CN116941606B - 脐带组织的细胞组织库的构建方法及其相关产品和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了脐带组织的细胞组织库的构建方法及其相关产品和应用，其包括平衡液和冻存液，所述平衡液包括：质量分数为0.5%~5%的甘油，100~2000μM的尿苷，2.5~25mM异亮氨酸，质量分数为5%~20%的人血白蛋白注射液，以及质量分数为30%~80%的右旋糖酐40氯化钠注射液；所述冻存液体还包括质量分数为5%~10%的DMSO。本发明提供的冻存液和平衡液能有效减少直接冷冻对为脐带组织块及其细胞的损伤，提高细胞复苏的产量和效能，且培养时间周期短，建库成本低。而且保存了脐带中的所有细胞类型和脐带组织中各种生物活性物质，最大程度的保存了脐带中的有用价值资源，避免了样本的资源浪费。
Description
技术领域
本发明涉及细胞组织库构建的技术领域，具体涉及一种脐带组织的细胞组织库的构建方法及其相关产品和应用。
背景技术
间充质干细胞 (mesenchymal stem/stromal cells, MSCs) 又称间充质基质细胞，属于成体干细胞的一种。由于 MSCs 来源广泛，容易分离，能快速扩增，且具有独特的免疫调节等特性，这使得其成为移植领域和治疗免疫性疾病的理想选择。从越来越多的动物实验和临床试验结果来看，MSCs 已经为治疗各种炎症相关性疾病提供了希望。从我国干细胞备案项目以及新药申报项目来看，MSCs 是当前干细胞治疗领域研究和应用最多的干细胞种类，而且超过60%采用了围产期脐带组织来源的MSCs（UCMSCs）。围产期脐带组织是医疗废物，多抛弃不用，具有来源丰富、采集方便、无伦理道德争议、受疾病的影响较小等优点。目前，已经发现几乎所有的UCMSCs比例高、免疫原性低、增殖分化能力强、免疫调节能力更强、易于规模化制备，已经越来越多的引起科学家及临床医生的青睐。Couto等人报告说，UCMSCs都是临床试验中占主导地位的围产期细胞类型，自2016年以来脐带组织是所有MSCs临床试验中MSCs的主要来源（Couto PS, Shatirishvili G, Bersenev A, Verter F.First decade of clinical trials and published studies with mesenchymalstromal cells from umbilical cord tissue. Regen Med 2019;14(4):309–319）。UCMSCs渐渐成为了新药研发和临床备案中备受青睐的干细胞来源。全球干细胞上市产品盘点我国干细胞备案项目以及新药申报项目均涉及到UCMSCs的多种不同的适应症。在2020年初，在新冠肺炎重症患者的救治中，UCMSCs也显示出了很好的疗效。国际上，UCMSCs治疗产品也在加速进入市场的步伐。
现代研究发现，新生儿伴随脐带组织中含有丰富的多种干细胞和各种生物活性物质。脐带组织中所含有以MSCs为主兼具其它类别的干细胞，比如内皮祖细胞。这也是一种重要的干细胞生物资源。除去各类活性细胞本身的临床价值外，伴随组织中的天然组织结构和各类核酸、蛋白分子如激素等重要活性成分，在临床疾病的诊断、治疗及科研上同样具有重要的意义。新生儿伴随组织是新生生命信息的重要承载物，也是极具医疗价值的初始生命信息来源，深入挖掘该信息是个体化医疗和健康维护的重要生命特征信息来源，同样是构建种族群体健康大数据的基础所在。通过存储的伴随组织采样分析不同种族初始健康信息，为各类常见疾病的预测、预防和治疗提供重要的决策依据，也是未来健康数据的重要内容。
干细胞库是大规模采集、制备、储存和具有提供干细胞的能力的场所和平台，又称为“生命银行”，干细胞库的建立可为MSCs的研究应用提供稳定的种子来源。近5年来，我国各省在省内的大中城市批准设置了各种地域性的干细胞库。国内的干细胞库为MSCs产业化提供了良好平台，也为MSCs临床应用提供了高质量、来源合法的干细胞“种子”，将会有力地促进MSCs的产业化和临床应用。
目前，行业内干细胞库保存UCMSCs的做法是：分离脐带华通氏胶，再经过原代和传代扩增培养到一定数量UCMSCs，然后进行深低温保存。中国发明专利申请号：202011388141.7（公开号：CN112481203A）公开了一种脐带间充质干细胞种子库的构建方法，公开如下步骤：1) 产妇筛查；2) 样本采集；3) 样本检测；4) 样本预处理；5) 细胞分离制备；6) 原代培养；7) 传代培养；8) 细胞检测；9) 细胞冻存；10) 建立可供检索的细胞信息档案；11) 编码入库并上传细胞信息档案。该方法存在以下几种缺点：1) 需要经过培养操作，时间周期长，制备成本高；2) 脐带中的其他类型的细胞和其它核酸、蛋白分子如激素等各种生物活性物质都将被作为废弃物丢弃，造成了样本资源浪费；3) UCMSCs冻存后损伤较大，细胞效能较低。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种脐带组织的细胞组织库的构建方法及其相关产品和应用。
第一方面，本发明提供了一种冻存保护剂，其包括平衡液和冻存液；所述平衡液由以下组分组成，组分的终浓度如下：质量分数为0.5%~5%的甘油，100~2000μM的尿苷，2.5~25mM异亮氨酸，质量分数为5%~20%的人血白蛋白注射液，以及质量分数为30%~80%的右旋糖酐40氯化钠注射液；所述冻存液由以下组分组成，组分的终浓度如下：质量分数为5%~10%的DMSO，质量分数为5%~20%的人血白蛋白注射液，以及质量分数为30%~80%的右旋糖酐40氯化钠注射液。
第二方面，本发明提供了一种冻存保护剂，其包括平衡液和冻存液；所述平衡液由以下组分组成，组分的终浓度如下：质量分数为0.5%~5%的甘油，100~2000μM的尿苷，2.5~25mM异亮氨酸，质量分数为5%~20%的人血白蛋白注射液，以及质量分数为30%~80%的右旋糖酐40氯化钠注射液；所述冻存液由以下组分组成，组分的终浓度如下：质量分数为0.5%~5%的甘油，100~2000μM的尿苷，2.5~25mM异亮氨酸，质量分数为5%~10%的DMSO，质量分数为5%~20%的人血白蛋白注射液，以及质量分数为30%~80%的右旋糖酐40氯化钠注射液。
第三方面，本发明提供了一种用于脐带组织的试剂盒，其包括：第一方面或第二方面提供的所述冻存保护剂。
第四方面，本发明提供了一种脐带组织的冻存方法，其包括：采用第一方面或第二方面提供的所述的冻存保护剂对脐带组织块进行冻存：将脐带组织块置于冻存液中降温保存；或将脐带组织块置于平衡液中静置后，再置于冻存液中降温保存。
第五方面，本发明提供了一种脐带组织的细胞组织库的构建方法，其包括：采用第四方面所述的冻存方法对脐带组织块进行冻存，并对冻存后的脐带组织块进行复苏。
具体的，对冻存后的脐带组织块进行复苏的步骤包括：将冻存的脐带组织块解冻溶解，离心去除上清液；在离心后的产物中添加第一方面所述的平衡液，放置10-40min后，离心去除上清液后，添加平衡液和完全培养基的混合物，放10-40min后，离心去除上清液，然后对胎盘组织块中的细胞进行培养，扩增获得细胞。
本发明的优点在于：本发明优化了用于冻存脐带组织的冻存液和平衡液，在冻存之前使用平衡液预处理和/或者在复苏过程中使用平衡液预处理能够减少冷冻对MSCs的损伤，提高细胞复苏的产量和效能，如提高细胞倍增能力、增强抑制淋巴细胞增殖能力、提高免疫调节功能等。
本发明提供的冻存试剂以及方法直接冻存脐带组织块，无需经过培养操作，时间周期短，建库成本低。而且保存了脐带中的所有细胞类型（包括但也不限于人脐带间充质干细胞、亚全能干细胞、造血干/祖细胞、内皮祖细胞和免疫细胞等）和脐带组织中核酸、蛋白分子如激素等各种生物活性物质，最大程度的保存了脐带中的有用价值资源，避免了样本的资源浪费。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例7中三个组UCMSCs的细胞形态学特征（×100）。
图2为实施例7三个组UCMSCs体外成脂诱导、成骨诱导、成软骨诱导分化染色结果（×200）。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1：一种冻存保护剂，其包括平衡液和冻存液；所述平衡液由以下组分组成，组分的终浓度如下：质量分数为0.5%~5%的甘油，100~2000μM的尿苷，2.5~25mM异亮氨酸，质量分数为5%~20%的人血白蛋白注射液，以及质量分数为30%~80%的右旋糖酐40氯化钠注射液；所述冻存液由以下组分组成，组分的终浓度如下：质量分数为5%~10%的DMSO，质量分数为5%~20%的人血白蛋白注射液，以及质量分数为30%~80%的右旋糖酐40氯化钠注射液。
实施例2：一种冻存保护剂，其包括平衡液和冻存液；所述平衡液由以下组分组成，组分的终浓度如下：质量分数为0.5%~5%的甘油，100~2000μM的尿苷，2.5~25mM异亮氨酸，质量分数为5%~20%的人血白蛋白注射液，以及质量分数为30%~80%的右旋糖酐40氯化钠注射液；所述冻存液由以下组分组成，组分的终浓度如下：质量分数为0.5%~5%的甘油，100~2000μM的尿苷，2.5~25mM异亮氨酸，质量分数为5%~10%的DMSO，质量分数为5%~20%的人血白蛋白注射液，以及质量分数为30%~80%的右旋糖酐40氯化钠注射液。
实施例3：一种用于脐带组织的试剂盒，其包括：实施例1或实施例2提供的所述冻存保护剂。
实施例4:一种脐带组织的冻存方法，其包括：采用实施例1或实施例2提供的所述的冻存保护剂对脐带组织块进行冻存：将脐带组织块置于冻存液中降温保存；或将脐带组织块置于平衡液中静置后，再置于冻存液中降温保存。
在一些实施例中，所述降温的程序包括：第一步：以-15~-5°C /min的速率，从室温降低至0~4℃；第二步：以-5~5°C/min的速率，从0~4℃降低至-12~-4°C；第三步：以-30~-20°C/min的速率，从-12~-4℃降低至-55~-45℃；第四步：以5~15°C/min的速率，从-55~-45℃调控至-18~-10℃；第五步：以-5~5°C/min的速率，从-18~-10℃调控至-50~-40℃；第六步：以-15~-5°C /min的速率，从-50~-40°C调控至-95~-80°C。生物样品在降温冷冻过程中，当由液态向固态变化的相变期内会释放一定热量，使其温度回升，不控制降温速率的冷冻过程将会导致组织细胞死亡。程序降温方法是把准确地测定生物样品的相变点，用微机编制降温程序，以便在样品相变时加大液氮输入量，克服相变样品温度的回升，使细胞安全而迅速地度过相变期，这是提高被冻样品成活率的关键环节。常规脐带间充质干细胞的冻存程序为降温速率-1～-2℃/min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。该降温程序优于常规的降温，能更有效地避免或降低冷冻导致的细胞死亡。
实施例5：一种脐带组织的细胞组织库的构建方法，其包括：采用实施例4所述的冻存方法对脐带组织块进行冻存，并对冻存后的脐带组织块进行复苏。
在一些实施例中，对冻存后的脐带组织块进行复苏的步骤包括：
将冻存的脐带组织块解冻溶解，离心去除上清液；在离心后的产物中添加实施例1中所述的平衡液，放置10-40min后，离心去除上清液后，添加平衡液和完全培养基的混合物，放10-40min后，离心去除上清液，然后对胎盘组织块中的细胞进行培养，扩增获得细胞。
在一些实施例中，所述解冻溶解的步骤可以包括：对冻存物置于30~40 °C中恒温水浴1~5min。
在一些实施例中，所述对胎盘组织块中的细胞进行培养，扩增获得细胞的步骤可基于现有常规技术知识获取。在一些实施例中，该步骤包括：将组织块转移至培养瓶，置于37℃、5% CO2细胞培养箱内培养，4~5天后移去组织块，每3天更换新鲜完全培养基。当细胞生长至约80%融合时，以2×103/cm2密度进行传代培养，扩增后获得大量人脐带间充质干细胞，备用。
在一些实施例中，所述离心的条件包括：1400~1600rpm，5~15min。
实施例6：冻存液试验
1、标本来源
人脐带标本来自北京友谊医院产科足月妊娠产妇，排除胎儿畸形、产妇先天性遗传病及传染病史，且签署知情同意书。供者应经过人源性特定病毒（包括 HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、CMV等）、梅毒螺旋体、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、谷丙转氨酶的项目检查，具体要求见表1。在手术室无菌条件下采集脐带组织，用生理盐水洗涤脐带组织2～3次，放入采集瓶中，12 小时内运输到实验室进行组织处理。
表1.供者要求
2、脐带样本的制备：
剪去脐带两头，将脐带血管中的血液捋出，将脐带分成10cm左右的小段，消毒液浸泡3min后，清洗液浸洗2～3次，直至清洗液中无血污。将每根脐带用弯头镊撕去脐带内部两根动脉和一根静脉血管，将脐带胶质清洗2～3次，剪碎至1～2mm3组织块，实验分为8组，每组10g，分别利用不同冻存液进行冻存。
3、冻存液配制及脐带组织的冻存：
1～7组为实验室配制冻存液，按照表2中第一组至第七组配制冻存液中，DMSO、甘油、人血白蛋白注射液、右旋糖酐40氯化钠注射液的浓度均为质量分数。取脐带胶质组织放入含有2ml实验室配制的冻存液中，每个5ml的冻存管可以放入大约2-2.5g组织。
表2 实验室配制冻存液的浓度
第八组为符合美国药典USP的临床细胞治疗级别冻存液（CryoSure-DEX40，美国OriGen BioMedical公司，货号：WAK-DEX40-50-5）。取脐带胶质组织放入含有2ml符合美国药典USP的临床细胞治疗级别冻存液中（CryoSure-DEX40，美国OriGen BioMedical公司，货号：WAK-DEX40-50-5），每个5ml的冻存管可以放入大约2-2.5g组织。
CryoSure-DEX40是国外OriGen BioMedical公司生产的符合美国药典USP的临床细胞治疗级别冻存液。该产品纯度为100%，在GMP条件下生产，无热原、无内毒素、无支原体，在市场上拥有较高的占有率。已经应用于临床注射、骨髓移植、造血干细胞分离、脐带血冻存、角膜及其他器官保存等领域。
4、程序降温冻存：
使用程序降温仪降温后（降温程序：Step 1: -10°C /min to 4.0°C, Step 2: -1.0°C/min to -8.0°C, Step 3: -25.0°C/min to -50°C, Step 4: 10.0°C/min to -14.0°C, Step 5: -1.0°C/min to -45°C, Step 6: -10.0 °C/min to-90 °C, Step 7:End.），放入液氮保存3个月。
5、组织复苏和细胞培养：
取出冻存管，放于37℃恒温水浴箱中3分钟，1500r/min离心5min，除去冻存液后，快速转移组织悬液至含有培养基（IMDM基础培养基+5%血小板裂解液）的无菌离心管内，离心洗涤2～3次，将组织块转移至T25培养瓶，置于37℃、5% CO2细胞培养箱内培养，5天后移去组织块，每3天更换新鲜培养基，当细胞生长至约80%融合时，以2×103/cm2密度进行传代培养。
6、脐带间充质干细胞的数量检测：
（1）原代培养（P1）细胞数量
当8组原代培养细胞中，有一组细胞生长至约80%融合时，计算8组中P1代细胞的数量：消化P1代细胞制备成细胞悬液，加入0.4%（w/v）台盼蓝溶液，在三分钟内按《全国临床检验操作规程》（第四版）白细胞计数方法分别计数活细胞和死细胞，计算活细胞总数。
（2）细胞培养总数量（P5）
细胞传代至P5后，消化各组细胞制备成细胞悬液，加入0.4%（w/v）台盼蓝溶液，在三分钟内按《全国临床检验操作规程》（第四版）白细胞计数方法分别计数活细胞和死细胞，计算活细胞总数。
表3、P1和P5细胞数量
*P＜0.05对比第三组；# P＜0.05对比第七组；﹩P＜0.05对比第八组。
如表3结果显示，与第三组相比，其它组中P1和P5的细胞数量均多于第三组，且均具有统计学差异（P＜0.05）。说明甘油、尿苷、异亮氨酸对脐带组织的冻存有一定程度的保护作用。这主要是因为：当脐带组织冻存的情况下，细胞没有足够的营养，冻存液中添加一定浓度的氨基酸和脂肪类等物质，可以为细胞和组织生命活动供能。
如表3结果显示，与第七组相比，第四组中P1和P5的细胞数量均多于第七组，且均具有统计学差异（P＜0.05）。说明尿苷对脐带组织冻存的保护作用要优于蔗糖、肌酸、甘露醇。这主要是因为：当脐带组织冻存时候，随着温度降低，细胞内外的水分也会“结冰”并形成冰晶，冰晶能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、pH改变、蛋白变性等，能引起细胞对糖类、氨基酸和脂肪类等物质的供能受到限制，细胞更可能转向将尿苷作为营养物质。
如表3结果显示，与第八组相比，第一组中P1和P5的细胞数量没有统计学差异（P＞0.05）。但是第四组和第五组中的P1细胞数量多于第八组P1的细胞数量，且具有统计学差异；第二组、第四组和第六组中的P5细胞数量多于第八组P5的细胞数量，且具有统计学差异。这些结果表明，实施例6中配制的冻存液均可用于冻存脐带组织，且第二组、第四组、第五组和第六组的冻存液效果优于CryoSure-DEX40，其中，第四组冻存液效果最优（表3）。
实施例7：冻存方法效果试验
1、标本来源
人脐带标本来自北京友谊医院产科足月妊娠产妇，排除胎儿畸形、产妇先天性遗传病及传染病史，且签署知情同意书。供者应经过人源性特定病毒（包括 HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、CMV等）、梅毒螺旋体、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、谷丙转氨酶的项目检查，具体要求见表4。在手术室无菌条件下采集脐带组织，用生理盐水洗涤脐带组织2～3次，放入采集瓶中，12 小时内运输到实验室进行组织处理。
表4.供者要求
2、脐带样本的制备：
剪去脐带两头，将脐带血管中的血液捋出，将脐带分成10cm左右的小段，消毒液浸泡3min后，清洗液浸洗2～3次，直至清洗液中无血污。将每根脐带用弯头镊撕去脐带内部两根动脉和一根静脉血管，将脐带胶质清洗2～3次，剪碎至1～2mm3组织块，按照重量平均分为三份，实验分为三组，分别进行不同的操作：
第一组（传统直接冻存方法）：取第一部分脐带胶质组织，放入含有2ml实验室配制的冻存液中（实施例6中第四组冻存液），每个5ml的冻存管可以放入大约2-2.5g组织。
使用程序降温仪降温后（降温程序：Step 1: -10°C /min to 4.0 °C, Step 2: -1.0 °C/min to -8.0 °C, Step 3: -25.0 °C/min to-50 °C, Step 4: 10.0 °C/min to-14.0 °C, Step 5: -1.0 °C/min to-45 °C, Step 6: -10.0 °C/min to -90 °C, Step7: End.），放入液氮中保存3个月后。
取出冻存管，放于37℃恒温水浴箱中3分钟，1500r/min离心5min，除去冻存液后，快速转移组织悬液至含有培养基（IMDM基础培养基+5%血小板裂解液）的无菌离心管内，离心洗涤2～3次，将组织块转移至T25培养瓶，置于37℃、5% CO2细胞培养箱内培养，5天后移去组织块，每3天更换新鲜培养基，当细胞生长至约80%融合时，以2×103/cm2密度进行传代培养。
第二组（平衡液冻存方法）：取第二部分脐带胶质组织，放入含有4ml平衡液（2 %甘油、1000μM尿苷、17.5 mM异亮氨酸、10%人血白蛋白注射液、60%右旋糖酐40氯化钠注射液）的冷冻管中，每个5ml的冻存管可以放入大约2-2.5g组织。在室温放置45分钟，然后4°C放置15分钟。
加入1倍体积的冻存剂。冻存剂：2 %甘油、1000μM尿苷、17.5 mM异亮氨酸、10%人血白蛋白注射液、60%右旋糖酐40氯化钠注射液、8%DMSO。使用程序降温仪降温后（降温程序：与第一组相同），放入液氮中保存3个月后。
取出冻存管，放于37℃恒温水浴箱中3分钟，1500r/min离心5min，除去冻存液后，快速转移组织悬液至含有培养基（IMDM基础培养基+5%血小板裂解液）的无菌离心管内，离心洗涤2～3次，将组织块转移至T25培养瓶，置于37℃、5% CO2细胞培养箱内培养，5天后移去组织块，每3天更换新鲜培养基，当细胞生长至约80%融合时，以2×103/cm2密度进行传代培养。
第三组（平衡液冻存和复苏方法）：取第三部分脐带胶质组织，放入含有4ml平衡液（2 %甘油、1000μM尿苷、17.5 mM异亮氨酸、10%人血白蛋白注射液、60%右旋糖酐40氯化钠注射液）的冷冻管中，每个5ml的冻存管可以放入大约2-2.5g组织。在室温放置45分钟，然后4°C放置15分钟。
加入1倍体积的冻存剂。冻存剂：2 %甘油、1000μM尿苷、17.5 mM异亮氨酸、10%人血白蛋白注射液、60%右旋糖酐40氯化钠注射液、8%DMSO。使用程序降温仪降温后（降温程序：与第一组相同），放入液氮中保存3个月后。
取出冻存管，放于37℃恒温水浴箱中3分钟，1500r/min离心5min，除去冻存液后，加入4ml的平衡液（2 %甘油、1000μM尿苷、17.5 mM异亮氨酸、10%人血白蛋白注射液、60%右旋糖酐40氯化钠注射液），在室温放置30分钟，1500r/min离心5min，除去上清。然后加入1倍体积的平衡液和完全培养基（IMDM基础培养基+5%血小板裂解液）的混合物（体积比为1：1），在室温放置30分钟，1500r/min离心5min，除去上清。快速转移组织悬液至含有培养基（IMDM基础培养基+5%血小板裂解液）的无菌离心管内，离心洗涤2～3次，将组织块转移至T25培养瓶，置于37℃、5% CO2细胞培养箱内培养，5天后移去组织块，每3天更换新鲜培养基，当细胞生长至约80%融合时，以2×103/cm2密度进行传代培养。
3、脐带间充质干细胞的质量检测：
UCMSCs在培养完成后需要进行各项质量控制点的质量检测，对每批UCMSCs进行质量评价。一般包括细胞形态、纯度、倍增时间、细胞存活率和安全检测等。UCMSCs质量检测如下：
（1）细胞形态
取第3代对数生长期细胞在10倍光镜下检测贴壁细胞形态。
（2）细胞活率
取第3代对数生长期的细胞悬液，加入0.4%台盼蓝溶液，在三分钟内按《全国临床检验操作规程》（第四版）白细胞计数方法分别计数活细胞和死细胞，计算细胞活率。
（3）细胞表面标志物
取第3代对数生长期细胞进行免疫表型分析，鉴定所培养的细胞为MSCs，用0.05%胰酶消化并收集细胞，制成1×106/ml的单细胞悬液，分别向预先加入抗体CD29-APC、CD44-PE、CD90-FITC、CD14-APC、CD19-APC、CD34-PE、CD45-FITC、CD73-PE、CD105-PercP、CD166-PE、HLA-DR-APC、HLA-ABC-FITC的Falcon管各加100μl细胞悬液，以大鼠IgG1-FITC、IgG1-APC、IgG1-PE、IgG1-PercP为阴性对照。4℃避光孵育30min，PBS洗涤2次，重悬后进行流式细胞仪检测。采用CellQuest Pro对数据进行分析。
（4）细胞诱导分化能力鉴定
成脂分化：取第3代对数生长期细胞，按照2×104/cm2密度接种，每孔加入完全培养基2ml，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，待细胞完全融合后更换成脂分化完全培养基A液，72h后更换成脂分化诱导完全培养基B液，如此循环3~5次后，用成脂分化诱导完全培养基B液继续维持7d，B液维持期间，每3d换液1次；分化诱导完成后10%多聚甲醛固定，油红O染色，显微镜下观察并拍照。
成骨分化：取第3代对数生长期细胞，按照2×104/cm2的细胞密度接种在事先包被0.1%明胶的六孔板中，每孔加入2ml完全培养基，置于37℃、5%CO2的培养箱中进行培养，直至细胞融合度达到60%~70%，然后更换成成骨诱导分化培养基，每3d换液1次；分化诱导完成后10%多聚甲醛固定，茜素红染色，显微镜下观察并拍照。
成软骨诱导分化：取第3代对数生长期细胞，调整细胞浓度为1.6×107/ml。取10μl细胞悬液，缓慢滴加至6孔板中间部位，培养2h，弃掉生长培养液及未贴壁细胞，加入成软骨诱导分化培养基。每3d换液1次，诱导分化21d后，10%多聚甲醛固定，阿利新蓝染色，显微镜下观察并拍照。
（5）群体倍增时间
取第3代对数生长期细胞，以5000个/孔（6孔板）的密度接种培养6天，用以下公式计算细胞倍增时间：PDT=(ΔT×lg 2)/(lg Nt-lg N0)式中，PDT：群体倍增时间；ΔT：培养时间；Nt：t时间后的细胞数；N0：对数生长期理论初始值。
（6）细胞克隆形成率检测
取第3代对数生长期细胞，以100个/孔密度接种于6孔板，轻轻转动，使细胞均匀，置于37℃、5%CO2细胞培养箱内培养2-3周，经常观察，当出现肉眼可见的克隆团时，终止培养，弃上清，PBS小心洗2次，加入4%多聚甲醛5ml固定细胞15min，去固定液，加适量GIMSA应用染色液30min，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥，计数大于40个细胞的克隆数。
（7）抑制淋巴细胞增殖实验
取健康供者外周血30mL，用Ficoll分离获取外周血单个核细胞（peripheralblood mononuclear cells, PBMCs）。取第3代对数生长期UCMSCs，以2×104/cm2接种到96孔板12h；50μg/mL丝裂霉素C处理60 min，加入1×104PBMCs，加入1 μg/mL anti-CD3单抗、1 μg/mL anti-CD28单抗 和200U/mL IL-2；以不添加anti-CD3单抗、anti-CD28单抗和IL-2的PBMCs作为空白组；共培养72h的PBMCs，加入CCK-8，将培养板在培养箱内孵育2h，用酶标仪测定在450nm处的吸光度（OD）。以公式计算PBMCs的增殖率：OD（实验组）/OD（不加刺激物的PBMCs）×100%。取不同组PBMCs，调整细胞密度1×106/mL；分别加入CD25和CD69抗体10 µL；同型对照管加入鼠IgG-FITC, IgG-PE；在4℃下孵育30 min；用PBS洗涤1次，1000 rpm离心5min；用500µL的PBS重悬细胞，然后上流式细胞仪进行检测。
（8）吲哚胺2, 3-双加氧酶（IDO）活性的检测
取第3代对数生长期细胞，调整细胞浓度为 1×105/cm2；用 15ng/mL IFN-γ或15ng/mL IFN-γ+15ng/mL TNF-α处理48h；收集细胞上清各100µl，使用ELISA方法检测免疫调节介质IDO 的浓度。
（9）安全性检测
1）无菌检测
将离心上清液或细胞培养上清接种于胰酪大豆胨琼脂平板培养基、沙氏葡萄糖琼脂平板培养基，胰酪大豆胨琼脂平板培养基倒置于 30℃-35℃培养箱中培养 3-5 天，沙氏葡萄糖琼脂平板培养基倒置于 20℃-25℃培养箱中培养 3-5 天，观察平板上的菌落。
2）支原体检测
取第3代对数生长期的细胞悬液，按《中华人民共和国药典》 2015版第三部，支原体检查法（通则3301）进行检测。
3）外源病毒因子检测
取第3代对数生长期的细胞悬液，按《中华人民共和国药典》 2015版，第三部，外源病毒因子检测（通则3302）进行检测。
4）内毒素检测
取第3代对数生长期的细胞悬液，按《中华人民共和国药典》 2015版，第三部，细菌内毒素检查法（通则1143）进行检测。
5）核型异常率检测
取第3代对数生长期的细胞悬液，按GB15193.6-2014进行检测。
6）致瘤性检测
取第3代对数生长期的细胞悬液，按软琼脂克隆形成率检测方法进行检测，具体步骤如下：①将1.2％低熔点琼脂糖与 2×细胞培养基以1:1的体积比混合制备0.6％的底层琼脂， 6孔板中每个孔1.4ml 温室凝固，取对数期细胞，胰酶消化后吹散成单个细胞悬液，计数，并调细胞浓度为10000个/ml；②将0.6％低熔点琼脂糖与2×细胞培养基以1:1的体积比混合，制备0.3％的上层琼脂，每孔加 1ml 上层琼脂和100ul 单细胞悬液(约1000cell/well)，混匀，室温凝固；③将6孔板置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养2～3周，显微镜下计数50个细胞以上的克隆。
（10）统计学处理
采用SPSS21.0软件进行统计分析，计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。
4、检测结果
（1）细胞形态观察
三个组UCMSCs传至第3代，显微镜下观察，均表现为均一的长梭形，并呈漩涡状生长，如图1所示。
（2）细胞表型分析结果
流式细胞仪检测结果显示，三个组UCMSCs均阳性表达CD90、CD73、CD105、CD29、CD44、CD166和HLA-ABC（＞95%），阴性表达CD14、CD19、CD45、CD34和HLA-DR（＜2%，表5）。且三组之间免疫表型表达均无统计学差异（所有P＜0.05，表5）
表5 三个组UCMSCs的细胞表型检测结果
（3）细胞诱导分化能力检测结果
三个组UCMSCs经成脂诱导分化21d后，采用油红O进行染色，在倒置显微镜下观察可见大量脂质沉积，即脂滴(图2上)。
三个组UCMSCs经成骨诱导分化21d后，采用茜素红进行钙化结节染色，可见致密生长的细胞中散在出现大量橘红色矿化结节(图2中)。
三个组UCMSCs经成软骨诱导分化21d后，采用阿利新蓝对细胞团进行染色，可见大小不一的蓝色结节(图2下)。
（4）细胞活率检测结果：
三个组UCMSCs进行细胞活率检测，结果显示三组之间的细胞活率均无统计学差异（P＞0.05，表6）
表6 三个组UCMSCs的细胞活率检测结果
（5）细胞倍增时间检测结果：
三个组UCMSCs进行细胞倍增时间计算，结果显示第二组和第三组细胞倍增时间均少于第一组，且两组之间的细胞倍增时间有统计学差异（*P＜0.05，表7），第三组细胞倍增时间也少于第二组，且两组之间的细胞倍增时间也有统计学差异（#P＜0.05，表7）。这个结果表明细胞倍增能力：第三组＞第二组＞第一组。
表7 三个组UCMSCs的细胞倍增时间检测结果
（6）克隆形成实验检测结果：
三个组UCMSCs进行细胞克隆检测，结果显示第三组和第二组细胞克隆个数高于第一组，且两组之间的细胞克隆数均有统计学差异（*P＜0.05，表8），第三组细胞克隆个数高于第二组，且两组之间的细胞克隆数也有统计学差异（#P＜0.05，表8）。这个结果表明细胞克隆个数：第三组＞第二组＞第一组。
表8 三个组UCMSCs的细胞克隆检测结果
（7）抑制淋巴细胞增殖和活化实验检测结果：
三个组UCMSCs进行抑制淋巴细胞增殖检测，结果显示第二组和第三组的淋巴细胞的增殖率均低于第一组，且两组之间均有统计学差异（*P＜0.05，表9），第二组的淋巴细胞的增殖率与第三组相比没有统计学差异（P＞0.05，表9）。这个结果表明UCMSCs抑制淋巴细胞增殖的能力：第三组=第二组＞第一组。
三个组UCMSCs进行抑制淋巴细胞活化检测，结果显示第二组和第三组淋巴细胞CD25和CD69的表达率均低于第一组，且均有统计学差异（*P＜0.05，表9）；第三组淋巴细胞的CD25和CD69表达率均低于第二组，且均有统计学差异（#P＜0.05，表6）。这个结果表明UCMSCs抑制淋巴细胞活化的能力：第三组＞第二组＞第一组。
表9 三个组UCMSCs抑制淋巴细胞增殖和活化实验检测结果
（8）IDO检测结果：
IDO是MSCs发挥免疫调节功能的关键因子之一，检测结果显示，在IFN-γ或IFN-γ+TNF-α处理48h后，三个组UCMSCs均表达一定浓度的IDO。第三组和第二组中IDO的浓度均高于第一组，均有统计学差异（*P<0.05，表10）；且第三组中IDO的浓度也均高于第二组，均有统计学差异（#P<0.05，表10）；这些结果表明，UCMSCs的免疫调节功能：第三组＞第二组＞第一组。
表10 三个组IDO活性的检测结果（pg/ml）
（9）安全性检测结果：
三个组UCMSCs进行安全检测，结果显示本发明的组织块冻存方式下，UCMSCs没有致瘤性和异常核型，具有非常高的生物安全性，且符合临床应用的微生物学安全性要求。
表11 安全性能检测结果
总之，通过平衡液冻存的方法对于脐带组织的冻存效果优于传统的直接冻存方法，而且平衡液冻存和复苏方法也优于平衡液冻存的方法。
可见。在冻存之前使用平衡液预处理和/或者在复苏过程中使用平衡液预处理能够减少冷冻对MSCs的损伤，提高细胞复苏的产量和效能，如提高细胞倍增能力、增强抑制淋巴细胞增殖能力、提高免疫调节功能等。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种冻存保护剂，其特征在于，其包括平衡液和冻存液；
所述平衡液由以下组分组成，组分的终浓度如下：质量分数为0.5%~5%的甘油，100~2000μM的尿苷，2.5~25mM异亮氨酸，质量分数为5%~20%的人血白蛋白注射液，以及质量分数为30%~80%的右旋糖酐40氯化钠注射液；
所述冻存液由以下组分组成，组分的终浓度如下：质量分数为5%~10%的DMSO，质量分数为5%~20%的人血白蛋白注射液，以及质量分数为30%~80%的右旋糖酐40氯化钠注射液；
将脐带组织块置于平衡液中静置后，再置于冻存液中降温保存。
2.一种冻存保护剂，其特征在于，其包括平衡液和冻存液；
所述平衡液由以下组分组成，组分的终浓度如下：质量分数为0.5%~5%的甘油，100~2000μM的尿苷，2.5~25mM异亮氨酸，质量分数为5%~20%的人血白蛋白注射液，以及质量分数为30%~80%的右旋糖酐40氯化钠注射液；
所述冻存液由以下组分组成，组分的终浓度如下：质量分数为0.5%~5%的甘油，100~2000μM的尿苷，2.5~25mM异亮氨酸，质量分数为5%~10%的DMSO，质量分数为5%~20%的人血白蛋白注射液，以及质量分数为30%~80%的右旋糖酐40氯化钠注射液；
将脐带组织块置于平衡液中静置后，再置于冻存液中降温保存。
3.一种用于脐带组织的试剂盒，其特征在于，其包括：如权利要求1或2所述的冻存保护剂。
4.一种脐带组织的冻存方法，其特征在于，其包括：采用权利要求1或2所述的冻存保护剂对脐带组织块进行冻存：将脐带组织块置于平衡液中静置后，再置于冻存液中降温保存。
5.一种脐带组织的细胞组织库的构建方法，其特征在于，其包括：采用权利要求4所述的冻存方法对脐带组织块进行冻存，并对冻存后的脐带组织块进行复苏。
6.根据权利要求5所述的一种脐带组织的细胞组织库的构建方法，其特征在于，对冻存后的脐带组织块进行复苏的步骤包括：
将冻存的脐带组织块解冻溶解，离心去除上清液；在离心后的产物中添加权利要求1中所述的平衡液，放置10-40min后，离心去除上清液后，添加平衡液和完全培养基的混合物，放10-40min后，离心去除上清液，然后对胎盘组织块中的细胞进行培养，扩增获得细胞。
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