccaggtg ttcctgaaga tgaacagcct gcagaccgac 780
gacacagcca tttattactg cgccaagcac tattattacg gcggcagcta cgccatggac 840
tattggggcc agggaacaag cgtgaccgtc agcagcacca caacccctgc ccccagacct 900
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cctgctgctg gaggcgccgt gcacaccaga ggactggatt tcgcctgcga catctacatc 1020
tgggcccctc tggctggcac atgtggcgtg ctgctgctct ccctggtgat caccctgtac 1080
tgcaaaaggg gcagaaagaa actgctctac atcttcaagc agcccttcat gaggcccgtc 1140
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tgcgagctgc gtctgaagat ccaagttagg aaggccgcca tcacctccta cgagaagagc 1260
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acccacggca gcgaggattc ctaa 2424
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 51
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggattaca aggatgacga cgataaggac tataaggacg acgacgataa ggattataaa 120
gacgatgacg acaaaggtgg aggcggttcg gacatccaga tgacccagac caccagcagc 180
ctgagcgcta gcctgggcga tagagtgacc atcagctgca gagccagcca ggacatcagc 240
aagtacctga actggtacca gcagaagccc gacggcacag tgaaactgct gatctaccac 300
acctccagac tgcatagcgg cgtgcctagc aggttttccg gcagcggcag cggaaccgac 360
tactccctga ccatcagcaa cctggagcag gaggacatcg ctacctactt ttgtcagcag 420
ggcaacaccc tgccttacac ctttggcggc ggaacaaagc tggagattac cggcggcgga 480
ggcagcggcg gcggaggctc cggaggcgga ggatccgagg tgaagctgca ggaaagcgga 540
cctggactgg tcgcccctag ccagagcctg agcgtgacct gtaccgtgag cggagtgagc 600
ctgcccgatt acggcgtgtc ctggatcagg cagcccccca ggaagggact ggaatggctg 660
ggcgtcatct ggggctccga gacaacctac tacaacagcg ccctcaagtc caggctcacc 720
attatcaagg acaatagcaa gagccaggtg ttcctgaaga tgaacagcct gcagaccgac 780
gacacagcca tttattactg cgccaagcac tattattacg gcggcagcta cgccatggac 840
tattggggcc agggaacaag cgtgaccgtc agcagcacca caacccctgc ccccagacct 900
cccacacccg cccctaccat cgctagccag cctctgagcc tgaggcccga ggcttgcaga 960
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<210> 52
<211> 1830
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 52
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<211> 1620
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成多核苷酸
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ggcagcggcg gcggaggctc cggaggcgga ggatccgagg tgaagctgca ggaaagcgga 840
cctggactgg tcgcccctag ccagagcctg agcgtgacct gtaccgtgag cggagtgagc 900
ctgcccgatt acggcgtgtc ctggatcagg cagcccccca ggaagggact ggaatggctg 960
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gatgacgacg ataaggacta taaggacgac gacgataagg attataaaga cgatgacgac 1260
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<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 60
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggattaca aggatgacga cgataaggac tataaggacg acgacgataa ggattataaa 120
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<210> 61
<211> 1524
<212> DNA
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<220>
<223> 合成多核苷酸
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<212> DNA
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<223> 合成多核苷酸
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<212> DNA
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<220>
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ctgagcgcta gcctgggcga tagagtgacc atcagctgca gagccagcca ggacatcagc 240
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ggcagcggcg gcggaggctc cggaggcgga ggatccgagg tgaagctgca ggaaagcgga 540
cctggactgg tcgcccctag ccagagcctg agcgtgacct gtaccgtgag cggagtgagc 600
ctgcccgatt acggcgtgtc ctggatcagg cagcccccca ggaagggact ggaatggctg 660
ggcgtcatct ggggctccga gacaacctac tacaacagcg ccctcaagtc caggctcacc 720
attatcaagg acaatagcaa gagccaggtg ttcctgaaga tgaacagcct gcagaccgac 780
gacacagcca tttattactg cgccaagcac tattattacg gcggcagcta cgccatggac 840
tattggggcc agggaacaag cgtgaccgtc agcagcacca caacccctgc ccccagacct 900
cccacacccg cccctaccat cgctagccag cctctgagcc tgaggcccga ggcttgcaga 960
cctgctgctg gaggcgccgt gcacaccaga ggactggatt tcgcctgcga cggcggcacc 1020
gtgctgctgc tgctgttcgt gatctccatc accaccatca tcgtcatctt tctgaacaga 1080
aggaggagaa gggagaggag ggatctgttc accgagagct gggacaccca gaaggccccc 1140
aacaactata gaagccccat cagcaccagc cagcccacca accagagcat ggacgacacc 1200
agagaggaca tctacgtgaa ctaccccacc ttcagcagaa gacccaagac cagagtgctg 1260
agaaagagaa gagactctct gtctctgagc acccaaagaa cacaaggccc cgagagcgcc 1320
agaaatctgg agtacgtgag cgtgagcccc accaacaaca ccgtgtacgc cagcgtgacc 1380
cacagcaaca gagagaccga gatctggacc cctagagaga acgacaccat caccatctac 1440
agcaccatca accacagcaa ggagagcaag cccacattct ctagagccac cgctctggat 1500
aacgtggtgt aa 1512
<210> 70
<211> 1329
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 70
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggattaca aggatgacga cgataaggac tataaggacg acgacgataa ggattataaa 120
gacgatgacg acaaaggtgg aggcggttcg gacatccaga tgacccagac caccagcagc 180
ctgagcgcta gcctgggcga tagagtgacc atcagctgca gagccagcca ggacatcagc 240
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acctccagac tgcatagcgg cgtgcctagc aggttttccg gcagcggcag cggaaccgac 360
tactccctga ccatcagcaa cctggagcag gaggacatcg ctacctactt ttgtcagcag 420
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attatcaagg acaatagcaa gagccaggtg ttcctgaaga tgaacagcct gcagaccgac 780
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tattggggcc agggaacaag cgtgaccgtc agcagcacca caacccctgc ccccagacct 900
cccacacccg cccctaccat cgctagccag cctctgagcc tgaggcccga ggcttgcaga 960
cctgctgctg gaggcgccgt gcacaccaga ggactggatt tcgcctgcga ccctttcttc 1020
ttctgctgct tcatcgccgt ggccatgggc attcgtttca tcatcatggt ggccctgaga 1080
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gtggtgtaa 1329
<210> 71
<211> 1485
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 71
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgggtggag gcggttcgga agtgcagctg gtgcagagcg gagcagaagt gaagaagccc 120
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<210> 72
<211> 1557
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 72
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggattaca aggatgacga cgataaggac tataaggacg acgacgataa ggattataaa 120
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<210> 73
<211> 2433
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 73
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<210> 74
<211> 1629
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 74
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggattaca aggatgacga cgataaggac tataaggacg acgacgataa ggattataaa 120
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<210> 75
<211> 1446
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 75
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 76
tggaggagga aaaggaagga gaagcagtcc gagacatccc ccaaagagtt tttaaccatt 60
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gacgacgata aggactataa ggacgacgac gataaggatt ataaagacga tgacgacaaa 1380
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<210> 77
<211> 1533
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 77
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggattaca aggatgacga cgataaggac tataaggacg acgacgataa ggattataaa 120
gacgatgacg acaaaggtgg aggcggttcg gaagtgcagc tggtgcagag cggagcagaa 180
gtgaagaagc ccggaagcag cgtgaaggtg tcttgcaagg ccagcggcta caccatcacc 240
gacagcaaca tccattgggt ccggcaggct ccaggacagt ctctggagtg gatcggctac 300
atctacccct acaacggcgg caccgactac aaccagaagt tcaagaaccg ggccaccctg 360
accgtggata accccaccaa caccgcctac atggagctga gcagcctgag aagcgaggac 420
accgccttct actattgcgt gaacggcaac ccttggctgg cctattgggg acagggaaca 480
ctggtgaccg tgtcctctgg cggcggaggc agcggcggcg gaggctccgg aggcggagga 540
tccgacatcc agctgaccca gtctcctagc accctgagcg ctagcgtggg agatagagtg 600
accatcactt gcagagccag cgagagcctg gacaactacg gcatccggtt cctgacttgg 660
ttccagcaga aacccggcaa ggcccctaaa ctgctgatgt acgccgcctc taaccaggga 720
agcggagtgc ctagcagatt cagcggcagc ggaagcggaa ccgagttcac cctgaccatc 780
agctctctgc agccagacga cttcgccacc tactactgcc agcagaccaa ggaggtgcct 840
tggagcttcg gccagggaac caaggtggaa gtgaagcgga cagtgaccac aacccctgcc 900
cccagacctc ccacacccgc ccctaccatc gctagccagc ctctgagcct gaggcccgag 960
gcttgcagac ctgctgctgg aggcgccgtg cacaccagag gactggattt cgcctgcgac 1020
ggcggcaccg tgctgctgct gctgttcgtg atctccatca ccaccatcat cgtcatcttt 1080
ctgaacagaa ggaggagaag ggagaggagg gatctgttca ccgagagctg ggacacccag 1140
aaggccccca acaactatag aagccccatc agcaccagcc agcccaccaa ccagagcatg 1200
gacgacacca gagaggacat ctacgtgaac taccccacct tcagcagaag acccaagacc 1260
agagtgtggt ttctgaagag agagaggcaa gaggagtaca tcgaggagaa gaagagggtg 1320
gacatctgca gagagacccc caacatctgc ccccattccg gcgagaacac cgagtacgac 1380
accatccccc acaccaacag aaccattctg aaggaggacc ccgccaacac cgtgtacagc 1440
accgtggaga tccccaagaa gatggagaat ccccactctc tgctgaccat gcccgacacc 1500
cccagactgt tcgcctatga gaatgttatc taa 1533
<210> 78
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 78
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggattaca aggatgacga cgataaggac tataaggacg acgacgataa ggattataaa 120
gacgatgacg acaaaggtgg aggcggttcg gaagtgcagc tggtgcagag cggagcagaa 180
gtgaagaagc ccggaagcag cgtgaaggtg tcttgcaagg ccagcggcta caccatcacc 240
gacagcaaca tccattgggt ccggcaggct ccaggacagt ctctggagtg gatcggctac 300
atctacccct acaacggcgg caccgactac aaccagaagt tcaagaaccg ggccaccctg 360
accgtggata accccaccaa caccgcctac atggagctga gcagcctgag aagcgaggac 420
accgccttct actattgcgt gaacggcaac ccttggctgg cctattgggg acagggaaca 480
ctggtgaccg tgtcctctgg cggcggaggc agcggcggcg gaggctccgg aggcggagga 540
tccgacatcc agctgaccca gtctcctagc accctgagcg ctagcgtggg agatagagtg 600
accatcactt gcagagccag cgagagcctg gacaactacg gcatccggtt cctgacttgg 660
ttccagcaga aacccggcaa ggcccctaaa ctgctgatgt acgccgcctc taaccaggga 720
agcggagtgc ctagcagatt cagcggcagc ggaagcggaa ccgagttcac cctgaccatc 780
agctctctgc agccagacga cttcgccacc tactactgcc agcagaccaa ggaggtgcct 840
tggagcttcg gccagggaac caaggtggaa gtgaagcgga cagtgaccac aacccctgcc 900
cccagacctc ccacacccgc ccctaccatc gctagccagc ctctgagcct gaggcccgag 960
gcttgcagac ctgctgctgg aggcgccgtg cacaccagag gactggattt cgcctgcgac 1020
cctttcttct tctgctgctt catcgccgtg gccatgggca ttcgtttcat catcatggtg 1080
gcctggtttc tgaagagaga gaggcaagag gagtacatcg aggagaagaa gagggtggac 1140
atctgcagag agacccccaa catctgcccc cattccggcg agaacaccga gtacgacacc 1200
atcccccaca ccaacagaac cattctgaag gaggaccccg ccaacaccgt gtacagcacc 1260
gtggagatcc ccaagaagat ggagaatccc cactctctgc tgaccatgcc cgacaccccc 1320
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<210> 79
<211> 1287
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 79
tggtttctga agagagagag gcaagaggag tacatcgagg agaagaagag ggtggacatc 60
tgcagagaga cccccaacat ctgcccccat tccggcgaga acaccgagta cgacaccatc 120
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ctgttcgcct atgagaatgt tatccctttc ttcttctgct gcttcatcgc cgtggccatg 300
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agcggagcag aagtgaagaa gcccggaagc agcgtgaagg tgtcttgcaa ggccagcggc 540
tacaccatca ccgacagcaa catccattgg gtccggcagg ctccaggaca gtctctggag 600
tggatcggct acatctaccc ctacaacggc ggcaccgact acaaccagaa gttcaagaac 660
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accctgacca tcagctctct gcagccagac gacttcgcca cctactactg ccagcagacc 1140
aaggaggtgc cttggagctt cggccaggga accaaggtgg aagtgaagcg gacagtgggt 1200
ggaggcggtt cggattacaa ggatgacgac gataaggact ataaggacga cgacgataag 1260
gattataaag acgatgacga caaataa 1287
<210> 80
<211> 361
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 80
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Asp Tyr Lys
20 25 30
Asp Asp Asp Asp Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser
50 55 60
Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser
65 70 75 80
Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu
85 90 95
Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
100 105 110
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu
115 120 125
Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu
130 135 140
Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu
165 170 175
Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val
180 185 190
Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp
195 200 205
Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp
210 215 220
Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr
225 230 235 240
Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser
245 250 255
Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr
260 265 270
Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val
275 280 285
Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala
290 295 300
Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg
305 310 315 320
Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys
325 330 335
Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu
340 345 350
Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
355 360
<210> 81
<211> 491
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 81
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln
20 25 30
Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser
35 40 45
Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln
50 55 60
Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu
65 70 75 80
His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
85 90 95
Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr
100 105 110
Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr
115 120 125
Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val
145 150 155 160
Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser
165 170 175
Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly
180 185 190
Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn
195 200 205
Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser
210 215 220
Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile
225 230 235 240
Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp
245 250 255
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro
260 265 270
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
275 280 285
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
290 295 300
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
305 310 315 320
Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
325 330 335
Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
340 345 350
Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg
355 360 365
Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser
370 375 380
Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
385 390 395 400
Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
405 410 415
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn
420 425 430
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
435 440 445
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
450 455 460
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
465 470 475 480
Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490
<210> 82
<211> 515
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 82
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Asp Tyr Lys
20 25 30
Asp Asp Asp Asp Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser
50 55 60
Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser
65 70 75 80
Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu
85 90 95
Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
100 105 110
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu
115 120 125
Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu
130 135 140
Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu
165 170 175
Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val
180 185 190
Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp
195 200 205
Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp
210 215 220
Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr
225 230 235 240
Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser
245 250 255
Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr
260 265 270
Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val
275 280 285
Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala
290 295 300
Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg
305 310 315 320
Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys
325 330 335
Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu
340 345 350
Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu
355 360 365
Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln
370 375 380
Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly
385 390 395 400
Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
405 410 415
Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
420 425 430
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
435 440 445
Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu
450 455 460
Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys
465 470 475 480
Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu
485 490 495
Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu
500 505 510
Pro Pro Arg
515
<210> 83
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 83
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Asp Tyr Lys
20 25 30
Asp Asp Asp Asp Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser
50 55 60
Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser
65 70 75 80
Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu
85 90 95
Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
100 105 110
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu
115 120 125
Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu
130 135 140
Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu
165 170 175
Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val
180 185 190
Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp
195 200 205
Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp
210 215 220
Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr
225 230 235 240
Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser
245 250 255
Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr
260 265 270
Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val
275 280 285
Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala
290 295 300
Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg
305 310 315 320
Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys
325 330 335
Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu
340 345 350
Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu
355 360 365
Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln
370 375 380
Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly
385 390 395 400
Cys Glu Leu Arg Leu Lys Ile Gln Val Arg Lys Ala Ala Ile Thr Ser
405 410 415
Tyr Glu Lys Ser Asp Gly Val Tyr Thr Gly Leu Ser Thr Arg Asn Gln
420 425 430
Glu Thr Tyr Glu Thr Leu Lys His Glu Lys Pro Pro Gln
435 440 445
<210> 84
<211> 629
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 84
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Asp Tyr Lys
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Asp Asp Asp Asp Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser
50 55 60
Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser
65 70 75 80
Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu
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Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
100 105 110
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu
115 120 125
Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu
130 135 140
Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu
165 170 175
Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val
180 185 190
Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp
195 200 205
Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp
210 215 220
Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr
225 230 235 240
Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser
245 250 255
Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr
260 265 270
Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val
275 280 285
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Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg
305 310 315 320
Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys
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Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu
340 345 350
Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu
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Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln
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Glu Thr Tyr Glu Thr Leu Lys His Glu Lys Pro Pro Gln Gly Ser Gly
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Gln Cys Tyr Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala
485 490 495
Gly Ile His Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys
500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu
545 550 555 560
Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp
565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
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Phe Ile Asn Thr Ser
625
<210> 85
<211> 807
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 85
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Asp Tyr Lys
20 25 30
Asp Asp Asp Asp Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser
50 55 60
Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser
65 70 75 80
Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu
85 90 95
Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
100 105 110
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu
115 120 125
Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu
130 135 140
Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu
165 170 175
Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val
180 185 190
Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp
195 200 205
Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp
210 215 220
Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr
225 230 235 240
Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser
245 250 255
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260 265 270
Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val
275 280 285
Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala
290 295 300
Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg
305 310 315 320
Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys
325 330 335
Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu
340 345 350
Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu
355 360 365
Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln
370 375 380
Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly
385 390 395 400
Cys Glu Leu Arg Leu Lys Ile Gln Val Arg Lys Ala Ala Ile Thr Ser
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Tyr Glu Lys Ser Asp Gly Val Tyr Thr Gly Leu Ser Thr Arg Asn Gln
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450 455 460
Pro Gly Pro Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile
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Pro Pro Gly His Arg Ser Gln Ala Pro Ser His Arg Pro Pro Pro Pro
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Gly His Arg Val Gln His Gln Pro Gln Lys Arg Pro Pro Ala Pro Ser
450 455 460
Gly Thr Gln Val His Gln Gln Lys Gly Pro Pro Leu Pro Arg Pro Arg
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<220>
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Asp Asp Asp Asp Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly
35 40 45
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 94
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Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
165 170 175
Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly
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195 200 205
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225 230 235 240
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Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
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420
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 95
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<220>
<223> 合成多肽
<400> 96
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<220>
<223> 合成多肽
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<220>
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<400> 99
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180 185 190
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Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys
325 330 335
Asp Gly Gly Thr Val Leu Leu Leu Leu Phe Val Ile Ser Ile Thr Thr
340 345 350
Ile Ile Val Ile Phe Leu Asn Arg Arg Arg Arg Arg Glu Arg Arg Asp
355 360 365
Leu Phe Thr Glu Ser Trp Asp Thr Gln Lys Ala Pro Asn Asn Tyr Arg
370 375 380
Ser Pro Ile Ser Thr Ser Gln Pro Thr Asn Gln Ser Met Asp Asp Thr
385 390 395 400
Arg Glu Asp Ile Tyr Val Asn Tyr Pro Thr Phe Ser Arg Arg Pro Lys
405 410 415
Thr Arg Val Lys Arg Lys Lys Gln Arg Ser Arg Arg Asn Asp Glu Glu
420 425 430
Leu Glu Thr Arg Ala His Arg Val Ala Thr Glu Glu Arg Gly Arg Lys
435 440 445
Pro His Gln Ile Pro Ala Ser Thr Pro Gln Asn Pro Ala Thr Ser Gln
450 455 460
His Pro Pro Pro Pro Pro Gly His Arg Ser Gln Ala Pro Ser His Arg
465 470 475 480
Pro Pro Pro Pro Gly His Arg Val Gln His Gln Pro Gln Lys Arg Pro
485 490 495
Pro Ala Pro Ser Gly Thr Gln Val His Gln Gln Lys Gly Pro Pro Leu
500 505 510
Pro Arg Pro Arg Val Gln Pro Lys Pro Pro His Gly Ala Ala Glu Asn
515 520 525
Ser Leu Ser Pro Ser Ser Asn
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<220>
<223> 合成多肽
<400> 101
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Asp Tyr Lys
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Asp Asp Asp Asp Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser
50 55 60
Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser
65 70 75 80
Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu
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130 135 140
Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu
165 170 175
Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val
180 185 190
Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp
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Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser
245 250 255
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260 265 270
Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val
275 280 285
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305 310 315 320
Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys
325 330 335
Asp Pro Phe Phe Phe Cys Cys Phe Ile Ala Val Ala Met Gly Ile Arg
340 345 350
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370 375 380
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435 440 445
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
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1 5 10 15
Arg Val Asp Ile Cys Arg Glu Thr Pro Asn Ile Cys Pro His Ser Gly
20 25 30
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35 40 45
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100 105 110
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115 120 125
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
130 135 140
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165 170 175
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195 200 205
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Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr
245 250 255
Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
260 265 270
Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val
275 280 285
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Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly
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Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn
325 330 335
Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser
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Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp
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Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
420 425
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 103
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Asp Tyr Lys
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Asp Asp Asp Asp Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly
35 40 45
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Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser
65 70 75 80
Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu
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Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
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Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu
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<220>
<223> 合成多肽
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His Ala Ala Arg Pro Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Asp Tyr Lys
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Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu
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Ile Ile Val Ile Phe Leu Asn Arg Arg Arg Arg Arg Glu Arg Arg Asp
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 105
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu
165 170 175
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Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys
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340 345 350
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Ser Arg Ala Thr Ala Leu Asp Asn Val Val
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
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275 280 285
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Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 107
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Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu
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Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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340 345 350
Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg
355 360 365
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Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
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450 455 460
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485 490 495
Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met
500 505 510
Gln Ala Leu Pro Pro Arg
515
<210> 108
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 108
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1 5 10 15
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20 25 30
Asp Asp Asp Asp Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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145 150 155 160
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165 170 175
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu
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Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu
195 200 205
Ser Leu Asp Asn Tyr Gly Ile Arg Phe Leu Thr Trp Phe Gln Gln Lys
210 215 220
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225 230 235 240
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe
245 250 255
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
260 265 270
Cys Gln Gln Thr Lys Glu Val Pro Trp Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys
275 280 285
Val Glu Val Lys Arg Thr Val Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro
290 295 300
Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
305 310 315 320
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
325 330 335
Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly
340 345 350
Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg
355 360 365
Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln
370 375 380
Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu
385 390 395 400
Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Leu Lys Ile Gln Val Arg Lys Ala Ala
405 410 415
Ile Thr Ser Tyr Glu Lys Ser Asp Gly Val Tyr Thr Gly Leu Ser Thr
420 425 430
Arg Asn Gln Glu Thr Tyr Glu Thr Leu Lys His Glu Lys Pro Pro Gln
435 440 445
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
450 455 460
Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser
465 470 475 480
Ile Ser Ile Gln Cys Tyr Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu
485 490 495
Thr Glu Ala Gly Ile His Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly
500 505 510
Leu Pro Lys Thr Glu Ala Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys
515 520 525
Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr
530 535 540
Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys
545 550 555 560
Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser
565 570 575
Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu
580 585 590
Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu
595 600 605
Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile
610 615 620
Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Gly Ser Gly Arg Ala Glu Gly Arg
625 630 635 640
Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met
645 650 655
Glu Arg Ile Val Ile Cys Leu Met Val Ile Phe Leu Gly Thr Leu Val
660 665 670
His Lys Ser Ser Ser Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg
675 680 685
Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu
690 695 700
Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu
705 710 715 720
Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn
725 730 735
Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys
740 745 750
Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu
755 760 765
Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe
770 775 780
Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu
785 790 795 800
Ser Ser Arg Thr His Gly Ser Glu Asp Ser
805 810
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<211> 542
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 109
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Asp Tyr Lys
20 25 30
Asp Asp Asp Asp Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro
50 55 60
Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Ile Thr
65 70 75 80
Asp Ser Asn Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ser Leu Glu
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Tyr Cys Val Asn Gly Asn Pro Trp Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
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Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
165 170 175
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180 185 190
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu
195 200 205
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210 215 220
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Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe
245 250 255
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
260 265 270
Cys Gln Gln Thr Lys Glu Val Pro Trp Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys
275 280 285
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290 295 300
Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
305 310 315 320
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
325 330 335
Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly
340 345 350
Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn Cys Arg Asn
355 360 365
Thr Gly Pro Trp Leu Lys Lys Val Leu Lys Cys Asn Thr Pro Asp Pro
370 375 380
Ser Lys Phe Phe Ser Gln Leu Ser Ser Glu His Gly Gly Asp Val Gln
385 390 395 400
Lys Trp Leu Ser Ser Pro Phe Pro Ser Ser Ser Phe Ser Pro Gly Gly
405 410 415
Leu Ala Pro Glu Ile Ser Pro Leu Glu Val Leu Glu Arg Asp Lys Val
420 425 430
Thr Gln Leu Leu Pro Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu Ser Leu Gln Glu
435 440 445
Leu Gln Gly Gln Asp Pro Thr His Leu Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys
450 455 460
Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr
465 470 475 480
Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly
485 490 495
Gly Cys Glu Leu Arg Leu Lys Ile Gln Val Arg Lys Ala Ala Ile Thr
500 505 510
Ser Tyr Glu Lys Ser Asp Gly Val Tyr Thr Gly Leu Ser Thr Arg Asn
515 520 525
Gln Glu Thr Tyr Glu Thr Leu Lys His Glu Lys Pro Pro Gln
530 535 540
<210> 110
<211> 481
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 110
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Asp Tyr Lys
20 25 30
Asp Asp Asp Asp Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro
50 55 60
Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Ile Thr
65 70 75 80
Asp Ser Asn Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ser Leu Glu
85 90 95
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Gln
100 105 110
Lys Phe Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Asn Pro Thr Asn Thr
115 120 125
Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Phe Tyr
130 135 140
Tyr Cys Val Asn Gly Asn Pro Trp Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
145 150 155 160
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
165 170 175
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu
180 185 190
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu
195 200 205
Ser Leu Asp Asn Tyr Gly Ile Arg Phe Leu Thr Trp Phe Gln Gln Lys
210 215 220
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Met Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly
225 230 235 240
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe
245 250 255
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
260 265 270
Cys Gln Gln Thr Lys Glu Val Pro Trp Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys
275 280 285
Val Glu Val Lys Arg Thr Val Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro
290 295 300
Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
305 310 315 320
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
325 330 335
Phe Ala Cys Asp Pro Phe Phe Phe Cys Cys Phe Ile Ala Val Ala Met
340 345 350
Gly Ile Arg Phe Ile Ile Met Val Ala Trp Arg Arg Lys Arg Lys Glu
355 360 365
Lys Gln Ser Glu Thr Ser Pro Lys Glu Phe Leu Thr Ile Tyr Glu Asp
370 375 380
Val Lys Asp Leu Lys Thr Arg Arg Asn His Glu Gln Glu Gln Thr Phe
385 390 395 400
Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ile Tyr Ser Met Ile Gln Ser Gln Ser Ser
405 410 415
Ala Pro Thr Ser Gln Glu Pro Ala Tyr Thr Leu Tyr Ser Leu Ile Gln
420 425 430
Pro Ser Arg Lys Ser Gly Ser Arg Lys Arg Asn His Ser Pro Ser Phe
435 440 445
Asn Ser Thr Ile Tyr Glu Val Ile Gly Lys Ser Gln Pro Lys Ala Gln
450 455 460
Asn Pro Ala Arg Leu Ser Arg Lys Glu Leu Glu Asn Phe Asp Val Tyr
465 470 475 480
Ser
<210> 111
<211> 460
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 111
Trp Arg Arg Lys Arg Lys Glu Lys Gln Ser Glu Thr Ser Pro Lys Glu
1 5 10 15
Phe Leu Thr Ile Tyr Glu Asp Val Lys Asp Leu Lys Thr Arg Arg Asn
20 25 30
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35 40 45
Met Ile Gln Ser Gln Ser Ser Ala Pro Thr Ser Gln Glu Pro Ala Tyr
50 55 60
Thr Leu Tyr Ser Leu Ile Gln Pro Ser Arg Lys Ser Gly Ser Arg Lys
65 70 75 80
Arg Asn His Ser Pro Ser Phe Asn Ser Thr Ile Tyr Glu Val Ile Gly
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Lys Ser Gln Pro Lys Ala Gln Asn Pro Ala Arg Leu Ser Arg Lys Glu
100 105 110
Leu Glu Asn Phe Asp Val Tyr Ser Pro Phe Phe Phe Cys Cys Phe Ile
115 120 125
Ala Val Ala Met Gly Ile Arg Phe Ile Ile Met Val Ala Thr Thr Thr
130 135 140
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
145 150 155 160
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
165 170 175
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Glu Val Gln Leu Val Gln
180 185 190
Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys
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275 280 285
Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln
305 310 315 320
Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val
325 330 335
Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Leu Asp Asn Tyr Gly Ile Arg
340 345 350
Phe Leu Thr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
355 360 365
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Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Lys Glu Val Pro
405 410 415
Trp Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Val Lys Arg Thr Val Gly
420 425 430
Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Asp Tyr Lys Asp
435 440 445
Asp Asp Asp Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
450 455 460
<210> 112
<211> 510
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 112
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Asp Tyr Lys
20 25 30
Asp Asp Asp Asp Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro
50 55 60
Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Ile Thr
65 70 75 80
Asp Ser Asn Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ser Leu Glu
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Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Gln
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Lys Phe Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Asn Pro Thr Asn Thr
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130 135 140
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Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
165 170 175
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu
180 185 190
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu
195 200 205
Ser Leu Asp Asn Tyr Gly Ile Arg Phe Leu Thr Trp Phe Gln Gln Lys
210 215 220
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225 230 235 240
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe
245 250 255
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Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
305 310 315 320
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
325 330 335
Phe Ala Cys Asp Gly Gly Thr Val Leu Leu Leu Leu Phe Val Ile Ser
340 345 350
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355 360 365
Arg Arg Asp Leu Phe Thr Glu Ser Trp Asp Thr Gln Lys Ala Pro Asn
370 375 380
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405 410 415
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420 425 430
Tyr Ile Glu Glu Lys Lys Arg Val Asp Ile Cys Arg Glu Thr Pro Asn
435 440 445
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450 455 460
Thr Asn Arg Thr Ile Leu Lys Glu Asp Pro Ala Asn Thr Val Tyr Ser
465 470 475 480
Thr Val Glu Ile Pro Lys Lys Met Glu Asn Pro His Ser Leu Leu Thr
485 490 495
Met Pro Asp Thr Pro Arg Leu Phe Ala Tyr Glu Asn Val Ile
500 505 510
<210> 113
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 113
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
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His Ala Ala Arg Pro Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Asp Tyr Lys
20 25 30
Asp Asp Asp Asp Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro
50 55 60
Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Ile Thr
65 70 75 80
Asp Ser Asn Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ser Leu Glu
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Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Gln
100 105 110
Lys Phe Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Asn Pro Thr Asn Thr
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Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Phe Tyr
130 135 140
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Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu
180 185 190
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu
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Ser Leu Asp Asn Tyr Gly Ile Arg Phe Leu Thr Trp Phe Gln Gln Lys
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Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe
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435 440 445
Ile
<210> 114
<211> 428
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 114
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275 280 285
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370 375 380
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Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Asp Tyr Lys Asp
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<211> 63
<212> DNA
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<220>
<223> 合成多核苷酸
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<210> 116
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 116
ggcggcaccg tgctgctgct gctgttcgtg atctccatca ccaccatcat cgtcatcttt 60
ctg 63
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<220>
<223> 合成多肽
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20
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<220>
<223> 合成多肽
<400> 118
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Ile Val Ile Phe Leu
20
<210> 119
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 119
ggaggcggtt cg 12
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<211> 4
<212> PRT
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<220>
<223> 合成多肽
<400> 120
Gly Gly Gly Ser
1
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 121
gattacaagg atgacgacga taaggactat aaggacgacg acgataagga ttataaagac 60
gatgacgaca aaggt 75
<210> 122
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<220>
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<400> 122
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
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Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly
20 25
<210> 123
<211> 370
<212> PRT
<213> 智人
<400> 123
Met Leu Gly Gln Val Val Thr Leu Ile Leu Leu Leu Leu Leu Lys Val
1 5 10 15
Tyr Gln Gly Lys Gly Cys Gln Gly Ser Ala Asp His Val Val Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Val Pro Leu Gln Leu Gln Pro Asn Ser Ile Gln Thr Lys Val
35 40 45
Asp Ser Ile Ala Trp Lys Lys Leu Leu Pro Ser Gln Asn Gly Phe His
50 55 60
His Ile Leu Lys Trp Glu Asn Gly Ser Leu Pro Ser Asn Thr Ser Asn
65 70 75 80
Asp Arg Phe Ser Phe Ile Val Lys Asn Leu Ser Leu Leu Ile Lys Ala
85 90 95
Ala Gln Gln Gln Asp Ser Gly Leu Tyr Cys Leu Glu Val Thr Ser Ile
100 105 110
Ser Gly Lys Val Gln Thr Ala Thr Phe Gln Val Phe Val Phe Glu Ser
115 120 125
Leu Leu Pro Asp Lys Val Glu Lys Pro Arg Leu Gln Gly Gln Gly Lys
130 135 140
Ile Leu Asp Arg Gly Arg Cys Gln Val Ala Leu Ser Cys Leu Val Ser
145 150 155 160
Arg Asp Gly Asn Val Ser Tyr Ala Trp Tyr Arg Gly Ser Lys Leu Ile
165 170 175
Gln Thr Ala Gly Asn Leu Thr Tyr Leu Asp Glu Glu Val Asp Ile Asn
180 185 190
Gly Thr His Thr Tyr Thr Cys Asn Val Ser Asn Pro Val Ser Trp Glu
195 200 205
Ser His Thr Leu Asn Leu Thr Gln Asp Cys Gln Asn Ala His Gln Glu
210 215 220
Phe Arg Phe Trp Pro Phe Leu Val Ile Ile Val Ile Leu Ser Ala Leu
225 230 235 240
Phe Leu Gly Thr Leu Ala Cys Phe Cys Val Trp Arg Arg Lys Arg Lys
245 250 255
Glu Lys Gln Ser Glu Thr Ser Pro Lys Glu Phe Leu Thr Ile Tyr Glu
260 265 270
Asp Val Lys Asp Leu Lys Thr Arg Arg Asn His Glu Gln Glu Gln Thr
275 280 285
Phe Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ile Tyr Ser Met Ile Gln Ser Gln Ser
290 295 300
Ser Ala Pro Thr Ser Gln Glu Pro Ala Tyr Thr Leu Tyr Ser Leu Ile
305 310 315 320
Gln Pro Ser Arg Lys Ser Gly Ser Arg Lys Arg Asn His Ser Pro Ser
325 330 335
Phe Asn Ser Thr Ile Tyr Glu Val Ile Gly Lys Ser Gln Pro Lys Ala
340 345 350
Gln Asn Pro Ala Arg Leu Ser Arg Lys Glu Leu Glu Asn Phe Asp Val
355 360 365
Tyr Ser
370
<210> 124
<211> 335
<212> PRT
<213> 智人
<400> 124
Met Ala Gly Ser Pro Thr Cys Leu Thr Leu Ile Tyr Ile Leu Trp Gln
1 5 10 15
Leu Thr Gly Ser Ala Ala Ser Gly Pro Val Lys Glu Leu Val Gly Ser
20 25 30
Val Gly Gly Ala Val Thr Phe Pro Leu Lys Ser Lys Val Lys Gln Val
35 40 45
Asp Ser Ile Val Trp Thr Phe Asn Thr Thr Pro Leu Val Thr Ile Gln
50 55 60
Pro Glu Gly Gly Thr Ile Ile Val Thr Gln Asn Arg Asn Arg Glu Arg
65 70 75 80
Val Asp Phe Pro Asp Gly Gly Tyr Ser Leu Lys Leu Ser Lys Leu Lys
85 90 95
Lys Asn Asp Ser Gly Ile Tyr Tyr Val Gly Ile Tyr Ser Ser Ser Leu
100 105 110
Gln Gln Pro Ser Thr Gln Glu Tyr Val Leu His Val Tyr Glu His Leu
115 120 125
Ser Lys Pro Lys Val Thr Met Gly Leu Gln Ser Asn Lys Asn Gly Thr
130 135 140
Cys Val Thr Asn Leu Thr Cys Cys Met Glu His Gly Glu Glu Asp Val
145 150 155 160
Ile Tyr Thr Trp Lys Ala Leu Gly Gln Ala Ala Asn Glu Ser His Asn
165 170 175
Gly Ser Ile Leu Pro Ile Ser Trp Arg Trp Gly Glu Ser Asp Met Thr
180 185 190
Phe Ile Cys Val Ala Arg Asn Pro Val Ser Arg Asn Phe Ser Ser Pro
195 200 205
Ile Leu Ala Arg Lys Leu Cys Glu Gly Ala Ala Asp Asp Pro Asp Ser
210 215 220
Ser Met Val Leu Leu Cys Leu Leu Leu Val Pro Leu Leu Leu Ser Leu
225 230 235 240
Phe Val Leu Gly Leu Phe Leu Trp Phe Leu Lys Arg Glu Arg Gln Glu
245 250 255
Glu Tyr Ile Glu Glu Lys Lys Arg Val Asp Ile Cys Arg Glu Thr Pro
260 265 270
Asn Ile Cys Pro His Ser Gly Glu Asn Thr Glu Tyr Asp Thr Ile Pro
275 280 285
His Thr Asn Arg Thr Ile Leu Lys Glu Asp Pro Ala Asn Thr Val Tyr
290 295 300
Ser Thr Val Glu Ile Pro Lys Lys Met Glu Asn Pro His Ser Leu Leu
305 310 315 320
Thr Met Pro Asp Thr Pro Arg Leu Phe Ala Tyr Glu Asn Val Ile
325 330 335
<210> 125
<211> 351
<212> PRT
<213> 智人
<400> 125
Met Ser Phe Pro Cys Lys Phe Val Ala Ser Phe Leu Leu Ile Phe Asn
1 5 10 15
Val Ser Ser Lys Gly Ala Val Ser Lys Glu Ile Thr Asn Ala Leu Glu
20 25 30
Thr Trp Gly Ala Leu Gly Gln Asp Ile Asn Leu Asp Ile Pro Ser Phe
35 40 45
Gln Met Ser Asp Asp Ile Asp Asp Ile Lys Trp Glu Lys Thr Ser Asp
50 55 60
Lys Lys Lys Ile Ala Gln Phe Arg Lys Glu Lys Glu Thr Phe Lys Glu
65 70 75 80
Lys Asp Thr Tyr Lys Leu Phe Lys Asn Gly Thr Leu Lys Ile Lys His
85 90 95
Leu Lys Thr Asp Asp Gln Asp Ile Tyr Lys Val Ser Ile Tyr Asp Thr
100 105 110
Lys Gly Lys Asn Val Leu Glu Lys Ile Phe Asp Leu Lys Ile Gln Glu
115 120 125
Arg Val Ser Lys Pro Lys Ile Ser Trp Thr Cys Ile Asn Thr Thr Leu
130 135 140
Thr Cys Glu Val Met Asn Gly Thr Asp Pro Glu Leu Asn Leu Tyr Gln
145 150 155 160
Asp Gly Lys His Leu Lys Leu Ser Gln Arg Val Ile Thr His Lys Trp
165 170 175
Thr Thr Ser Leu Ser Ala Lys Phe Lys Cys Thr Ala Gly Asn Lys Val
180 185 190
Ser Lys Glu Ser Ser Val Glu Pro Val Ser Cys Pro Glu Lys Gly Leu
195 200 205
Asp Ile Tyr Leu Ile Ile Gly Ile Cys Gly Gly Gly Ser Leu Leu Met
210 215 220
Val Phe Val Ala Leu Leu Val Phe Tyr Ile Thr Lys Arg Lys Lys Gln
225 230 235 240
Arg Ser Arg Arg Asn Asp Glu Glu Leu Glu Thr Arg Ala His Arg Val
245 250 255
Ala Thr Glu Glu Arg Gly Arg Lys Pro His Gln Ile Pro Ala Ser Thr
260 265 270
Pro Gln Asn Pro Ala Thr Ser Gln His Pro Pro Pro Pro Pro Gly His
275 280 285
Arg Ser Gln Ala Pro Ser His Arg Pro Pro Pro Pro Gly His Arg Val
290 295 300
Gln His Gln Pro Gln Lys Arg Pro Pro Ala Pro Ser Gly Thr Gln Val
305 310 315 320
His Gln Gln Lys Gly Pro Pro Leu Pro Arg Pro Arg Val Gln Pro Lys
325 330 335
Pro Pro His Gly Ala Ala Glu Asn Ser Leu Ser Pro Ser Ser Asn
340 345 350
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<211> 331
<212> PRT
<213> 智人
<400> 126
Met Leu Trp Leu Phe Gln Ser Leu Leu Phe Val Phe Cys Phe Gly Pro
1 5 10 15
Gly Asn Val Val Ser Gln Ser Ser Leu Thr Pro Leu Met Val Asn Gly
20 25 30
Ile Leu Gly Glu Ser Val Thr Leu Pro Leu Glu Phe Pro Ala Gly Glu
35 40 45
Lys Val Asn Phe Ile Thr Trp Leu Phe Asn Glu Thr Ser Leu Ala Phe
50 55 60
Ile Val Pro His Glu Thr Lys Ser Pro Glu Ile His Val Thr Asn Pro
65 70 75 80
Lys Gln Gly Lys Arg Leu Asn Phe Thr Gln Ser Tyr Ser Leu Gln Leu
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Ser Asn Leu Lys Met Glu Asp Thr Gly Ser Tyr Arg Ala Gln Ile Ser
100 105 110
Thr Lys Thr Ser Ala Lys Leu Ser Ser Tyr Thr Leu Arg Ile Leu Arg
115 120 125
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130 135 140
Met Thr Cys Glu Leu His Leu Thr Cys Ser Val Glu Asp Ala Asp Asp
145 150 155 160
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165 170 175
Pro Asn Leu Thr Val Ser Trp Asp Pro Arg Ile Ser Ser Glu Gln Asp
180 185 190
Tyr Thr Cys Ile Ala Glu Asn Ala Val Ser Asn Leu Ser Phe Ser Val
195 200 205
Ser Ala Gln Lys Leu Cys Glu Asp Val Lys Ile Gln Tyr Thr Asp Thr
210 215 220
Lys Met Ile Leu Phe Met Val Ser Gly Ile Cys Ile Val Phe Gly Phe
225 230 235 240
Ile Ile Leu Leu Leu Leu Val Leu Arg Lys Arg Arg Asp Ser Leu Ser
245 250 255
Leu Ser Thr Gln Arg Thr Gln Gly Pro Glu Ser Ala Arg Asn Leu Glu
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
Ile Thr Ile Tyr Ser Thr Ile Asn His Ser Lys Glu Ser Lys Pro Thr
305 310 315 320
Phe Ser Arg Ala Thr Ala Leu Asp Asn Val Val
325 330
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<211> 86
<212> PRT
<213> 智人
<400> 127
Met Ile Pro Ala Val Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val Glu Gln Ala
1 5 10 15
Ala Ala Leu Gly Glu Pro Gln Leu Cys Tyr Ile Leu Asp Ala Ile Leu
20 25 30
Phe Leu Tyr Gly Ile Val Leu Thr Leu Leu Tyr Cys Arg Leu Lys Ile
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His Glu Lys Pro Pro Gln
85
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<211> 163
<212> PRT
<213> 智人
<400> 128
Met Lys Trp Lys Ala Leu Phe Thr Ala Ala Ile Leu Gln Ala Gln Leu
1 5 10 15
Pro Ile Thr Glu Ala Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys
20 25 30
Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala
35 40 45
Leu Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
50 55 60
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
65 70 75 80
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
85 90 95
Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu
100 105 110
Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys
115 120 125
Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu
130 135 140
Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu
145 150 155 160
Pro Pro Arg
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<211> 255
<212> PRT
<213> 智人
<400> 129
Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu
1 5 10 15
Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro
20 25 30
Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys
35 40 45
Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile
50 55 60
Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser
65 70 75 80
Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly
85 90 95
Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu
100 105 110
Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln
115 120 125
Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys
130 135 140
Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro
145 150 155 160
Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala
165 170 175
Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu
180 185 190
Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu
195 200 205
Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
210 215 220
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
225 230 235 240
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
245 250 255
<210> 130
<211> 551
<212> PRT
<213> 智人
<400> 130
Met Ala Ala Pro Ala Leu Ser Trp Arg Leu Pro Leu Leu Ile Leu Leu
1 5 10 15
Leu Pro Leu Ala Thr Ser Trp Ala Ser Ala Ala Val Asn Gly Thr Ser
20 25 30
Gln Phe Thr Cys Phe Tyr Asn Ser Arg Ala Asn Ile Ser Cys Val Trp
35 40 45
Ser Gln Asp Gly Ala Leu Gln Asp Thr Ser Cys Gln Val His Ala Trp
50 55 60
Pro Asp Arg Arg Arg Trp Asn Gln Thr Cys Glu Leu Leu Pro Val Ser
65 70 75 80
Gln Ala Ser Trp Ala Cys Asn Leu Ile Leu Gly Ala Pro Asp Ser Gln
85 90 95
Lys Leu Thr Thr Val Asp Ile Val Thr Leu Arg Val Leu Cys Arg Glu
100 105 110
Gly Val Arg Trp Arg Val Met Ala Ile Gln Asp Phe Lys Pro Phe Glu
115 120 125
Asn Leu Arg Leu Met Ala Pro Ile Ser Leu Gln Val Val His Val Glu
130 135 140
Thr His Arg Cys Asn Ile Ser Trp Glu Ile Ser Gln Ala Ser His Tyr
145 150 155 160
Phe Glu Arg His Leu Glu Phe Glu Ala Arg Thr Leu Ser Pro Gly His
165 170 175
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180 185 190
Ile Cys Leu Glu Thr Leu Thr Pro Asp Thr Gln Tyr Glu Phe Gln Val
195 200 205
Arg Val Lys Pro Leu Gln Gly Glu Phe Thr Thr Trp Ser Pro Trp Ser
210 215 220
Gln Pro Leu Ala Phe Arg Thr Lys Pro Ala Ala Leu Gly Lys Asp Thr
225 230 235 240
Ile Pro Trp Leu Gly His Leu Leu Val Gly Leu Ser Gly Ala Phe Gly
245 250 255
Phe Ile Ile Leu Val Tyr Leu Leu Ile Asn Cys Arg Asn Thr Gly Pro
260 265 270
Trp Leu Lys Lys Val Leu Lys Cys Asn Thr Pro Asp Pro Ser Lys Phe
275 280 285
Phe Ser Gln Leu Ser Ser Glu His Gly Gly Asp Val Gln Lys Trp Leu
290 295 300
Ser Ser Pro Phe Pro Ser Ser Ser Phe Ser Pro Gly Gly Leu Ala Pro
305 310 315 320
Glu Ile Ser Pro Leu Glu Val Leu Glu Arg Asp Lys Val Thr Gln Leu
325 330 335
Leu Leu Gln Gln Asp Lys Val Pro Glu Pro Ala Ser Leu Ser Ser Asn
340 345 350
His Ser Leu Thr Ser Cys Phe Thr Asn Gln Gly Tyr Phe Phe Phe His
355 360 365
Leu Pro Asp Ala Leu Glu Ile Glu Ala Cys Gln Val Tyr Phe Thr Tyr
370 375 380
Asp Pro Tyr Ser Glu Glu Asp Pro Asp Glu Gly Val Ala Gly Ala Pro
385 390 395 400
Thr Gly Ser Ser Pro Gln Pro Leu Gln Pro Leu Ser Gly Glu Asp Asp
405 410 415
Ala Tyr Cys Thr Phe Pro Ser Arg Asp Asp Leu Leu Leu Phe Ser Pro
420 425 430
Ser Leu Leu Gly Gly Pro Ser Pro Pro Ser Thr Ala Pro Gly Gly Ser
435 440 445
Gly Ala Gly Glu Glu Arg Met Pro Pro Ser Leu Gln Glu Arg Val Pro
450 455 460
Arg Asp Trp Asp Pro Gln Pro Leu Gly Pro Pro Thr Pro Gly Val Pro
465 470 475 480
Asp Leu Val Asp Phe Gln Pro Pro Pro Glu Leu Val Leu Arg Glu Ala
485 490 495
Gly Glu Glu Val Pro Asp Ala Gly Pro Arg Glu Gly Val Ser Phe Pro
500 505 510
Trp Ser Arg Pro Pro Gly Gln Gly Glu Phe Arg Ala Leu Asn Ala Arg
515 520 525
Leu Pro Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu Ser Leu Gln Glu Leu Gln Gly
530 535 540
Gln Asp Pro Thr His Leu Val
545 550
<210> 131
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 131
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 132
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 132
Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu
1 5 10 15
Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 133
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 133
Gly Ser Gly Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 134
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 134
Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala
1 5 10 15
Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 135
<211> 216
<212> PRT
<213> 智人
<400> 135
Met Gly Trp Ile Arg Gly Arg Arg Ser Arg His Ser Trp Glu Met Ser
1 5 10 15
Glu Phe His Asn Tyr Asn Leu Asp Leu Lys Lys Ser Asp Phe Ser Thr
20 25 30
Arg Trp Gln Lys Gln Arg Cys Pro Val Val Lys Ser Lys Cys Arg Glu
35 40 45
Asn Ala Ser Pro Phe Phe Phe Cys Cys Phe Ile Ala Val Ala Met Gly
50 55 60
Ile Arg Phe Ile Ile Met Val Ala Ile Trp Ser Ala Val Phe Leu Asn
65 70 75 80
Ser Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys
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Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln
100 105 110
Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met
115 120 125
Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp
130 135 140
Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val His Ile
145 150 155 160
Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro
165 170 175
Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr
180 185 190
Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr
195 200 205
Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val
210 215
<210> 136
<211> 304
<212> PRT
<213> 智人
<400> 136
Met Ser Ser Thr Leu Pro Ala Leu Leu Cys Val Gly Leu Cys Leu Ser
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Gln Arg Ile Ser Ala Gln Gln Gln Thr Leu Pro Lys Pro Phe Ile Trp
20 25 30
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Cys Gln Gly Asn Tyr Gly Ala Val Glu Tyr Gln Leu His Phe Glu Gly
50 55 60
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65 70 75 80
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Gly Leu Gln Lys Asp His Ala Leu Trp Asp His Thr Ala Gln Asn Leu
245 250 255
Leu Arg Met Gly Leu Ala Phe Leu Val Leu Val Ala Leu Val Trp Phe
260 265 270
Leu Val Glu Asp Trp Leu Ser Arg Lys Arg Thr Arg Glu Arg Ala Ser
275 280 285
Arg Ala Ser Thr Trp Glu Gly Arg Arg Arg Leu Asn Thr Gln Thr Leu
290 295 300
<210> 137
<211> 336
<212> PRT
<213> 智人
<400> 137
Met Asp Tyr Pro Thr Leu Leu Leu Ala Leu Leu His Val Tyr Arg Ala
1 5 10 15
Leu Cys Glu Glu Val Leu Trp His Thr Ser Val Pro Phe Ala Glu Asn
20 25 30
Met Ser Leu Glu Cys Val Tyr Pro Ser Met Gly Ile Leu Thr Gln Val
35 40 45
Glu Trp Phe Lys Ile Gly Thr Gln Gln Asp Ser Ile Ala Ile Phe Ser
50 55 60
Pro Thr His Gly Met Val Ile Arg Lys Pro Tyr Ala Glu Arg Val Tyr
65 70 75 80
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Asn Ala Ser Glu Asp Asp Val Gly Tyr Tyr Ser Cys Ser Leu Tyr Thr
100 105 110
Tyr Pro Gln Gly Thr Trp Gln Lys Val Ile Gln Val Val Gln Ser Asp
115 120 125
Ser Phe Glu Ala Ala Val Pro Ser Asn Ser His Ile Val Ser Glu Pro
130 135 140
Gly Lys Asn Val Thr Leu Thr Cys Gln Pro Gln Met Thr Trp Pro Val
145 150 155 160
Gln Ala Val Arg Trp Glu Lys Ile Gln Pro Arg Gln Ile Asp Leu Leu
165 170 175
Thr Tyr Cys Asn Leu Val His Gly Arg Asn Phe Thr Ser Lys Phe Pro
180 185 190
Arg Gln Ile Val Ser Asn Cys Ser His Gly Arg Trp Ser Val Ile Val
195 200 205
Ile Pro Asp Val Thr Val Ser Asp Ser Gly Leu Tyr Arg Cys Tyr Leu
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
Ile Phe Leu Asn Arg Arg Arg Arg Arg Glu Arg Arg Asp Leu Phe Thr
275 280 285
Glu Ser Trp Asp Thr Gln Lys Ala Pro Asn Asn Tyr Arg Ser Pro Ile
290 295 300
Ser Thr Ser Gln Pro Thr Asn Gln Ser Met Asp Asp Thr Arg Glu Asp
305 310 315 320
Ile Tyr Val Asn Tyr Pro Thr Phe Ser Arg Arg Pro Lys Thr Arg Val
325 330 335
<210> 138
<211> 235
<212> PRT
<213> 智人
<400> 138
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Ser Gln Phe Arg Val Ser Pro Leu Asp Arg Thr
20 25 30
Trp Asn Leu Gly Glu Thr Val Glu Leu Lys Cys Gln Val Leu Leu Ser
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Thr Phe Val Leu Thr Leu Ser Asp Phe Arg Arg Glu Asn Glu Gly Tyr
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His
195 200 205
Arg Asn Arg Arg Arg Val Cys Lys Cys Pro Arg Pro Val Val Lys Ser
210 215 220
Gly Asp Lys Pro Ser Leu Ser Ala Arg Tyr Val
225 230 235
<210> 139
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 139
Gly Gly Ser
1
<210> 140
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 140
Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 141
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 141
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 142
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 142
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 143
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 143
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 144
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 144
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 145
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 145
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Ser
20
<210> 146
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 146
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
20
<210> 147
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 147
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
20 25
<210> 148
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 148
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 149
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 149
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 150
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 150
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 151
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 151
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 152
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 152
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 153
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 153
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
20
<210> 154
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 154
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 155
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 155
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 156
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 156
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
20 25 30
Gly Gly Gly Ser
35
<210> 157
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 157
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
35 40
<210> 158
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 158
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 159
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 159
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 160
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 160
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 161
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 161
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 162
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 162
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 163
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 163
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser
35
<210> 164
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 164
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
35 40
<210> 165
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 165
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
35 40 45
<210> 166
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 166
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Ser
50
<210> 167
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 167
Gly Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 168
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 168
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 169
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 169
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 170
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 170
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser
20
<210> 171
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 171
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 172
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 172
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Ser
35
<210> 173
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 173
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser
35 40
<210> 174
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 174
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser
35 40 45
<210> 175
<211> 54
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 175
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser
35 40 45
Gly Gly Gly Gly Gly Ser
50
<210> 176
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 176
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser
35 40 45
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser
50 55 60

Claims (154)

1.一种用于在自然杀伤(NK)细胞中表达的嵌合抗原受体(CAR)多肽，包括：
a)胞外结合结构域；
b)跨膜结构域；和
c)胞内结构域，所述胞内结构域包括以下中的至少一种：
i)来自NK细胞受体的胞内信号转导结构域；
ii)来自NK细胞膜结合信号转导接头蛋白的胞内信号转导结构域；和/或
iii)来自共刺激受体的胞内共刺激结构域。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中，所述NK细胞受体：
a)选自于由以下组成的组：
i)自然杀伤细胞受体2B4；
ii)自然杀伤细胞、T细胞和B细胞抗原(NTB-A)；
iii)CD2样细胞毒性细胞活化受体(CRACC)；和
iv)分化簇2(CD2)；或
b)胞内信号转导结构域，所述结构域包括SEQ ID NOs：7-10中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：7-10中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的多肽，其中，所述NK细胞膜结合信号转导接头蛋白：
a)选自于由以下组成的组：
i)高亲和力IgE受体(FcεR1)；和
ii)CD3-zeta(CD3ζ)；或
b)胞内信号转导结构域，所述结构域包括SEQ ID NOs：11-12中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：11-12中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的多肽，其中，所述共刺激受体：
a)是4-1BB和/或IL2受体β(IL2RB)；或
b)胞内共刺激结构域，所述结构域包括SEQ ID NOs：15-16中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：15-16中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的多肽，其中，所述胞内结构域进一步包括至少一个自剪切肽和/或细胞因子。
6.根据权利要求5所述的多肽，其中，所述自剪切肽：
a)是T2A、P2A、E2A或F2A；或
b)包括SEQ ID NOs：19-20中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：19-20中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
7.根据权利要求5所述的多肽，其中，所述细胞因子：
a)是IL-15或IL-21；
b)包括SEQ ID NOs：23-24中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：23-24中的一个至少80％相同的氨基酸序列；或
c)相邻并处于所述自剪切肽的远端，使得所述细胞因子通过所述自剪切肽与所述多肽分隔开。
8.根据权利要求1所述的多肽，其中，所述跨膜结构域包括：
a)天然NK细胞受体的跨膜结构域；
b)CD8的跨膜结构域；或
c)SEQ ID NOs：29-32或117-118中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：29-32或117-118中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
9.根据权利要求8所述的多肽，其中，所述天然NK细胞受体的跨膜结构域选自于由自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)、自然杀伤细胞P46相关蛋白(NKp46)、和DNAX辅助分子-1(DNAM1)组成的组。
10.根据权利要求1所述的多肽，其中，所述胞外结合结构域：
a)是抗体、其抗原结合片段、F(ab)片段、F(ab’)片段、单链抗体(scFv)或单域抗体(sdAb)；
b)特异性地结合至肿瘤相关抗原；或
c)包括SEQ ID NOs：35-36中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：35-36中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
11.根据权利要求1所述的多肽，所述多肽进一步包括位于所述胞外结合结构域的N-末端的信号肽。
12.根据权利要求11所述的多肽，其中，所述信号肽：
a)是CD8信号肽；或
b)包括SEQ ID NO：38的氨基酸序列或与SEQ ID NO：38至少80％相同的氨基酸序列。
13.根据权利要求1所述的多肽，所述多肽进一步包括位于所述胞外结合结构域远端的可检测标志物。
14.根据权利要求11所述的多肽，所述多肽进一步包括位于所述胞外结合结构域远端和/或位于所述信号肽近端的连接子结构域。
15.根据权利要求1所述的多肽，所述多肽进一步包括位于所述胞外结合结构域和所述跨膜结构域之间的间隔区结构域。
16.根据权利要求15所述的多肽，其中，所述间隔区结构域包括：
a)CD8铰链结构域；或
b)SEQ ID NO：44的氨基酸序列或与SEQ ID NO：44至少80％相同的氨基酸序列。
17.根据权利要求1所述的CAR多肽，其中，所述多肽包括SEQ ID NOs：80-114中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：80-114中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
18.一种自然杀伤(NK)细胞或其细胞群，所述细胞或其细胞群包括权利要求1所述的多肽。
19.一种增加NK细胞或其细胞群的活化的方法，所述方法包括使所述细胞或其细胞群与权利要求1所述的多肽接触。
20.一种对需要基于CAR的治疗剂的受试者进行治疗的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包括权利要求1所述的多肽的基于CAR的治疗剂。
21.一种用于在自然杀伤(NK)细胞中表达的嵌合抗原受体(CAR)多肽，包括：
a)胞外结合结构域；
b)跨膜结构域；和
c)胞内结构域，所述胞内结构域包括以下中的至少一个：
i)来自NK细胞受体的胞内信号转导结构域；
ii)来自NK细胞膜结合信号转导接头蛋白的胞内信号转导结构域；和/或
iii)来自共刺激受体的胞内共刺激结构域。
22.根据权利要求21所述的多肽，其中，所述多肽从N-末端到C-末端包括：
a)所述胞外结合结构域；
b)所述跨膜结构域；和
c)所述胞内结构域。
23.根据权利要求21所述的多肽，其中，所述多肽从C-末端到N-末端包括：
a)所述胞外结合结构域；
b)所述跨膜结构域；和
c)所述胞内结构域。
24.根据权利要求21-23中任一项所述的多肽，其中，所述NK细胞受体或NK细胞膜结合信号转导接头蛋白选自于由以下组成的组：
a)自然杀伤细胞受体2B4；
b)自然杀伤细胞、T细胞和B细胞抗原(NTB-A)；
c)CD2样细胞毒性细胞活化受体(CRACC)；
d)分化簇2(CD2)；
e)高亲和力IgE受体(FcεR1)；和
f)CD3-zeta(CD3ζ)。
25.根据权利要求21-24中任一项所述的多肽，其中，所述NK细胞受体选自于由2B4、NTB-A、CRACC和CD2组成的组。
26.根据权利要求21-25中任一项所述的多肽，其中，所述NK细胞受体是2B4。
27.根据权利要求21-26中任一项所述的多肽，其中，所述NK细胞受体是NTB-A。
28.根据权利要求21-27中任一项所述的多肽，其中，所述NK细胞受体是CRACC。
29.根据权利要求21-28中任一项所述的多肽，其中，所述NK细胞受体是CD2。
30.根据权利要求21-29中任一项所述的多肽，其中，所述NK细胞膜结合信号转导接头蛋白是CD3ζ或FcεR1。
31.根据权利要求21-30中任一项所述的多肽，其中，所述来自NK细胞受体的胞内信号转导结构域或所述来自NK细胞膜结合信号转导接头蛋白的胞内信号转导结构域包括SEQID NOs：7-12中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：7-12中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
32.根据权利要求21-31中任一项所述的多肽，其中，所述共刺激受体是4-1BB和/或IL2受体β(IL2RB)。
33.根据权利要求32所述的多肽，其中，所述来自共刺激受体的胞内共刺激结构域包括SEQ ID NOs：15-16中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：15-16中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
34.根据权利要求21-33中任一项所述的多肽，其中，所述胞内结构域进一步包括至少一种自剪切肽。
35.根据权利要求34所述的多肽，其中，所述自剪切肽是T2A、P2A、E2A或F2A。
36.根据权利要求34或35所述的多肽，其中，所述自剪切肽包括SEQ ID NOs：19-20中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：19-20中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
37.根据权利要求21-36中任一项所述的多肽，其中，所述胞内结构域进一步包括细胞因子。
38.根据权利要求37所述的多肽，其中，所述细胞因子是IL-15或IL-21。
39.根据权利要求37或38所述的多肽，其中，所述细胞因子包括SEQ ID NOs：23-24中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：23-24中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
40.根据权利要求21-39中任一项所述的多肽，其中，所述胞内结构域进一步包括至少一种自剪切肽和至少一种细胞因子。
41.根据权利要求40所述的多肽，其中，所述细胞因子与所述自剪切肽相邻且位于所述自剪切肽远端，使得所述细胞因子通过所述自剪切肽与所述多肽分隔开。
42.根据权利要求21-41中任一项所述的多肽，其中，所述跨膜结构域包括天然NK细胞受体的跨膜结构域。
43.根据权利要求21-42中任一项所述的多肽，其中，所述天然NK细胞受体的跨膜结构域选自于由自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)、自然杀伤细胞P46相关蛋白(NKp46)、和DNAX辅助分子-1(DNAM1)组成的组。
44.根据权利要求21-43中任一项所述的多肽，其中，所述跨膜结构域包括CD8的跨膜结构域。
45.根据权利要求21-44中任一项所述的多肽，其中，所述跨膜结构域包括SEQ ID NOs：29-32或117-118中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：29-32或117-118中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
46.根据权利要求21-45中任一项所述的多肽，其中，所述胞外结合结构域是抗体、其抗原结合片段、F(ab)片段、F(ab’)片段、单链抗体(scFv)或单域抗体(sdAb)。
47.根据权利要求21-46中任一项所述的多肽，其中，所述胞外结合结构域包括scFv。
48.根据权利要求21-47中任一项所述的多肽，其中，所述胞外结合结构域特异性地结合至肿瘤相关抗原。
49.根据权利要求21-48中任一项所述的多肽，其中，所述肿瘤相关抗原是CD19。
50.根据权利要求21-49中任一项所述的多肽，其中，所述肿瘤相关抗原是CD33。
51.根据权利要求21-50中任一项所述的多肽，其中，所述胞外结合结构域包括SEQ IDNOs：35-36中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：35-36中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
52.根据权利要求21-51中任一项所述的多肽，所述多肽进一步包括位于所述胞外结合结构域的N-末端的信号肽。
53.根据权利要求52所述的多肽，其中，所述信号肽是CD8信号肽。
54.根据权利要求52或53所述的多肽，其中，所述信号肽包括SEQ ID NO：38的氨基酸序列或与SEQ ID NO：38至少80％相同的氨基酸序列。
55.根据权利要求21-54中任一项所述的多肽，所述多肽进一步包括位于所述胞外结合结构域远端的可检测标志物。
56.根据权利要求55所述的多肽，其中，所述可检测标志物是3×FLAG。
57.根据权利要求55或56所述的多肽，其中，所述可检测标志物包括SEQ ID NO：40的氨基酸序列或与SEQ ID NO：40至少80％相同的氨基酸序列。
58.根据权利要求21-57中任一项所述的多肽，所述多肽进一步包括位于所述胞外结合结构域远端和/或位于所述信号肽和/或可检测标志物近端的连接子结构域。
59.根据权利要求58所述的多肽，其中，所述连接子包括SEQ ID NO：42的氨基酸序列或与SEQ ID NO：42至少80％相同的氨基酸序列。
60.根据权利要求21-59中任一项所述的多肽，所述多肽进一步包括位于所述胞外结合结构域和所述跨膜结构域之间的间隔区结构域。
61.根据权利要求60所述的多肽，其中，所述间隔区结构域包括CD8铰链结构域。
62.根据权利要求60或61所述的多肽，其中，所述间隔区包括SEQ ID NO：44的氨基酸序列或与SEQ ID NO：44至少80％相同的氨基酸序列。
63.根据权利要求21-62中任一项所述的CAR多肽，其中，所述多肽包括SEQ ID NOs：80-114中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：80-114中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
64.一种用于在自然杀伤(NK)细胞中表达的嵌合抗原受体(CAR)多肽，包括：
a)胞外结合结构域；
b)跨膜结构域；和
c)胞内结构域，所述胞内结构域包括来自NK细胞受体的至少一个胞内信号转导结构域。
65.根据权利要求64所述的多肽，其中，所述多肽从N-末端到C-末端包括：
d)所述胞外结合结构域；
e)所述跨膜结构域；和
f)所述胞内结构域。
66.根据权利要求64所述的多肽，其中，所述多肽从C-末端到N-末端包括：
d)所述胞外结合结构域；
e)所述跨膜结构域；和
f)所述胞内结构域。
67.根据权利要求64-66中任一项所述的多肽，其中，所述NK细胞受体选自于由2B4、NTB-A、CRACC和CD2组成的组。
68.根据权利要求64-67中任一项所述的多肽，其中，所述NK细胞受体是2B4。
69.根据权利要求64-68中任一项所述的多肽，其中，所述NK细胞受体是NTB-A。
70.根据权利要求64-69中任一项所述的多肽，其中，所述NK细胞受体是CRACC。
71.根据权利要求64-70中任一项所述的多肽，其中，所述NK细胞受体是CD2。
72.根据权利要求64-71中任一项所述的多肽，其中，所述来自NK细胞受体的胞内信号转导结构域包括SEQ ID NOs：7-10中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：7-10中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
73.根据权利要求64-72中任一项所述的多肽，其中，所述跨膜结构域包括天然NK细胞受体的跨膜结构域。
74.根据权利要求64-73中任一项所述的多肽，其中，所述天然NK细胞受体的跨膜结构域选自于由自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)、自然杀伤细胞P46相关蛋白(NKp46)、和DNAX辅助分子-1(DNAM1)组成的组。
75.根据权利要求64-74中任一项所述的多肽，其中，所述跨膜结构域包括SEQ ID NOs：29-31或117-118中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：29-31或117-118中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
76.根据权利要求64-75中任一项所述的多肽，其中，所述胞外结合结构域是抗体、其抗原结合片段、F(ab)片段、F(ab’)片段、单链抗体(scFv)或单域抗体(sdAb)。
77.根据权利要求64-76中任一项所述的多肽，其中，所述胞外结合结构域包括scFv。
78.根据权利要求64-77中任一项所述的多肽，其中，所述胞外结合结构域特异性地结合至肿瘤相关抗原。
79.根据权利要求64-78中任一项所述的多肽，其中，所述肿瘤相关抗原是CD19。
80.根据权利要求64-79中任一项所述的多肽，其中，所述肿瘤相关抗原是CD33。
81.根据权利要求64-80中任一项所述的多肽，其中，所述胞外结合结构域包括SEQ IDNOs：35-36中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：35-36中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
82.根据权利要求64-81中任一项所述的多肽，所述多肽进一步包括位于所述胞外结合结构域的N-末端的信号肽。
83.根据权利要求82所述的多肽，其中，所述信号肽是CD8信号肽。
84.根据权利要求82或83所述的多肽，其中，所述信号肽包括SEQ ID NO：38的氨基酸序列或与SEQ ID NO：38至少80％相同的氨基酸序列。
85.根据权利要求64-84中任一项所述的多肽，所述多肽进一步包括位于所述胞外结合结构域远端的可检测标志物。
86.根据权利要求85所述的多肽，其中，所述可检测标志物是3×FLAG。
87.根据权利要求85或86所述的多肽，其中，所述可检测标志物包括SEQ ID NO：40的氨基酸序列或与SEQ ID NO：40至少80％相同的氨基酸序列。
88.根据权利要求64-87中任一项所述的多肽，所述多肽进一步包括位于所述胞外结合结构域远端和/或位于所述信号肽和/或可检测标志物近端的连接子结构域。
89.根据权利要求88所述的多肽，其中，所述连接子包括SEQ ID NO：42的氨基酸序列或与SEQ ID NO：42至少80％相同的氨基酸序列。
90.根据权利要求64-89中任一项所述的多肽，所述多肽进一步包括位于所述胞外结合结构域和所述跨膜结构域之间的间隔区结构域。
91.根据权利要求90所述的多肽，其中，所述间隔区结构域包括CD8铰链结构域。
92.根据权利要求90或91所述的多肽，其中，所述间隔区包括SEQ ID NO：44的氨基酸序列或与SEQ ID NO：44至少80％相同的氨基酸序列。
93.根据权利要求64-92中任一项所述的CAR多肽，其中，所述多肽包括SEQ ID NOs：90-105或SEQ ID NOs：110-114中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：90-105或SEQ ID NOs：110-114中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
94.一种用于在自然杀伤(NK)细胞中表达的嵌合抗原受体(CAR)多肽，包括：
a)胞外结合结构域；
b)跨膜结构域；和
c)胞内结构域，所述胞内结构域包括以下中的至少一种：
i)来自NK细胞膜结合信号转导接头蛋白的胞内信号转导结构域；和/或
ii)来自共刺激受体的胞内共刺激结构域。
95.根据权利要求94所述的多肽，其中，所述多肽从N-末端到C-末端包括：
a)所述胞外结合结构域；
b)所述跨膜结构域；和
c)所述胞内结构域。
96.根据权利要求94所述的多肽，其中，所述多肽从C-末端到N-末端包括：
a)所述胞外结合结构域；
b)所述跨膜结构域；和
c)所述胞内结构域。
97.根据权利要求94-96中任一项所述的多肽，其中，所述NK细胞膜结合信号转导接头蛋白是CD3ζ或FcεR1。
98.根据权利要求94-97中任一项所述的多肽，其中，所述来自NK细胞膜结合信号转导接头蛋白的胞内信号转导结构域包括SEQ ID NOs：11-12中的一个的氨基酸序列或与SEQID NOs：11-12中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
99.根据权利要求94-98中任一项所述的多肽，其中，所述共刺激受体是4-1BB和/或IL2受体β(IL2RB)。
100.根据权利要求99所述的多肽，其中，所述来自共刺激受体的胞内共刺激结构域包括SEQ ID NOs：15-16中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：15-16中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
101.根据权利要求94-100中任一项所述的多肽，其中，所述胞内结构域进一步包括至少一种自剪切肽。
102.根据权利要求101所述的多肽，其中，所述自剪切肽是T2A、P2A、E2A或F2A。
103.根据权利要求101或102所述的多肽，其中，所述自剪切肽包括SEQ ID NOs：19-20中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：19-20中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
104.根据权利要求94-103中任一项所述的多肽，其中，所述胞内结构域进一步包括细胞因子。
105.根据权利要求104所述的多肽，其中，所述细胞因子是IL-15或IL-21。
106.根据权利要求104或105所述的多肽，其中，所述细胞因子包括SEQ ID NOs：23-24中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：23-24中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
107.根据权利要求94-106中任一项所述的多肽，其中，所述胞内结构域进一步包括至少一个自剪切肽和至少一个细胞因子。
108.根据权利要求107所述的多肽，其中，所述细胞因子与所述自剪切肽相邻并位于所述自剪切肽远端，使得所述细胞因子通过所述自剪切肽与所述多肽分隔开。
109.根据权利要求94-108中任一项所述的多肽，其中，所述跨膜结构域包括CD8的跨膜结构域。
110.根据权利要求94-109中任一项所述的多肽，其中，所述跨膜结构域包括SEQ IDNO：32的氨基酸序列或与SEQ ID NO：32至少80％相同的氨基酸序列。
111.根据权利要求94-110中任一项所述的多肽，其中，所述胞外结合结构域是抗体、其抗原结合片段、F(ab)片段、F(ab’)片段、单链抗体(scFv)或单域抗体(sdAb)。
112.根据权利要求94-111中任一项所述的多肽，其中，所述胞外结合结构域包括scFv。
113.根据权利要求94-112中任一项所述的多肽，其中，所述胞外结合结构域特异性地结合至肿瘤相关抗原。
114.根据权利要求94-113中任一项所述的多肽，其中，所述肿瘤相关抗原是CD19。
115.根据权利要求94-114中任一项所述的多肽，其中，所述肿瘤相关抗原是CD33。
116.根据权利要求94-115中任一项所述的多肽，其中，所述胞外结合结构域包括SEQID NOs：35-36中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：35-36中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
117.根据权利要求94-116中任一项所述的多肽，所述多肽进一步包括位于胞外结合结构域的N-末端的信号肽。
118.根据权利要求117所述的多肽，其中，所述信号肽是CD8信号肽。
119.根据权利要求117或118所述的多肽，其中，所述信号肽包括SEQ ID NO：38的氨基酸序列或与SEQ ID NO：38至少80％相同的氨基酸序列。
120.根据权利要求94-119中任一项所述的多肽，所述多肽进一步包括位于所述胞外结合结构域远端的可检测标志物。
121.根据权利要求120所述的多肽，其中，所述可检测标志物是3×FLAG。
122.根据权利要求120或121所述的多肽，其中，所述可检测标志物包括SEQ ID NO：40的氨基酸序列或与SEQ ID NO：40至少80％相同的氨基酸序列。
123.根据权利要求94-122中任一项所述的多肽，所述多肽进一步包括位于所述胞外结合结构域远端和/或位于所述信号肽和/或可检测标志物近端的连接子结构域。
124.根据权利要求123所述的多肽，其中，所述连接子包括SEQ ID NO：42的氨基酸序列或与SEQ ID NO：42至少80％相同的氨基酸序列。
125.根据权利要求74-104中任一项所述的多肽，所述多肽进一步包括位于所述胞外结合结构域和所述跨膜结构域之间的间隔区结构域。
126.根据权利要求125所述的多肽，其中，所述间隔区结构域包括CD8铰链结构域。
127.根据权利要求125或126所述的多肽，其中，所述间隔区包括SEQ ID NO：44的氨基酸序列或与SEQ ID NO：44至少80％相同的氨基酸序列。
128.根据权利要求94-127中任一项所述的多肽，其中，所述多肽包括SEQ ID NOs：80-89或SEQ ID NOs：106-109中的一个的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：80-89或SEQID NOs：106-109中的一个至少80％相同的氨基酸序列。
129.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码权利要求1-17或21-128中任一项所述的多肽。
130.根据权利要求129所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸包括SEQ ID NOs：45-79中的一个、或与SEQ ID NOs：45-79中的一个至少80％相同的核酸序列。
131.一种载体，所述载体包括权利要求129或130所述的多核苷酸。
132.根据权利要求131所述的载体，其中，所述载体包括慢病毒载体。
133.一种慢病毒，所述慢病毒包括权利要求1-17或21-128中任一项所述的多肽、权利要求129-130中任一项所述的多核苷酸或权利要求131-132中任一项所述的载体。
134.一种细胞或其细胞群，所述细胞或其细胞群包括权利要求1-17或21-128中任一项所述的多肽、权利要求129-130中任一项所述的多核苷酸、权利要求131-132中任一项所述的载体或权利要求133所述的慢病毒。
135.根据权利要求134所述的细胞，其中，所述细胞包括免疫细胞。
136.根据权利要求135所述的细胞，其中，所述免疫细胞包括自然杀伤(NK)细胞。
137.一种药物组合物，所述组合物包括权利要求1-17或21-128中任一项所述的多肽、权利要求129-130中任一项所述的多核苷酸、权利要求131-132中任一项所述的载体、权利要求133所述的慢病毒或者权利要求18或134-136中任一项所述的细胞，以及药学上可接受的运载体。
138.一种增加NK细胞或其细胞群的活化的方法，所述方法包括使所述细胞或其细胞群与权利要求1-17或21-128中任一项所述的多肽、权利要求129-130中任一项所述的多核苷酸、权利要求131-132中任一项所述的载体或权利要求133所述的慢病毒接触。
139.根据权利要求138所述的方法，其中，与接触所述多肽、多核苷酸、载体或慢病毒之前相比，将所述NK细胞或其细胞群与所述多肽、多核苷酸、载体或慢病毒接触使所述NK细胞的活性增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少200％、至少300％、至少400％或至少500％。
140.根据权利要求138-139中任一项所述的方法，其中，所述NK细胞或其细胞群的增加的活化包括选自于由TNFα、IFNγ、GM-CSF和颗粒酶B组成的组中的细胞因子或颗粒酶的表达增加。
141.根据权利要求138-140中任一项所述的方法，其中，所述NK细胞或其细胞群的增加的活化引起靶细胞的特异性裂解增加。
142.根据权利要求138-141中任一项所述的方法，其中，所述靶细胞表达特异性地结合至所述多肽的胞外结合结构域的表面抗原。
143.根据权利要求138-142中任一项所述的方法，其中，所述靶细胞是癌细胞。
144.根据权利要求138-143中任一项所述的方法，其中，所述靶细胞是被病毒或细菌感染的细胞。
145.一种对需要基于CAR的治疗剂的受试者进行治疗的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的选自于由以下组成的组中的所述基于CAR的治疗剂：权利要求1-17或21-128中任一项所述的多肽、权利要求129-130中任一项所述的多核苷酸、权利要求131-132中任一项所述的载体、权利要求133所述的慢病毒、权利要求18或134-136中任一项所述的细胞或其细胞群以及权利要求137所述的药物组合物。
146.根据权利要求145所述的方法，其中，所述受试者患有癌症或被诊断患有癌症。
147.根据权利要求145或146所述的方法，其中，所述受试者患有或已经被诊断患有肾上腺癌、肛门癌、阑尾癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、胆囊癌、妊娠滋养细胞疾病、头颈部癌、霍奇金淋巴瘤、肠癌、肾癌、白血病、肝癌、肺癌、黑色素瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、多发性骨髓瘤、神经内分泌肿瘤、非霍奇金淋巴瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、鼻窦癌、皮肤癌、肉瘤、软组织肉瘤、脊柱癌、胃癌、睾丸癌、喉癌、肿瘤、甲状腺癌、子宫癌、阴道癌或外阴癌。
148.根据权利要求145-147中任一项所述的方法，其中，所述基于CAR的治疗剂的施用引起由所述CAR靶向的癌细胞的特异性裂解增加。
149.根据权利要求145-148中任一项所述的方法，其中，所述受试者患有感染性疾病或已被诊断患有感染性疾病。
150.根据权利要求145-149中任一项所述的方法，其中，所述感染性疾病是病毒性或细菌性疾病。
151.根据权利要求145-150中任一项所述的方法，其中，施用所述基于CAR的治疗剂引起由所述CAR靶向的感染细胞的特异性裂解增加。
152.一种制备治疗组合物的方法，所述方法包括：在允许多肽于NK细胞中表达的条件下，将编码权利要求1-17或21-128中任一项所述的多肽的核酸、权利要求129-130中任一项所述的多核苷酸、权利要求131-132中任一项所述的载体或权利要求133所述的慢病毒引入所述NK细胞。
153.根据权利要求152所述的方法，其中，在引入所述核酸、多核苷酸、载体或慢病毒之前，从需要所述治疗组合物的受试者中移除所述NK细胞。
154.根据权利要求152或153所述的方法，其中，在引入所述核酸、多核苷酸、载体或慢病毒后，将所述NK细胞返回受试者。
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