CN117024573B - 一种具有铁螯合活性的胶原肽及其制备方法和应用 - Google Patents
一种具有铁螯合活性的胶原肽及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于水产品深加工技术领域，尤其涉及一种具有铁螯合活性的胶原肽及其制备方法和应用。所述胶原肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明以鲢鱼鱼鳞为原料，制备得到的胶原肽具有较高的铁螯合活性和良好地促进铁吸收转运的能力，能够有效地提高铁在人体肠道中的吸收率，提高铁的生物利用度，有望应用于食品、药品和保健品领域的铁补充剂。
Description
技术领域
本发明涉及水产品深加工技术领域，特别涉及一种具有铁螯合活性的胶原肽及其制备方法和应用。
背景技术
铁是人体必需的微量元素之一，在人体内分布广泛，具有重要的生物活性，它参与了人体多种重要的生物学过程，如构成血红素、预防贫血，参与细胞色素合成，调解组织呼吸和能量代谢；维持机体的免疫力和抗感染能力。日常饮食铁的摄入量不足以及摄入铁的生物利用度低都会导致铁缺乏症的出现，人体内缺铁易导致贫血，这种现象在世界范围内普遍存在。统计数据显示，世界上约有30％的人患有贫血，其中约有一半是由于缺铁造成的。因此，合理补铁至关重要。
为解决缺铁问题，市场上开发了不同种类的补铁剂，但常见的补铁剂如硫酸亚铁、葡萄糖酸亚铁和甘氨酸亚铁等普遍存在性质不稳定、吸收利用率低、副作用大、易刺激胃肠道和制备成本相对较高等缺陷。有研究表明，通过酶解蛋白质获得具有铁螯合活性的蛋白肽，可与亚铁离子结合并形成肽铁螯合物，肽铁螯合物能够增加铁离子在人体肠道内的溶解度，增加铁离子的吸收率，与传统的铁补充剂相比在人体内具有生物利用度好、吸收能力强、稳定性好、安全性高等优点，因此，肽铁螯合物作为一种新型补铁剂有巨大的开发潜力。
目前，鲢鱼加工过程中会产生大量的下脚料，如鱼鳞、鱼皮、鱼排等，这些下脚料中含有大量的蛋白质，直接丢弃不仅会造成资源浪费，还可能导致环境被污染，因此，对鲢鱼下脚料的综合研究利用在过去的几年里受到越来越多的重视，目前已有诸如海参多肽、南极磷虾多肽、罗非鱼皮胶原多肽等水产性多肽与亚铁螯合的相关报道，但缺乏关于鲢鱼鱼鳞活性多肽与亚铁盐螯合的较为系统的研究，鲢鱼鱼鳞是一种具有一定生物活性的蛋白质，是制备活性多肽的优质原料，但并未得到有效利用，有待于开发和探究鲢鱼鱼鳞铁螯合多肽及其提取工艺。
基于上述理由，提出本申请。
发明内容
针对现有技术中鲢鱼鱼鳞活性多肽未得到有效利用以及缺乏鲢鱼鱼鳞铁螯合多肽的问题，本发明提供了一种具有铁螯合活性的胶原肽，并提供了具有铁螯合活性的胶原肽的制备方法以及该胶原肽在制备补铁剂中的应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
为实现上述目的，本发明具体通过以下技术方案实现：
本发明第一方面提供了一种促铁吸收的铁螯合胶原肽，包括DY肽和/或LR肽，所述DY肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述LR肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
进一步地，所述铁螯合胶原肽至少包括所述DY肽。
本发明第二方面提供了如上所述的促铁吸收的铁螯合胶原肽在铁补充剂中的应用。
进一步地，所述铁补充剂为具有补铁功能的食品、药品和/或保健品。
进一步地，所述应用包括：将所述铁螯合胶原肽与铁离子溶液混合，制得肽铁螯合物，应用于铁补充剂。
更进一步地，所述铁离子溶液选自氯化亚铁溶液、硫酸亚铁溶液和硝酸亚铁溶液中的至少一种；所述DY肽与所述铁离子溶液中铁离子的摩尔比为1：0-2，所述LR肽与所述铁离子溶液中铁离子的摩尔比为1：0-1。
本发明第三方面提供了一种促铁吸收的铁螯合胶原肽的制备方法，包括以下步骤：
S1、将经过脱脂脱钙处理的鲢鱼鱼鳞粉碎，得到鲢鱼鱼鳞粉末；
S2、向所述鲢鱼鱼鳞粉末中加入碱性蛋白酶，进行酶解处理，酶解完成后，高温灭酶，离心取上清液并超滤，收集分子量小于3kDa的组分，浓缩干燥得到鲢鱼鱼鳞酶解物；
S3、采用液相色谱串联二级质谱技术解析所述鲢鱼鱼鳞酶解物中的多肽组分；
S4、对步骤S3中解析出的所述多肽组分进行分子结构模型构建和分子动力学模拟，结合均方根误差值、羧基氧与亚铁之间的相互作用能及铁原子与氧原子之间的动态距离分析，筛选得到铁螯合胶原肽；
其中，所述铁螯合胶原肽包括DY肽和/或LR肽，所述DY肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述LR肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
进一步地，步骤S2中，所述碱性蛋白酶的添加量为400-500U/g，酶解时间为4-6h。
进一步地，步骤S4中，通过Alphofold2在线软件构建分子结构模型，之后通过GROMACS2021.4软件进行分子动力学模拟，选用Amber力场，水分子采用SPC模型，添加亚铁离子和氯离子到立方体水盒子中平衡电荷并进行能量最小化处理，得到均方根误差值、羧基氧与亚铁之间的相互作用能及铁原子与氧原子之间的动态距离。
更进一步地，所述的羧基氧与亚铁之间的相互作用能包括Lennard-Jones近程能量和Coul-SR近程能量。
本发明的优点及积极效果为：
本发明以鲢鱼鱼鳞为原料，制备得到的DY肽和LR肽具有较高的铁螯合活性和良好地促进铁吸收转运的能力，能够有效地提高铁在人体肠道中的吸收率，提高铁的生物利用度，有望应用于食品、药品和保健品领域的铁补充剂。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1小于3kDa的鲢鱼鱼鳞胶原肽的总离子流色谱图和一级质谱图；
图2为本发明实施例1的17种鲢鱼鱼鳞胶原肽在铁离子环境下的均方根误差值；
图3为本发明实施例1的17种鲢鱼鱼鳞胶原肽的氧原子与铁离子在分子动力学模拟过程中的动态距离；
图4为本发明实施例1的铁螯合胶原肽DY肽和LR肽的质谱鉴定图；
图5为本发明实施例1的铁螯合胶原肽DY肽和LR肽的液相色谱图；
图6为本发明实施例2的铁螯合胶原肽DY肽和LR肽螯合铁离子前后的能量色散光谱图；其中，图A-D依次为DY、DY-Fe、LR和LR-Fe的能谱测试结果，左侧图为点扫时在样品结构表面所选取的范围，右侧图为能谱测试得到的样品主要元素分布情况；
图7为本发明实施例2的铁螯合胶原肽DY肽和LR肽螯合铁离子前后的X射线衍射图；
图8为本发明实施例2的铁螯合胶原肽DY肽和LR肽螯合铁离子前后的红外光谱图；其中，图A为DY肽，图B为LR肽；
图9为本发明实施例2铁离子滴定到DY肽和LR肽溶液中原始等温滴定量热分析图；
图10为为本发明实施例3不同浓度的氯化亚铁和肽铁混合物对细胞存活率的影响；其中，图A为氯化亚铁，图B为肽铁混合物；
图11为本发明实施例3单层细胞模型结构示意图；
图12为本发明实施例3不同浓度的DY肽和LR肽对单层细胞铁转运量的影响。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。此处所描述的实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
根据本发明包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本发明中所用的表示用量、百分比的所有数字以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。术语“大约”具有其通常的含义，用于表示一个值包括用于确定该值的设备或方法的误差的固有变化，或包含接近所述值的值，例如在所述值(或值的范围)的10％之内。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。
术语“包括”、“包含”、“含有”、“具有”等类似词语的含义是非限制性的，即可加入不影响结果的其它步骤和其它成分。术语“和/或”应被视对在具有或不具有另一者的情况下两种指定特征或组分中的每一种的具体公开。例如，“A和/或B”将被视为包含以下情形：(i)A、(ii)B、以及(iii)A和B。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细说明。
本发明实施例提供了一种促铁吸收的铁螯合胶原肽，包括DY肽和/或LR肽，其氨基酸序列如下所示：
DY肽：DTSGGYDEY(见SEQ ID NO.1)；
LR肽：LQGSNEIEIR(见SEQ ID NO.9)。
本发明以鲢鱼鱼鳞为原料，制备得到DY肽和/或LR肽，DY肽的分子量为1006.45Da，LR肽的分子量为1156.50Da，DY肽和LR肽具有较高的铁螯合活性，可以通过其肽链上的羧基、氨基和酰胺基上的氮原子与Fe2+结合，自主发生络合反应，并形成稳定的肽铁螯合物，避免Fe2+发生氧化沉淀，经等温滴定量热法(ITC)技术测量，DY肽与Fe2+的化学计量比为1：2，LR肽与Fe2+的化学计量比为1：1。进一步通过Caco-2肠上皮细胞模型研究前述多肽的铁转运能力，在37℃孵育2h条件下，Fe-DY肽或LR肽螯合物跨单层细胞的铁转运量显著高于FeCl2组，且Fe2+转运量一定程度上随着多肽浓度的升高而升高，当FeCl2浓度为30μg/mL，DY肽的质量浓度为0.2mg/mL时，Fe2+转运量为0.6112μg/well，当FeCl2浓度为30μg/mL，LR肽的质量浓度为0.4mg/mL时，Fe2+转运量为0.3175μg/well，可见DY肽和LR肽具有良好地促进铁吸收转运的能力，能够有效地提高铁在人体肠道中的吸收率，提高铁的生物利用度。而且，经细胞毒性实验验证，本发明提供的DY肽和LR肽安全无毒副作用，因此，可应用于食品、药品和保健品领域的铁补充剂，为高活性鲢鱼鱼鳞铁补充剂的开发提供了理论依据，具有广阔的应用前景，而且提高了鲢鱼鱼鳞的利用率和附加值，为鲢鱼鱼鳞的高值化利用提供了新的途径。
肽段DY和LR均具有促铁吸收的能力且DY肽促铁吸收的效果优于LR肽，因此，在较佳的实施方式中，所述铁螯合胶原肽至少包括DY肽。
本发明又一实施例提供了一种促铁吸收的铁螯合胶原肽在铁补充剂中的应用。
所述促铁吸收的铁螯合胶原肽在铁补充剂中的应用优势与如上所述的促铁吸收的铁螯合胶原肽相对于现有技术的优势相同，在此不再赘述。
可选地，所述铁补充剂为具有补铁功能的食品、药品和/或保健品。
可选地，所述应用包括：将所述铁螯合胶原肽与铁离子溶液混合，制得铁-肽螯合物，应用于铁补充剂。
可以理解的是，铁离子溶液通常用于提供亚铁离子，本发明对提供亚铁离子的盐的种类不作特殊的限定，能够有效地形成亚铁离子即可。在具体的实施方式中，所述铁离子溶液可以选自氯化亚铁溶液、硫酸亚铁溶液和硝酸亚铁溶液中的至少一种。
根据多肽与Fe2+的化学计量比，优选地，所述DY肽与所述铁离子溶液中铁离子的摩尔比为1：0-2，所述LR肽与所述铁离子溶液中铁离子的摩尔比为1：0-1。
本发明另一实施例提供了一种促铁吸收的铁螯合胶原肽的制备方法，包括以下步骤：
S1、将经过脱脂脱钙处理的鲢鱼鱼鳞粉碎，得到鲢鱼鱼鳞粉末；
S2、向所述鲢鱼鱼鳞粉末中加入碱性蛋白酶，进行酶解处理，酶解完成后，高温灭酶，离心取上清液并超滤，收集分子量小于3kDa的组分，浓缩干燥得到鲢鱼鱼鳞酶解物；
S3、采用液相色谱串联二级质谱(LC-MS/MS)技术解析所述鲢鱼鱼鳞酶解物中的多肽组分；
S4、对步骤S3中解析出的所述多肽组分进行分子结构模型构建和分子动力学模拟，结合均方根误差(RMSD)值、羧基氧与亚铁之间的相互作用能及铁原子与氧原子(FE-O)之间的动态距离分析，筛选得到铁螯合胶原肽。
本发明以脱脂脱钙的鲢鱼鱼鳞为原料，依次经过碱性蛋白酶酶解、LC-MS/MS分离鉴定和分子模拟处理，碱性蛋白酶酶解处理得到小分子多肽，然后通过LC-MS/MS分离鉴定得到小分子多肽的氨基酸组成，最后通过分子模拟处理示筛选出具有高铁螯合活性的肽段分别为DTSGGYDEY和LQGSNEIEIR，本发明利用分子结构构建和分子动力学模拟的计算机分析技术，结合RMSD值、羧基氧与亚铁之间的相互作用能及FE-O之间的动态距离等参数分析，从分子水平出发有利于提高铁螯合胶原肽的精确筛选效率，筛选得到的铁螯合胶原肽可以通过固相合成法合成。本发明基于前述制备方法，从鲢鱼鱼鳞中所提取胶原肽与铁进行螯合时，得到的螯合物得率高达60％以上，而且得到的DY肽和LR肽的铁螯合活性高，促铁转运能力优异。
可选地，步骤S2中，所述碱性蛋白酶的添加量为400-500U/g，酶解时间为4-6h。
可选地，步骤S3中，多肽组分解析采用本领域的常规操作，首先采用液相色谱对得到的所述鲢鱼鱼鳞酶解物进行检测，之后通过串联质谱对其特征离子质子峰进行二级质谱分析鉴定，得到多肽的氨基酸组成。
可选地，步骤S4中，通过Alphofold2在线软件构建分子结构模型，之后通过GROMACS2021.4软件进行分子动力学模拟，选用Amber力场，水分子采用SPC模型，添加亚铁离子和氯离子到立方体水盒子中平衡电荷并进行能量最小化处理，得到RMSD值、羧基氧与亚铁之间的相互作用能及FE-O之间的动态距离。前述所述的羧基氧与亚铁之间的相互作用能包括Lennard-Jones近程能量(LJ-SR)和Coul-SR近程能量(Coul-SR)。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1铁螯合胶原肽的制备
铁螯合胶原肽采用以下步骤制备得到：
S1、鲢鱼鱼鳞预处理：取烘干后的鲢鱼鱼鳞200g，按照料液比为1：10的量加入0.1mol/L氢氧化钠溶液，在25℃下搅拌4h后用蒸馏水洗至中性；随后按照料液比为1：10的量加入0.5mol/L盐酸溶液，25℃脱钙1.5h，用蒸馏水冲洗至中性；最后，按照料液比为1：10的量加入0.5mol/L碳酸氢钠溶液，25℃下脱脂8h，用蒸馏水冲洗至中性，在85℃的热水中浸泡1.5h，用料理机搅碎，得到预处理的鲢鱼鱼鳞粉末。
S2、蛋白酶解处理：将鲢鱼鱼鳞粉末加入到蒸馏水中调节底物浓度，用盐酸或氢氧化钠调节起始pH值为8.0-8.5，加入420U/g的碱性蛋白酶后混匀，在磁力搅拌器中酶解4h，随后水浴灭酶15min，离心，取上清液过3kDa超滤膜，收集分子量小于3kDa的滤液，真空浓缩后经喷雾干燥得到鲢鱼鱼鳞酶解物，喷雾干燥条件为进风温度200℃，出风温度90℃，进样量200mL/h。
S3、多肽组分鉴定：首先采用液相色谱对得到的所述鲢鱼鱼鳞酶解物进行检测，包括如下步骤：将上述的鲢鱼鱼鳞酶解物用buffer A(配方：5％乙腈(CAN)+0.1％甲酸(FA))复溶至约35μL，20000g离心10min，除去不溶物质，通过纳升液相色谱仪(岛津公司LC-20AD)进行分离，上样量为30μL，所用的分离柱包括Trap柱和分析柱两部分，分离程序如下：先以8μL/min的流速在4min内将样品带入到Trap柱上，紧接着以总流速为300nL/min的分析梯度将样品带入分析柱中，将多肽组分分离并传输至串联的质谱系统中。前述的分析梯度设置如下：先在5％buffer B(配方：95％CAN+0.1％FA)下洗脱5min，接着在35min内使buffer B的比例由5％线性上升至35％，之后在5min内进一步提高到60％，然后在2min内将buffer B增加到80％并保持2min，最后在1min内恢复至5％并在此条件下平衡10min。
经过液相分离的多肽通过nanoESI源离子化后进入到串联质谱仪OrbitrapFusion Lumos(Thermo Fisher Scientific,San Jose,CA)进行DDA(data-dependentacquisition)模式检测。主要参数设置如下：离子源电压为2kV，一级质谱扫描范围350-1500m/z、分辨率为60000，二级质谱起始m/z固定为100、分辨率15000；二级碎裂的母离子筛选条件为：电荷2+到6+，峰强度超过20000的强度排在前30的母离子，离子碎裂模式为HCD，碎片离子在Orbitrap中进行检测，动态排除时间设定为30s，AGC设置为：一级1E5，二级2E4。
通过液相色谱串联二级质谱(LC-MS/MS)技术共解析出280个肽段，得到的鲢鱼鱼鳞胶原肽的总离子流色谱图(TIC)(上图)和一级质谱Basepeak(下图)如图1所示。在280个肽段中，Gly-X-Y(X和Y通常为脯氨酸和羟脯氨酸)的肽序列发现较多，被认为是胶原蛋白的特征序列，同时有224个肽段的前体蛋白来源于Ⅰ型胶原(Collagen type I)α链，由于胶原链是鲢鱼鱼鳞胶原蛋白的主要组成部分，因此鉴定的样品确为鲢鱼鱼鳞胶原蛋白肽。
分子量是影响铁螯合活性的重要因素，在以前的研究中，分子量分布在300-1500Da之间的肽段具有高铁螯合活性，根据鉴定到的肽段并结合前人的研究结果，在胶原肽的研究中，精氨酸位于C端的肽段具有较高的铁螯合活性，且精氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸在已鉴定的铁螯合胶原肽中含量丰富，综上，筛选出了17种潜在的铁螯合胶原肽肽段，其氨基酸序列和分子量信息如表1所示。
表1LC-MS/MS解析出的潜在的铁螯合胶原肽的序列信息
S4、对上述解析出的17种胶原肽进行分子结构模型构建和分子动力学(MD)模拟，通过Alphofold2在线软件构建分子结构模型，之后通过GROMACS 2021.4软件进行分子动力学模拟，选用Amber力场，水分子采用SPC模型，添加亚铁离子和氯离子到立方体水盒子中平衡电荷并进行能量最小化，分子动力学分为能量最小化、平衡、成品模拟三个部分。使用最速下降法运行5000步，平衡阶段先在正则系综(canonical ensemble，NVT)下使用调速温控器耦合方法运行50000步，将体系温度保持在310K，然后在等温等压系综(constant-pressure,constant-temperature，NPT)下运行50000步，使用Parrinello-Rahman恒压器将体系压强保持在1.0bar，在NPT系综下使用蛙跳算法运行50ns的成品模拟。使用粒子网格算法，其截断距离为1.0nm，分子动力学过程中步长为2fs，所有的分析均使用GROMACS自带的分析插离分析筛选。
为了考察胶原肽链在常温模拟过程中构象相对于初始位置的变化，计算了胶原肽分子相对于初始结构肽骨架位置的均方根误差(RMSD)值，RMSD值可反映胶原肽分子在亚铁离子的环境中的构象的变化。图2示出了17个肽段在Fe2+环境中的RMSD值，经过50ns的分子动力学模拟，17个肽段的RMSD值均有不同幅度的波动，在相同的MD模拟时间内，1-DTSGGYDEY、7-EKAPDPFRHF、8-IVGLPGQR、9-LQGSNEIEIR、10-IAGPAGPR、11-AQGPIGAR、12-GAQGPIGAR、13-VGPSGPAGAR这8个肽段在动力学模拟过程中相较于其他肽段RMSD值的震动频率和幅度更小，表明其结构在Fe2+体系内更稳定。
为了评估肽段上的羧基氧与铁整体结合的贡献，计算了两种类型的近程能量—Lennard-Jones近程能量(LJ-SR)和Coul-SR近程能量(Coul-SR)，以确定铁原子在整个MD轨迹中与肽段上羧基氧的相互作用能(见表2)。各肽段经过50ns的MD模拟后，其Coul-SR总能量均远高于LJ-SR总能量，表明库仑相互作用对肽铁结合有着重要作用，其中肽段1-DTSGGYDE在各肽段中的Coul-SR近程能量最高，表现出-66.40kJ/mol的强库仑相互作用能，表明其在静电相互作用中具有重要作用。此外，2-IAQPAEKAPDPF、9-LQGSNEIEIR也表现出较高的相互作用能(Coul-SR与LJ-SR能量之和)，分别为-52.62kJ/mol、-23.64kJ/mol。通过比较17个肽段上羧基氧与铁之间的相互作用能可知，1-DTSGGYDEY、2-IAQPAEKAPDPF、9-LQGSNEIEIR这3个肽段可能表现出更高的高铁亲和活性。
表2胶原肽上羧基氧与铁之间的相互作用能分析
为了更准确地寻找具有潜在高铁螯合活性肽段，对Fe2+与各肽段上羧基氧原子结合过程中产生的距离轨迹进行分析，图3示出了Fe(图中所示为FE)与氧原子(O)在分子动力学模拟过程中的动态距离，图中螯合位点的原子分别为Glu、Asp、Arg残基羧基中的氧原子。以0.35nm作为FE-O之间距离的界限，筛选出与Fe2+最有可能结合的胶原肽，在17个肽段中，1-DTSGGYDEY和9-LQGSNEIEIR这2个肽段在同样的模拟时间内与Fe2+接触的次数最多，分别为16次和8次，即铁原子更倾向于与1-DTSGGYDEY和9-LQGSNEIEIR发生结合反应。
综合分子动力学模拟结果，筛选1-DTSGGYDEY、9-LQGSNEIEIR作为潜在的高铁螯合肽进行下一步合成验证。
S5、合成与鉴定：通过固相合成技术合成的DTSGGYDEY(DY)九肽和LQGSNEIEIR(LR)十肽，DY肽和LR肽的分子量质谱鉴定结果如图4所示，液相色谱纯度结果如图5所示。
从前述图中可以得到，DY肽的纯度为98.73％，分子量为1006.45Da，LR肽的纯度为98.94％，分子量为1156.50Da。
实施例2铁螯合胶原肽与铁之间的螯合模式探究
(1)胶原肽螯合铁离子前后的微观结构分析
将SCSCP-Fe及SCSCP粉末研磨均匀后，取适量样品均匀分散于样品盘的双面胶上，喷金，抽真空，在加速电压为15kV的条件下获取SCSCP-Fe及SCSCP的微观结构，并进行对比分析，结果如图6所示，其中，图A-D分别为DY、DY-Fe、LR和LR-Fe的能谱测试结果，左侧图为点扫时在样品结构表面所选取的范围，右侧图为能谱测试得到的样品主要元素分布情况。
从图中可以看出，DY肽中C、N、O元素占比分别为38.22％、41.12％、20.66％，不含铁元素，而DY肽铁螯合物(DY-Fe)中的C、N、O、Fe四种元素占比分别为32.35％、30.33％、31.66％、5.66％，其能谱结果中出现了铁元素的峰；这种铁元素的百分比变化也发生在LR肽与LR肽铁螯合物(LR-Fe)的元素分布结果中，表明DY肽和LR肽与Fe2+发生了螯合作用，导致DY-Fe和LR-Fe的元素分布中出现了较多的铁元素占比。另外，DY-Fe中的铁元素百分比为5.66％，高于LR-Fe中的铁元素百分比4.56％，推测可能9肽DY比10肽LR结合Fe2+的能力强。
(2)胶原肽螯合铁离子前后的晶体结构分析
利用X射线衍射仪对DY肽、DY肽铁螯合物(DY-Fe)、LR肽和LR肽铁螯合物(LR-Fe)进行晶体形态分析，结果如图7所示。
从图中可以看出，对比LR肽和DY肽可知，LR肽在2θ为8°、16°、19°、23°处左右出现强衍射峰，DY肽在2θ为12°、19°及25°处左右出现衍射峰，与Fe2+螯合后，LR-Fe的衍射峰强度下降并逐渐向大掠角方向移动(2θ为8°、19°、23°)甚至消失(2θ为16°)，DY-Fe的XRD图谱中在2θ为22°处左右出现一个宽的散射衍射峰，其他地方的衍射峰消失，即两个肽段螯合前后均呈现出截然不同的形态特征，这两个肽段与Fe2+螯合后的衍射峰减弱甚至消失，近似无定形光谱，属于非晶形结构，表明Fe2+呈高度分散状态，与肽段以配位键的形式结合。
(3)胶原肽铁结合位点分析
利用傅里叶变换红外光谱对胶原肽铁结合位点进行分析，结果如图8所示。
从图中可以看出，DY肽和LR肽与Fe2+螯合前后的红外光谱特征峰有差异，说明Fe2+的加入影响了原本的官能团吸收峰的位置。肽段中的N-H拉伸振动分别从3298cm-1(DY)、3278cm-1(LR)移动至3308cm-1、3290cm-1，并且添加Fe2+后峰变宽，表明–NH2和-NH基团参与了螯合反应，N-Fe键取代了N-OH(氢键)。酰胺I带(1700-1600cm-1)主要与肽链上C＝O的伸缩振动有关，DY和LR的吸收峰分别从1644cm-1、1636cm-1偏移至1660cm-1、1632cm-1，表明肽段与Fe2+的结合与羧基、酰胺基有关。酰胺II带的特征频率通常位于1600-1550cm-1的范围内，由N-H弯曲振动和C-N拉伸振动产生。DY和LR在酰胺Ⅱ带处的波数分别为1516cm-1和1548cm-1，与Fe2+结合后分别蓝移至1519cm-1、1558cm-1，可能是Fe2+的加入取代了N-H键上的H生成了Fe-N键所致。DY和LR分别在1234cm-1和1288cm-1处的吸收峰对应于酰胺III带(1320-1220cm-1)，表现为肽段的-COO-基团的特征峰，与Fe2+结合后，分别偏移至1243cm-1和1236cm-1，发生这种吸收峰变化的原因可能是DY肽段(天冬氨酸、谷氨酸和N端的酪氨酸)和LR肽段中(天冬氨酸、谷氨酸和N端的精氨酸)的羧基氧原子提供自由电子对与Fe2+发生结合反应形成-COO-Fe所致。综上，DY肽和LR肽主要通过其肽链上的羧基、氨基和酰胺基上的氮原子与Fe2+结合。
(4)等温滴定量热分析(ITC)
以50mM的Tris-HCI缓冲液(pH 7.5)为溶剂，配置2mM的FeCl2溶液、0.1897mM的DTSGGYDEY肽溶液和0.1730mM的LQGSNEIEIR肽溶液，使用ITC将Fe2+分别滴定到DTSGGYDEY和LQGSNEIEIR这两个肽溶液中，得到等温滴定曲线如图9所示，相互作用的热力学参数总结如表3所示。
表3通过等温滴定量热分析测定的铁离子与DY肽和LR肽结合特性的参数
由等温滴定曲线可知，Fe2+逐渐滴到两个肽溶液的过程中，其热量逐渐减小，相互作用导致负的ΔH值和ΔG值，这表明Fe2+与DY肽和LR肽的螯合反应是一个放热反应。另一方面，螯合物形成的正ΔS值表明这些反应具有熵性，该过程是一个熵增的驱动反应，发生这种变化的主要原因可能是体系的溶剂化效应或构象的自由变化所致。研究表明，两个分子之间的主要作用力类型与ΔH、ΔS和ΔG三者之间的关系密切；当ΔH＞0，ΔS＞0时，表示两个分子之间的作用力主要为疏水相互作用；当ΔH＜0，ΔS＜0时，主要表现为氢键和范德华力；当ΔH＜0，ΔS＞0时，主要是静电相互作用。由表3中的数据可知，Fe2+滴定到DY肽溶液中产生的ΔH为-6.623kJ/mol，ΔS为55.05kJ/mol；Fe2+滴定到LR肽溶液中产生的ΔH为-18.41kJ/mol，ΔS为26.74kJ/mol，即两个体系中的ΔH＜0，ΔS＞0，这表明Fe2+与两个肽段的结合主要表现为静电相互作用，该结果与使用计算机模拟得出的库仑力(DY：-66.4024±16kJ/mol，LR：-23.5549±4.5kJ/mol)占主导的结果相呼应。相互作用导致负ΔH值(DY：-6.623kJ/mol，LR：-18.41kJ/mol)和ΔG值(DY：-23.035kJ/mol，LR：-26.385kJ/mol)，意味Fe2+和两个肽段的络合是自主发生的。
对于DY组，DTSGGYDEY与Fe2+的Ka和Kd分别为1.086×104M和9.208×10-5M-1，在进行ITC滴定时，化学计量比可由计算机直接给出，经测定，DY肽与Fe2+的化学计量比为1:2(n＝2.160)，表明肽上含有两个功能铁螯合位点，平均一个DY肽分子大约与2个铁原子结合；对于LR组，LR肽与Fe2+的Ka和Kd分别为4.195×104M和2.384×10-5M-1，LR肽与Fe2+的化学计量比为1:1(n＝1.251)，表明大约每个LR肽分子可结合一个铁原子。比较两者的Ka和Kd的大小可以看出，DY肽与Fe2+结合力弱于LR肽，而解离能力优于LR肽。
实施例3铁螯合胶原肽体外促铁吸收活性研究
(1)细胞毒性测试
使用CCK-8法检测不同浓度氯化亚铁(5-50μg/mL)对人结直肠腺癌细胞(Caco-2细胞)存活率的影响，将不同浓度(0.05-1.2mg/mL)的DY肽和LR肽与固定浓度的氯化亚铁混合测试其对Caco-2细胞存活率的影响。
图10示出了不同浓度的氯化亚铁(图A)及肽铁混合物(图B)对细胞存活率的影响。从图A中可以看出，随着FeCl2浓度的增加，细胞存活率逐渐下降，但在5-50μg/mL的FeCl2条件下细胞存活率始终维持在80％以上，对细胞的生长无显著影响，同时为方便测量铁的转运量不能选择太低的铁浓度，故选择30μg/mL FeCl2作为铁转运实验的固定浓度。如图B所示，为筛选适宜的肽浓度范围，以30μg/mL FeCl2作为空白对照组，将30μg/mL FeCl2与不同浓度的DY肽、LR肽混合作为实验组，混合培养24h后，Caco-2细胞的存活率均在85％以上，表明适宜浓度(0.05-1.2mg/mL)的DY和LR肽段与30μg/mL的FeCl2混合对细胞生长无毒性作用，因此选择0.1、0.2、0.4mg/mL这三个对细胞毒性作用小的浓度梯度用于进一步的铁转运实验来评价两条肽的促铁吸收效果。
(2)DY肽和LR肽促铁吸收效果评价
如图11所示，建立Caco-2细胞单层模型评价消化液中铁的转运效果，用于构建模型的细胞代数在20-50代之间，将处于对数生长期的细胞制成细胞悬液，将细胞接种于12孔Transwell插入式培养板中，细胞接种密度为2×105个/mL。在转运槽肠腔侧(AP侧，上室)加入0.5mL的细胞悬液，在基底侧(BL侧，下室)加入1.5mL的完全培养基。培养第一周隔天换液，一周后每天换液。待细胞生长至22天后评估备用。
用提前预热好的HBSS缓冲液清洗通过完整性评估的Caco-2单层细胞2次，并在培养箱中孵育30min。吸弃HBSS缓冲液，上室加入0.5mL用HBSS缓冲液配置的样品(30μg/mL的FeCl2、30μg/mL的FeCl2+0.1mg/mL的DY/LR、30μg/mL的FeCl2+0.2mg/mL的DY/LR、30μg/mL的FeCl2+0.4mg/mL的DY/LR)，下室加入1.5mL HBSS缓冲液，37℃下孵育2h后从BL侧吸取0.5mL溶液待测，将收集的转运液用HNO3和HCIO4混合消化，采用原子吸收法测定其铁含量，并计算铁转运量。
如图12所示，上室加入30μg/mL FeCl2，比较了不同浓度的九肽DY和十肽LR对单层细胞铁转运量的影响，DY/LR的浓度可影响Caco-2单层细胞对铁的转运。对于LR组，随着肽浓度的增加，铁转运量逐渐上升，添加0.1mg/mL和0.2mg/mL时，铁转运量分别为0.2316和0.2349μg/well，较未加肽空白组分别提高了16.69％、18.86％，当LR的浓度为0.4mg/mL时，促铁吸收活性最高，铁转运量达到0.3175μg/well，相比于未加肽空白组时提高了43.32％，差异显著(p＜0.05)；对于DY组，随着肽浓度的增加，铁转运量与未加肽空白组相比呈显著性上升(p＜0.05)，当上室加入0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/mL的DY肽时，铁转运量分别为0.3188、0.6112和0.3515μg/well，较未加肽空白组分别提高了29.33％、117.7％、93.87％，当DY的浓度为0.2μg/mL时，促铁吸收活性最高。此外，在相同肽浓度下，DY组铁的转运量高于LR组。
上述结果表明，肽段DY和LR均可与一定量的Fe2+结合，避免Fe2+可发生氧化沉淀，从而提高了铁的生物利用度，而且均具有良好的促铁吸收的能力。且DY肽促铁吸收的效果优于LR肽。由等温滴定结果可知，LR肽与Fe的化学计量比为1:1，而DY肽与Fe的化学剂量比为1:2，由于LR肽与铁的结合量不如DY肽多，导致DY肽促铁转运能力优于LR肽。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种具有铁螯合活性的胶原肽，其特征在于，所述胶原肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
2.一种具有铁螯合活性的胶原肽在制备铁补充剂中的应用，其特征在于，所述胶原肽为DY肽或LR肽，所述DY肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述LR肽的氨基酸序列如SEQID NO.9所示；
所述应用包括：将所述胶原肽与铁离子溶液混合，制得肽铁螯合物，应用于所述铁补充剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述铁补充剂为具有补铁功能的药品或保健品。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述铁离子溶液选自氯化亚铁溶液、硫酸亚铁溶液和硝酸亚铁溶液中的至少一种；
所述DY肽与所述铁离子溶液中铁离子的摩尔比为1：2，所述LR肽与所述铁离子溶液中铁离子的摩尔比为1：1。
5.一种具有铁螯合活性的胶原肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将经过脱脂脱钙处理的鲢鱼鱼鳞粉碎，得到鲢鱼鱼鳞粉末；
S2、向所述鲢鱼鱼鳞粉末中加入碱性蛋白酶，进行酶解处理，所述碱性蛋白酶的添加量为400-500U/g，酶解时间为4-6h，酶解完成后，高温灭酶，离心取上清液并超滤，收集分子量小于3kDa的组分，浓缩干燥得到鲢鱼鱼鳞酶解物；
S3、采用液相色谱串联二级质谱技术解析所述鲢鱼鱼鳞酶解物中的多肽组分；
S4、对步骤S3中解析出的所述多肽组分进行分子结构模型构建和分子动力学模拟，结合均方根误差值、羧基氧与亚铁之间的相互作用能及铁原子与氧原子之间的动态距离分析，筛选得到具有铁螯合活性的胶原肽，所述胶原肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤S4中，通过Alphofold2在线软件构建分子结构模型，之后通过GROMACS2021.4软件进行分子动力学模拟，选用Amber力场，水分子采用SPC模型，添加亚铁离子和氯离子到立方体水盒子中平衡电荷并进行能量最小化处理，得到均方根误差值、羧基氧与亚铁之间的相互作用能及铁原子与氧原子之间的动态距离。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的羧基氧与亚铁之间的相互作用能包括Lennard-Jones近程能量和Coul-SR近程能量。
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| CN117024573A (zh) | 2023-11-10 |
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