CN116964066A - 唾液酸寡糖的纯化 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及从产生唾液酸化寡糖的水性介质中分离和纯化唾液酸化寡糖。
Description
技术领域
本发明涉及从微生物产生唾液酸化寡糖的发酵液中分离和纯化唾液酸化寡糖。
背景技术
在过去的几十年中，人们对人乳寡糖(HMO)的制备和商业化的兴趣一直在稳步增长。人乳寡糖的重要性与其独特的生物活性直接相关。唾液酸化人乳寡糖是母乳的主要成分之一，例如二唾液酸基-乳-N-四糖、3’-O-唾液酸基-3-O-岩藻糖基乳糖、6’-O-唾液酸乳糖、3’-O-唾液酸乳糖、6’-O-唾液酸化-乳-N-新四糖和3’-O-唾液酸化-乳-N-四糖。在这些唾液酸化的人乳寡糖中，唾液酸残基总是通过α-糖苷键，连接到末端D-半乳糖的3-O-和/或6-O-位或非末端GlcNAc残基的6-O-位。因为它们在支持对病原体的抵抗力、肠道成熟、免疫功能和认知发育方面发挥着作用，唾液酸化HMO被认为对新生儿具有显著的健康益处(tenBruggencate等Nutr.Rev.72,377(2014))。
由于HMO在众多人类生物过程中的作用，在过去十年中，开发合成HMO(包括唾液酸化HMO)工艺的努力得到显著增加。在这方面，已经开发了通过微生物发酵、酶促法、化学合成或这些技术的组合来产生它们的工艺。在生产力方面，已证明在实验室规模上产生3’-SL和6’-SL的发酵工艺是有前途的。
然而，从复杂基质(如发酵液)中分离唾液酸化乳糖或唾液酸化寡糖是一项具有挑战性的任务。根据最新进展，从发酵液中纯化唾液酸乳糖通常包括膜过滤与离子交换色谱法的组合，其中离子交换色谱法包括用H+-型强酸性阳离子交换剂和Cl--型强碱性阴离子交换剂处理含有唾液酸乳糖的溶液(参见例如EP-A-3456836、WO 2019/043029、WO 2019/110803、WO 2019/229118)。
应用强碱性阴离子交换剂的缺点是树脂的抗衡离子被释放到洗脱液中。因此，需将洗脱液的pH值设置为所需值和/或需在后续步骤中去除(例如通过纳滤)由此产生的无机盐。
因此，人们一直在寻找一种以工业规模从水性介质(例如发酵液)中分离和纯化唾液酸寡糖(sialooligosaccharide)、优选唾液酸乳糖的经济方法，其中离子交换树脂处理直接提供所需纯度/测定的唾液酸寡糖，同时保持较高回收率。
发明内容
本发明涉及一种从水溶液中纯化唾液酸化寡糖的方法，该水溶液是或来源于包含所述唾液酸化寡糖的发酵液或酶促反应混合物，该方法包括用离子交换树脂处理所述水溶液，其中
-离子交换处理包括将包含唾液酸化寡糖的水溶液与H+-型强酸性阳离子交换树脂接触，然后与游离碱型弱碱性阴离子交换树脂接触，并且其中
-在所述离子交换处理之前，将强酸的无机阴离子添加至包含唾液酸化寡糖的水溶液中，优选的量为游离碱型弱碱性阴离子交换树脂相对于唾液酸化寡糖的结合能力的约1～2摩尔当量。
因此，本发明涉及一种从水溶液中分离唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖的方法或工艺，该方法包括将包含所述唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖的所述水溶液用H+-型强酸性阳离子交换树脂处理，然后用游离碱型弱碱性阴离子交换树脂处理，其中水溶液还包含在树脂处理之前添加到水溶液中的强酸的无机阴离子，优选为氯离子，例如以NaCl的形式，优选为给定的量的NaCl。此外，本发明涉及一种从水溶液中分离唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖的方法或工艺，该方法包括例如通过超滤、纳滤、活性炭处理或其任意组合预处理包含发酵液或酶促反应混合物的水性介质，以得到包含所述唾液酸化寡糖的水溶液，并将该水溶液用H+-型强酸性阳离子交换树脂处理，然后用游离碱型弱碱性阴离子交换树脂处理，其中水性介质进一步包含以给定的量共添加的强酸的无机阴离子，优选氯离子，例如以NaCl的形式。
在一个实施方式中，分离/纯化方法还包括以下步骤：
-超滤(UF)，优选地，从水性介质中分离生物质和/或酶，
-纳滤(NF)，优选地，浓缩预处理的水性介质中的唾液酸化寡糖，和/或降低预处理的水性介质的无机盐含量，和/或从预处理的水性介质中的唾液酸化寡糖中分离低分子量有机化合物如单糖或乳糖，和/或
-活性炭(AC)处理，优选地，将任选预处理的水性介质进行脱色。
优选地，UF步骤在任何NF和AC步骤以及离子交换树脂处理之前进行。可以在离子交换树脂处理后收集唾液酸化寡糖。
同样优选地，水性介质是培养能够从内化的碳水化合物前体产生所述唾液酸化寡糖的转基因微生物的发酵液。
同样优选地，该方法在包含唾液酸化寡糖的水性介质上按以下顺序进行：UF步骤、NF步骤、任选的AC处理以及用H+-型强酸性阳离子交换树脂处理，然后用游离碱型弱酸性阳离子交换树脂处理，其中水性介质进一步包含以给定的量共添加的强酸的无机阴离子，优选氯离子，例如NaCl。
本发明的一个实施方式涉及一种用于从发酵液中分离和纯化唾液酸化寡糖的方法，其中所述唾液酸化寡糖是通过培养能够从内化的碳水化合物前体产生所述唾液酸化寡糖的转基因微生物来产生的，包括以下步骤：
a)对发酵液进行超滤(UF)并收集UF渗透物(UFP)，
b)对UFP进行纳滤(NF)并收集NF渗余物(NFR)，
c)任选地，用活性炭处理UFP和/或NFR，并收集活性炭洗脱液(CE)，
d)以给定量将强酸的无机阴离子、优选氯离子、例如NaCl添加至NFR或CE，以及
e)将步骤d)中获得的水溶液用H+-型强酸性阳离子交换树脂处理，然后用游离碱型弱碱性阴离子交换树脂处理。
优选地，步骤按以下顺序进行：步骤a)、步骤b)、任选的步骤c)、步骤d)、步骤e)。
优选地，唾液酸化寡糖在其结构中包含仅一个唾液酸基部分(也可以称为单唾液酸化寡糖)。
优选地，唾液酸化寡糖是酸性人乳寡糖(HMO)(也可以称为唾液酸化HMO)。
优选地，唾液酸化HMO在其结构中包含仅一个唾液酸基部分(也可以称为单唾液酸化HMO)。
优选地，单唾液酸化HMO是唾液酸乳糖，例如3’-SL或6’-SL。
具体实施方式
根据本发明，术语“唾液酸化寡糖”优选是指含有至少两个单糖单元的糖聚合物，其中至少一个是唾液酸基(N-乙酰神经氨酰基)部分。唾液酸化寡糖可具有直链或支链结构，其包含通过糖苷间键彼此连接的单糖单元。有利地，唾液酸化寡糖是酸性人乳寡糖。
术语“酸性人乳寡糖”、“酸性HMO”“唾液酸HMO”优选是指在母乳中发现的复合唾液酸化寡糖(Urashima等:Milk Oligosaccharides.Nova Science Publishers,2011；ChenAdv.Carbohydr.Chem.Biochem.72,113(2015))包含还原端的乳糖单元作为核心结构，还原端可以被一个或多个β-N-乙酰基-乳糖胺基和/或一个或多个β-乳-N-生物糖基单元延长，并且该核心结构被α-N-乙酰基-神经氨酰基(唾液酸基)部分取代并且任选地可以被L-岩藻吡喃糖基部分取代。在这方面，酸性HMO在其结构中具有至少一个唾液酸残基。酸性HMO的实例包括3’-唾液酸乳糖(3’-SL)、6’-唾液酸乳糖(6’-SL)、3-岩藻糖基-3’-唾液酸乳糖(FSL)、LST a、岩藻糖基-LST a(FLST a)、LST b、岩藻糖基-LST b(FLST b)、LST c、岩藻糖基-LST c(FLST c)、唾液酸基-LNH(SLNH)、唾液酸基-乳-N-六糖(SLNH)、唾液酸基-乳-N-新六糖I(SLNH-I)、唾液酸基-乳-N-新六糖II(SLNH-II)和二唾液酸基-乳-N-四糖(DS-LNT)。术语“唾液酸化乳糖”优选表示为3’-SL或6’-SL。
术语“转基因细胞”或“转基因微生物”优选是指细胞或微生物，例如细菌细胞，例如大肠杆菌(E.coli)细胞，其DNA序列至少有一个改变。这种改变会导致野生型细胞的原始特征发生变化，例如由于引入了编码野生型细胞中不存在的酶的表达的新遗传材料，改性细胞能够进行额外的化学转化，或者由于移除基因/基因(敲除)，改性细胞无法进行降解等转化。可以通过本领域技术人员熟知的基因工程技术以常规方式产生转基因细胞。
术语“能够从内化的碳水化合物前体产生唾液酸化寡糖的转基因细胞或微生物”优选是指经过遗传学处理(参见上文)以包含编码合成所述唾液酸化寡糖所需的唾液酸转移酶的重组基因的细胞或微生物，合成所述唾液酸化寡糖是产生适合由所述糖基转移酶转移到碳水化合物前体(受体)的唾液酸核苷酸供体的生物合成通路，和/或碳水化合物前体(受体)从培养基内化到细胞中的机理，在细胞中它被唾液酸化以产生感兴趣的唾液酸化寡糖。
术语“包含唾液酸化寡糖的水性介质”优选地是指其中产生或合成所述唾液酸化寡糖的水性反应或生产混合物，并且在反应或生产结束时获得所述水性反应或生产混合物。这种水性介质通常是发酵液或离体酶促反应混合物。因此，根据合成反应的性质或生产方法，水性介质通常包括——除了作为主要产物的唾液酸化寡糖——不同种类的副产物、未反应的反应物或试剂、中间体、催化剂、添加剂、溶剂(水除外)等。
术语“包含唾液酸化寡糖的水溶液”优选是指根据本发明进行离子交换树脂处理的包含所述唾液酸化寡糖(参见上文)的任选预处理的水性介质。在这方面，包含唾液酸化寡糖的水性介质可以直接进行根据本发明的离子交换树脂处理，或者在进行根据本发明的离子交换树脂处理之前，通过通常不同于离子交换处理的一个或多个步骤来预处理该水性介质。在上述定义的意义上，术语“包含唾液酸化寡糖的水溶液”包括包含所述唾液酸化寡糖的水性介质和包含所述唾液酸化寡糖的经预处理的水性介质。通过预处理，水性介质被部分纯化，从而减少一些污染物的量。
术语“约”是指，在一个实施方式中，与指示值存在±10％偏差，或在另一实施方式中，±5％偏差。
为了克服现有技术中存在的上述问题，本发明人对现有技术的工艺进行了改进，以弱碱性阴离子交换树脂代替强碱性阴离子交换树脂，以去除各种类型的离子杂质，例如无机物、蛋白质、氨基酸等。
弱碱性阴离子交换树脂通常含有具有吸引质子的孤对电子的碱基，例如某些含氮基团，其包括例如伯胺、仲胺、叔胺(游离胺基)、胍基或含氮杂芳基(如吡啶、嘧啶等)，优选叔胺。在游离碱形式中，碱基不是质子化形式，换而言之，碱基中不存在抗衡阴离子。因此，该基团能够整体吸附酸，即酸阳离子(H+)和酸阴离子(X-)都能在不进行离子交换(不释放抗衡离子)的情况下从进料溶液中去除。因此，用H+-型强酸性阳离子交换剂、随后用游离碱型弱碱性阴离子交换剂进行离子交换剂处理可以直接得到几乎不含盐的溶液，从而不需要进一步纯化/脱盐。
在这方面，用弱碱性阴离子树脂替代强碱性阴离子交换树脂似乎是一个不错的选择。此外，弱碱性阴离子树脂的再生比强碱性阴离子交换剂更容易且成本更低。然而，本发明人发现，弱阴离子树脂相比于Cl--型强碱性阴离子交换剂，更易于结合更多的唾液酸化寡糖/唾液酸乳糖，因此唾液酸化寡糖/唾液酸乳糖的总回收率可能降低约10～15％。
本发明人惊奇地发现了一种工艺/方法，是通过将游离碱型弱碱性阴离子交换树脂的应用所带的优势效果和现有技术的高回收率相结合。在这方面，提供了一种从水溶液中纯化唾液酸化寡糖的方法，该水溶液是或源自包含所述唾液酸化寡糖的发酵液或酶促反应混合物，该水溶液任选地经过预处理，包括用离子交换树脂处理所述水溶液，其中
-离子交换处理包括将包含唾液酸化寡糖的水溶液与H+-型强酸性阳离子交换树脂接触，然后与游离碱型弱碱性阴离子交换树脂接触，并且其中，
-在树脂处理之前，将强酸的无机阴离子、优选氯离子、例如NaCl添加至包含唾液酸化寡糖的水溶液中。
在一个实施方式中，添加的阴离子的量为游离碱型弱碱性阴离子交换树脂相对于唾液酸化寡糖的结合能力的约1～2摩尔当量。
因此，本发明涉及一种从存在其它化合物的水溶液中纯化唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖的方法，例如，在通过培养能够由内化的碳水化合物前体产生所述唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖的转基因细胞或微生物所获得的发酵液中或在酶促反应混合物中。
本发明的方法直接提供一种高度富集唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖的纯化溶液，从该溶液中可以获得高收率和高纯度唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖，尤其是无机阴离子含量非常低。
包含唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖的水溶液，优选是经过发酵或离体酶促反应后得到的，可以直接进行上述公开的离子交换树脂处理，但如后文所述，优选在离子交换树脂处理前进行预处理。
在对包含唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖的水溶液进行离子交换树脂处理之前，向进料中添加阴离子。如上所述，弱碱性阴离子交换树脂对唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖具有一定的结合能力。不受特定理论束缚的情况下，发明人认为向进料中添加的共阴离子(co-anion)，其竞争性地结合至弱碱性阴离子交换树脂的官能团，因此唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖保留在溶液中，且穿过树脂而并不与它结合。因此，可以最大限度地减少唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖在树脂上的损失，并且可在洗脱液中收集较多量的唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖。
添加的共阴离子通常是无机酸阴离子。示例性阴离子是强无机酸阴离子，例如氯离子、溴离子、碘离子、硫酸根、亚硫酸根、硝酸根、磷酸根、磷酸氢根、亚磷酸根、高氯酸根等，优选氯离子。共阴离子可以在树脂处理之前以酸或其盐的形式添加到进料溶液中，优选以盐的形式。共阴离子的盐的阳离子通常是选自除Be2+之外的第I族和第II族离子的强无机碱的阳离子，例如钠、钾、锂、钙或镁离子，然而也可以选择来自弱碱的阳离子，例如铵、Al3+或Fe3+。优选的盐是水溶性中性盐，更优选氯化物，例如LiCl、NaCl、KCl、MgCl2或CaCl2，尤其是NaCl。
任何量的共添加阴离子都会提高离子交换色谱后唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖的回收率，因为共添加阴离子抑制了唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖与弱碱性阴离子交换树脂的结合。优选地，为了实现商业相关回收率改进，共添加阴离子的摩尔量是唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖与弱碱性阴离子交换树脂结合的摩尔量的至少0.5当量(分别与阴离子和唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖的电荷有关)：例如约0.6、0.7、0.8、0.9或1当量。一定当量的共添加阴离子的摩尔量意味着阴离子与唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖所带的电荷也被考虑在内，并因此被归一化。当共添加阴离子的电荷与唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖的电荷相等时，1当量是指共添加阴离子的摩尔量与结合的唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖的摩尔量相同。在这种情况下，例如，共添加阴离子和唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖两者分别是一价(例如氯离子、溴离子、碘离子、硝酸根或高氯酸根，以及单唾液酸化寡糖/单唾液酸化乳糖[条件是寡糖/乳糖不含除唾液酸基之外的带电部分)或二价(例如硫酸根，以及二唾液酸化寡糖/二唾液酸化乳糖)。当共添加阴离子的电荷与唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖的电荷不相等时，例如存在以下情况：
-共添加阴离子是二价，并且唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖是一价：1当量的共添加阴离子是指其相对于结合的唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖的1/2摩尔量；
-共添加阴离子是三价(例如磷酸根)，并且唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖是一价：1当量的共添加阴离子是指其相对于结合的唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖的1/3摩尔量；
-共添加阴离子是一价，并且唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖是二价：1当量共添加的阴离子是指其相对于结合的唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖的2倍摩尔量。
在一个实施方式中，阴离子的添加量大于1当量，例如至多2当量、至多3当量、至多5当量或甚至至多10当量。然而，在达到弱碱性树脂与共阴离子的结合能力(其值与唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖的(结合能力)值不同)后，共阴离子渗漏到洗脱液中。在这种情况下，虽然唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖的回收率仍然很高，但可能需要额外的步骤来从洗脱液中去除过量的共阴离子。
在这方面，根据一个优选的实施方式，共添加阴离子的摩尔量设定为约0.5当量至约3当量，优选为0.75～2.5当量，例如0.75～2、0.75～1.51～2.5、1～2或1～1.5当量。在这种情况下，唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖的回收率足够高，同时阴离子不会渗漏到洗脱液中。特别优选的范围是1～2或1～1.5当量。
为了测定游离碱型弱碱性阴离子交换树脂对唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖的结合能力，将包含唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖的进料溶液应用至填充有游离碱型弱碱性阴离子交换树脂的柱顶部，用水洗脱，并收集洗脱液级分。树脂的结合能力可以通过唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖的初始量减去通过树脂的量计算得到，该差值通过进料溶液和洗脱液的浓度和体积，以及树脂的体积可知，如以下实验部分所示。
在本发明的方法中应用的质子化(H+)型强阳离子交换树脂结合进料溶液中存在的无机阳离子，以及任选地利用产生菌株在发酵过程中代谢产生的有机胺，氨基酸和短肽也被有效地结合和去除。所获得的树脂洗脱液包含酸性形式的唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖。
合适的酸性阳离子交换树脂的非限制性实例可以是例如：AmberliteTMIR100、AmberliteTMIR120、AmberliteTMFPC22、DowexTM50WX、FinexTMCS16GC、FinexTMCS13GC、FinexTMCS12GC、FinexTMCS11GC、LewatitTMS、DiaionTMSK、DiaionTMUBK、AmberjetTM1000、AmberjetTM1200、DowexTM88。
游离碱型弱碱性阴离子交换剂整体吸附无机酸并将其从进料溶液中去除，但不与唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖结合。合适的弱碱性阴离子交换剂的非限制性实例是DowexTM66或AmberliteTMFPA53。
经过上述公开的步骤后，所得到的唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖溶液可以进行喷雾干燥、冷冻干燥或结晶以获得固体形式的唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖。另外，唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖可以通过例如蒸馏，优选真空蒸馏或纳滤等方式除去水分，以浓缩水溶液或糖浆的形式提供。
根据本发明的方法，在将包含唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖的水溶液应用于上述公开的树脂装置之前，还可以进一步包括其它步骤。
一旦通过发酵或离体酶促工艺产生唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖，则优选在离子交换处理之前对包含唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖的水性介质进行预处理，例如进行超滤，优选将其作为第一步。除了产生的唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖之外，发酵液通常还含有所用微生物细胞的生物质以及蛋白质、蛋白质片段、DNA、内毒素、生物胺、无机盐、未反应的碳水化合物受体(例如乳糖)、糖类副产物、唾液酸、着色体等。离体酶促反应混合物通常除了所产生的唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖之外，还含有蛋白质、蛋白质片段、无机盐、未反应的碳水化合物受体(例如乳糖)、糖类副产物、唾液酸及其前体等。超滤步骤是将生物质和高分子量悬浮固体与水性介质的可溶性成分分离(保留)，可溶性成分通过超滤膜至渗透液中。该超滤渗透物(UFP)是含有所产生的唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖的水溶液。
可使用任何常规超滤膜，截留分子量(MWCO)范围为约1至约500kDa，例如10～250、50～100、200～500、100～250、1～100、1～50、10～25、1～5kDa、任何其它合适的子范围(根据供应商的规格)。膜材料可以是陶瓷或由合成或天然聚合物制成，例如聚砜、聚丙烯、醋酸纤维素或聚乳酸。超滤步骤可以采用死端或错流模式。该UF步骤可以包括使用具有不同MWCO的膜进行不止一个超滤步骤，例如使用两步超滤分离，其中第一膜的MWCO高于第二膜。这种布置可以更高效地分离水性介质中较高分子量组分。在该分离步骤之后，渗透物含有分子量低于第二膜的MWCO的材料，包括感兴趣的唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖。
在一个实施方式中，使用MWCO为5～30kDa，例如10～25、15或20kDa的膜对水性介质，优选发酵液进行超滤。
生物质分离可以通过将发酵液离心，而不是UF来进行。
包含唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖的水性介质的预处理可以包括纳滤(NF)步骤。NF步骤可以在UF步骤或任选的活性炭处理(见下文)步骤之后进行。该纳滤步骤可以有效用于浓缩先前处理过的包含唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖的水性介质和/或去除离子(主要是一价离子)，以及分子量低于唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖的有机材料(如单糖)。纳滤膜的MWCO可确保截留感兴趣的唾液酸化寡糖\唾液酸化乳糖，其MWCO低于步骤a)中使用的超滤膜的MWCO，并且约为唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖分子量的25～50％。例如，MWCO为约150-300Da的纳滤膜适合于截留唾液酸化乳糖。在这种情况下，唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖积累于NF渗余物(NFR)中。纳滤可以与水渗滤组合使用，以便更有效地去除可渗透分子，例如直到渗透液的电导率显示不含盐或含盐量极低为止。
在纳滤的其它方面，其有效地适用于含有较多乳糖的UF渗透物，膜的MWCO为600～3500Da以确保截留三或更高唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖，并允许至少一部分乳糖穿过膜，其中膜的活性(顶)层由聚酰胺组成，并且其中所述膜上的MgSO4阻隔因子约为20～90％，优选为50～90％。然后，将应用的纳滤膜与三和更高唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖紧密结合，以便其被有效地截留。这种膜公开于WO 2019/003133中，其并入本文以供参考。
包含唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖的水性介质的预处理可以包括活性炭(AC)处理的步骤。AC步骤可以在UF步骤或NF步骤之后。如果需要的话，AC处理有助于去除或至少减少着色剂和/或水溶性污染物(例如盐)的量。
碳水化合物物质(如感兴趣的唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖)倾向于从其水溶液(例如在UF或NF步骤后获得的水溶液)中结合到活性炭颗粒的表面。同样地，着色剂也会吸附到活性炭上。当碳水化合物和着色材料被吸附时，未与活性炭结合或与活性炭结合较弱的水溶性材料可以用水洗脱。将洗脱液从水改为乙醇水溶液，吸附的唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖可以很容易地洗脱，并收集在单独的级分中。被吸附的着色物质仍吸附在活性炭上，从而可以同时实现脱色和脱盐。活性炭处理可以通过以下方式进行：在搅拌下将活性炭(例如粉末、球粒或颗粒)添加到唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖的水性介质/溶液中，滤出活性炭，在搅拌下重新悬浮在乙醇水溶液中，并通过过滤分离活性炭。在更大规模的纯化中，将UF步骤和/或NF步骤后的唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖的水溶液加载到填充有活性炭的色谱柱中，其可以任选地与硅藻土混合，然后用所需的洗脱液洗色谱柱。收集包含唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖的级分。如果需要，可以通过例如蒸发等方法从这些级分中除去乙醇，得到唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖的水溶液。
或者，在某些条件下，唾液酸化寡糖不被或至少基本上不被吸附在活性炭颗粒上，并且用水洗脱产生唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖的水溶液，且没有显著损失，同时着色物质仍然被吸附。
唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖可以通过化学合成、离体酶促合成或通过培养能够产生唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖的转基因来产生。产生唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖的优选方法是发酵。
对于6’-SL的化学合成，参见例如WO 2010/116317或WO 2011/100979。
对于通过使用转唾液酸酶进行唾液酸化乳糖的离体酶促合成，参见例如Maru等.Biosci.Biotech.Biochem.56,1557(1992)，Masuda等.J.Biosci.Bioeng.89,119(2000)或WO 2012/007588。对于使用唾液酸转移酶进行3’-SL的离体酶促合成，请参见例如WO 96/32492，Gilbert等.Nature Biotechnol.16,769(1998)，WO 99/31224或Mine等.J.Carbohydr.Chem.29,51(2010)。
包含转基因细胞的发酵生产优选以下列方式进行。外源添加的受体从培养基内化到细胞中，在细胞中在包括由唾液酸转移酶介导的酶促唾液酸化的反应中转化为感兴趣的唾液酸寡糖。在一个实施方式中，内化可以通过被动转运机制发生，在此过程中外源性受体被动地扩散穿过细胞的质膜。流动由细胞外和细胞内空间中相对于要内化的受体分子的浓度差所引导，该受体应该从较高浓度的位置传递到较低浓度区域，而趋于平衡。在另一个实施方式中，外源性受体可以借助主动转运机制而内化于细胞中，在此过程中外源性受体在细胞的转运蛋白或通透酶的影响下扩散穿过细胞的质膜。乳糖通透酶(LacY)对选自半乳糖、N-乙酰基-葡糖胺、半乳糖基化单糖(例如乳糖)、N-乙酰基-葡糖胺化单糖及其糖苷衍生物的单糖或二糖具有特异性。所有这些碳水化合物衍生物都可以很容易地被具有LacY通透酶的细胞通过主动转运的方式吸收，并在被糖基化之前在细胞中积累(WO 01/04341，Fort等.J.Chem.Soc,Chem.Comm.2558(2005)，EP-A-1911850，WO 2013/182206,WO 2014/048439)。这是因为细胞能够使用其LacY通透酶将这些碳水化合物受体转运到细胞中，而细胞缺乏任何可以降解这些受体的酶，特别是LacZ。可以通过已知的重组DNA技术的突变来改变对要内化的底物的糖基部分的特异性。在优选的实施方式中，外源添加的受体是乳糖，并且其通过细胞的乳糖通透酶(更优选为LacY)介导的主动转运机制发生内化。受体在内化到细胞后，通过异源性基因或核酸序列表达的唾液酸转移酶被唾液酸化，该异源性基因或核酸序列通过已知技术引入细胞，例如通过将其整合到细胞的染色体中或使用表达载体。转基因细胞包含生物合成通路，以产生适合由相应的唾液酸转移酶转移的唾液酸单糖核苷酸供体(通常是CMP-唾液酸)。转基因细胞可以通过两种方式产生CMP-唾液酸。以一种方式，外源添加的唾液酸被主动或被动内化，优选通过唾液酸通透酶主动内化，更优选通过nanT编码的唾液酸通透酶内化，随后通过CMP-NeuAc合成酶，例如由异源neuA编码的CMP-NeuAc合成酶转化为CMP-唾液酸。以另一种方式利用内部可得的UDP-GlcNAc，通过异源性neuC、neuB和neuA的表达，以ManNAc和唾液酸作为中间体，将UDP-GlcNAc转化为CMP-唾液酸。同时，醛缩酶基因(nanA)和/或ManNAc激酶基因(nanK)的失活/缺失抑制了细胞对唾液酸及其前体的分解代谢活性。内化的碳水化合物前体可以是唾液酸化以外的糖基化的主体，例如N-乙酰葡糖胺化、半乳糖基化和/或岩藻糖基化，然后如上所述进行唾液酸化。
在通过转基因微生物产生唾液酸化寡糖/唾液酸化乳糖的优选实施方式中，能够产生唾液酸化寡糖的微生物是大肠杆菌，优选携带neuBCA的LacZ-或LacY+LacZ-基因型。在微生物中的异源性唾液酸转移酶基因优选为α-2,3-或α-2,6-唾液酸转移酶，借助于这些唾液酸转移酶，以外源添加的乳糖作为碳水化合物受体，分别产生3’-SL或6’-SL。这样的微生物公开于例如WO 2007/101862，Fierfort等.J.Biotechnol.134,261(2008)和Drouillard等.Carbohydr.Res.345,1394(2010)或WO 2017/101958中。
因此，本发明的一个实施方式是一种从发酵液中分离唾液酸化乳糖的方法，该发酵液通过培养能够从内化乳糖产生所述唾液酸化乳糖的转基因微生物获得，包括以下步骤：
i)对培养液进行超滤以获得超滤渗透物，
ii)对超滤渗透物进行纳滤以获得纳滤渗余物，
iii)任选地，对纳滤渗余物进行活性炭处理以获得脱色水溶液，
iv)将阴离子添加至步骤ii)或iii)获得的溶液中，
v)用H+-型强阳离子交换树脂处理步骤iv)获得的水溶液，以及
vi)用游离碱型弱碱性阴离子交换树脂处理步骤v)的洗脱液并收集该洗脱液。
优选地，在步骤iv)中添加预定量的共阴离子。更优选地，共阴离子的量为与弱碱性阴离子交换树脂结合的唾液酸化乳糖的摩尔量的0.5-3当量(分别与阴离子和唾液酸化乳糖的电荷有关)。
实施例
产生6’-SL
根据WO 2017/101958，使用LacY+LacZ-基因型的大肠杆菌通过发酵产生6’-SL，该大肠杆菌具有整合在其染色体中并从其染色体中表达的α-2,6-唾液酸转移酶，以及从同一质粒表达的neuBCA和nadC。根据EP-A-3456836纯化(UF、NF)发酵液以提供包含6’-SL的水溶液，其用于以下实施例中。
实施例1
该实施例演示了与弱碱性树脂结合的6’-SL的量的测定。
将包含6’-SL的水溶液通过两个相互连接的填充有不同离子交换树脂的柱，使得来自树脂1的洗脱液直接导入树脂2的柱的顶部。树脂1是DowexTM88(H+-型强酸性阳离子交换树脂(SAC))，而树脂2是游离碱型弱碱性阴离子交换树脂DowexTM66。在来自树脂2的洗脱液中加入NaOH溶液，将pH值调节至5左右。
进行三个平行实验，每个实验的工艺操作参数汇总于下表中。
通过HPLC(在带PAD的CarboPac PA200上的离子色谱法)测定碳水化合物。
从数据中清楚的是，大量的6’-SL由于与弱碱性阴离子交换树脂结合而损失，少量的6’-SL经由水解而损失(根据乳糖平衡计算)。因此，一升的DowexTM66(湿体积)结合约0.2mol的6’-SL。
实施例2
在该实施例中使用了相同的6’-SL水溶液和相同的树脂设置，不同之处在于树脂进料中添加了计算量的NaCl。实验的工艺操作参数汇总于下表中：
将来自洗脱液的样品进行冷冻干燥，并用毛细管电泳分析无机阴离子含量：
| #4 | #5 | #6 | |
| 氯离子(wt％) | 0.071 | 0.004 | 3.42 |
| 硫酸根(wt％) | <d.l. | <d.l. | 0.09 |
| 磷酸根(wt％) | <d.l. | <d.l. | <d.l. |
*<d.l.：低于检出限
实施例证明，向树脂进料中添加1或1.5摩尔当量的NaCl(分别是实验#4和#5)有效地提高了6’-SL的回收率，而分离的样品中阴离子的量非常低并且远低于监管要求。在添加约10当量的NaCl的情况下(实验#6)，虽然回收率高，但是大量的盐污染了分离的6’-SL。
结论：与EP-A-3456836中公开的现有技术方法相比，所要求保护的改进的纯化方法以至少相同的收率和相同的纯度/测定(特别是在阴离子含量方面)提供6’-SL。
Claims (25)
1.一种从包含唾液酸化寡糖的水溶液中纯化所述唾液酸化寡糖的方法，所述方法包括用离子交换树脂处理所述水溶液，其中
-所述离子交换树脂处理包括将所述水溶液与H+-型强酸性阳离子交换树脂接触，然后与游离碱型弱碱性阴离子交换树脂接触，并且其中
-在所述离子交换处理之前，将强酸的无机阴离子添加至所述水溶液中。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述无机阴离子是氯离子。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述氯离子呈盐的形式。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述盐是NaCl。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中以计算摩尔量将所述无机阴离子添加至包含所述唾液酸化寡糖的所述水溶液中。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所添加的阴离子的摩尔量为所述弱碱性阴离子交换树脂相对于所述唾液酸化寡糖的结合能力的至少0.5当量。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中所添加的阴离子的摩尔量为所述弱碱性阴离子交换树脂相对于所述唾液酸化寡糖的结合能力的至多3当量。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所添加的阴离子的摩尔量为0.75～2.5当量。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述摩尔量为1～1.5当量。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中包含所述唾液酸化寡糖的所述水溶液是包括发酵液或离体酶促反应混合物的水性介质。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中包含所述唾液酸化寡糖的所述水溶液源自包括发酵液或离体酶促反应混合物的任选预处理的水性介质。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述水性介质包括发酵液。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其中包含所述唾液酸化寡糖的所述水溶液从包括发酵液或酶促反应混合物的所述水性介质经过一个或多个纯化步骤之后获得。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述一个或多个纯化步骤包括离心、超滤、纳滤、活性炭处理或其任意组合。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述一个或多个纯化步骤包括：
-对所述发酵液进行超滤以获得超滤渗透物，
-对所述超滤渗透物进行纳滤以获得纳滤渗余物，以及
-任选地，对所述纳滤渗余物进行活性炭处理以获得包含所述唾液酸化寡糖的脱色水溶液。
16.根据权利要求14或15所述的方法，所述方法包括：
a)对所述发酵液进行超滤(UF)并收集UF渗透物(UFP)，
b)对所述UFP进行纳滤(NF)并收集NF渗余物(NFR)，
c)任选地，用活性炭处理所述UFP和/或NFR，并收集活性炭洗脱液(CE)，
d)将强酸的无机阴离子、优选氯离子、例如NaCl添加至所述NFR或CE，以及
e)将步骤d)获得的水溶液用H+-型强酸性阳离子交换树脂处理，然后用游离碱型弱碱性阴离子交换树脂处理。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述唾液酸化寡糖在其结构中包含仅一个唾液酸基部分。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述唾液酸化寡糖是酸性人乳寡糖(HMO)。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述酸性HMO为3’-唾液酸乳糖(3’-SL)、6’-唾液酸乳糖(6’-SL)、3-岩藻糖基-3’-唾液酸乳糖(FSL)、LSTa、岩藻糖基-LSTa(FLSTa)、LSTb、岩藻糖基-LSTb(FLSTb)、LSTc、岩藻糖基-LSTc(FLSTc)、唾液酸基-LNH(SLNH)、唾液酸基-乳-N-六糖(SLNH)、唾液酸基-乳-N-新六糖I(SLNH-I)、唾液酸基-乳-N-新六糖II(SLNH-II)或二唾液酸基-乳-N-四糖(DS-LNT)。
20.根据权利要求18或19所述的方法，其中所述酸性HMO在其结构中包含仅一个唾液酸基部分。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述酸性HMO是3’-SL或6’-SL。
22.根据权利要求18～21中任一项所述的方法，其中所述酸性HMO由转基因微生物产生。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述转基因微生物是大肠杆菌。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述大肠杆菌携带基因簇neuBCA。
25.根据权利要求21所述的方法，所述方法包括：
i)培养能够从内化乳糖产生3’-SL或6’-SL的转基因微生物，
ii)对步骤i)的培养液进行超滤以获得超滤渗透物，
iii)对所述超滤渗透物进行纳滤以获得纳滤渗余物，
iv)任选地，对所述纳滤渗余物进行活性炭处理以获得脱色水溶液，
v)将NaCl添加至步骤iii)或iv)获得的溶液中，添加的摩尔量为所述弱碱性阴离子交换树脂相对于3’-SL或6’-SL的结合能力的0.75～2.5当量、优选1～1.5当量，
vi)用H+-型强阳离子交换树脂处理步骤v)获得的水溶液，以及
vii)用游离碱型弱碱性阴离子交换树脂处理步骤vi)的洗脱液并收集所述洗脱液。
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