CN116940597A

CN116940597A - 多特异性抗体及其用途

Info

Publication number: CN116940597A
Application number: CN202180089374.3A
Authority: CN
Inventors: M·S·扎曼; Y·刘
Original assignee: Diagnosis And Treatment Co AB
Current assignee: Diagnosis And Treatment Co AB
Priority date: 2020-11-16
Filing date: 2021-11-16
Publication date: 2023-10-24

Abstract

本公开涉及多特异性抗体(例如双特异性抗体)或其抗原结合片段。在一个方面，多特异性抗体或其抗原结合片段结合cMET和/或EGFR、或它们的组合。结合cMET(酪氨酸‑蛋白质激酶Met)的抗体或其抗原结合片段，其包含：包含互补决定区(CDR)1、2和3的重链抗体可变结构域(VHH)。

Description

多特异性抗体及其用途

要求优先权

本申请要求于2020年11月16日提交的美国临时申请No.63/114,479以及于2021年8月26日提交的美国临时申请No.63/237,526的权益。前述申请的全部内容以引用方式并入本文。

技术领域

本公开涉及多特异性抗体或其抗原结合片段。

背景技术

多特异性抗体是能够同时与两种或更多种不同的表位结合的人造蛋白质。这开辟了广泛的应用领域，包括使T细胞重定向至肿瘤细胞、同时阻断两种不同的信号传导通路、双重靶向不同的疾病介质，以及将有效载荷递送至靶向位点。对卡妥索单抗(catumaxomab)(抗EpCAM和抗CD3)和博纳吐单抗(blinatumomab)(抗CD19和抗CD3)的批准已成为多特异性抗体发展的重要里程碑。

由于多特异性抗体具有各种应用，需要继续开发出基于多特异性抗体的各种疗法。

发明内容

本公开涉及抗体或抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段特异性结合cMET和/或EGFR、或它们的组合。在一些实施方案中，本公开涉及cMET/EGFR靶向性双特异性抗体的开发。在一些实施方案中，本文所述的抗体可治疗非小细胞肺癌(NSCLC)。

在一个方面，本公开涉及一种结合cMET(酪氨酸蛋白激酶Met)的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含：包含互补决定区(CDR)1、2和3的重链抗体可变结构域(VHH)。

在一些实施方案中，VHH CDR1区包含与选定的VHH CDR1氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，VHH CDR2区包含与选定的VHH CDR2氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，并且VHH CDR3区包含与选定的VHH CDR3氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，选定的VHH CDR 1、2和3氨基酸序列是以下之一：

(1)选定的VHH CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:1、2和3中示出；

(2)选定的VHH CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:4、5和6中示出；

(3)选定的VHH CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:7、8和9中示出；以及

(4)选定的VHH CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:10、11和12中示出。

在一些实施方案中，VHH包含分别具有SEQ ID NO:1、2和3中所示的氨基酸序列的CDR 1、2、3。

在一些实施方案中，VHH包含分别具有SEQ ID NO:4、5和6中所示的氨基酸序列的CDR 1、2、3。

在一些实施方案中，VHH包含分别具有SEQ ID NO:7、8和9中所示的氨基酸序列的CDR 1、2、3。

在一些实施方案中，VHH包含分别具有SEQ ID NO:10、11和12中所示的氨基酸序列的CDR 1、2、3。

在一个方面，本公开涉及一种结合cMET的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含含有与选定的VHH序列至少80％相同的氨基酸序列的重链抗体可变结构域(VHH)。在一些实施方案中，选定的VHH序列选自SEQ ID NO:19-22和77-84。在一些实施方案中，VHH包含SEQ ID NO:19、77、78、79、80、81、或84的序列。在一些实施方案中，VHH包含SEQID NO:20的序列。在一些实施方案中，VHH包含SEQ ID NO:21的序列。在一些实施方案中，VHH包含SEQ ID NO:22、82、或83的序列。

在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段特异性结合cMET。

在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段是人源化抗体或其抗原结合片段。

在一个方面，本公开涉及一种抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含如本文所述的抗体或其抗原结合片段的VHH CDR 1、2、3。

在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含人IgG Fc。

在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含两个或更多个重链抗体可变结构域。

在一个方面，本公开涉及一种抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段与如本文所述的抗体或其抗原结合片段交叉竞争。

在一个方面，本公开涉及一种多特异性抗体或其抗原结合片段，该多特异性抗体或其抗原结合片段包含特异性结合EGFR的第一抗原结合位点，以及特异性结合cMET的第二抗原结合位点。

在一些实施方案中，第一抗原结合位点包含重链可变区(VH)以及轻链可变区(VL)。在一些实施方案中，VH和VL彼此缔合并且特异性结合EGFR。

在一些实施方案中，重链可变区(VH)包含互补决定区(CDR)1、2和3。在一些实施方案中，VH CDR1区包含与SEQ ID NO:13至少80％相同的氨基酸序列，VH CDR2区包含与SEQID NO:14至少80％相同的氨基酸序列，并且VH CDR3区包含与SEQ ID NO:15至少80％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，轻链可变区(VL)包含CDR 1、2和3。在一些实施方案中，VL CDR1区包含与SEQ ID NO:16至少80％相同的氨基酸序列，VL CDR2区包含与SEQ ID NO:17至少80％相同的氨基酸序列，并且VL CDR3区包含与SEQ ID NO:18至少80％相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，重链可变区(VH)包含与SEQ ID NO:23至少90％相同的氨基酸序列，并且轻链可变区(VL)包含与SEQ ID NO:24至少90％相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，第二抗原结合位点特异性结合cMET，并且第二抗原结合位点包含含有互补决定区(CDR)1、2和3的第一重链抗体可变结构域(VHH1)。在一些实施方案中，VHH1 CDR1区包含与选定的VHH1CDR1氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，VHH1 CDR2区包含与选定的VHH1 CDR2氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，并且VHH1 CDR3区包含与选定的VHH1 CDR3氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，选定的VHH1CDR 1、2和3氨基酸序列是以下之一：

(1)选定的VHH1 CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:1、2和3中示出；

(2)选定的VHH1 CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:4、5和6中示出；

(3)选定的VHH1 CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:7、8和9中示出；以及

(4)选定的VHH1 CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:10、11和12中示出。

在一些实施方案中，第一重链抗体可变结构域(VHH1)包含与选定的VHH序列至少80％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，选定的VHH序列选自SEQ ID NO:19-22和77-84。在一些实施方案中，如本文所述的多特异性抗体或其抗原结合片段还包含特异性结合cMET的第三抗原结合位点。

在一些实施方案中，第三抗原结合位点特异性结合cMET，并且第三抗原结合位点包含含有互补决定区(CDR)1、2和3的第二重链抗体可变结构域(VHH2)。在一些实施方案中，VHH2 CDR1区包含与选定的VHH2CDR1氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，VHH2 CDR2区包含与选定的VHH2 CDR2氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，并且VHH2 CDR3区包含与选定的VHH2 CDR3氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，选定的VHH2CDR 1、2和3氨基酸序列是以下之一：

(1)选定的VHH2 CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:1、2和3中示出；

(2)选定的VHH2 CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:4、5和6中示出；

(3)选定的VHH2 CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:7、8和9中示出；以及

(4)选定的VHH2 CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:10、11和12中示出。

在一些实施方案中，第二重链抗体可变结构域(VHH2)包含与选定的VHH2序列至少80％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，选定的VHH2序列选自SEQ ID NO:19-22和77-84。

在一些实施方案中，VH和VL通过接头肽序列连接形成scFv。在一些实施方案中，接头肽序列包含与SEQ ID NO:37-42中任一项至少80％相同的序列。

在一个方面，本公开涉及一种多肽复合物，该多肽复合物包含(a)第一多肽，该第一多肽从N末端到C末端包含：第一重链抗体可变结构域(VHH)、第一铰链区、第一Fc区；(b)第二多肽，该第二多肽从N末端到C末端包含：重链可变区(VH)、第二铰链区，以及第二Fc区；以及(c)第三多肽，该第三多肽包含轻链可变区(VL)。在一些实施方案中，第一VHH特异性结合cMET。在一些实施方案中，VH和VL彼此缔合并且特异性结合EGFR。

在一些实施方案中，第一铰链区和/或第二铰链区包含与SEQ ID NO:25-29中任一项至少80％相同的序列。

在一些实施方案中，第一Fc区和/或第二Fc区包含与SEQ ID NO:30或31至少80％相同的序列。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:43或44至少80％相同的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQ ID NO:45或46至少80％相同的序列。在一些实施方案中，第三多肽包含与SEQ ID NO:47至少80％相同的序列。

在一些实施方案中，第一多肽还包含特异性结合cMET的第二VHH。在一些实施方案中，第二VHH经由接头肽序列连接至第一VHH的N末端。

在一些实施方案中，接头肽序列包含与SEQ ID NO:37-42中任一项至少80％相同的序列。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:48或49至少80％相同的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQ ID NO:50或51至少80％相同的序列。在一些实施方案中，第三多肽包含与SEQ ID NO:52至少80％相同的序列。

在一些实施方案中，第一Fc区和/或第二Fc区包含根据EU编号在第239位处的天冬氨酸(Asp)，和/或根据EU编号在第332位处的谷氨酸(Glu)。

在一个方面，本公开涉及一种多肽复合物，该多肽复合物包含(a)第一多肽，该第一多肽从N末端到C末端包含：第一重链抗体可变结构域(VHH)、第一铰链区、第一Fc区；以及(b)第二多肽，该第二多肽从N末端到C末端包含：单链可变片段(scFv)、第二铰链区，以及第二Fc区。在一些实施方案中，第一VHH特异性结合cMET。在一些实施方案中，scFv包含重链可变区(VH)、第一接头肽序列，以及轻链可变区(VL)。在一些实施方案中，VH和VL彼此缔合并且特异性结合EGFR。

在一些实施方案中，第一接头肽序列包含与SEQ ID NO:37-42中任一项至少80％相同的序列。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:53或54至少80％相同的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQ ID NO:55或56至少80％相同的序列。

在一些实施方案中，第一多肽还包含特异性结合cMET的第二VHH。在一些实施方案中，第二VHH经由第二接头肽序列连接至第一VHH的N末端。

在一些实施方案中，第二接头肽序列包含与SEQ ID NO:37-42中任一项至少80％相同的序列。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:57或58至少80％相同的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQ ID NO:59或60至少80％相同的序列。

在一个方面，本公开涉及一种多肽复合物，该多肽复合物包含(a)第一多肽，该第一多肽从N末端到C末端包含：第一重链抗体可变结构域(VHH1)、第一接头肽序列、第一重链可变区(VH1)、第一铰链区，以及第一Fc区；(b)第二多肽，该第二多肽包含第一轻链可变区(VL1)；(c)第三多肽，该第三多肽从N末端到C末端包含：第二重链抗体可变结构域(VHH2)、第二接头肽序列、第二重链可变区(VH2)、第二铰链区，以及第二Fc区；以及(d)第四多肽，该第四多肽包含第二轻链可变区(VL2)。在一些实施方案中，VHH1和VHH2特异性结合cMET。在一些实施方案中，VH1和VL1彼此缔合并且特异性结合EGFR。在一些实施方案中，VH2和VL2彼此缔合并且特异性结合EGFR。

在一些实施方案中，第一接头肽序列和/或第二接头肽序列包含与SEQ ID NO:37-42中任一项至少80％相同的序列。

在一些实施方案中，VHH1和VHH2的序列是相同的。在一些实施方案中，第一Fc区和/或第二Fc区包含与SEQ ID NO:32至少80％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:61或62至少80％相同的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQ IDNO:63至少80％相同的序列。在一些实施方案中，第三多肽包含与SEQ ID NO:61或62至少80％相同的序列。在一些实施方案中，第四多肽包含与SEQ ID NO:63至少80％相同的序列。

在一些实施方案中，VHH1和VHH2的序列是不同的。在一些实施方案中，第一Fc区和/或第二Fc区包含与SEQ ID NO:30或31至少80％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:64或65至少80％相同的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQID NO:68至少80％相同的序列。在一些实施方案中，第三多肽包含与SEQ ID NO:66或67至少80％相同的序列。在一些实施方案中，第四多肽包含与SEQ ID NO:68至少80％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:85至少80％相同的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQ ID NO:68至少80％相同的序列。在一些实施方案中，第三多肽包含与SEQ ID NO:86至少80％相同的序列。在一些实施方案中，第四多肽包含与SEQ ID NO:68至少80％相同的序列。

在一个方面，本公开涉及一种多肽复合物，该多肽复合物包含(a)第一多肽，该第一多肽从N末端到C末端包含：第一重链可变区(VH1)、第一铰链区、第一Fc区；第一接头肽序列，以及第一重链抗体可变结构域(VHH1)；(b)第二多肽，该第二多肽包含第一轻链可变区(VL1)；(c)第三多肽，该第三多肽从N末端到C末端包含：第二重链可变区(VH2)、第二铰链区、第二Fc区、第二接头肽序列，以及第二重链抗体可变结构域(VHH2)；以及(d)第四多肽，该第四多肽包含第二轻链可变区(VL2)。在一些实施方案中，VHH1和/或VHH2特异性结合cMET。在一些实施方案中，VH1和VL1彼此缔合并且特异性结合EGFR。在一些实施方案中，VH2和VL2彼此缔合并且特异性结合EGFR。

在一些实施方案中，VHH1和VHH2的序列是相同的。在一些实施方案中，第一Fc区和/或第二Fc区包含与SEQ ID NO:32至少80％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:69或70至少80％相同的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQ IDNO:71至少80％相同的序列。在一些实施方案中，第三多肽包含与SEQ ID NO:69或70至少80％相同的序列。在一些实施方案中，第四多肽包含与SEQ ID NO:71至少80％相同的序列。

在一些实施方案中，VHH1和VHH2的序列是不同的。在一些实施方案中，第一Fc区和/或第二Fc区包含与SEQ ID NO:30或31至少80％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:72或73至少80％相同的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQID NO:76至少80％相同的序列。在一些实施方案中，第三多肽包含与SEQ ID NO:74或75至少80％相同的序列。在一些实施方案中，第四多肽包含与SEQ ID NO:76至少80％相同的序列。

在一个方面，本公开涉及一种多肽复合物，该多肽复合物包含(a)第一多肽，该第一多肽从N末端到C末端包含：第一重链抗体可变结构域(VHH)、第一铰链区、第一Fc区；(b)第二多肽，该第二多肽从N末端到C末端包含：重链可变区(VH)、第二铰链区，以及第二Fc区；以及(c)第三多肽，该第三多肽包含轻链可变区(VL)。在一些实施方案中，第一VHH特异性结合cMET。在一些实施方案中，VH和VL彼此缔合并且特异性结合EGFR。在一些实施方案中，第一多肽还包含特异性结合cMET的第二VHH。在一些实施方案中，第二VHH经由接头肽序列连接至第一VHH的N末端。

在一个方面，本公开涉及一种多肽复合物，该多肽复合物包含(a)第一多肽，该第一多肽从N末端到C末端包含：第一重链抗体可变结构域(VHH)、第一铰链区、第一Fc区；以及(b)第二多肽，该第二多肽从N末端到C末端包含：单链可变片段(scFv)、第二铰链区，以及第二Fc区。在一些实施方案中，第一VHH特异性结合cMET。在一些实施方案中，scFv包含重链可变区(VH)、第一接头肽序列，以及轻链可变区(VL)。在一些实施方案中，VH和VL彼此缔合并且特异性结合EGFR。在一些实施方案中，第一多肽还包含特异性结合cMET的第二VHH。在一些实施方案中，第二VHH经由第二接头肽序列连接至第一VHH的N末端。

在一个方面，本公开涉及一种多肽复合物，该多肽复合物包含(a)第一多肽，该第一多肽从N末端到C末端包含：第一重链抗体可变结构域(VHH1)、第一接头肽序列、第一重链可变区(VH1)、第一铰链区，以及第一Fc区；(b)第二多肽，该第二多肽包含第一轻链可变区(VL1)；(c)第三多肽，该第三多肽从N末端到C末端包含：第二重链抗体可变结构域(VHH2)、第二接头肽序列、第二重链可变区(VH2)、第二铰链区，以及第二Fc区；以及(d)第四多肽，该第四多肽包含第二轻链可变区(VL2)。在一些实施方案中，VHH1和VHH2特异性结合cMET。在一些实施方案中，VH1和VL1彼此缔合并且特异性结合EGFR。在一些实施方案中，VH2和VL2彼此缔合并且特异性结合EGFR。在一些实施方案中，VHH1和VHH2的序列是不同的。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:64或65至少80％相同的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQ ID NO:68至少80％相同的序列。在一些实施方案中，第三多肽包含与SEQ ID NO:66或67至少80％相同的序列。在一些实施方案中，第四多肽包含与SEQ ID NO:68至少80％相同的序列。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:85至少80％相同的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQ ID NO:68至少80％相同的序列。在一些实施方案中，第三多肽包含与SEQ ID NO:86至少80％相同的序列。在一些实施方案中，第四多肽包含与SEQID NO:68至少80％相同的序列。

在一个方面，本公开涉及一种多肽复合物，该多肽复合物包含(a)第一多肽，该第一多肽从N末端到C末端包含：第一重链可变区(VH1)、第一铰链区、第一Fc区；第一接头肽序列，以及第一重链抗体可变结构域(VHH1)；(b)第二多肽，该第二多肽包含第一轻链可变区(VL1)；(c)第三多肽，该第三多肽从N末端到C末端包含：第二重链可变区(VH2)、第二铰链区、第二Fc区、第二接头肽序列，以及第二重链抗体可变结构域(VHH2)；以及(d)第四多肽，该第四多肽包含第二轻链可变区(VL2)。在一些实施方案中，VHH1和/或VHH2特异性结合cMET。在一些实施方案中，VH1和VL1彼此缔合并且特异性结合EGFR。在一些实施方案中，VH2和VL2彼此缔合并且特异性结合EGFR。在一些实施方案中，VHH1和VHH2的序列是不同的。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:72或73至少80％相同的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQ ID NO:76至少80％相同的序列。在一些实施方案中，第三多肽包含与SEQ ID NO:74或75至少80％相同的序列。在一些实施方案中，第四多肽包含与SEQ ID NO:76至少80％相同的序列。

在一个方面，本公开涉及一种核酸，该核酸包含编码如本文所述的抗体或其抗原结合片段、如本文所述的多特异性抗体或其抗原结合片段、或如本文所述的多肽复合物的多核苷酸。在一些实施方案中，核酸是DNA(例如cDNA)或RNA(例如mRNA)。

在一个方面，本公开涉及一种载体，该载体包含如本文所述的一种或多种核酸。

在一个方面，本公开涉及一种细胞，该细胞包含如本文所述的载体。在一些实施方案中，细胞是CHO细胞。

在一个方面，本公开涉及一种细胞，该细胞包含如本文所述的一种或多种核酸。

在一个方面，本公开涉及一种产生抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括(a)在足以使细胞产生抗体或抗原结合片段的条件下，培养如本文所述的细胞；以及(b)收集由细胞产生的抗体或抗原结合片段。

在一个方面，本公开涉及一种抗体-药物缀合物，该抗体-药物缀合物包含与治疗剂共价结合的如本文所述的抗体或其抗原结合片段、如本文所述的多特异性抗体或其抗原结合片段、或如本文所述的多肽复合物。在一些实施方案中，治疗剂是细胞毒性剂或细胞抑制剂。

在一个方面，本公开涉及一种治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的组合物，该组合物包含如本文所述的抗体或其抗原结合片段、如本文所述的多特异性抗体或其抗原结合片段、如本文所述的多肽复合物、或如本文所述的抗体-药物缀合物。

在一些实施方案中，受试者患有表达cMET的癌症。在一些实施方案中，受试者患有表达EGFR的癌症。

在一些实施方案中，癌症是肺癌。在一些实施方案中，癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)。

在一个方面，本公开涉及一种降低肿瘤生长速率的方法，该方法包括使肿瘤细胞与有效量的组合物接触，该组合物包含如本文所述的抗体或其抗原结合片段、如本文所述的多特异性抗体或其抗原结合片段、如本文所述的多肽复合物、或如本文所述的抗体-药物缀合物。

在一个方面，本公开涉及一种杀伤肿瘤细胞的方法，该方法包括使肿瘤细胞与有效量的组合物接触，该组合物包含如本文所述的抗体或其抗原结合片段、如本文所述的多特异性抗体或其抗原结合片段、如本文所述的多肽复合物、或如本文所述的抗体-药物缀合物。

在一个方面，本公开涉及一种药物组合物，该药物组合物包含如本文所述的抗体或其抗原结合片段、如本文所述的多特异性抗体或其抗原结合片段、如本文所述的多肽复合物，以及药学上可接受的载剂。

在一个方面，本公开涉及一种药物组合物，该药物组合物包含如本文所述的抗体-药物缀合物以及药学上可接受的载剂。

在一个方面，本公开提供了一种多特异性抗体或其抗原结合片段，该多特异性抗体或其抗原结合片段包含如本文所述的重链抗体可变结构域(VHH)、或如本文所述的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。

在一个方面，本公开提供了一种双特异性抗体或其抗原结合片段，该双特异性抗体或其抗原结合片段包含如本文所述的重链抗体可变结构域(VHH)、或如本文所述的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。

在一个方面，本公开提供了一种特异性结合cMET的多特异性抗体或其抗原结合片段。在一个方面，本公开提供了一种特异性结合EGFR的多特异性抗体或其抗原结合片段。

在一个方面，本公开提供了一种靶向cMET和EGFR两者的多特异性抗体。在一些实施方案中，与JNJ372或JNJ372类似物相比，本文所述的多特异性抗体对cMET和/或EGFR的结合能力相当或甚至更高。在一些实施方案中，本文所述的多特异性抗体比JNJ372或JNJ372类似物更有效地阻断cMET与cMET配体(例如HGF)的相互作用。在一些实施方案中，本文所述的多特异性抗体比JNJ372类似物更有效地阻断EGFR与EGFR配体(例如EGF)的相互作用。在一些实施方案中，与JNJ372或JNJ372类似物相比，本文所述的多特异性抗体相当地或甚至更有效地抑制cMET和/或EGFR的磷酸化。在一些实施方案中，与JNJ372或JNJ372类似物相比，本文所述的多特异性抗体更有效地抑制参与癌细胞存活和增殖的下游信号传导通路(例如ERK和/或Akt通路)的磷酸化。

本公开提供了结合EGFR和cMET的多特异性抗体或其抗原结合片段。多特异性抗体(例如双特异性抗体或三特异性抗体)或其抗原结合片段是能够同时与两种或更多种不同类型的表位结合的人造蛋白质。表位可处于相同抗原或不同抗原中。在一些实施方案中，多特异性抗体或其抗原结合片段可具有两个、三个、四个、五个、六个、或更多个抗原结合位点。在一些实施方案中，抗原结合位点具有一个重链可变区和一个轻链可变区。在一些实施方案中，抗原结合位点具有一个VHH。

本公开提供了结合EGFR和cMET的多特异性抗体或其抗原结合片段。本公开还提供了抗cMET VHH、具有VH和VL的抗EGFR抗体、或其抗原结合片段。这些VHH、VH、VL可用于制备如本文所述的各种多特异性抗体或抗原结合片段。

如本文所用，术语“抗体”是指含有至少一个(例如一个、两个、三个、四个、五个、或六个)互补决定区(CDR)(例如，来自免疫球蛋白轻链的三个CDR中的任一者或来自免疫球蛋白重链的三个CDR中的任一者)并且能够特异性结合抗原中的表位的任何抗原结合分子。抗体包括的非限制性实例包括：单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、单链抗体、单可变结构域(VHH)抗体、嵌合抗体、人抗体，以及人源化抗体。在一些实施方案中，抗体可含有人抗体的Fc区。术语抗体还包括衍生物，例如多特异性抗体、双特异性抗体、单链抗体、双抗体，以及由这些抗体或抗体片段形成的线性抗体。

如本文所用，术语“抗原结合片段”是指全长抗体的一部分，其中抗体的该部分能够特异性结合抗原。在一些实施方案中，抗原结合片段含有至少一个可变结构域(例如，重链的可变结构域、轻链的可变结构域或VHH)。抗体片段的非限制性实例包括例如Fab、Fab’、F(ab’)2，以及Fv片段、ScFv和VHH。

如本文所用，术语“受试者”和“患者”在整个说明书中可互换使用，并且描述根据本发明的方法的治疗所要提供的动物、人类或非人类。本公开中设想了兽医和非兽医应用。人类患者可为成年人或未成年人(例如，18岁以下的人类)。除了人类之外，患者还包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、雪貂、猫、狗和灵长类。包括例如非人灵长类(例如，猴、黑猩猩、大猩猩等)、啮齿类(例如，大鼠、小鼠、沙鼠、仓鼠、雪貂、兔)、兔类动物、猪(例如，猪、小型猪)、马、犬、猫、牛以及其它家养、农场和动物园动物。

如本文所用，当涉及到抗体或抗原结合片段时，短语“特异性结合(specificallybinding)”和“特异性接合(specifically binds)”意指抗体或抗原结合片段相对于其它分子优选地与其靶分子相互作用，因为相互作用取决于靶分子上存在的特定结构(即抗原决定簇或表位)；换言之，试剂识别并结合包括特定结构的分子，而非所有一般的分子。特异性结合靶分子的抗体可称为靶物特异性抗体。例如，特异性结合EGFR的抗体可称为EGFR特异性抗体或抗EGFR抗体。

如本文所用，术语“双特异性抗体”是指结合两种不同表位的抗体。表位可处于相同抗原或不同抗原上。

如本文所用，术语“三特异性抗体”是指结合三种不同表位的抗体。表位可处于相同抗原或不同抗原上。

如本文所用，术语“多特异性抗体”是指结合两种或更多种不同表位的抗体。表位可处于相同抗原或不同抗原上。多特异性抗体可为例如双特异性抗体或三特异性抗体。在一些实施方案中，多特异性抗体结合两种、三种、四种、五种、或六种不同的表位。

如本文所用，“VHH”是指重链抗体的可变结构域。在一些实施方案中，VHH是人源化VHH。

如本文所用，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”互换地用于指至少两个氨基酸的任何长度的氨基酸聚合物。

如本文所用，术语“多核苷酸”、“核酸分子”和“核酸序列”在本文中互换地用于指至少两个核苷酸的任何长度的核苷酸聚合物，并且包括但不限于DNA、RNA、DNA/RNA杂交体，以及它们的修饰形式。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。本文描述了用于本发明的方法和材料；也可使用本领域已知的其它合适的方法和材料。材料、方法和实例仅是示例性的，而非旨在进行限制。本文所提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其它参考文献均全文以引用方式并入。如发生矛盾，以本说明书及其所包括的定义为准。

根据以下具体实施方式和附图以及权利要求书，本发明的其它特征和优点将是显而易见的。

附图说明

图1显示了竞争性ELISA测定的发光信号。测定了在16种独特克隆的存在下cMET与Hu-HGF之间的结合。RFU是平均相对荧光单元。

图2显示了16种独特克隆对人cMET(抗Hu)和猴cMET(抗Cyno)的交叉反应性。

图3显示了通过生物层干涉测量法(Bio-Layer Interferometry,BLI)测定的1D5、1F3、1H1和2C7克隆的VHH表达水平。

图4显示了VHH蛋白与cMET结合的ELISA结果。培养基和PBS是阴性对照。

图5显示了竞争性ELISA测定的发光信号。测定了在cMET VHH克隆1D5、1H1和2C7的存在下cMET与Hu-HGF之间的结合。11F11是同种型对照。

图6显示了1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3的示意性结构。

图7显示了1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3的cMET-结合ELISA结果。JNJ372类似物(JNJBsAb)是阳性对照。11F11是同种型阴性对照。

图8显示了1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3的EGFR-结合ELISA结果。JNJ372类似物(JNJBsAb)是阳性对照。11F11是同种型阴性对照。

图9显示了1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V1(1H1 v1)、1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3(1H1v3)和JNJ372类似物与cMET结合的滴定ELISA结果。

图10显示了1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3(1H1 v3)和JNJ372类似物与EGFR结合的滴定ELISA结果。

图11显示了竞争性ELISA测定的发光信号。测定了在EGFR、1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3和JNJ372类似物的存在下cMET与Hu-HGF之间的结合。11F11是同种型对照。Hu-HGF-B是不添加任何抗体的生物素化人HGF对照。

图12A显示了1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3和JNJ372类似物对EGFR的EGF/EGFR阻断效应。EGF-B是生物素化EGF。

图12B显示了仅用PBS处理的NCIH1975细胞的免疫荧光图像。

图12C显示了与11F11一起孵育，并然后用生物素化EGF处理的NCIH1975细胞的免疫荧光图像。

图12D显示了仅用生物素化EGF处理的NCIH1975细胞的免疫荧光图像。

图12E显示了与JNJ372类似物一起孵育，并然后用生物素化EGF处理的NCIH1975细胞的免疫荧光图像。

图12F显示了与1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3一起孵育，并然后用生物素化EGF处理的NCIH1975细胞的免疫荧光图像。

图13A显示了具有磷酸化cMET的NCIH1975细胞的百分比。将细胞用JNJ372类似物或1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3处理，然后用HGF处理。HGF是没有任何抗体处理的阳性对照。NC是同种型对照。

图13B显示了具有磷酸化EGFR的NCIH1975细胞的百分比。将细胞用JNJ372类似物或1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3处理，然后用EGF处理。“EGF+无Ab”是没有任何抗体处理的阳性对照。NC是同种型对照。

图14A显示了在Hu-HGF的存在下生长的NCI-H1975细胞中磷酸化ERK(pERK)的比率。将细胞用JNJ372类似物或1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3处理。

图14B显示了在Hu-HGF的存在下生长的NCI-H1975细胞中磷酸化Akt(pAkt)的比率。将细胞用JNJ372类似物或1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3处理。

图15A显示了JNJ372类似物和1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3的ADCC效应。

图15B显示了JNJ372类似物和1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3的CDC效应。

图15C显示了JNJ372类似物和1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3(1H1 v3)的癌细胞杀伤效应。

图16A显示了具有双特异性-V1形式的示例性cMET/EGFR双特异性抗体的示意性结构。

图16B显示了具有三特异性-V1形式的示例性cMET/EGFR三特异性抗体的示意性结构。

图17A显示了具有双特异性-V2形式的示例性cMET/EGFR双特异性抗体的示意性结构。

图17B显示了具有三特异性-V2形式的示例性cMET/EGFR三特异性抗体的示意性结构。

图18A显示了具有双特异性-V3形式的示例性cMET/EGFR双特异性抗体的示意性结构。

图18B显示了具有三特异性-V3形式的示例性cMET/EGFR三特异性抗体的示意性结构。

图19A显示了具有双特异性-V4形式的示例性cMET/EGFR双特异性抗体的示意性结构。

图19B显示了具有三特异性-V4形式的示例性cMET/EGFR三特异性抗体的示意性结构。

图20A显示了在与JNJ372类似物、1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3、或1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3 Tri一起孵育后，pHrodo标记的二抗染色的细胞的百分比。

图20B显示了在与JNJ372类似物、1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3、或1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3 Tri一起孵育后，pHrodo标记的二抗染色的细胞的图像。

图21A显示了cMET-1H1的人源化VHH(SEQ ID NO:19)的cMET VHH-Fc表位框并(binning)测定结果。

图21B显示了cMET-1A12的VHH(SEQ ID NO:20)的cMET VHH-Fc表位框并测定结果。

图22A显示了对H1975细胞的抗体结合曲线和计算的EC50值。抗His IgG用作阴性对照。

图22B显示了对H1975.HGF细胞的抗体结合曲线和计算的EC50值。抗His IgG用作阴性对照。

图22C显示了对EGFR突变型C797S-BaF3细胞的抗体结合曲线和计算的EC50值。抗His IgG用作阴性对照。

图23A显示了使用H1975细胞针对EGF/EGFR相互作用的抗体阻断曲线和计算的EC50值。抗His IgG用作阴性对照。

图23B显示了使用H1975.HGF细胞针对EGF/EGFR相互作用的抗体阻断曲线和计算的EC50值。抗His IgG用作阴性对照。

图23C显示了使用EGFR突变型C797S-BaF3细胞针对EGF/EGFR相互作用的抗体阻断曲线和计算的EC50值。抗His IgG用作阴性对照。

图24A显示了使用H1975细胞针对cMET/EGF相互作用的抗体阻断曲线和计算的EC50值。抗His IgG用作阴性对照。

图24B显示了使用H1975.HGF细胞针对cMET/EGF相互作用的抗体阻断曲线和计算的EC50值。抗His IgG用作阴性对照。

图25A显示了使用经HGF刺激的H1975细胞(HGF-)的一组蛋白质印迹结果。还将细胞用1H1cMET/1A12cMET/EGFR(WT)(“三特异性”)、1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3(“双特异性”)、JNJ372类似物(“JNJ”)或阴性对照抗体(“Neg”)处理。抗体的浓度为0.16μg/ml或4μg/ml。箭头突出显示与三特异性相比，JNJ373类似物在介导EGFR降解方面的效率低。

图25B显示了使用H1975.HGF细胞(HGF+)的一组蛋白质印迹结果。还将细胞用1H1cMET/1A12cMET/EGFR(WT)(“TsAb”)、1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3(“BsAb”)、JNJ372类似物(“JNJ”)或阴性对照抗体(“Neg”)处理。抗体的浓度为0.16μg/ml或4μg/ml。

图25C显示了使用具有不可处理的EGFR点突变C797S的细胞系的一组蛋白质印迹结果。还将细胞用1H1cMET/1A12cMET/EGFR(WT)(“三特异性Ab”)、1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3(“双特异性Ab”)、JNJ372类似物(“JNJ”)、抗His Tag抗体(“抗His”)、或阴性对照抗体(“Neg”)处理。抗体的浓度为0.16μg/ml或4μg/ml。

图26A显示了H1975细胞在用抗体处理时的细胞增殖曲线。抗His IgG用作阴性对照。

图26B显示了H1975.HGF细胞在用抗体处理时的细胞增殖曲线。抗His IgG用作阴性对照。

图26C显示了C797S-BaF3细胞在用抗体处理时的细胞增殖曲线。抗His IgG用作阴性对照。

图27A显示了H1975细胞中的抗体内化曲线和计算的IC₅₀值。抗His IgG用作阴性对照。

图27B显示了C797S-BaF3细胞中的抗体内化曲线和计算的IC₅₀值。抗His IgG用作阴性对照。

图27C显示了H1975.HGF细胞中的抗体内化曲线和计算的IC₅₀值。抗His IgG用作阴性对照。

图27D显示了D770-BaF3细胞中的抗体内化曲线和计算的IC₅₀值。抗His IgG用作阴性对照。

图28A显示了使用1:10的靶标:效应物比率的H1975.GFP.Luc细胞和PMBC的ADCC测定结果。还计算了每种测试抗体的IC₅₀值。抗His IgG用作阴性对照。

图28B显示了使用1:10的靶标:效应物比率的H1975.GFP.Luc.HGF细胞和PMBC的ADCC测定结果。还计算了每种测试抗体的IC₅₀值。抗His IgG用作阴性对照。

图29A显示了功效研究的设计。在第-20天执行肿瘤细胞接种。在第0天、第4天、第8天、第12天、第15天和第19天通过腹膜内注射(IP)执行抗体处理(Tx)。第一次处理后，每周监测肿瘤体积(TV)两次。实验在第26天终止。4臂中的“臂”意指研究中的处理。“4臂”意指包括对照在内的4种处理。

图29B显示了组名称、剂量水平和给予计划表。

图29C显示了用H1975肿瘤细胞接种并然后用JNJ372类似物或1H1cMET/1A12cMET/EGFR(WT)处理的Balb/c NU/Nu小鼠的绝对中值肿瘤体积。DPBS用作阴性对照。

图30A显示了功效研究的设计。在第-20天执行肿瘤细胞接种。在第0天、第3天、第7天、第10天、第14天、第17天、第21天和第24天通过腹膜内注射(IP)执行抗体处理(Tx)。第一次处理后，每周监测肿瘤体积(TV)两次。实验在第28天终止。4臂中的“臂”意指研究中的处理。“4臂”意指包括对照在内的4种处理。

图30B显示了组名称、剂量水平和给予计划表。

图30C显示了用H1975-Luc-GFP-HGF肿瘤细胞接种并然后用JNJ372类似物或1H1cMET/1A12cMET/EGFR(WT)处理的Balb/c NU/Nu小鼠的平均肿瘤体积。DPBS用作阴性对照。

图31A显示了功效研究的设计。在第-20天执行肿瘤细胞接种。在第0天、第3天、第7天、第10天、第14天和第17天通过腹膜内注射(IP)执行抗体处理(Tx)。第一次处理后，每周监测肿瘤体积(TV)两次。实验在第22天终止。4臂中的“臂”意指研究中的处理。“4臂”意指包括对照在内的4种处理。

图31B显示了组名称、剂量水平和给予计划表。

图31C显示了用C797S-BaF3细胞接种并然后用JNJ372类似物或1H1cMET/1A12cMET/EGFR(WT)处理的Balb/c NU/Nu小鼠的平均肿瘤体积。DPBS用作阴性对照。

图32列出了来自本公开所述的cMET抗体的VHH的CDR序列。

图33列出了本公开所述的EGFR抗体的重链可变区(VH)的CDR序列。

图34列出了本公开所述的EGFR抗体的轻链可变区(VL)的CDR序列。

图35列出了如本公开所述的特异性结合cMET的VHH的氨基酸序列。

图36列出了如本公开所述的特异性结合EGFR的VH和VL的氨基酸序列。

图37列出了本公开中所讨论的序列。

具体实施方式

在美国，无论男女，肺癌都是癌症相关死亡率的主要原因。发病率和死亡率在发达国家是最高的。根据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)，肺癌死亡率在全球范围内将继续上升，主要是因为特别是在亚洲，全球烟草使用增加。NSCLC(非小细胞肺癌)占所有肺癌的约85％。非小细胞肺癌(NSCLC)的5年总生存率仍然较差——从IB期疾病患者的68％到IVA-IVB期疾病患者的0％至10％。因此，开发出针对NSCLC的有效治疗剂是至关重要的。

针对NSCLC的治疗模式可大致分为两类：免疫检查点阻断剂(ICB)和分子靶向疗法。尽管ICB有显著的临床改善，但其仍可导致发展出原发性和继发性抗性。分子靶向疗法靶向于癌症的致癌驱动因素。EGFR突变是可靶向的致癌驱动因素中最常见的突变。另一方面，已经在包括NSCLC在内的多种人类癌症中检测到异常的c-Met信号传导。此外，c-Met是对靶向疗法(包括针对EGFR的疗法)发展出抗性的关键参与者。因此，同时靶向EGFR和c-Met两者可为有效的策略。

在过去二十年中，NSCLC和肺癌的治疗大体上已从细胞毒性疗法进展到免疫疗法治疗。早期疾病可以用细胞毒性和外科手术方法有效地治疗。然而，高百分比的肿瘤可能复发，导致了较低生存率。

以改善长期生存率为目标的更有效的全身疗法的开发主要需要使用免疫疗法和分子靶向疗法。在2015年，随着纳武单抗(nivolumab)(抗PD-L1，免疫检查点阻断剂(ICB))被US FDA批准用于基于铂的疗法期间或之后疾病有进展的患者，晚期NSCLC的管理取得重大进步。尽管显著的临床改善，但由于原发性或继发性抗性的发展，大多数患者最终无法对ICB疗法作出反应。这可能是由于包括以下的几个原因：细胞因子信号传导、MHC复合物呈递的缺陷，或者分解代谢色氨酸的酶的水平增加，该色氨酸是最佳的T细胞功能所需的。

NSCLC患者中的分子靶向疗法始于20世纪90年代末吉非替尼(gefitinib)，即口服EGFR(表皮生长因子受体)酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的使用。表皮生长因子受体(EGFR)的生理功能是调节上皮组织发育和稳态。在肺癌和乳腺癌以及胶质母细胞瘤中，EGFR是肿瘤发生的驱动因素。EGFR突变是可靶向的致癌驱动因素中最常见的突变，大约占NSCLC的25％(Kris,M.G.等人,"Using multiplexed assays of oncogenic drivers in lung cancersto select targeted drugs."Jama 311.19(2014):1998-2006)。EGFR中的激活突变(如外显子19del和外显子21上的L858R)可使大多数NSCLC肿瘤细胞对第一代EGFR-TKI吉非替尼和埃罗替尼(erlotinib)以及第二代EGFR-TKI阿法替尼(afatinib)和达克替尼(dacomitinib)敏感。在患有这些肿瘤的这些患者的50％中，由于EGFR T790M突变而发展出了获得性抗性。这种抗性导致了第三代EGFR-TKI药物奥希替尼(osimertinib)(TAGRISSO)和罗西替尼(rociletinib)的开发。随着奥希替尼的广泛使用，EGFR C797S抗性突变也随之出现。除了继发性EGFR突变之外，旁路机制如MET或ERBB2扩增、Hippo通路抑制，以及胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)激活也促成对EGFR-TKI的抗性。

异常的cMET信号传导牵涉到多种人类癌症的发展/进展。这由cMET的过表达、cMET中的激活突变、反式激活、自分泌或旁分泌信号传导、或cMET基因扩增引起。通过对癌症疗法结果的研究，认识到了EGFR与cMET信号传导之间的显著关系。cMET是对靶向疗法(包括针对EGFR的疗法)发展出抗性的关键参与者。相似地，EGFR和下游基因突变(如KRAS)、组织学转化以及替代通路(包括cMET信号传导通路)的激活已被鉴定为对EGFR靶向疗法的抗性机制。因此，阻断一种受体往往上调另一种，从而导致对单一试剂治疗的抗性。在对EGFR的酪氨酸激酶抑制剂(包括埃罗替尼和吉非替尼)具有固有或获得性抗性的NSCLC患者中，观察到cMET的扩增和/或高水平的HGF配体表达。相反，MET扩增的肺癌细胞在延长的时段内暴露于cMET抑制剂经由EGF通路产生抗性。

由于EGFR和cMet之间的信号传导串扰，联合抑制这两种受体可导致改善MET和EGFR驱动的癌症患者的结果。另外，与仅阻断一种通路相比，同时抑制可以克服或者延迟治疗抗性。已经使用单独的MET和EGFR抑制剂的组合(二价MET抗体，即依玛妥珠单抗(emibetuzumab)(LY2875358 Eli Lilly))作为单一疗法以及与埃罗替尼联合用于晚期癌症，探索了MET和EGFR的双重抑制。但是针对EGFR和cMET两者的双特异性抗体(BsAb)的开发是NSCLC治疗的重大发展。已经测试了两种主要的BsAb(LY3164530，来自Eli Lilly，以及JNJ-61186372(埃万妥单抗(Amivantamab)，也称为JNJ372)，来自Janssen labs和Genmab)。LY3164530和JNJ-61186372的细节可见于例如PCT/US2013/071288；Moores,S.L.等人,"Anovel bispecific antibody targeting EGFR and cMet is effective against EGFRinhibitor–resistant lung tumors."Cancer research 76.13(2016):3942-3953；和Patnaik,A.等人,"A phase I study of LY3164530,a bispecific antibody targetingMET and EGFR,in patients with advanced or metastatic cancer."CancerChemotherapy and Pharmacology 82.3(2018):407-418；其各自以引用方式并入本文。

LY3164530药物的I期临床试验(ClinicalTrials.gov Identifier:NCT02221882)于2014年8月开始，并且该研究于2017年3月7日完成。这项研究的主要目的是评价LY3164530在患有晚期和/或已扩散到身体其它部位的癌症的参与者中的安全性。由于以下原因，药物LY3164530未进入II期：a)缺乏用于研究的预测标记，b)毒性增加，c)PK和PD问题，以及d)由不良事件所致的剂量调整。JNJ-61186372是在Genmab与Janssen Biotech,Inc.的合作下使用Genmab的技术创建的(Moores,S.L.等人,"A novelbispecific antibody targeting EGFR and cMet is effective against EGFRinhibitor-resistant lung tumors."Cancer research 76.13(2016):3942-3953)。JNJ-61186372正处于治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的II期临床研究的探索之中(ClinicalTrials.gov Identifier:NCT02609776)。该研究于2016年5月24日开始，并且是正在进行的试验，计划于2022年7月结束。另外，该药物已被美国FDA授予治疗非小细胞肺癌的突破性疗法认证(Breakthrough Therapy Designation for the Treatment of Non-Small Cell Lung Cancer)。

肿瘤靶向小分子激酶抑制剂奥希替尼以及BsAb(如JNJ61186372)的开发导致了许多NSCLC患者的无进展生存期得到改善。然而，已有文献表明，在体内小鼠模型中产生对JNJ61186372单一和联合疗法(与奥希替尼，TAGRISSO联合)的抗性。在鉴定基于信号传导的抗性机制而进行的研究中(Goodman,A.M.等人,"Tumor mutational burden as anindependent predictor of response to immunotherapy in diverse cancers."Molecular Cancer Therapeutics 16.11(2017):2598-2608)，将皮下细胞系异种移植物用奥希替尼、JNJ-61186372、或组合处理较短时间以确定靶标抑制，或者延长的时间段以建立抗性肿瘤，然后，对这些切除的肿瘤进行基于质谱的磷酸化蛋白质组学分析，以量化旁路信号传导或靶标再激活。在短时间的研究中，发现奥希替尼比JNJ-61186372更有效，因为它对肿瘤磷酸酪氨酸谱具有最强的效应。所有用奥希替尼处理的肿瘤是更高相关的并且被分组在一起，而不考虑联合治疗。相比之下，给予JNJ-61186372单一疗法的肿瘤展示出更大的肿瘤间异质性，并且与奥希替尼单一疗法或联合治疗的相关性不大。另外，与JNJ-61186372单一疗法的适中降低相比，用奥希替尼单一疗法处理的肿瘤表现出EGFR、Shc1和Gab1的磷酸化显著下降，指示对EGFR的较强在靶(on-target)抑制。

在本公开中，创建了靶向cMET和EGFR两者的多特异性抗体(例如1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3)。在一些实施方案中，抗体的结构形式使得其具有两个与cMET结合的VHH结构域，而主要的IgG结构与EGFR结合。实验显示，多特异性抗体在与cMET和/或EGFR受体的结合能力方面比参考对照双特异性抗体(例如JNJ372类似物，得自Janssen labs)更有效。此外，本文所述的多特异性抗体还可阻断这些受体与其相应配体之间的相互作用。功能测定揭示，多特异性抗体有利地与JNJ372类似物相当，并且在大多数情况下，不仅更好地成功抑制了cMET和EGFR受体的磷酸化，而且通过抑制ERK和Akt蛋白的磷酸化而抑制下游信号传导通路，所述ERK和Akt蛋白参与癌细胞增殖、生存和阻碍凋亡通路。还发现与JNJ372类似物相比，多特异性抗体在补体依赖性细胞毒性(CDC)中更有效。因此，这些数据支持了本文所述的多特异性抗体可开发成患有肺癌以及与异常EGFR和cMET信号传导有关的其它恶性肿瘤的患者的候选药物。

也在本公开中，创建了靶向cMET和EGFR两者的三特异性抗体(例如1H1cMET/1A12cMET/EGFR(WT))。在一些实施方案中，抗体具有两个单独的VHH结构域，这两个结构域与cMET的两个不同表位结合，而主要的IgG结构与EGFR结合。实验显示，三特异性抗体在与cMET和EGFR受体的结合能力方面比基准对照双特异性抗体(例如JNJ372类似物，得自Janssen labs)更有效。此外，三特异性抗体还可阻断这些受体与其相应配体之间的相互作用。功能测定揭示，三特异性抗体有利地在不仅成功抑制了cMET和EGFR受体的磷酸化，而且通过抑制MET的磷酸化以及降解EGFR蛋白而抑制下游信号传导通路中与JNJ372类似物相当，所述蛋白参与癌细胞增殖、生存和阻碍凋亡通路。另外，与基准相比，三特异性抗体显示出增强的受体内化。此外，还发现与JNJ372类似物相比，三特异性抗体在抗体依赖性细胞毒性中更有效。此外，体内结果显示三特异性抗体在肿瘤减少中比JNJ372类似物更有效。因此，这些数据支持了本文所述的三特异性抗体可开发成患有肺癌以及与异常EGFR和cMET信号传导有关的其它恶性肿瘤的患者的候选药物。

EGFR和cMET

表皮生长因子受体(EGFR、ErbBI或HER1)是由c-erbBl原癌基因编码的170kDa的1型跨膜糖蛋白。表皮生长因子受体是ErbB受体家族、四种密切相关的受体酪氨酸激酶的亚家族的成员：EGFR(ErbB-1)、HER2/neu(ErbB-2)、Her 3(ErbB-3)和Her 4(ErbB-4)。在许多癌症类型中，影响EGFR表达或活性的突变可导致癌症。EGFR信号传导由配体结合引发，随后诱导构象变化、受体与其它ErbB家族成员同源二聚化或异源二聚化，以及受体反式自磷酸化，从而引发信号传导级联，最终影响各种各样的细胞功能(包括细胞增殖和存活)，EGFR的表达或激酶活性的提高与一系列人类癌症有关，从而使EGFR成为治疗性干预的有吸引力的靶标。EGFR基因拷贝数和蛋白质表达两者的提高与非小细胞肺癌中对EGFR酪氨酸激酶抑制剂IRESSA^TM(吉非替尼)作出的有利反应相关联。

c-Met(也称为酪氨酸蛋白激酶Met或肝细胞生长因子受体(HGFR))是人类中由MET基因编码的蛋白质。该蛋白质具有酪氨酸激酶活性。初级单链前体蛋白经翻译后切割以产生α和β亚基，它们通过二硫键连接形成成熟受体。c-Met被其配体肝细胞生长因子(HGF)激活，刺激了大量的细胞过程，包括生长、运动、侵入、转移、上皮-间质转化、血管生成/伤口愈合以及组织再生。HGF:c-Met结合的确切化学计量尚不清楚，但通常认为两个HGF分子与两个c-Met分子结合，导致受体二聚化以及酪氨酸1230、1234和1235处的自磷酸化。配体非依赖性c-Met自磷酸化也可由于基因扩增、突变或受体过表达而发生。

c-Met经常在许多类型的癌症中扩增、突变或过表达，包括胃癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌、膀胱癌、头颈癌、卵巢癌、前列腺癌、甲状腺癌、胰腺癌以及CNS癌。典型地定位于激酶结构域的错义突变通常存在于遗传性乳头状肾细胞癌(PRCC)和13％的散发性PRCC中(Schmidt等人,Oncogene 18:2343-2350,1999)，定位于c-Met的信号素或近膜结构域的c-Met突变经常存在于胃癌、头颈癌、肝癌、卵巢癌、NSCLC和甲状腺癌。已经在脑癌、结肠直肠癌、胃癌和肺癌中检测到c-Met扩增，这通常与疾病进展相关。分别多至4％和20％的非小细胞肺癌(NSCLC)和胃癌表现出c-Met扩增。在肺癌中也经常观察到c-Met过表达。此外，在临床样本中，近一半的肺腺癌表现出高水平的c-Met和HGF，这两者都与增强的肿瘤生长率、转移和预后不良相关。

在对EGF酪氨酸激酶抑制剂变得有抗性的所有肿瘤中，有近60％提高c-Met表达，扩增c-Met，或者增加c-Met唯一已知的配体HGF，表明了存在着通过c-Met对EGFR的补偿通路。c-Met扩增首先在对吉非替尼(EGFR激酶抑制剂)变得有抗性的培养细胞中鉴定出，并通过Her3通路表现出增强的生存率。这在临床样本中得到进一步验证，在43名对埃罗替尼或吉非替尼有获得性抗性的患者中，有九名表现出c-Met扩增。

由于可能缺乏特异性、潜在脱靶活性以及小分子抑制剂可能遇到的剂量限制性毒性，目前用于拮抗EGFR和/或c-Met信号传导通路的小分子和大分子治疗方法的疗法可能是次优的。典型的单特异性二价抗体可导致膜结合受体聚集以及下游信号传导通路不希望的激活。具有全长重链(半臂)的单价抗体给制造过程带来了显著的复杂性和成本。

配体(如EGF)与EGFR的结合刺激受体二聚化、自磷酸化、受体的内部细胞质酪氨酸激酶结构域的激活，以及参与调节DNA合成(基因激活)和细胞周期进程或分裂的多种信号传导和反式激活通路的引发。EGFR信号传导的抑制可导致一种或多种EGFR的抑制。在一些实施方案中，EGFR配体包括EGF、TGFa、肝素结合EGF(HB-EGF)、双调蛋白(AR)以及上皮调节蛋白(EPI)。

HGF与cMet的结合刺激受体二聚化、自磷酸化、受体的内部细胞质酪氨酸激酶结构域的激活，以及参与调节DNA合成(基因激活)和细胞周期进程或分裂的多种信号传导和反式激活通路的引发，c-Met信号传导的抑制可导致一种或多种c-Met下游信号传导通路的抑制，并因此中和c-Met可具有各种效应，包括抑制细胞增殖和分化、血管生成、细胞运动以及转移。

EGFR和c-Met在癌症中的作用描述于例如WO2014081954A1、WO2008/127710、WO2009/111691、WO2009/126834、WO2010/039248、WO2010/115551和US2009/0042906；Engelman等人"MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancerby activating ERBB3 signaling."science316.5827(2007):1039-1043；Bean等人"METamplification occurs with or without T790M mutations in EGFR mutant lungtumors with acquired resistance to gefitinib or erlotinib."Proceedings of theNational Academy of Sciences 104.52(2007):20932-20937，其全文以引用方式并入本文。

重链抗体可变结构域(VHH)

单克隆抗体和重组抗体是医学和生物技术中的重要工具。像所有哺乳动物一样，骆驼科(如美洲驼)能够产生由以Y形经二硫键结合在一起的两条重链和两条轻链构成的常规抗体(例如IgG1)。然而，它们也产生两种独特的IgG亚类：IgG2和IgG3，也称为重链抗体。这些抗体仅由两条重链构成，它们缺乏CH1区，但在其N末端仍然带有抗原结合结构域，称为VHH(或纳米抗体)。常规Ig需要重链和轻链的可变区的缔合，以允许抗原-抗体相互作用的高度多样性。尽管分离的重链和轻链仍显示出这种能力，但与成对的重链和轻链相比，它们表现出极低的亲和力。重链抗体的独特特征在于其单体抗原结合区以与常规抗体相当的特异性、亲和力并尤其是多样性结合抗原的能力，无需与另一个区配对。这一特征主要是由于两条重链的可变区的氨基酸序列内的几个主要变异，这在与常规Ig相比时诱导深度构象变化。可变区中的主要置换阻止了轻链与重链的结合，而且也阻止了未结合的重链被免疫球蛋白结合蛋白再循环利用。

这些抗体的单可变结构域(称为VHH、sdAb、纳米抗体、或重链抗体可变结构域)是由适应性免疫系统生成的最小抗原结合结构域。通常发现这些抗体的可变区的第三互补决定区(CDR3)的长度是常规抗体的两倍。这导致与抗原的相互作用表面增大以及抗原-抗体相互作用的多样性增加，这补偿了轻链的缺失。凭借长互补决定区3(CDR3)，VHH可延伸到常规抗体不可接近的蛋白质的缝隙中，包括功能上感兴趣的位点，如酶的活性位点或病毒表面上的受体结合峡谷。此外，额外的半胱氨酸残基使结构更稳定，从而增加了相互作用的强度。

与携带常规抗体可变结构域(VH和VL)的常规抗体相比，VHH提供了许多其它优势，包括更高的稳定性、溶解度、表达产量和重折叠能力，以及更好的体内组织穿透性。此外，与常规抗体的VH结构域形成对照，VHH不展现与轻链结合的内在趋势。这有利于在功能性轻链基因座的存在下重链抗体的诱导。另外，由于VHH不与VL结构域结合，与含有常规VH-VL对或基于VH结构域的单结构域的构建体相比，将VHH重建为多特异性抗体构建体要容易得多。

本公开提供了例如抗cMET抗体、其修饰抗体、其嵌合抗体，以及其人源化抗体。本公开还提供了这些抗体的VHH。这些VHH可用于如本文所述的各种多特异性抗体构建体中。

cMET-1H1(或1H1)以及cMET-1H1衍生的抗体(例如人源化抗体)的CDR序列包括分别如SEQ ID NO:1、2和3中所示的VHH结构域的CDR。cMET-1H1抗体的VHH结构域的氨基酸序列在SEQ ID NO:19、77、78、79、80、81和84中示出。

cMET-1A12(或1A12)以及cMET-1A12衍生的抗体(例如人源化抗体)的CDR序列包括分别如SEQ ID NO:4、5和6中所示的VHH结构域的CDR。cMET-1A12抗体的VHH结构域的氨基酸序列在SEQ ID NO:20中示出。

cMET-1E9(或1E9)以及cMET-1E9衍生的抗体(例如人源化抗体)的CDR序列包括分别如SEQ ID NO:7、8和9中所示的VHH结构域的CDR。cMET-1E9抗体的VHH结构域的氨基酸序列在SEQ ID NO:21中示出。

cMET-1F3(或1F3)以及cMET-1F3衍生的抗体(例如人源化抗体)的CDR序列包括分别如SEQ ID NO:10、11和12中所示的VHH结构域的CDR。cMET-1F3抗体的VHH结构域的氨基酸序列在SEQ ID NO:22、82和83中示出。

还提供了各种修饰或人源化VHH的氨基酸序列。由于有不同的方式来修饰或人源化美洲驼抗体(例如，序列可用不同的氨基酸置换来修饰)，抗体的重链和轻链可具有多于一种形式的人源化序列。在一些实施方案中，人源化VHH结构域与SEQ ID NO:19-22和77-84中的任何序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％相同。

此外，在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段还可含有一个、两个、或三个选自SEQ ID NO:1-3、SEQ ID NO:4-6、SEQ ID NO:7-9，以及SEQ ID NO:10-12的VHH结构域CDR。

在一些实施方案中，抗体可具有包含互补决定区(CDR)1、2、3的重链抗体可变结构域(VHH)，其中CDR1区包含与选定的VHH CDR1氨基酸序列至少80％、85％、90％、或95％相同的氨基酸序列或由与选定的VHH CDR1氨基酸序列至少80％、85％、90％、或95％相同的氨基酸序列组成，CDR2区包含与选定的VHH CDR2氨基酸序列至少80％、85％、90％、或95％相同的氨基酸序列或由与选定的VHH CDR2氨基酸序列至少80％、85％、90％、或95％相同的氨基酸序列组成，并且CDR3区包含与选定的VHH CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％、或95％相同的氨基酸序列或由与选定的VHH CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％、或95％相同的氨基酸序列组成。选定的VHH CDR 1、2、3氨基酸序列显示于图32中。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可含有重链抗体可变结构域(VHH)，该重链抗体可变结构域含有以下项中的一者、两者、或三者：具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失、或置换的VHH CDR1；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失、或置换的VHH CDR2；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失、或置换的VHH CDR3，其中VHH CDR1、VHHCDR2和VHH CDR3选自图32中的CDR。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可含有重链抗体可变结构域(VHH)，该重链抗体可变结构域含有以下项的CDR中的一者、两者、或三者：具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失、或置换的SEQ ID NO:1；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失、或置换的SEQ ID NO:2；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失、或置换的SEQ ID NO:3。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可含有重链抗体可变结构域(VHH)，该重链抗体可变结构域含有以下项的CDR中的一者、两者、或三者：具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失、或置换的SEQ ID NO:4；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失、或置换的SEQ ID NO:5；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失、或置换的SEQ ID NO:6。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可含有重链抗体可变结构域(VHH)，该重链抗体可变结构域含有以下项的CDR中的一者、两者、或三者：具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失、或置换的SEQ ID NO:7；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失、或置换的SEQ ID NO:8；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失、或置换的SEQ ID NO:9。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可含有重链抗体可变结构域(VHH)，该重链抗体可变结构域含有以下项的CDR中的一者、两者、或三者：具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失、或置换的SEQ ID NO:10；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失、或置换的SEQ ID NO:11；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失、或置换的SEQ ID NO:12。

插入、缺失和置换可以在CDR序列之内，或者在CDR序列的一个或两个末端处。在一些实施方案中，CDR基于Kabat编号方案确定。在一些实施方案中，CDR基于Chothia编号方案确定。在一些实施方案中，CDR基于组合编号方案确定。

本公开还提供了结合cMET的抗体或其抗原结合片段。抗体或其抗原结合片段含有重链抗体可变结构域(VHH)，该重链抗体可变结构域包含与选定的VHH序列至少80％、85％、90％、或95％相同的氨基酸序列或由与选定的VHH序列至少80％、85％、90％、或95％相同的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，选定的VHH序列为SEQ ID NO:19。在一些实施方案中，选定的VHH序列为SEQ ID NO:20。在一些实施方案中，选定的VHH序列为SEQ ID NO:21。在一些实施方案中，选定的VHH序列为SEQ ID NO:22。在一些实施方案中，选定的VHH序列为SEQID NO:77。在一些实施方案中，选定的VHH序列为SEQ ID NO:78。在一些实施方案中，选定的VHH序列为SEQ ID NO:79。在一些实施方案中，选定的VHH序列为SEQ ID NO:80。在一些实施方案中，选定的VHH序列为SEQ ID NO:81。在一些实施方案中，选定的VHH序列为SEQ ID NO:82。在一些实施方案中，选定的VHH序列为SEQ ID NO:83。在一些实施方案中，选定的VHH序列为SEQ ID NO:84。

为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的百分比同一性，将序列进行比对以用于最佳比较目的(例如，可在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一者或两者中引入空位以用于最佳比对，并且可忽略非同源序列以用于比较目的)。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中相应位置处的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置处是相同的。考虑到为了两个序列的最佳比对而需要引入的空位的数量和每个空位的长度，两个序列之间的百分比同一性是序列共享的相同位置的数量的函数。出于举例说明的目的，序列的比较和两个序列之间的百分比同一性的确定可以使用例如具有12的空位罚分、4的空位扩展罚分和5的移码空位罚分的Blossum 62评分矩阵来实现。

本公开还提供了核酸，该核酸包含编码包含免疫球蛋白重链抗体可变结构域(VHH)的多肽的多核苷酸。VHH包含如图32所显示的CDR，或者具有如图35所显示的序列。

抗体和抗原结合片段也可为抗体或抗体片段的抗体变体(包括衍生物和缀合物)以及多特异性(例如双特异性)抗体或抗体片段。本文所提供的额外抗体是多克隆、单克隆、多特异性(多聚体，例如双特异性)、人抗体、嵌合抗体(例如，人-小鼠嵌合体)、单链抗体、胞内制造的抗体(即胞内抗体)及其抗原结合片段。

在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含可源自各种类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、种类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)、或亚类的Fc结构域。在一些实施方案中，Fc结构域源自IgG抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，Fc结构域包含一个、两个、三个、四个、或更多个重链恒定区。

本公开还提供了结合cMET的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含选自SEQ ID NO:1、4、7、或10的重链抗体可变结构域(VHH)CDR1。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含选自SEQ ID NO:2、5、8、或11的重链抗体可变结构域(VHH)CDR2。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含选自SEQ ID NO:3、6、9、或12的重链抗体可变结构域(VHH)CDR3。

抗EGFR抗体和抗原结合片段

本公开提供了特异性结合EGFR的抗体和其抗原结合片段。本文所述的抗体和抗原结合片段能够结合EGFR。这些抗体可为激动剂或拮抗剂。在一些实施方案中，这些抗体可以抑制EGFR相关的信号传导通路(例如，阻断EGF与EGFR之间的结合)，并因此治疗癌症(例如，NSCLC)。在一些实施方案中，这些抗体可引发CMC或ADCC。

本公开提供了例如抗EGFR抗体、其嵌合抗体，以及其人源化抗体。在一些实施方案中，抗EGFR抗体及其衍生的抗体(例如人源化抗体)的CDR序列包括重链可变结构域的CDR(SEQ ID NO:13、14和15)。具有这些VH CDR的VH可以与具有各种不同VL CDR的VL配对。在一些实施方案中，抗EGFR抗体及其衍生的抗体(例如人源化抗体)的CDR序列包括轻链可变结构域的CDR(SEQ ID NO:16、17和18)。

还提供了人源化抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。由于有不同的方式来人源化小鼠抗体(例如，序列可用不同的氨基酸置换来修饰)，抗体的重链和轻链可具有多于一种形式的人源化序列。在一些实施方案中，人源化重链可变区(VH)与SEQ ID NO:23至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％相同。在一些实施方案中，人源化轻链可变区(VL)与SEQ ID NO:24至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％相同。

抗EGFR抗体的重链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:23中示出。抗EGFR抗体的轻链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:24中示出。

此外，在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段还可含有一个、两个、或三个选自SEQ ID NO:13-15的重链可变区CDR；和/或一个、两个、或三个选自SEQ IDNO:16-18的轻链可变区CDR。

在一些实施方案中，抗体可具有包含互补决定区(CDR)1、2、3的重链可变区(VH)，其中CDR1区包含与选定的VH CDR1氨基酸序列至少80％、85％、90％、或95％相同的氨基酸序列或由与选定的VH CDR1氨基酸序列至少80％、85％、90％、或95％相同的氨基酸序列组成，CDR2区包含与选定的VH CDR2氨基酸序列至少80％、85％、90％、或95％相同的氨基酸序列或由与选定的VH CDR2氨基酸序列至少80％、85％、90％、或95％相同的氨基酸序列组成，并且CDR3区包含与选定的VH CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％、或95％相同的氨基酸序列或由与选定的VH CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％、或95％相同的氨基酸序列组成，以及包含CDR 1、2、3的轻链可变区(VL)，其中CDR1区包含与选定的VL CDR1氨基酸序列至少80％、85％、90％、或95％相同的氨基酸序列或由与选定的VL CDR1氨基酸序列至少80％、85％、90％、或95％相同的氨基酸序列组成，CDR2区包含与选定的VL CDR2氨基酸序列至少80％、85％、90％、或95％相同的氨基酸序列或由与选定的VL CDR2氨基酸序列至少80％、85％、90％、或95％相同的氨基酸序列组成，并且CDR3区包含与选定的VL CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％、或95％相同的氨基酸序列或由与选定的VL CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％、或95％相同的氨基酸序列组成。选定的VH CDR 1、2、3氨基酸序列以及选定的VL CDR 1、2、3氨基酸序列显示于图33(VH CDR)和图34(VL CDR)中。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可含有重链可变结构域，该重链可变结构域含有以下项的CDR中的一者、两者、或三者：具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失、或置换的SEQ ID NO:13；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失、或置换的SEQID NO:14；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失、或置换的SEQ ID NO:15。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可含有轻链可变结构域，该轻链可变结构域含有以下项的CDR中的一者、两者、或三者：具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失、或置换的SEQ ID NO:16；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失、或置换的SEQID NO:17；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失、或置换的SEQ ID NO:18。

本公开还提供了结合EGFR的抗体或其抗原结合片段。抗体或其抗原结合片段含有重链可变区(VH)，该重链可变区包含与选定的VH序列至少80％、85％、90％、或95％相同的氨基酸序列或由与选定的VH序列至少80％、85％、90％、或95％相同的氨基酸序列组成，以及轻链可变区(VL)，该轻链可变区包含与选定的VL序列至少80％、85％、90％、或95％相同的氨基酸序列或由与选定的VL序列至少80％、85％、90％、或95％相同的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，选定的VH序列为SEQ ID NO:23，并且选定的VL序列为SEQ ID NO:24。

本公开还提供了核酸，该核酸包含编码包含免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链的多肽的多核苷酸。免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链分别包含如图33和图34所显示的CDR，或者具有如图36所显示的序列。当多肽与相应的多肽(例如，相应的重链可变区或相应的轻链可变区)配对时，配对的多肽结合EGFR(例如，人EGFR)。

抗EGFR抗体和抗原结合片段也可为抗体或抗体片段的抗体变体(包括衍生物和缀合物)以及多特异性(例如双特异性)抗体或抗体片段。本文所提供的额外抗体是多克隆、单克隆、多特异性(多聚体，例如双特异性)、人抗体、嵌合抗体(例如，人-小鼠嵌合体)、单链抗体、胞内制造的抗体(即胞内抗体)及其抗原结合片段。抗体或其抗原结合片段可为任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、种类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)、或亚类。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段为IgG抗体或其抗原结合片段。

抗体片段适合用于所提供的方法，只要它们保留全长抗体的期望亲和力和特异性即可。因此，结合EGFR的抗体的片段将保留结合EGFR的能力。

在一个方面，本公开涉及一种核酸，该核酸包含编码多肽的多核苷酸，该多肽包含：

(1)包含重链可变区(VH)的免疫球蛋白重链或其片段，该重链可变区包含含有分别在SEQ ID NO:13、14和15中所示的氨基酸序列的互补决定区(CDR)1、2和3，并且其中VH在与包含SEQ ID NO:24中所示的氨基酸序列的轻链可变区(VL)配对时结合EGFR；或者

(2)包含VL的免疫球蛋白轻链或其片段，该VL包含含有分别在SEQ ID NO:16、17和18中所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中VH在与包含SEQ ID NO:23中所示的氨基酸序列的VH配对时结合EGFR。

在一些实施方案中，核酸包含编码多肽的多核苷酸，该多肽包含含有VH的免疫球蛋白重链或其片段，该VH包含含有分别在SEQ ID NO:13、14和15中所示的氨基酸序列的CDR1、2和3。

在一些实施方案中，核酸包含编码多肽的多核苷酸，该多肽包含含有VL的免疫球蛋白轻链或其片段，该VL包含含有分别在SEQ ID NO:16、17和18中所示的氨基酸序列的CDR1、2和3。

在一些实施方案中，VH在与VL配对时特异性结合人EGFR，或者VL在与VH配对时特异性结合人EGFR。

在一些实施方案中，免疫球蛋白重链或其片段是人源化免疫球蛋白重链或其片段，并且免疫球蛋白轻链或其片段是人源化免疫球蛋白轻链或其片段。

在一些实施方案中，核酸编码单链可变片段(scFv)。在一些实施方案中，核酸是cDNA。

在一个方面，本公开涉及一种载体，该载体包含本文所述的一种或多种核酸。在一个方面，本公开涉及一种载体，该载体包含本文所述的两种核酸，其中载体编码VL区和VH区，该VL区和VH区一起结合EGFR。在一个方面，本公开涉及一对载体，其中每个载体包含本文所述的一种核酸，其中载体对一起编码VL区和VH区，该VL区和VH区一起结合EGFR。

在一个方面，本公开涉及一种细胞，该细胞包含本文所述的载体或载体对。在一个方面，本公开涉及本文所述的两种核酸。

在一些实施方案中，两种核酸一起编码VL区和VH区，该VL区和VH区一起结合EGFR。

在一个方面，本公开涉及一种结合EGFR(表皮生长因子受体)的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含：

重链可变区(VH)，该重链可变区包含互补决定区(CDR)1、2和3，其中VH CDR1区包含与SEQ ID NO:13至少80％相同的氨基酸序列，VH CDR2区包含与SEQ ID NO:14至少80％相同的氨基酸序列，并且VH CDR3区包含与SEQ ID NO:15至少80％相同的氨基酸序列；以及

轻链可变区(VL)，该轻链可变区包含CDR 1、2和3，其中VL CDR1区包含与SEQ IDNO:16至少80％相同的氨基酸序列，VL CDR2区包含与SEQ ID NO:17至少80％相同的氨基酸序列，并且VL CDR3区包含与SEQ ID NO:18至少80％相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，VH包含分别具有SEQ ID NO:13、14和15中所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且VL包含分别具有SEQ ID NO:16、17和18中所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3。

在一个方面，本公开涉及一种结合EGFR的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含含有与SEQ ID NO:23至少90％相同的氨基酸序列的重链可变区(VH)，以及含有与SEQ ID NO:24至少90％相同的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。

在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:23的序列，并且VL包含SEQ ID NO:24的序列。

在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段特异性结合人EGFR。

在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段是单链可变片段(scFV)。

在一个方面，本公开涉及一种抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含如本文所述的抗体或其抗原结合片段的VH CDR 1、2、3以及VL CDR 1、2、3。

在一些实施方案中，本文所述的抗体是双特异性抗体或多特异性抗体。

cMET/EGFR双特异性抗体的结构

在一些实施方案中，双特异性抗体设计成包括靶向cMET的VHH。双特异性抗体描述于以下。

cMET(酪氨酸蛋白激酶Met，或肝细胞生长因子受体(HGFR))是一种对胚胎发育、器官发生和伤口愈合至关重要的单次跨膜酪氨酸激酶受体。本公开提供了结合cMET和EGFR两者的双特异性抗体。双特异性抗体可用于治疗受试者中的cMET或EGFR阳性癌症(例如非小细胞肺癌)。

具有特异性结构的cMET/EGFR双特异性抗体描述于以下。

双特异性-V1结构

如图16A所显示，cMET/EGFR双特异性抗体可制备成具有双特异性-V1结构。特别地，cMET/EGFR双特异性抗体包含(a)第一多肽，该第一多肽从N末端到C末端包含：第一重链抗体可变结构域(VHH)、第一铰链区、第一Fc区；(b)第二多肽，该第二多肽从N末端到C末端包含：重链可变区(VH)、第二铰链区，以及第二Fc区；以及(c)第三多肽，该第三多肽包含轻链可变区(VL)。在一些实施方案中，第一VHH特异性结合cMET。在一些实施方案中，VH和VL彼此缔合并且特异性结合EGFR。

在一些实施方案中，第一铰链区和/或第二铰链区包含与SEQ ID NO:25-29中的任一者至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。在一些实施方案中，第一Fc区和/或第二Fc区包含与SEQ ID NO:30或31至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。

在一些实施方案中，cMET/EGFR双特异性抗体包含纽入扣(knob-into-hole)突变。在一些实施方案中，Fc区为IgG1 Fc区。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:43或44至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQ ID NO:45或46至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。在一些实施方案中，第三多肽包含与SEQ ID NO:47至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。

在一些实施方案中，第一Fc区和/或第二Fc区包含根据EU编号在第239位处的天冬氨酸(Asp)。在一些实施方案中，第一Fc区和/或第二Fc区包含根据EU编号在第332位处的谷氨酸(Glu)。在一些实施方案中，第一Fc区和/或第二Fc区包含与SEQ ID NO:35或36至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。

在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQ ID NO:33至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。在一些实施方案中，第三多肽包含与SEQ ID NO:34至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。

双特异性-V2结构

如图17A所显示，cMET/EGFR双特异性抗体可制备成具有双特异性-V2结构。特别地，cMET/EGFR双特异性抗体包含(a)第一多肽，该第一多肽从N末端到C末端包含：第一重链抗体可变结构域(VHH)、第一铰链区、第一Fc区；以及(b)第二多肽，该第二多肽从N末端到C末端包含：单链可变片段(scFv)、第二铰链区，以及第二Fc区。

在一些实施方案中，第一VHH特异性结合cMET。在一些实施方案中，scFv包含重链可变区(VH)、接头肽序列，以及轻链可变区(VL)。在一些实施方案中，VH和VL彼此缔合并且特异性结合EGFR。

在一些实施方案中，接头肽序列包含与SEQ ID NO:37-42中的任一者至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。在一些实施方案中，接头肽序列包含与SEQ ID NO:38或39至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。在一些实施方案中，接头肽序列包含与GGGGS(SEQ ID NO:37)的一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、或8个)重复序列至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。在一些实施方案中，第一铰链区和/或第二铰链区包含与SEQ ID NO:25-29中的任一者至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。在一些实施方案中，第一Fc区和/或第二Fc区包含与SEQ ID NO:30或31至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。

在一些实施方案中，cMET/EGFR双特异性抗体包含纽入扣(knob-into-hole)突变。在一些实施方案中，Fc区为IgG1 Fc区。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:53或54至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQ ID NO:55或56至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:57或58至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQ ID NO:59或60至少80％相同的序列。

双特异性-V3结构

如图18A所显示，cMET/EGFR双特异性抗体可制备成具有双特异性-V3结构。特别地，cMET/EGFR双特异性抗体包含(a)第一多肽，该第一多肽从N末端到C末端包含：第一重链抗体可变结构域(VHH1)、第一接头肽序列、第一重链可变区(VH1)、第一铰链区，以及第一Fc区；(b)第二多肽，该第二多肽包含第一轻链可变区(VL1)；(c)第三多肽，该第三多肽从N末端到C末端包含：第二重链抗体可变结构域(VHH2)、第二接头肽序列、第二重链可变区(VH2)、第二铰链区，以及第二Fc区；以及(d)第四多肽，该第四多肽包含第二轻链可变区(VL2)。在一些实施方案中，VHH1和VHH2特异性结合cMET。在一些实施方案中，VH1和VL1彼此缔合并且特异性结合EGFR。在一些实施方案中，VH2和VL2彼此缔合并且特异性结合EGFR。

在一些实施方案中，第一接头肽序列和/或第二接头肽序列包含与SEQ ID NO:37-42中的任一者至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。在一些实施方案中，第一接头肽序列和/或第二接头肽序列包含与SEQ ID NO:38或39至少80％相同的序列。在一些实施方案中，第一和/或第二接头肽序列包含与GGGGS(SEQ ID NO:37)的一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、或8个)重复序列至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。

在一些实施方案中，第一铰链区和/或第二铰链区包含与SEQ ID NO:25-29中的任一者至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。

在一些实施方案中，VHH1和VHH2的序列是相同的。在一些实施方案中，第一Fc区和/或第二Fc区包含与SEQ ID NO:32至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:61或62至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQ ID NO:63至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。在一些实施方案中，第三多肽包含与SEQ ID NO:61或62至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。在一些实施方案中，第四多肽包含与SEQ ID NO:63至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。

在一些实施方案中，第一多肽和/或第三多肽包含与SEQ ID NO:33至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。在一些实施方案中，第二多肽和/或第四多肽包含与SEQ ID NO:34至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。

双特异性-V4结构

如图19A所显示，cMET/EGFR双特异性抗体可制备成具有双特异性-V4结构。特别地，cMET/EGFR双特异性抗体包含(a)第一多肽，该第一多肽从N末端到C末端包含：第一重链可变区(VH1)、第一铰链区、第一Fc区；第一接头肽序列，以及第一重链抗体可变结构域(VHH1)；(b)第二多肽，该第二多肽包含第一轻链可变区(VL1)；(c)第三多肽，该第三多肽从N末端到C末端包含：第二重链可变区(VH2)、第二铰链区、第二Fc区、第二接头肽序列，以及第二重链抗体可变结构域(VHH2)；以及(d)第四多肽，该第四多肽包含第二轻链可变区(VL2)。在一些实施方案中，VHH1和/或VHH2特异性结合cMET。在一些实施方案中，VH1和VL1彼此缔合并且特异性结合EGFR。在一些实施方案中，VH2和VL2彼此缔合并且特异性结合EGFR。

在一些实施方案中，第一接头肽序列和/或第二接头肽序列包含与SEQ ID NO:37-42中的任一者至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。在一些实施方案中，第一接头肽序列和/或第二接头肽序列包含与SEQ ID NO:38或39至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。在一些实施方案中，第一和/或第二接头肽序列包含与GGGGS(SEQ IDNO:37)的一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、或8个)重复序列至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。

在一些实施方案中，VHH1和VHH2的序列是相同的。在一些实施方案中，第一Fc区和/或第二Fc区包含与SEQ ID NO:32至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:69或70至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQ ID NO:71至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。在一些实施方案中，第三多肽包含与SEQ ID NO:69或70至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。在一些实施方案中，第四多肽包含与SEQ ID NO:71至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。

在一些实施方案中，具有双特异性-V1、双特异性-V2、双特异性-V3、或双特异性-V4结构的cMET/EGFR双特异性抗体的特异性结合cMET的VHH可以选自本公开中所描述的靶向cMET的VHH中的任一种。

在一些实施方案中，具有双特异性-V1、双特异性-V2、双特异性-V3、或双特异性-V4结构的cMET/EGFR双特异性抗体的在与VL缔合时特异性结合EGFR的VH可以选自本公开中所描述的靶向EGFR的VH中的任一种。

在一些实施方案中，具有双特异性-V1、双特异性-V2、双特异性-V3、或双特异性-V4结构的cMET/EGFR双特异性抗体的在与VH缔合时特异性结合EGFR的VL可以选自本公开中所描述的靶向EGFR的VL中的任一种。

cMET/EGFR多特异性抗体的结构

在一些实施方案中，多特异性(例如三特异性)抗体设计成包括靶向cMET的VHH。在一些实施方案中，设计了包括靶向cMET的额外VHH的多特异性(例如三特异性)抗体。多特异性(例如三特异性)抗体描述于以下。

cMET(酪氨酸蛋白激酶Met，或肝细胞生长因子受体(HGFR))是一种对胚胎发育、器官发生和伤口愈合至关重要的单次跨膜酪氨酸激酶受体。本公开提供了结合cMET和EGFR两者的多特异性(例如三特异性)抗体。三特异性抗体可用于治疗受试者中的cMET或EGFR阳性癌症(例如非小细胞肺癌)。

具有特异性结构的cMET/EGFR三特异性抗体描述于以下。

三特异性-V1结构

如图16B所显示，cMET/EGFR三特异性抗体可制备成具有三特异性-V1结构。特别地，cMET/EGFR三特异性抗体包含(a)第一多肽，该第一多肽从N末端到C末端包含：第二重链抗体可变结构域(VHH)、接头肽序列、第一VHH、第一铰链区、第一Fc区；(b)第二多肽，该第二多肽从N末端到C末端包含：重链可变区(VH)、第二铰链区，以及第二Fc区；以及(c)第三多肽，该第三多肽包含轻链可变区(VL)。在一些实施方案中，第一VHH和第二VHH特异性结合cMET。在一些实施方案中，VH和VL彼此缔合并且特异性结合EGFR。

在一些实施方案中，接头肽序列包含与SEQ ID NO:37-42中的任一者至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。在一些实施方案中，接头肽序列包含与SEQ ID NO:38或39至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。在一些实施方案中，接头肽序列包含与GGGGS(SEQ ID NO:37)的一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、或8个)重复序列至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:48或49至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQ ID NO:50或51至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。在一些实施方案中，第三多肽包含与SEQ IDNO:52至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。

三特异性-V2结构

如图17B所显示，cMET/EGFR三特异性抗体可制备成具有三特异性-V2结构。特别地，cMET/EGFR三特异性抗体包含(a)第一多肽，该第一多肽从N末端到C末端包含：第二重链抗体可变结构域(VHH)、第二接头肽序列、第一VHH、第一铰链区、第一Fc区；以及(b)第二多肽，该第二多肽从N末端到C末端包含：单链可变片段(scFv)、第二铰链区，以及第二Fc区。

在一些实施方案中，第一和第二VHH特异性结合cMET。在一些实施方案中，scFv包含重链可变区(VH)、第一接头肽序列，以及轻链可变区(VL)。在一些实施方案中，VH和VL彼此缔合并且特异性结合EGFR。

在一些实施方案中，cMET/EGFR三特异性抗体包含纽入扣突变。在一些实施方案中，Fc区为IgG1 Fc区。

在一些实施方案中，第一接头肽序列和/或第二接头肽序列包含与SEQ ID NO:37-42中的任一者至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。在一些实施方案中，第一接头肽序列和/或第二接头肽序列包含与SEQ ID NO:38或39至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。在一些实施方案中，第一接头肽序列和/或第二接头肽序列包含与GGGGS(SEQ ID NO:37)的一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、或8个)重复序列至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。

三特异性-V3结构

如图18B所显示，cMET/EGFR三特异性抗体可制备成具有三特异性-V3结构。特别地，cMET/EGFR三特异性抗体包含(a)第一多肽，该第一多肽从N末端到C末端包含：第一重链抗体可变结构域(VHH1)、第一接头肽序列、第一重链可变区(VH1)、第一铰链区，以及第一Fc区；(b)第二多肽，该第二多肽包含第一轻链可变区(VL1)；(c)第三多肽，该第三多肽从N末端到C末端包含：第二重链抗体可变结构域(VHH2)、第二接头肽序列、第二重链可变区(VH2)、第二铰链区，以及第二Fc区；以及(d)第四多肽，该第四多肽包含第二轻链可变区(VL2)。在一些实施方案中，VHH1和VHH2特异性结合cMET。在一些实施方案中，VH1和VL1彼此缔合并且特异性结合EGFR。在一些实施方案中，VH2和VL2彼此缔合并且特异性结合EGFR。

在一些实施方案中，如三特异性-V3结构中所述的VHH1和VHH2的序列是不同的。在一些实施方案中，第一Fc区和/或第二Fc区包含与SEQ ID NO:30或31至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:64或65至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQ IDNO:68至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。在一些实施方案中，第三多肽包含与SEQ ID NO:66或67至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。在一些实施方案中，第四多肽包含与SEQ ID NO:68至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:85至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQ ID NO:68至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。在一些实施方案中，第三多肽包含与SEQ ID NO:86至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。在一些实施方案中，第四多肽包含与SEQ IDNO:68至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。

在一些实施方案中，Fc区为IgG1(例如人IgG1)Fc区。一些实施方案中，本文所述的cMET/EGFR三特异性抗体包含纽入扣突变。

三特异性-V4结构

如图19B所显示，cMET/EGFR三特异性抗体可制备成具有三特异性-V4结构。特别地，cMET/EGFR三特异性抗体包含(a)第一多肽，该第一多肽从N末端到C末端包含：第一重链可变区(VH1)、第一铰链区、第一Fc区；第一接头肽序列，以及第一重链抗体可变结构域(VHH1)；(b)第二多肽，该第二多肽包含第一轻链可变区(VL1)；(c)第三多肽，该第三多肽从N末端到C末端包含：第二重链可变区(VH2)、第二铰链区、第二Fc区、第二接头肽序列，以及第二重链抗体可变结构域(VHH2)；以及(d)第四多肽，该第四多肽包含第二轻链可变区(VL2)。在一些实施方案中，VHH1和/或VHH2特异性结合cMET。在一些实施方案中，VH1和VL1彼此缔合并且特异性结合EGFR。在一些实施方案中，VH2和VL2彼此缔合并且特异性结合EGFR。

在一些实施方案中，如三特异性-V4结构中所述的VHH1和VHH2的序列是不同的。在一些实施方案中，第一Fc区和/或第二Fc区包含与SEQ ID NO:30或31至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:72或73至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQ IDNO:76至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。在一些实施方案中，第三多肽包含与SEQ ID NO:74或75至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。在一些实施方案中，第四多肽包含与SEQ ID NO:76至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。

在一些实施方案中，具有三特异性-V1、三特异性-V2、三特异性-V3、或三特异性-V4结构的cMET/EGFR三特异性抗体的特异性结合cMET的VHH可以选自本公开中所描述的靶向cMET的VHH中的任一种。

在一些实施方案中，具有三特异性-V1、三特异性-V2、三特异性-V3、或三特异性-V4结构的cMET/EGFR三特异性抗体的在与VL缔合时特异性结合EGFR的VH可以选自本公开中所描述的靶向EGFR的VH中的任一种。

在一些实施方案中，具有三特异性-V1、三特异性-V2、三特异性-V3、或三特异性-V4结构的cMET/EGFR三特异性抗体的在与VH缔合时特异性结合EGFR的VL可以选自本公开中所描述的靶向EGFR的VL中的任一种。

抗体特征

抗cMET、抗EGFR、或抗cMET/EGFR抗原结合蛋白构建体(例如抗体、双特异性抗体、三特异性抗体、多特异性抗体、或其抗体片段)可以包括衍生自如本文所述的任何抗cMET抗体、抗EGFR抗体、或其任何抗原结合片段的抗原结合位点。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段是EGFR拮抗剂。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是EGFR激动剂。在一些实施方案中，如本文所述的抗体或其抗原结合片段是cMET拮抗剂。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是cMET激动剂。

在一些实施方案中，本文所述的抗体、或其抗原结合片段可结合cMET和/或EGFR，由此阻断这些受体与其相应配体的相互作用；减少cMET和/或EGFR的磷酸化；减少下游信号传导通路(例如ERK和/或Akt通路)的磷酸化；和/或通过ADCC和/或CDC来直接杀伤癌细胞。

在一些实施方案中，与JNJ-372或JNJ-372类似物相比，本文所述的抗体或其抗原结合片段具有至少或约50％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约80％、至少或约90％、至少或约100％、至少或约110％、至少或约120％、至少或约130％、至少或约140％、至少或约150％、至少或约200％的cMET结合能力(例如通过ELISA所测定)。

在一些实施方案中，与JNJ-372或JNJ-372类似物相比，本文所述的抗体或其抗原结合片段具有至少或约50％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约80％、至少或约90％、至少或约100％、至少或约110％、至少或约120％、至少或约130％、至少或约140％、至少或约150％、至少或约200％的EGFR结合能力(例如通过ELISA所测定)。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段结合cMET的EC50为小于或约50ng/ml、小于或约40ng/ml、小于或约30ng/ml、小于或约20ng/ml、小于或约15ng/ml、小于或约10ng/ml、小于或约9ng/ml、小于或约8ng/ml、小于或约7ng/ml、小于或约6ng/ml、小于或约5ng/ml、小于或约4ng/ml、小于或约3ng/ml、小于或约2ng/ml、小于或约1ng/ml。在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段结合cMET的EC50为约1ng/ml至约20ng/ml、约1ng/ml至约10ng/ml、或约5ng/ml至约10ng/ml。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段阻断cMET/HGF相互作用的EC50为小于或约1nM、小于或约0.9nM、小于或约0.8nM、小于或约0.7nM、小于或约0.6nM、小于或约0.5nM、小于或约0.4nM、小于或约0.3nM。在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段阻断cMET/HGF相互作用的EC50为约0.1nM至约1nM、约0.1nM至约0.8nM、或约0.1nM至约0.6nM。在一些实施方案中，与使用基本相同的测定方法的JNJ372或JNJ372类似物的EC50相比，本文所述的抗体或其抗原结合片段阻断cMET/HGF相互作用的EC50为小于80％、小于70％、小于60％、小于50％、或小于40％。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段结合EGFR的EC50为小于或约50ng/ml、小于或约40ng/ml、小于或约30ng/ml、小于或约20ng/ml、小于或约15ng/ml、小于或约10ng/ml、小于或约9ng/ml、小于或约8ng/ml、小于或约7ng/ml、小于或约6ng/ml、小于或约5ng/ml、小于或约4ng/ml、小于或约3ng/ml、小于或约2ng/ml、小于或约1ng/ml。在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段结合EGFR的EC50为约1ng/ml至约20ng/ml、约1ng/ml至约15ng/ml、约1ng/ml至约10ng/ml、或约5ng/ml至约10ng/ml。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段阻断EGFR/EGF相互作用的EC50为小于或约1nM、小于或约0.9nM、小于或约0.8nM、小于或约0.7nM、小于或约0.6nM、小于或约0.5nM、小于或约0.4nM、小于或约0.3nM。在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段阻断EGFR/EGF相互作用的EC50为约0.2nM至约1nM、约0.2nM至约0.8nM、或约0.2nM至约0.6nM。在一些实施方案中，与使用基本相同的测定方法的JNJ372或JNJ372类似物的EC50相比，本文所述的抗体或其抗原结合片段阻断EGFR/EGF相互作用的EC50为小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％、或小于3％。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段结合NSCLC细胞(例如，本文所述的任一种NSCLC细胞)的EC50为小于或约1nM、小于或约0.9nM、小于或约0.8nM、小于或约0.7nM、小于或约0.6nM、小于或约0.5nM、小于或约0.4nM、小于或约0.3nM、小于或约0.2nM、小于或约0.15nM、小于或约0.14nM、小于或约0.13nM、小于或约0.1nM。在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段结合NSCLC细胞的EC50为约0.1nM至约1nM、约0.1nM至约0.5nM、约0.1nM至约0.2nM、或约0.1nM至约0.15nM。在一些实施方案中，与使用基本相同的测定方法的JNJ372或JNJ372类似物的EC50相比，本文所述的抗体或其抗原结合片段结合NSCLC细胞的EC50为小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、或小于5％。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段抑制NSCLC细胞(例如，本文所述的任一种NSCLC细胞)增殖的EC50为小于或约2nM、小于或约1.5nM、小于或约1nM、小于或约0.9nM、小于或约0.8nM、小于或约0.7nM、小于或约0.6nM、小于或约0.5nM、小于或约0.4nM、小于或约0.3nM、小于或约0.2nM、小于或约0.1nM、小于或约0.05nM、小于或约0.04nM、小于或约0.03nM。在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段抑制NSCLC细胞增殖的EC50为约0.03nM至约2nM、约0.03nM至约1nM、或约0.03nM至约0.3nM。在一些实施方案中，与使用基本相同的测定方法的JNJ372或JNJ372类似物的EC50相比，本文所述的抗体或其抗原结合片段结合NSCLC细胞的EC50为小于20％、小于10％、小于5％、小于3％、小于1％、小于0.5％、小于0.1％、小于0.05％、或小于0.01％。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段诱导内化的IC₅₀为小于或约0.5nM、小于或约0.4nM、小于或约0.3nM、小于或约0.2nM、小于或约0.15nM、小于或约0.1nM、小于或约0.09nM、小于或约0.08nM、小于或约0.07nM、小于或约0.06nM、小于或约0.05nM、小于或约0.02nM、小于或约0.01nM。在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段诱导内化的IC₅₀为约0.01nM至约0.1nM、约0.01nM至约0.05nM、或约0.05nM至约0.1nM。在一些实施方案中，与使用基本相同的测定方法的JNJ372或JNJ372类似物的IC₅₀相比，本文所述的抗体或其抗原结合片段诱导内化的IC₅₀为小于70％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％、或小于3％。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段在NSCLC细胞(例如H1975细胞)中具有比JNJ372或JNJ372类似物更好的效应子功能(例如ADCC效应)。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段在NSCLC细胞移植的动物模型中具有比JNJ372或JNJ-372类似物更好的癌细胞杀伤功效。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段可阻断cMET与cMET配体(例如HGF)的相互作用。在一些实施方案中，与同种型对照抗体或JNJ-372或JNJ-372类似物相比，抗体或其抗原结合片段使cMET与cMET配体(例如HGF)的结合下降至小于90％、小于80％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、或小于5％。在一些实施方案中，与JNJ-372或JNJ-372类似物相比，抗体或其抗原结合片段具有至少或约50％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约80％、至少或约90％、至少或约100％、至少或约110％、至少或约120％、至少或约130％、至少或约140％、至少或约150％、至少或约200％的cMET/HGF阻断能力(例如通过ELISA所测定)。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段可阻断EGFR与EGFR配体(例如EGF)的相互作用。在一些实施方案中，与同种型对照抗体或JNJ-372或JNJ-372类似物相比，抗体或其抗原结合片段使EGFR与EGFR配体(例如EGF)的结合下降至小于90％、小于80％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、或小于5％。在一些实施方案中，与JNJ-372或JNJ-372类似物相比，抗体或其抗原结合片段具有至少或约50％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约80％、至少或约90％、至少或约100％、至少或约110％、至少或约120％、至少或约130％、至少或约140％、至少或约150％、至少或约200％的EGFR/EGF阻断能力(例如通过如本文所述的免疫荧光测定所测定)。

在一些实施方案中，与非特异性抗体、同种型对照抗体、JNJ372、或JNJ372类似物相比，本文所述的抗体或其抗原结合片段使细胞(例如cMET表达细胞)中cMET的磷酸化(例如HGF诱导的磷酸化)水平下降至小于90％、小于80％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、或小于5％。在一些实施方案中，与用JNJ-372或JNJ-372类似物处理相比，在用抗体或其抗原结合片段处理之后，包含磷酸化cMET(例如通过如本文所述的FACS所测定)的细胞的比率为小于或约50％、小于或约60％、小于或约70％、小于或约80％、小于或约90％、小于或约100％、小于或约110％、小于或约120％、小于或约130％、小于或约140％、小于或约150％、小于或约200％。在一些实施方案中，在用抗体或其抗原结合片段处理之后，包含磷酸化cMET(例如通过如本文所述的FACS所测定)的细胞的比率为小于或约6％、小于或约5％、小于或约4％、小于或约3％、小于或约2％、小于或约1％。

在一些实施方案中，与非特异性抗体、同种型对照抗体、JNJ372、或JNJ-372类似物相比，本文所述的抗体或其抗原结合片段使细胞(例如EGFR表达细胞)中EGFR的磷酸化(例如EGF诱导的磷酸化)水平下降至小于90％、小于80％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、或小于5％。在一些实施方案中，与用JNJ-372或JNJ-372类似物处理的细胞相比，用抗体或其抗原结合片段处理的细胞(例如EGFR表达细胞)具有小于或约90％、小于或约80％、小于或约70％、小于或约60％、小于或约50％、小于或约40％、小于或约30％、小于或约20％、小于或约10％、小于或约5％的磷酸化EGFR(例如通过如本文所述的ELISA所测定)的比率。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段降低了参与癌细胞增殖、存活、和/或细胞凋亡的下游信号传导通路的磷酸化水平。在一些实施方案中，与非特异性抗体、同种型对照抗体、JNJ372、或JNJ372类似物相比，本文所述的抗体或其抗原结合片段使细胞(例如cMET或EGFR表达细胞)中ERK的磷酸化水平下降至小于90％、小于80％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、或小于5％。在一些实施方案中，与用JNJ-372或JNJ-372类似物处理的细胞相比，用抗体或其抗原结合片段处理的细胞(例如cMET或EGFR表达细胞)具有小于或约90％、小于或约80％、小于或约70％、小于或约60％、小于或约50％、小于或约40％、小于或约30％、小于或约20％、小于或约10％、小于或约5％的磷酸化ERK在总ERK中的比率(例如通过如本文所述的ELISA所测定)。在一些实施方案中，用抗体或其抗原结合片段处理的细胞(例如cMET或EGFR表达细胞)具有小于或约0.95、小于或约0.90、小于或约0.85、小于或约0.80、小于或约0.75、小于或约0.75、小于或约0.70、小于或约0.65、小于或约0.60、小于或约0.55、小于或约0.50、小于或约0.45、小于或约0.40、小于或约0.35、小于或约0.30、小于或约0.25、小于或约0.20、小于或约0.15、小于或约0.10、小于或约0.05的磷酸化ERK相对于总ERK的比率(例如通过如本文所述的ELISA所测定)。

在一些实施方案中，与非特异性抗体、同种型对照抗体、JNJ372、或JNJ-372类似物相比，本文所述的抗体或其抗原结合片段使细胞(例如cMET或EGFR表达细胞)中Akt的磷酸化水平下降至小于90％、小于80％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、或小于5％。在一些实施方案中，与用JNJ-372或JNJ-372类似物处理的细胞相比，用抗体或其抗原结合片段处理的细胞(例如cMET或EGFR表达细胞)具有小于或约90％、小于或约80％、小于或约70％、小于或约60％、小于或约50％、小于或约40％、小于或约30％、小于或约20％、小于或约10％、小于或约5％的磷酸化Akt的比率(例如通过如本文所述的ELISA所测定)。在一些实施方案中，用抗体或其抗原结合片段处理的细胞(例如cMET或EGFR表达细胞)具有小于或约0.95、小于或约0.90、小于或约0.85、小于或约0.80、小于或约0.75、小于或约0.75、小于或约0.70、小于或约0.65、小于或约0.60、小于或约0.55、小于或约0.50、小于或约0.45、小于或约0.40、小于或约0.35、小于或约0.30、小于或约0.25、小于或约0.20、小于或约0.15、小于或约0.12、小于或约0.10、小于或约0.08、小于或约0.06的磷酸化Akt相对于总Akt的比率(例如通过如本文所述的ELISA所测定)。

在一些实施方案中，抗体(或其抗原结合片段)以小于0.1s^-1、小于0.01s^-1、小于0.001s^-1、小于0.0001s^-1、或小于0.00001s^-1的解离速率(k_off)特异性结合抗原(例如癌抗原)。在一些实施方案中，解离速率(k_off)为大于0.01s^-1、大于0.001s^-1、大于0.0001s^-1、大于0.00001s^-1、或大于0.000001s^-1。在一些实施方案中，动力学缔合速率(k_on)为大于1×10²/Ms、大于1×10³/Ms、大于1×10⁴/Ms、大于1×10⁵/Ms、大于2×10⁵/Ms、大于2.2×10⁵/Ms或大于2.4×10⁶/Ms。在一些实施方案中，动力学缔合速率(k_on)为小于1×10⁵/Ms、小于1×10⁶/Ms、或小于1×10⁷/Ms。

亲和力可以由动力学速率常数的商数(K_d＝k_off/k_on)推导出。在一些实施方案中，Kd为小于1×10^-4M、小于1×10^-5M、小于1×10^-6M、小于1×10^-7M、小于1×10^-8M、小于1×10^- ⁹M、或小于1×10^-10M。在一些实施方案中，Kd为小于50nM、30nM、20nM、15nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、或0.1nM。在一些实施方案中，Kd为大于1×10^-4M、大于1×10^-5M、大于1×10^-6M、大于1×10^- ⁷M、大于1×10^-8M、大于1×10^-9M、大于1×10^-10M、大于1×10^-11M、或大于1×10^-12M。此外，Ka可以通过式Ka＝1/Kd由Kd推导出。

在一些实施方案中，小心地调整与cMET或EGFR的结合亲和力，例如Kd可为100nM-0.1nM、100nM-1nM、100nM-10nM、10nM-0.1nM、10nM-1nM、或1nM-0.1nM。

用于测量抗体对抗原的亲和力的一般技术包括例如ELISA、RIA，以及表面等离子体共振(SPR)。

在一些实施方案中，抗体具有大于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、或200％的肿瘤生长抑制百分比(TGI％)。在一些实施方案中，抗体具有小于60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、或200％的肿瘤生长抑制百分比。可以例如在处理开始后3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30天，或者在处理开始后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12个月测定TGI％。

如本文所用，肿瘤生长抑制百分比(TGI％)使用下式计算：

TGI(％)＝[1-(T_i-T₀)/(V_i-V₀)]×100

T_i是处理组在第i天的平均肿瘤体积。T₀是处理组在第零天的平均肿瘤体积。V_i是对照组在第i天的平均肿瘤体积。V₀是对照组在第零天的平均肿瘤体积。

在一些实施方案中，与参考抗体(例如JNJ372或JNJ-372类似物)相比，本文所述的抗体或其抗原结合片段具有至少或约50％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约80％、至少或约90％、至少或约100％、至少或约110％、至少或约120％、至少或约130％、至少或约140％、至少或约150％、至少或约200％的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在一些实施方案中，与非特异性抗体对照或同种型抗体对照相比，本文所述的抗体或其抗原结合片段可以使抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、2倍、3倍、5倍、10倍、20倍、或100倍。

在一些实施方案中，与参考抗体(例如JNJ372或JNJ372类似物)相比，本文所述的抗体或其抗原结合片段具有至少或约50％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约80％、至少或约90％、至少或约100％、至少或约110％、至少或约120％、至少或约130％、至少或约140％、至少或约150％、至少或约200％的补体依赖性细胞毒性(CDC)。在一些实施方案中，与非特异性抗体对照或同种型抗体对照相比，本文所述的抗体或其抗原结合片段可以使补体依赖性细胞毒性(CDC)增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、2倍、3倍、5倍、10倍、20倍、或100倍。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段具有小于或约1000ng/ml、小于或约500ng/ml、小于或约400ng/ml、小于或约300ng/ml、小于或约250ng/ml、小于或约200ng/ml、小于或约100ng/ml的细胞杀伤IC₅₀。在一些实施方案中，与参考抗体(例如JNJ372或JNJ372类似物)相比，本文所述的抗体或其抗原结合片段具有小于或约50％、小于或约60％、小于或约70％、小于或约80％、小于或约90％、小于或约100％、小于或约110％、小于或约120％、小于或约130％、小于或约140％、小于或约150％、小于或约200％的细胞杀伤IC₅₀值。在一些实施方案中，与同种型对照抗体相比，本文所述的抗体或其抗原结合片段具有小于或约20％、小于或约10％、小于或约8％、小于或约5％、小于或约3％、小于或约1％的细胞杀伤IC₅₀值。

在一些实施方案中，与参考抗体(例如JNJ372或JNJ372类似物)或同种型对照抗体相比，抗体或抗原结合片段可以使cMET、EGFR、和/或cMET/EGFR复合物内化率增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、2倍、3倍、5倍、10倍、或20倍。

在一些实施方案中，与本文所述的双特异性抗体(例如1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3)、参考抗体(例如JNJ372或JNJ372类似物)、或同种型对照抗体相比，本文所述的三特异性抗体(例如1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3 Tri)可以使包含内化cMET、EGFR、和/或cMET/EGFR复合物的细胞的百分比增加至少或约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％。在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段可诱导至少或约5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％细胞中的cMET、EGFR、和/或cMET/EGFR复合物内化。

在一些实施方案中，由抗体或其抗原结合片段诱导的cMET、EGFR、和/或cMET/EGFR复合物的内化可进一步减小cMET与cMET配体(例如HGF)的相互作用、和/或EGFR与EGFR配体(例如EGF)的相互作用。

在一些实施方案中，与参考抗体(例如JNJ372或JNJ372类似物)或同种型对照相比，抗体或抗原结合片段可以使吞噬率增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、2倍、3倍、5倍、10倍、或20倍。

在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段具有功能Fc区。在一些实施方案中，功能Fc区的效应子功能是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在一些实施方案中，功能Fc区的效应子功能是吞噬作用。在一些实施方案中，功能Fc区的效应子功能是ADCC和吞噬作用。在一些实施方案中，Fc区为人IgG1、人IgG2、人IgG3、或人IgG4。

在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可诱导细胞凋亡。

在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段不具有功能Fc区。例如，抗体或抗原结合片段为Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段。

在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段是人源化抗体。人源化百分比意指重链或轻链可变区序列与Immunogenetics Information System(IMGT)数据库中的人抗体序列相比的同一性百分比。最高命中意指重链或轻链可变区序列比其它物种更接近于特定物种。例如，对人类的最高命中意指该序列比其它物种更接近于人类。对人和食蟹猕猴(Macaca fascicularis)的最高命中意指该序列与人序列和食蟹猕猴序列具有相同的百分比同一性，并且这些百分比同一性与其它物种的序列相比是最高的。在一些实施方案中，人源化百分比为大于80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、或95％。关于如何确定人源化百分比以及如何确定最高命中的详细描述是本领域已知的，并且描述于例如Jones,等人"The INNs and outs of antibodynonproprietary names."MAbs.第8卷,第1期,Taylor&Francis,2016，其全文以引用方式并入本文。高人源化百分比通常具有各种优势，例如，对人类更安全且更有效，更可能被人类受试者耐受，并且/或者不太可能具有副作用。

在一些实施方案中，多特异性抗体，包括本文所述的双特异性抗体(例如cMET/EGFR双特异性抗体)或本文所述的三特异性抗体(例如cMET/EGFR三特异性抗体)具有包含以下的非对称结构：2、3、4、5、或6个抗原结合位点。在一些实施方案中，本文所述的多特异性抗体包含2、3、4、5、或6个靶向癌抗原(例如cMET或EGFR)的抗原结合位点(例如抗原结合Fab结构域、scFV、或纳米抗体(VHH))。在一些实施方案中，本文所述的多特异性抗体(例如cMET/EGFR双特异性抗体、或cMET/EGFR三特异性抗体)包含至少2、3、4、5、6、或7个共同轻链。在一些实施方案中，至少2、3、4、5、6、或7个共同轻链具有相同的VL序列。在一些实施方案中，至少2、3、4、5、6、或7个共同轻链具有不同的VL序列。在一些实施方案中，结合癌抗原(例如cMET或EGFR)的Fab结构域包含相同的VH序列。在一些实施方案中，结合癌抗原(例如cMET或EGFR)的Fab结构域包含不同的VH序列。在一些实施方案中，在同一多特异性抗体内，结合癌抗原的Fab结构域的C末端与相邻的结合癌抗原的Fab结构域的N末端连接(例如，共价连接或化学连接)。

本公开还提供了一种抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段与如本文所述的任何抗体或抗原结合片段交叉竞争。交叉竞争测定在本领域中是已知的，并且描述于例如Moore等人,"Antibody cross-competition analysis of the humanimmunodeficiency virus type 1gp120 exterior envelope glycoprotein."Journal ofvirology 70.3(1996):1863-1872，其全文以引用方式并入本文。在一个方面，本公开还提供了一种抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段结合与如本文所述的任何抗体或抗原结合片段相同的表位或区。表位框并测定在本领域中是已知的，并且描述于例如Estep等人"High throughput solution-based measurement of antibody-antigenaffinity and epitope binning."MAbs.第5卷,第2期,Taylor&Francis,2013，其全文以引用方式并入本文。

抗体和抗原结合片段

本公开提供了包含本文所述的互补决定区(CDR)、重链可变区、轻链可变区、重链、或轻链的抗体和其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体和其抗原结合片段是不平衡双特异性抗体和其抗原结合片段。

通常，抗体(也称为免疫球蛋白)由两类多肽链即轻链和重链构成。本公开的非限制性抗体可为包含两条重链和两条轻链的完整四条免疫球蛋白链抗体。抗体的重链可为任何同种型，包括IgM、IgG、IgE、IgA、或IgD，或者亚同种型，包括IgG1、IgG2、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4、IgE1、IgE2等。轻链可为k轻链或λ轻链。抗体可包含两个相同的轻链拷贝和/或两个相同的重链拷贝。各自含有一个可变结构域(或可变区，VH)和多个恒定结构域(或恒定区)的重链经由其恒定结构域内的二硫键键合彼此结合，以形成抗体的“茎”。各自含有一个可变结构域(或可变区，VL)和一个恒定结构域(或恒定区)的轻链各自经由二硫结合二硫键结合与一条重链结合。每条轻链的可变区与其所结合的重链的可变区对准。轻链和重链的可变区均含有三个超变区，夹置在更保守的框架区(FR)之间。

这些超变区(称为互补决定区(CDR))形成环，构成了抗体的主要抗原结合表面。四个框架区主要采用β折叠构象，而CDR形成连接β-折叠结构的环，并且在某些情况下构成β折叠结构的一部分。每条链中的CDR通过框架区靠近地保持，并且与来自另一条链的CDR一起促成抗原结合区的形成。

通过分析抗体的氨基酸序列来鉴定抗体的CDR区的方法是公知的，并且通常使用CDR的多种定义。Kabat定义基于序列变异性，而Chothia定义基于结构环区的位置。这些方法和定义描述于例如Martin,"Protein sequence and structure analysis of antibodyvariabledomains,"Antibody engineering,Springer Berlin Heidelberg,2001.422-439；Abhinandan等人"Analysis and improvements to Kabat and structurallycorrect numbering of antibody variable domains,"Molecular immunology 45.14(2008):3832-3839；Wu,T.T.和Kabat,E.A.(1970)J.Exp.Med.132:211-250；Martin等人,Methods Enzymol.203:121-53(1991)；Morea等人,Biophys Chem.68(1-3):9-16(1997年10月)；Morea等人,J Mol Biol.275(2):269-94(1998年1月)；Chothia等人,Nature 342(6252):877-83(1989年12月)；Ponomarenko和Bourne,BMC Structural Biology 7:64(2007)；Kontermann,R.,&Dübel,S.(编辑).(2010).Antibody engineering:第2卷,Springer；其各自全文以引用方式并入本文。在一些实施方案中，CDR基于Kabat定义。在一些实施方案中，CDR基于Chothia定义。在一些实施方案中，CDR是如由Kabat、Chothia、AbM、IMGT、或接触定义所确定的最长CDR序列。

CDR对于识别抗原的表位很重要。如本文所用，“表位”是能够被抗体的抗原结合结构域特异性结合的靶分子的最小部分。表位的最小尺寸可为约三个、四个、五个、六个、或七个氨基酸，但这些氨基酸不需要处在抗原一级结构的连续线性序列中，因为表位可取决于基于抗原的二级和三级结构的抗原的三维构型。

在一些实施方案中，抗体是完整免疫球蛋白分子(例如IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgD、IgE、IgA)。IgG亚类(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)是高度保守的，差别在于其恒定区，特别是其铰链和上CH2结构域。IgG亚类的序列和差异在本领域中是已知的，并且描述于例如Vidarsson等人,"IgG subclasses and allotypes:from structure to effectorfunctions."Frontiers in immunology 5(2014)；Irani等人"Molecular properties ofhuman IgG subclasses and their implications for designing therapeuticmonoclonal antibodies against infectious diseases."Molecular immunology 67.2(2015):171-182；Shakib,Farouk编辑,The human IgG subclasses:molecular analysisof structure,function and regulation.Elsevier,2016；其各自全文以引用方式并入本文。

抗体也可为衍生自任何物种(例如，人类、啮齿动物、小鼠、大鼠、骆驼)的免疫球蛋白分子。本文所公开的抗体还包括但不限于多克隆、单克隆、单特异性、多特异性抗体，以及包括与另一多肽融合的免疫球蛋白结合结构域的嵌合抗体。术语“抗原结合结构域”或“抗原结合片段”是保留完整抗体的特异性结合活性的抗体的一部分，即能够与完整抗体的靶分子上的表位特异性结合的抗体的任何部分。其包括例如Fab、Fab'、F(ab')2，以及这些片段的变体。因此，在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段可为例如scFv、Fv、Fd、dAb、双特异性抗体、双特异性scFv、双抗体、线性抗体、单链抗体分子、由抗体片段形成的多特异性抗体，以及包括结合结构域(该结合结构域是或者与抗体结合结构域同源)的任何多肽。抗原结合结构域的非限制性实例包括例如完整抗体的重链和/或轻链CDR、完整抗体的重链和/或轻链可变区、完整抗体的全长重链或轻链、或来自完整抗体的重链或轻链的单独CDR。

在一些实施方案中，scFV具有两个重链可变结构域，以及两个轻链可变结构域。在一些实施方案中，scFV具有两个抗原结合区(抗原结合区：A和B)，并且两个抗原结合区能够以不同的亲和力结合相应的靶抗原。

在一些实施方案中，抗原结合片段可形成嵌合抗原受体(CAR)的一部分。在一些实施方案中，嵌合抗原受体是如本文所述的单链可变片段(scFv)与CD3-ζ跨膜和胞内结构域融合的融合体。在一些实施方案中，嵌合抗原受体还包含来自各种共刺激蛋白受体(例如，CD28、41BB、ICOS)的胞内信号结构域。在一些实施方案中，嵌合抗原受体包含多个信号结构域，例如CD3z-CD28-41BB或CD3z-CD28-OX40以增大效力。因此，在一个方面，本公开还提供了表达如本文所述的嵌合抗原受体的细胞(例如T细胞)。

在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段可结合两种不同的抗原或两种不同的表位。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段可结合三种不同的抗原或三种不同的表位。

Fv片段是含有完整抗原识别和结合位点的抗体片段。该区由紧密缔合的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体组成，其性质上可为共价的，例如在scFv中。在这种构型中，各可变结构域的三个CDR相互作用，以在VH-VL二聚体的表面上限定抗原结合位点。总的来说，六个CDR或其子集向抗体赋予抗原结合特异性。然而，即使是单可变结构域(或仅包含对抗原特异的三个CDR的Fv的一半)也可具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力通常低于整个结合位点。

单链Fv或(scFv)抗体片段包含抗体的VH和VL结构域(或区)，其中这些结构域存在于单一多肽链中。通常，scFv多肽还包含介于VH与VL结构域之间的多肽接头，其允许scFv形成用于抗原结合的期望结构。

在一些实施方案中，本文所述的scFv从N末端到C末端包含：VH；多肽接头；和VL。在一些实施方案中，本文所述的scFv从N末端到C末端包含：VL；多肽接头；和VH。在一些实施方案中，接头肽包含与SEQ ID NO:37-42中的任一者至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。在一些实施方案中，接头肽包含与SEQ ID NO:38或39至少或约80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。在一些实施方案中，接头肽包含与GGGGS(SEQ ID NO:37)的一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、或8个)重复序列至少或约80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。

Fab片段含有轻链的可变和恒定结构域以及重链的可变结构域和第一恒定结构域(CH1)。F(ab')2抗体片段包含一对Fab片段，这些片段通常通过它们之间的铰链半胱氨酸在其羧基末端附近共价连接。抗体片段的其它化学偶联也是本领域已知的。

双抗体是具有两个抗原结合位点的小抗体片段，这些片段包含在同一多肽链(VH和VL)中与VL连接的VH。通过使用太短而不允许同一链上的两个结构域之间配对的接头，结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并创建两个抗原结合位点。

抗体的多聚化可通过抗体的自然聚集或者通过本领域已知的化学或重组连接技术来实现。例如，一定百分比的纯化抗体制备剂(例如，纯化IgG1分子)自发形成含有抗体同源二聚体和其它高阶抗体多聚体的蛋白质聚集体。

线性抗体包含一对串联的Fd段(VH-CH1-VH-CH1)，它们与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区。线性抗体可为双特异性或单特异性。

或者，抗体同源二聚体可以通过本领域已知的化学连接技术形成。例如，异双功能交联剂，包括但不限于SMCC(琥珀酰亚胺4-(马来酰亚胺甲基)环己烷-1-甲酸酯)和SATA(N-琥珀酰亚胺S-乙酰硫基-乙酸酯)，可以用于形成抗体多聚体。用于形成抗体同源二聚体的示例性方案描述于Ghetie等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:7509-7514,1997)。抗体同源二聚体可以通过胃蛋白酶消化转化为Fab’₂同源二聚体。形成抗体同源二聚体的另一种方式是通过使用Zhao等人(J.Immunol.25:396-404,2002)描述的自亲性T15肽。

本公开的抗体和抗体片段可以在Fc区进行修饰，以提供期望的效应子功能或血清半衰期。在一些实施方案中，本文所述的任一种抗体或抗原结合片段中的Fc区包含根据EU编号在第239位处的天冬氨酸(Asp)。在一些实施方案中，本文所述的任一种抗体或抗原结合片段中的Fc区包含根据EU编号在第332位处的谷氨酸(Glu)。在一些实施方案中，本文所述的Fc区是包含根据EU编号在第239位处的天冬氨酸(Asp)和/或根据EU编号在第332位处的谷氨酸(Glu)的本文所述的任一种Fc区。在一些实施方案中，与野生型抗体或其抗原结合片段的那些相比，本文所述的Asp239和/或Glu332可使抗体或其抗原结合片段的效应子功能(例如ADCC或CDC)增加至少或约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、或100倍。细节可见于例如Lazar,G.A.等人,"Engineeredantibody Fc variants with enhanced effector function."Proceedings of theNational Academy of Sciences 103.11(2006):4005-4010，其全文以引用方式并入本文。

在一些实施方案中，本文所述的任一种抗体或抗原结合片段中的Fc区包含野生型人IgG1 CH2结构域(例如SEQ ID NO:35)。在一些实施方案中，本文所述的任一种抗体或抗原结合片段中的Fc区包含突变的人IgG1 CH2结构域(例如SEQ ID NO:36)。在一些实施方案中，本文所述的Fc区包含与SEQ ID NO:35或36至少80％、85％、90％、95％、或100％相同的序列。

本文所述的任何抗体或抗原结合片段可以缀合至稳定分子(例如，增加抗体或其抗原结合片段在受试者中或溶液中的半衰期的分子)。稳定分子的非限制性实例包括：聚合物(例如，聚乙二醇)或蛋白质(例如，血清白蛋白，如人血清白蛋白)。稳定分子的缀合可以在体外(例如，在组织培养物中，或者当作为药物组合物储存时)或体内(例如，在人体内)增加抗体或抗原结合片段的半衰期或延长其生物活性。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段(例如双特异性抗体)可缀合至治疗剂。包含抗体或其抗原结合片段的抗体-药物缀合物可共价或非共价地结合至治疗剂。在一些实施方案中，治疗剂是细胞毒性剂或细胞抑制剂(例如，细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春花碱、秋水仙素、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素、美登素类如DM-1和DM-4、二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、表柔比星，以及环磷酰胺和类似物)。

在一些实施方案中，本文所述的多特异性抗体或其抗原结合片段(例如cMET/EGFR双特异性抗体或cMET/EGFR三特异性抗体)以包含多特异性抗体的相同VHH的重链抗体(例如抗cMET重链抗体)的约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约110％、约120％、约130％、约140％、约150％、或约200％的结合亲和力结合抗原(例如cMET)。

在一些实施方案中，本文所述的多特异性抗体或其抗原结合片段(例如cMET/EGFR双特异性抗体或cMET/EGFR三特异性抗体)以包含多特异性抗体的靶向EGFR的相同VH和VL的抗体或抗原结合片段(例如抗EGFR单克隆抗体)的约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约110％、约120％、约130％、约140％、约150％、或约200％的结合亲和力结合抗原(例如EGFR)。

在一些实施方案中，与由同种型对照抗体所介导的相比，本文所述的双特异性抗体或其抗原结合片段(例如cMET/EGFR双特异性抗体、或cMET/EGFR三特异性抗体)介导补体依赖性细胞毒性(CDC)达至少或约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、30倍、40倍、或50倍。

在一些实施方案中，本文所述的多特异性抗体或其抗原结合片段(例如cMET/EGFR双特异性抗体、或cMET/EGFR三特异性抗体)以单克隆抗体(例如抗cMET抗体、抗EGFR抗体、或同种型抗体对照)的约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约110％、约120％、约130％、约140％、约150％、或约200％的百分比进行内化。

重组载体

本公开还提供了重组载体(例如，表达载体)，该重组载体包括本文所公开的分离的多核苷酸(例如，编码本文所公开的多肽的多核苷酸)、其中引入有重组载体的宿主细胞(即，使得宿主细胞含有多核苷酸和/或包含多核苷酸的载体)，以及通过重组技术产生的重组抗体多肽或其片段。

如本文所用，“载体”是当载体引入宿主细胞时能够将一种或多种感兴趣的多核苷酸递送至宿主细胞的任何构建体。“表达载体”能够在已引入有表达载体的宿主细胞中递送并且作为编码的多肽表达一种或多种感兴趣的多核苷酸。因此，在表达载体中，通过在载体之内或宿主细胞的基因组中感兴趣的多核苷酸的整合位点之处或附近或侧翼可操作地连接调控元件(如启动子、增强子和/或聚A尾)，使得感兴趣的多核苷酸将在表达载体所引入的宿主细胞中翻译，感兴趣的多核苷酸被定位成在载体中进行表达。

可以通过本领域已知的方法将载体引入宿主细胞中，例如电穿孔、化学转染(例如，DEAE-葡聚糖)、转化、转染、以及感染和/或转导(例如，用重组病毒)。因此，载体的非限制性实例包括病毒载体(其可用于生成重组病毒)、裸DNA或RNA、质粒、粘粒、噬菌体载体，以及与阳离子凝聚剂缔合的DNA或RNA表达载体。

在一些具体实施中，使用病毒表达系统(例如，牛痘病毒或其它痘病毒、逆转录病毒、或腺病毒)引入本文所公开的多核苷酸(例如，编码本文所公开的多肽的多核苷酸)，这可能涉及使用非病原性(缺陷型)有复制能力的病毒，或者可使用复制缺陷型病毒。在后一种情况下，病毒增殖通常仅在互补病毒包装细胞中发生。合适的系统公开于例如Fisher-Hoch等人,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:317-321；Flexner等人,1989,Ann.N.Y.AcadSci.569:86-103；Flexner等人,1990,Vaccine,8:17-21；美国专利No.4,603,112、4,769,330和5,017,487；WO 89/01973；美国专利No.4,777,127；GB 2,200,651；EP 0,345,242；WO91/02805；Berkner-Biotechniques,6:616-627,1988；Rosenfeld等人,1991,Science,252:431-434；Kolls等人,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:215-219；Kass-Eisler等人,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:11498-11502；Guzman等人,1993,Circulation,88:2838-2848；和Guzman等人,1993,Cir.Res.,73:1202-1207。用于将DNA引入此类表达系统中的技术是本领域的普通技术人员所公知的。DNA也可为“裸露的”，如描述于例如Ulmer等人,1993,Science,259:1745-1749，以及Cohen,1993,Science,259:1691-1692。通过将DNA包被到可有效转运到细胞中的可生物降解珠粒上，可以使裸DNA的摄取增加。

为了表达，包含本文所公开的编码抗体或编码多肽的多核苷酸的DNA插入片段能够可操作地连接至适当的启动子(例如，异源启动子)，举例来说，如噬菌体λPL启动子、大肠杆菌(E.coli)lac、trp和tac启动子、SV40早期和晚期启动子以及逆转录病毒LTR的启动子。其它合适的启动子是技术人员已知的。表达构建体可进一步含有用于转录起始、终止的位点，以及转录区中用于翻译的核糖体结合位点。由构建体表达的成熟转录物的编码部分可包括开始处的翻译起始密码子以及终止密码子(UAA、UGA或UAG)，它们适当地定位在待翻译多肽的端部。

如所指示，表达载体可包括至少一个选择性标记。此类标记包括用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性以及用于在大肠杆菌和其它细菌中培养的四环素或氨苄青霉素抗性基因。适当宿主的代表性实例包括但不限于细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌属(Streptomyces)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)细胞；真菌细胞，如酵母细胞；昆虫细胞，如果蝇属(Drosophila)S2和灰翅夜蛾属(spodoptera)Sf9；动物细胞，如CHO、COS、Bowes黑色素瘤，以及HK 293细胞等；和植物细胞。适用于本文所述的宿主细胞的培养基和条件是本领域已知的。

用于细菌的非限制性载体包括pQE70、pQE60和pQE-9，可得自Qiagen；pBS载体、Phagescript载体、Bluescript载体、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A，可得自Stratagene；以及ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5，可得自Pharmacia。非限制性真核载体包括pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG，可得自Stratagene；以及pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL，可得自Pharmacia。其它合适的载体对于技术人员是显而易见的。

适合使用的非限制性细菌启动子包括大肠杆菌lacI和lacZ启动子、T3和T7启动子、gpt启动子、λPR和PL启动子以及trp启动子。合适的真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、逆转录病毒LTR的启动子，如劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)(RSV)的那些，以及金属硫蛋白启动子，如小鼠金属硫蛋白-I启动子。

在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，可以使用含有组成型或诱导型启动子(如α因子、醇氧化酶和PGH)的多种载体。对于综述，参见Ausubel等人(1989)CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,N.Y和Grant等人,Methods Enzymol.,153:516-544(1997)。

可以通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染或其它方法来实现构建体向宿主细胞的引入。此类方法描述于许多标准实验室手册中，如Davis等人,Basic Methods In Molecular Biology(1986)，其全文以引用方式并入本文。

通过将增强子序列插入载体中，可以使高等真核生物对编码本公开的抗体的DNA的转录提高。增强子是DNA的顺式作用元件，通常为约10至300bp，用于增加给定宿主细胞类型中的启动子转录活性。增强子的实例包括位于复制起点后端上的SV40增强子(碱基对100至270处)、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点后端的多瘤增强子，以及腺病毒增强子。

为了使翻译的蛋白质分泌到内质网腔中、周质间隙中或胞外环境中，可将适当的分泌信号引入表达的多肽中。这些信号可为多肽内源性的，或者它们可为异源性信号。

多肽(例如抗体)能够以修饰形式表达，如融合蛋白(例如，GST-融合体)或者带有组氨酸标签，并且不仅可包括分泌信号，而且包括额外的异源功能区。例如，可以向多肽的N末端添加额外的氨基酸(特别是带电荷的氨基酸)区，以改善在宿主细胞中、纯化期间、或后续处理和储存期间的稳定性和持久性。而且，可将肽部分添加至多肽以利于纯化。这些区可在多肽的最终制备之前移除。向多肽添加肽部分以引起分泌或排泄、改善稳定性以及有利于纯化等是本领域中熟悉和常规的技术。

本公开还提供了与如本文所述的任何核苷酸序列至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列，以及与如本文所述的任何氨基酸序列至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同的氨基酸序列。

本公开还提供了与如本文所述的任何核苷酸序列具有至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源性的核酸序列，以及与如本文所述的任何氨基酸序列具有至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本公开涉及编码本文所述的任何肽的核苷酸序列、或由如本文所述的任何核苷酸序列编码的任何氨基酸序列。在一些实施方案中，核酸序列为小于10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、150、200、250、300、350、400、500、或600个核苷酸。在一些实施方案中，氨基酸序列为小于5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、或400个氨基酸残基。

在一些实施方案中，氨基酸序列(i)包含氨基酸序列；或者(ii)由氨基酸序列组成，其中氨基酸序列是如本文所述的任一种序列。

在一些实施方案中，核酸序列(i)包含核酸序列；或者(ii)由核酸序列组成，其中核酸序列是如本文所述的任一种序列。

也可测定序列同源性(例如，氨基酸序列同源性或核酸同源性)的百分比。如何测定序列同源性的百分比是本领域中已知的。在一些实施方案中，具有相似物理化学特性(同源性百分比)的保守的氨基酸残基(例如亮氨酸和异亮氨酸)可用于测量序列相似性。本领域定义了具有相似物理化学特性的氨基酸残基的家族。这些家族包括例如具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β支化侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。在许多情况下，同源性百分比高于同一性百分比。

制备抗体的方法

分离的人蛋白片段(例如cMET、EGFR、或癌抗原)可用作免疫原，以使用多克隆和单克隆抗体制备的标准技术来生成抗体。可以通过多次注射(例如，皮下或腹膜内注射)抗原肽或蛋白质在动物中产生多克隆抗体。在一些实施方案中，将抗原肽或蛋白质与至少一种佐剂一起注射。在一些实施方案中，可以使抗原肽或蛋白质与在待免疫的物种中具免疫原性的试剂缀合。可以向动物注射抗原肽或蛋白质超过一次(例如，两次、三次、或四次)。

可使用全长多肽或蛋白质，或可替代地，其抗原肽片段可用作免疫原。蛋白质的抗原肽包含蛋白质的氨基酸序列的至少8个(例如，至少10、15、20、或30个)氨基酸残基，并且涵盖蛋白质的表位，使得针对该肽产生的抗体与蛋白质形成特异性免疫复合物。

免疫原典型地用于通过对合适的受试者(例如，表达至少一种人免疫球蛋白基因座的人或转基因动物)免疫来制备抗体。合适的免疫原性制备剂可以含有例如重组表达或化学合成的多肽。该制剂还可包括佐剂，如弗氏完全或不完全佐剂、或类似的免疫刺激剂。

多克隆抗体可以如上所述通过用多肽、或其抗原肽(例如蛋白质的一部分)作为免疫原对合适的受试者免疫进行制备。可以通过标准技术，如使用固定化多肽或肽采用酶联免疫吸附测定(ELISA)，随着时间推移监测免疫受试者的抗体滴度。如果需要，可以从哺乳动物(例如，从血液)中分离抗体分子，并通过公知的技术(如蛋白A或蛋白G层析)进一步纯化，以获得IgG级分。在免疫后的适当时间，例如，当特异性抗体滴度最高时，可以从受试者获得产抗体细胞并且用于通过标准技术制备单克隆抗体，如最初Kohler等人描述的杂交瘤技术(Nature 256:495-497,1975)、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等人,Immunol.Today 4:72,1983)、EBV杂交瘤技术(Cole等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,AlanR.Liss,Inc.,第77-96页,1985)、或三源杂交瘤技术。用于产生杂交瘤的技术是公知的(通常参见Current Protocols in Immunology,1994,Coligan等人(编辑),John Wiley&Sons,Inc.,New York,NY)。例如，使用标准ELISA测定，通过筛选杂交瘤培养上清液中结合感兴趣的多肽或表位的抗体来检测产生单克隆抗体的杂交瘤细胞。

VHH也可以从原始或设计的合成美洲驼VHH文库获得。可以获得来自美洲驼的PBMC，并分离RNA以通过逆转录生成cDNA。然后，可以通过PCR扩增VHH基因并将其克隆到噬菌体展示载体中以构建原始VHH文库。合成的(例如，人源化)VHH文库可以通过将重叠PCR生成的改组VHH CDR1、2和3引入修饰人VH支架中来制备，以生成增强的多样性并保持低免疫原性。然后，可以针对抗原淘选VHH文库以获得具有期望的结合亲和力的VHH。

本文所述的抗体或抗原结合片段的变体可以通过将适当的核苷酸变化引入编码本文所述的人、人源化、或嵌合抗体、或其抗原结合片段的DNA中，或者通过肽合成进行制备。此类变体包括例如构成抗体或抗原结合结构域的抗原结合位点的氨基酸序列内的残基的缺失、插入、或置换。在此类变体的群体中，一些抗体或抗原结合片段对靶蛋白具有增加的亲和力。可以进行缺失、插入、和/或组合的任何组合，以得到对靶标具有增加的结合亲和力的抗体或其抗原结合片段。引入抗体或抗原结合片段中的氨基酸变化也可以改变或者引入新的翻译后修饰到抗体或抗原结合片段中，如改变(例如，增加或减少)糖基化位点的数量、改变糖基化位点的类型(例如，改变氨基酸序列，使得不同的糖被细胞中存在的酶连接)，或者引入新的糖基化位点。

本文所公开的抗体可衍生自任何动物物种，包括哺乳动物。天然抗体的非限制性实例包括衍生自人类、灵长类(例如猴和类人猿)、牛、猪、马、绵羊、骆驼科(例如骆驼和美洲驼)、鸡、山羊，以及啮齿动物(例如，大鼠、小鼠、仓鼠和兔，包括经遗传工程化成产生人抗体的转基因啮齿动物)的抗体。

噬菌体展示(淘选)可用于优化具有期望的结合亲和力的抗体序列。在这种技术中，可将编码单链Fv(包含VH或VL)的基因插入噬菌体外壳蛋白基因中，致使噬菌体在其外部“展示”scFv，同时在其内部含有该蛋白质的基因，从而导致基因型与表型之间的联系。然后可以针对靶抗原筛选这些展示噬菌体，以便检测展示的抗原结合位点与靶抗原之间的相互作用。因此，可以在称为体外选择的过程中对大型蛋白质文库进行筛选和扩增，并且可以获得具有期望的结合亲和力的抗体序列。

人和人源化抗体包括具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区(或者具有与它衍生的那些相同的氨基酸序列)的抗体。人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或定点诱变或者通过体内体细胞突变引入的突变)，例如在CDR中。

人源化抗体典型地具有移植有非人CDR的人框架(FR)。因此，人源化抗体具有由非人类来源引入其中的一个或多个氨基酸序列。这些非人氨基酸残基通常称为“输入”残基，其典型地取自“输入”可变结构域。人源化基本上可以通过例如用啮齿动物CDR或CDR序列置换人抗体的相应序列来执行。这些方法描述于例如Jones等人,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen等人,Science,239:1534-1536(1988)；其各自全文以引用方式并入本文。因此，“人源化”抗体是嵌合抗体，其中远远小于完整人V结构域被来自非人物种的相应序列置换。实际上，人源化抗体典型地为小鼠抗体，其中一些CDR残基和一些FR残基被来自人抗体中类似位点的残基置换。

还重要的是抗体被人源化成保留对抗原的高特异性和亲和力以及其它有利的生物学特性。为实现这一目标，可以通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产品的过程来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型是常用的并且是本领域技术人员所熟悉的。计算机程序是可使用的，其示出和展示了所选定候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构。这些展示的检测允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，即，分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。通过此方式，可以从受体和输入序列中选择和组合FR残基，以便实现期望的抗体特征，如增加对一种或多种靶抗原的亲和力。

相对于原始序列的同一性或同源性通常是在比对序列并引入空位(根据需要)以实现最大百分比序列同一性之后，候选序列内存在的氨基酸残基与人、人源化、或嵌合抗体或片段内所存在的序列相同的百分比，而不考虑任何保守置换作为序列同一性的一部分。

在一些实施方案中，可以对抗体或其抗原结合片段进行共价修饰。这些共价修饰可以通过化学或酶促合成，或者通过酶促或化学裂解进行。通过使抗体或片段的靶向氨基酸残基与能够与选定的侧链或N-或C-末端残基反应的有机衍生化试剂反应，将抗体或抗体片段的其它类型的共价修饰引入分子中。

在一些实施方案中，提供了具有缺乏连接(直接或间接)至Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构的抗体变体。例如，此类抗体中岩藻糖的量可为1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。如由MALDI-TOF质谱所测量，通过计算相对于连接至Asn 297的所有糖结构的总和(例如，复合、杂合以及高甘露糖结构)而言糖链内Asn297处岩藻糖的平均量来确定岩藻糖的量，例如，如WO 2008/077546中所述。Asn297是指位于Fc区约第297位处的天冬酰胺残基(Fc区残基的EU编号；或Kabat编号的第314位)；然而，由于抗体中的微小序列变异，Asn297也可位于第297位上游或下游约±3个氨基酸处(即，介于第294与300位之间)。这种岩藻糖基化变体可具有改善的ADCC功能。在一些实施方案中，为了减少聚糖异质性，抗体的Fc区可进一步被工程化成用丙氨酸替换第297位的天冬酰胺(N297A)。

在一些实施方案中，为了通过避免Fab臂交换来提高产生效率，抗体的Fc区被进一步工程化成用脯氨酸替换IgG4的第228位(EU编号)的丝氨酸(S228P)。关于S228突变的详细描述描述于例如Silva等人"The S228P mutation prevents in vivo and in vitro IgG4Fab-arm exchange as demonstrated using a combination of novel quantitativeimmunoassays and physiological matrix preparation."Journal of BiologicalChemistry 290.9(2015):5462-5469，其全文以引用方式并入。

在一些实施方案中，此处描述的方法被设计成制备双特异性抗体。可以通过工程化一对抗体分子之间的界面来制备双特异性抗体，以最大化从重组细胞培养物回收的异源二聚体的百分比。例如，界面可含有抗体恒定结构域的CH3结构域的至少一部分。在该方法中，来自第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链被较大的侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)替换。通过用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换大氨基酸侧链，在第二抗体分子的界面上创建了与一个或多个大侧链的尺寸相同或相似的补偿性“腔”。这提供了用于增加异源二聚体而非其它不希望的终产物(如同源二聚体)的收率的机制。该方法描述于例如WO 96/27011中，其全文以引用方式并入。

在一些实施方案中，IgG的CH3部分中的一个或多个氨基酸残基被置换。在一些实施方案中，一条重链具有以下置换中的一者或多者：Y349C和T366W。另一重链可具有一个或多个以下置换：E356C、T366S、L368A和Y407V。此外，置换(-ppcpScp-->-ppcpPcp-)也可在两个置换的IgG的铰链区处引入。在一些实施方案中，一条重链具有T366Y(纽(knob))置换，而另一重链具有Y407T(扣(hole))置换(EU编号)。

本申请的一个方面提供了一种异多聚体(例如异源二聚体)蛋白，该蛋白包含含有第一重链恒定结构域3(CH3)结构域的第一多肽以及含有第二CH3结构域的第二多肽，其中第一CH3结构域包含相对于野生型CH3结构域在氨基酸位置354处大体积疏水性氨基酸的置换，并且/或者第二CH3结构域包含相对于野生型CH3结构域在氨基酸位置347处带负电荷的氨基酸的置换，并且其中氨基酸残基编号基于EU编号。在一些实施方案中，氨基酸位置354处的大体积疏水性氨基酸与第二CH3结构域中的氨基酸残基形成了疏水相互作用。在一些实施方案中，第二CH3结构域包含氨基酸位置349处的大体积疏水性残基(例如Y349)。在一些实施方案中，氨基酸位置347处带负电荷的氨基酸与第一CH3结构域中的氨基酸残基形成离子键。在一些实施方案中，第一CH3结构域包含氨基酸位置360处带负电荷的残基(例如K360)。在一些实施方案中，第一CH3结构域和第二CH3结构域是人CH3结构域。在一些实施方案中，第一CH3结构域包含选自S354Y、S354F和S354W的置换。在一些实施方案中，第一CH3结构域包含S354Y。在一些实施方案中，第二CH3结构域不包含针对第一CH3结构域中S354的置换的补偿性置换(例如，在Y349处的置换)。在一些实施方案中，第二CH3结构域包含选自Q347E和Q347D的置换。在一些实施方案中，第二CH3结构域包含Q347E。在根据上述任一种异多聚体蛋白的一些实施方案中，第一CH3结构域和第二CH3结构域还包含纽入扣(KIH)残基。在一些实施方案中，纽入扣残基为T366Y和Y407T。在一些实施方案中，第一CH3结构域包含T366Y和S354Y，并且第二CH3结构域包含Y407T和Q347E。在一些实施方案中，第一CH3结构域包含Y407T和S354Y，并且第二CH3结构域包含T366Y和Q347E。细节可见于例如PCT/US2020/025469，其以引用方式并入本文。

此外，阳离子交换层析可用于纯化双特异性抗体。阴离子交换色谱是使用含有带正电荷的基团(如二乙氨乙基(DEAE))的离子交换树脂，基于物质的电荷对物质进行分离的过程。在溶液中，树脂上包被有带正电的抗衡离子(阳离子)。阴离子交换树脂与带负电荷的分子结合，替换抗衡离子。阴离子交换色谱法可用来基于其等电点(pI)纯化蛋白质。等电点定义为蛋白质不带净电荷时的pH值。当pH>pI时，蛋白质具有净负电荷，而当pH<pI时，蛋白质具有净正电荷。因此，在一些实施方案中，可以将不同的氨基酸置换引入两个重链中，使得包含两个臂A的同源二聚体的pI和包含两个臂B的同源二聚体的pI不同。具有臂A和臂B的双特异性抗体的pI将介于同源二聚体的两个pI之间某处。因此，两种同源二聚体和双特异性抗体可以在不同的pH条件下释放。本公开显示可以将一些氨基酸残基置换引入重链以调节pI。

因此，在一些实施方案中，Kabat编号位置83处的氨基酸残基为赖氨酸、精氨酸、或组氨酸。在一些实施方案中，位置1、6、43、81和105(Kabat编号)中的一者或多者处的氨基酸残基为天冬氨酸或谷氨酸。

在一些实施方案中，位置13和105(Kabat编号)中的一者或多者处的氨基酸残基为天冬氨酸或谷氨酸。在一些实施方案中，位置13和42(Kabat编号)中的一者或多者处的氨基酸残基为赖氨酸、精氨酸、组氨酸、或甘氨酸。

双特异性抗体还可包括例如交联的或“杂缀合物”抗体。例如，杂缀合物中的抗体之一可以与亲合素偶联，另一者与生物素偶联。也可使用任何方便的交联方法来制备杂缀合物抗体。合适的交联剂和交联技术是本领域中公知的，并且公开于美国专利No.4,676,980中，其全文以引用方式并入本文。

由抗体片段生成双特异性抗体的方法也是本领域中已知的。例如，可以使用化学键合来制备双特异性抗体。Brennan等人(Science 229:81,1985)描述了完整抗体被蛋白水解裂解生成F(ab’)2片段的程序。这些片段在二硫醇络合剂亚砷酸钠的存在下还原，以稳定化邻近二硫醇类并防止分子间二硫键形成。所生成的Fab'片段则转化为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后，一种Fab'TNB衍生物通过用巯基乙胺还原而重新转化为Fab'硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab'TNB衍生物混合形成双特异性抗体。

治疗方法

本文所述的方法包括用于治疗与癌症相关联的障碍的方法。通常，该方法包括向需要或已确定需要此类治疗的受试者施用治疗有效量的如本文所述的工程化双特异性抗体(例如，不平衡双特异性抗体)或其抗原结合片段。

如上下文中所用，“治疗”意指改善与癌症相关联的障碍的至少一种症状。通常，癌症导致死亡；因此，治疗可导致预期寿命延长(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年)。施用治疗有效量的本文所述的试剂(例如，不平衡双特异性抗体)以治疗与癌症相关联的病症将导致癌细胞数量减少和/或症状减轻。

如本文所用，术语“癌症”是指具有自主生长能力的细胞，即，以快速增殖的细胞生长为特征的异常状态或病症。该术语意在包括所有类型的癌性生长或致癌过程、转移性组织或恶性转化的细胞、组织或器官，而不考虑组织病理学类型或入侵阶段。如本文所用，术语“肿瘤”是指癌细胞，例如癌细胞团。可使用本文所述的方法治疗或诊断的癌症包括各种器官系统的恶性肿瘤(如影响肺、乳腺、甲状腺、淋巴、胃肠道和泌尿生殖道)，以及腺癌，其包括恶性肿瘤如大多数结肠癌、肾细胞癌、前列腺癌和/或睾丸肿瘤、非小细胞肺癌、小肠癌和食道癌。在一些实施方案中，本文所述的试剂被设计用于治疗或诊断受试者的癌。术语“癌”是本领域公认的，并且是指上皮或内分泌组织的恶性肿瘤，包括呼吸系统癌、胃肠系统癌、泌尿生殖系统癌、睾丸癌、乳腺癌、前列腺癌、内分泌系统癌，以及黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是肾癌或黑素瘤。示例性的癌包括由子宫颈、肺、前列腺、乳腺癌、头颈部、结肠和卵巢组织形成的那些。该术语还包括癌肉瘤，例如，其包括由癌性和肉瘤性组织构成的恶性肿瘤。“腺癌”是指衍生自腺组织或者其中肿瘤细胞形成可识别的腺体结构的癌。术语“肉瘤”是本领域公认的并且是指间充质来源的恶性肿瘤。

在一个方面，本公开还提供了用于治疗受试者中的癌症的方法、降低受试者中的肿瘤体积随时间推移增加的速率的方法、降低发生转移的风险的方法、或者降低受试者中发展额外转移的风险的方法。在一些实施方案中，治疗可以停止、减缓、延缓、或抑制癌症的进展。在一些实施方案中，治疗可导致受试者中的癌症的一种或多种症状的数量、严重程度、和/或持续时间减少。

在一个方面，本公开的特征为包括以下的方法：将治疗有效量的本文所公开的抗体或其抗原结合片段、或抗体药物缀合物施用于对其有需要的受试者，例如患有、或鉴定或诊断患有癌症的受试者，例如乳腺癌(例如三阴性乳腺癌)、类癌、宫颈癌、子宫内膜癌、神经胶质瘤、头颈癌、肝癌、肺癌、小细胞肺癌、淋巴瘤、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、结肠直肠癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、膀胱癌、尿道癌、或血液系统恶性肿瘤。

在一些实施方案中，本公开的特征为包括以下的方法：鉴定在EGFR中具有至少一个抗性突变(例如，C797S、T790M、和/或L858R)的受试者；以及将治疗有效量的本文所公开的抗体或其抗原结合片段、或抗体药物缀合物施用于对其有需要的受试者，例如患有、或鉴定或诊断患有癌症的受试者。

如本文所用，术语“受试者”和“患者”在整个说明书中可互换使用，并且描述根据本发明的方法的治疗所要提供的动物、人类或非人类。本发明设想了兽医和非兽医应用。人类患者可为成年人或未成年人(例如，18岁以下的人类)。除了人类之外，患者还包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、雪貂、猫、狗和灵长类。包括例如非人灵长类(例如，猴、黑猩猩、大猩猩等)、啮齿类(例如，大鼠、小鼠、沙鼠、仓鼠、雪貂、兔)、兔类动物、猪(例如，猪、小型猪)、马、犬、猫、牛以及其它家养、农场和动物园动物。

在一些实施方案中，癌症是表达cMET的癌症。在一些实施方案中，癌症是表达EGFR的癌症。在一些实施方案中，癌症是表达cMET和EGFR两者的癌症。

在一些实施方案中，癌症是肺癌(例如非小细胞肺癌)。

在一些实施方案中，癌症为不可切除黑素瘤或转移性黑素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、膀胱癌、或转移性激素难治性前列腺癌。在一些实施方案中，受试者患有实体瘤。在一些实施方案中，癌症是头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)、肾细胞癌(RCC)、三阴性乳腺癌(TNBC)、或结直肠癌。在一些实施方案中，受试者患有霍奇金淋巴瘤。在一些实施方案中，受试者患有三阴性乳腺癌(TNBC)、胃癌、尿道上皮癌、Merkel细胞癌、或头颈癌。在一些实施方案中，癌症是黑素瘤、胰腺癌、间皮瘤、血液恶性肿瘤，尤其是非霍奇金淋巴瘤、淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、或晚期实体瘤。在一些实施方案中，癌症是遗传性乳突肾细胞癌。在一些实施方案中，癌症是胃癌、头颈癌、肝癌、卵巢癌、NSCLC或甲状腺癌。

在一些实施方案中，癌症对第一代EGFR-TKI(例如吉非替尼或埃罗替尼)有抗性。在一些实施方案中，癌症对第二代EGFR-TKI(例如阿法替尼或达克替尼)有抗性。在一些实施方案中，癌症对第三代EGFR-TKI(例如奥希替尼(TAGRISSO)或罗西替尼)有抗性。

在一些实施方案中，本文所述的受试者(例如人类)在一个或多个细胞中的EGFR基因中具有一种或多种突变。在一些实施方案中，突变包括外显子19缺失突变和/或外显子21中的单点置换突变(导致L858R)。

在一些实施方案中，本文所述的受试者(例如人类)在一个或多个细胞中的EGFR蛋白中具有一种或多种抗性突变。在一些实施方案中，一种或多种抗性突变包括C797S、T790M和/或L858R。

在一些实施方案中，本文所述的癌细胞是细胞系，例如NCI-H1975细胞。在一些实施方案中，癌细胞包含EGFR原发性和/或继发性激活突变。在一些实施方案中，癌细胞具有升高的cMET水平，例如比非癌细胞高至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％。

在一些实施方案中，本文所公开的组合物和方法可用于治疗处于癌症风险中的患者。患有癌症的患者可以用本领域已知的各种方法鉴定。

如本文所用，“有效量”意指足以实现有益或期望结果的量或剂量，包括停止、减缓、延缓、或抑制疾病(例如癌症)的进展。有效量将取决于例如抗体、抗原结合片段、抗体-药物缀合物、编码抗体的多核苷酸、包含多核苷酸的载体、和/或其组合物所施用的受试者的年龄和体重、症状的严重程度以及施用途径而变化，并因此可根据个体情况确定施用。

有效量能够以一次或多次施用进行施用。以举例的方式，抗体、抗原结合片段、或抗体-药物缀合物的有效量是足以在患者中改善、终止、稳定化、逆转、抑制、减缓和/或延缓自身免疫疾病或癌症进展的量，或者足以在体外改善、终止、稳定化、逆转、减缓和/或延缓细胞(例如，活检细胞、本文所述的任何癌细胞、或细胞系(例如，癌细胞系))增殖的量。如本领域所理解，抗体、抗原结合片段、或抗体-药物缀合物的有效量可尤其取决于患者病史以及其它因素，如所用抗体的类型(和/或剂量)而变化。

用于施用本文所公开的抗体、编码抗体的多核苷酸、抗体-药物缀合物、和/或组合物的有效量和计划表可以凭经验确定，并且做出这样的确定在本领域的技术之内。本领域内的技术人员将理解，必须施用的剂量将取决于例如接受本文所公开的抗体、编码抗体的多核苷酸、抗体-药物缀合物、和/或组合物的哺乳动物、施用途径、所使用的本文所公开的抗体、编码抗体的多核苷酸、抗原结合片段、抗体-药物缀合物、和/或组合物的特定类型，以及施用于哺乳动物的其它药物而变化。选择抗体或抗原结合片段的适当剂量的指南可以见于关于抗体和抗原结合片段的治疗用途的文献中，例如Handbook of MonoclonalAntibodies,Ferrone等人编辑,Noges Publications,Park Ridge,N.J.,1985,第22章和第303-357页；Smith等人,Antibodies in Human Diagnosis and Therapy,Haber等人编辑,Raven Press,New York,1977,第365-389页。

抗体的有效量的典型日剂量为0.01mg/kg至100mg/kg。在一些实施方案中，剂量可为小于100mg/kg、10mg/kg、9mg/kg、8mg/kg、7mg/kg、6mg/kg、5mg/kg、4mg/kg、3mg/kg、2mg/kg、1mg/kg、0.5mg/kg、或0.1mg/kg。在一些实施方案中，剂量可为大于10mg/kg、9mg/kg、8mg/kg、7mg/kg、6mg/kg、5mg/kg、4mg/kg、3mg/kg、2mg/kg、1mg/kg、0.5mg/kg、0.1mg/kg、0.05mg/kg、或0.01mg/kg。在一些实施方案中，剂量为约10mg/kg、9mg/kg、8mg/kg、7mg/kg、6mg/kg、5mg/kg、4mg/kg、3mg/kg、2mg/kg、1mg/kg、0.9mg/kg、0.8mg/kg、0.7mg/kg、0.6mg/kg、0.5mg/kg、0.4mg/kg、0.3mg/kg、0.2mg/kg、或0.1mg/kg。

在本文所述的任何方法中，可将至少一种抗体、其抗原结合片段、抗体-药物缀合物、或药物组合物(例如，本文所述的任何抗体、抗原结合片段、抗体-药物缀合物、或药物组合物)以及任选地至少一种额外的治疗剂至少每周一次(例如，每周一次、每周两次、每周三次、每周四次、每天一次、每天两次、或每天三次)施用于受试者。在一些实施方案中，将至少两种不同的抗体和/或抗原结合片段以相同的组合物(例如液体组合物)施用。在一些实施方案中，将至少一种抗体、抗原结合片段、抗体-药物缀合物以及至少一种额外的治疗剂以相同的组合物(例如液体组合物)施用。在一些实施方案中，将至少一种抗体或抗原结合片段以及至少一种额外的治疗剂以两种不同的组合物(例如，含有至少一种抗体或抗原结合片段的液体组合物，以及含有至少一种额外治疗剂的固体口服组合物)施用。在一些实施方案中，将至少一种额外的治疗剂以丸剂、片剂、或胶囊剂施用。在一些实施方案中，将至少一种额外的治疗剂以持续释放口服制剂施用。

在一些实施方案中，可以在施用至少一种抗体、抗原结合抗体片段、抗体-药物缀合物、或药物组合物(例如，本文所述的任何抗体、抗原结合抗体片段、或药物组合物)之前或之后，向受试者施用一种或多种额外的治疗剂。在一些实施方案中，将一种或多种额外的治疗剂以及至少一种抗体、抗原结合抗体片段、抗体-药物缀合物、或药物组合物(例如，本文所述的任何抗体、抗原结合抗体片段、或药物组合物)施用于受试者，使得受试者中的一种或多种额外的治疗剂以及至少一种抗体或抗原结合片段(例如，本文所述的任何抗体或抗原结合片段)的生物活性期存在重叠。

在一些实施方案中，可以在延长的时间段内(例如，在至少1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、1年、2年、3年、4年、或5年的时段内)向受试者施用至少一种抗体、抗原结合抗体片段、抗体-药物缀合物、或药物组合物(例如，本文所述的任何抗体、抗原结合抗体片段、或药物组合物)。熟练的医疗专业人员可以使用本文所述的任何方法来确定治疗期的长度，以诊断或跟踪治疗的有效性(例如，观察癌症的至少一种症状)。如本文所述，熟练的医疗专业人员还可以改变施用给受试者的抗体或抗原结合抗体片段、抗体-药物缀合物(和/或一种或多种额外的治疗剂)的特性和数量(例如，增加或减少)，并且还可以基于对治疗有效性的评估(例如，使用本文所描述和本领域已知的任何方法)来调整(例如，增加或减少)向受试者施用的至少一种抗体或抗原结合抗体片段(和/或一种或多种额外的治疗剂)的剂量或频率。

在一些实施方案中，可将一种或多种额外的治疗剂施用于受试者。额外的治疗剂可以包含一种或多种选自以下的抑制剂：B-Raf抑制剂、EGFR抑制剂、MEK抑制剂、ERK抑制剂、K-Ras抑制剂、c-Met抑制剂、间变性淋巴瘤激酶(ALK)抑制剂、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂、Akt抑制剂、mTOR抑制剂、双重PI3K/mTOR抑制剂、布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)抑制剂，以及异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)和/或异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)的抑制剂。在一些实施方案中，额外的治疗剂是吲哚胺2,3-双氧化酶-1(IDO1)的抑制剂(例如艾卡哚司他)。

在一些实施方案中，额外的治疗剂可包含一种或多种选自以下的抑制剂：HER3抑制剂、LSD1抑制剂、MDM2抑制剂、BCL2抑制剂、CHK1抑制剂、激活的hedgehog信号传导通路抑制剂，以及选择性降解雌激素受体的试剂。

在一些实施方案中，额外的治疗剂可包含一种或多种选自以下的治疗剂：曲贝替定、白蛋白结合紫杉醇、特伯纳尼(Trebananib)、帕唑帕尼、西地尼布、帕博西尼、依维莫司、氟嘧啶、IFL、瑞戈非尼、Reolysin、爱宁达、色瑞替尼、索坦、替西罗莫司、阿昔替尼、依维莫司、索拉非尼、帕唑帕尼、培唑帕尼、IMA-901、AGS-003、卡博替尼、长春氟宁、Hsp90抑制剂、Ad-GM-CSF、替莫唑胺、IL-2、IFNa、长春碱、沙利度胺、达卡巴嗪、环磷酰胺、来那度胺、氮杂胞苷、来那度胺、硼替佐米、氨柔比星、卡非佐米、普拉曲沙，以及恩扎妥林。

在一些实施方案中，额外的治疗剂可包含一种或多种选自以下的治疗剂：佐剂、TLR激动剂、肿瘤坏死因子(TNF)α、IL-1、HMGB1、IL-10拮抗剂、IL-4拮抗剂、IL-13拮抗剂、IL-17拮抗剂、HVEM拮抗剂、ICOS激动剂、靶向CX3CL1的治疗、靶向CXCL9的治疗、靶向CXCL10的治疗、靶向CCL5的治疗、LFA-1激动剂、ICAM1激动剂，以及选择素激动剂。

在一些实施方案中，将卡铂、白蛋白结合紫杉醇、紫杉醇、顺铂、培美曲塞、吉西他滨、FOLFOX、或FOLFIRI施用于受试者。

在一些实施方案中，额外的治疗剂为抗OX40抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗LAG-3抗体、抗TIGIT抗体、抗BTLA抗体、抗CTLA-4抗体、或抗GITR抗体。

药物组合物和施用途径

本文还提供了药物组合物，该药物组合物含有本文所述的抗体、抗原结合片段、或抗体-药物缀合物中的至少一种(例如，一种、两种、三种、或四种)。本文所述的抗体、抗原结合片段、或抗体-药物缀合物中的任何两种或更多种(例如，两种、三种、或四种)能够以任何组合存在于药物组合物中。药物组合物能够以本领域已知的任何方式配制。

药物组合物配制为其预期的施用途径(例如，静脉内、动脉内、肌内、皮内、皮下、或腹膜内)相容。该组合物可包括无菌稀释剂(例如，无菌水或盐水)、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂、抗细菌剂或抗真菌剂，例如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等，抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠，螯合剂，如乙二胺四乙酸，缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐、或磷酸盐，以及等渗剂，如糖类(例如，右旋糖)、多元醇(例如，甘露糖醇或山梨糖醇)、或盐(例如，氯化钠)，或它们的任何组合。脂质体混悬剂也可用作药学上可接受的载剂(参见例如美国专利No.4,522,811)。组合物的制备剂可以配制并封装在安瓿、一次性注射器、或多剂量小瓶中。在需要的情况下(如在例如可注射制剂中)，可通过例如使用包衣料如卵磷脂、或表面活性剂来维持适当的流动性。抗体或其抗原结合片段的吸收可以通过包括延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)来延长。或者，控释可通过植入物和微囊化递送系统来实现，其可包括可生物降解生物相容性聚合物(例如，乙烯-乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸；Alza Corporation和NovaPharmaceutical,Inc.)。

含有本文所述的抗体、抗原结合片段、抗体-药物缀合物中的任何一种或多种的组合物能够以剂量单位形式(即，含有预定量的活性化合物的物理离散单位，以便于施用和剂量均匀度)配制成用于进行胃肠外(如静脉内、动脉内、肌内、皮内、皮下、或腹膜内)施用。

组合物的毒性和治疗功效可在细胞培养物或实验动物(例如，猴)中通过标准药学程序来确定。可以确定LD50(使群体的50％致死的剂量)和ED50(在群体的50％中治疗有效的剂量)：治疗指数是LD50:ED50的比率。表现出高治疗指数的试剂是优选的。在药物表现出不期望的副作用的情况下，应注意使潜在损害最小化(即，减少不希望的副作用)。毒性和治疗功效可以通过其它标准药学程序来确定。

从细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制任何给定试剂的适当剂量以供受试者(例如人类)使用。一种或多种(例如，一种、两种、三种、或四种)抗体或其抗原结合片段(例如，本文所述的任何抗体或抗体片段)的治疗有效量为如下量：在受试者(例如，鉴定患有癌症的人类受试者)或者鉴定为处于发展疾病风险中的受试者(例如，先前癌症发展但现在已治愈的受试者)中，治疗受试者中的疾病(例如，杀伤癌细胞)，减少受试者(例如人类)中的疾病的一种或多种症状的严重程度、频率、和/或持续时间。本文所述的任何抗体或抗原结合片段的有效性和给予可由卫生保健专业人员或兽医专业人员使用本领域已知的方法以及通过观察受试者(例如，人类)中的疾病的一种或多种症状进行确定。某些因素可能影响有效治疗受试者所需的剂量和时间(例如，疾病或障碍的严重程度、既往治疗、受试者的一般健康状况和/或年龄，以及其它疾病的存在)。

示例性剂量包括每千克受试者体重的毫克或微克量的本文所述的任何抗体或抗原结合片段、或抗体-药物缀合物(例如约1μg/kg至约500mg/kg；约100μg/kg至约500mg/kg；约100μg/kg至约50mg/kg；约10μg/kg至约5mg/kg；约10μg/kg至约0.5mg/kg；或约1μg/kg至约50μg/kg)。虽然这些剂量涵盖了广泛的范围，但本领域的普通技术人员将理解，包括抗体及其抗原结合片段在内的治疗剂在其效力方面有所不同，并且有效量可以通过本领域已知的方法来确定。典型地，首先施用相对低的剂量，并且主治卫生保健专业人员或兽医专业人员(在治疗性应用的情况下)或研究人员(当仍处于开发阶段工作时)可以随后逐渐增加剂量，直到获得适当的反应。此外，应当理解，任何特定受试者的具体剂量水平将取决于多种因素，包括所采用的具体化合物的活性、受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食、施用时间、施用途径、排泄率，以及抗体或抗体片段在体内的半衰期。

药物组合物可以与给药说明书一起包括在容器、包装、或分配器中。本公开还提供了制造抗体或其抗原结合片段、或抗体-药物缀合物的方法以用于如本文所述的各种用途。

实施例

本发明在以下实施例中进一步描述，这些实施例不限制权利要求书中所述的本发明的范围。

实施例1.针对cMET结合物对ABS VHH文库淘选

通过将本文所述的EGFR结合序列与cMET结合序列(例如VHH)组合，开发出靶向cMET和EGFR两者的双特异性抗体。开发过程可分为以下步骤：1)针对cMET结合物淘选噬菌体VHH文库；2)对先导cMET结合物克隆进行筛选和表征；3)通过细胞激活测定来验证受体结合以及受体/配体阻断；4)cMET/EGFR BsAb(双特异性抗体)的构建和表征(例如受体结合、受体/配体阻断；受体磷酸化、信号转导抑制、和/或癌杀伤)；5)前导序列的优化和产生(例如，结构优化和先导表征)；6)BsAb功能的验证，其使用基于细胞的测定(例如受体结合；受体/配体阻断；受体磷酸化、信号转导抑制、和/或癌杀伤)和/或动物研究(例如，对以下CDX模型的动物研究：H1975和H1975-HGF)。

重链抗体可变结构域(VHH)噬菌体文库用于淘选过程。抗原包括人cMET-His-标签蛋白以及瞬时转染的表达人cMET的CHO细胞。淘选策略设计如下：2轮固相噬菌体淘选，继之以1轮基于细胞的噬菌体淘选。淘选过程的细节可见于下表中。

表1.

	第1轮	第2轮	第3轮
				抗原	cMET-His-标签	cMET-His-标签	细胞
输入	6×10¹¹	2.16×10¹²	3.4×10¹²
				输出	2.3×10⁷	2.8×10⁷	6.5×10⁵
富集	2.6×10⁴	7.7×10⁴	5.2×10⁶

在淘选过程之后，执行ELISA以筛选和表征先导cMET结合物。使用两个96孔板进行初步筛选。记录ELISA读数。总共鉴定出39种ELISA结合物，其中相应的ELISA信号超过阴性对照孔的5倍。在这39种ELISA结合物中，16种克隆被确认为独特克隆。

实施例2.通过竞争性配体结合进行二次筛选表征

执行竞争性结合测定(阻断ELISA)以确定在16种独特克隆的存在下cMET与人HGF(Hu-HGF)的结合。将高结合酶联免疫吸附测定(ELISA)板用200ng/孔cMET-FLAG标签蛋白(50μl体积；4ng/μl)包被过夜并保持于4℃。次日早晨，将孔用1％牛血清白蛋白(BSA)在室温(RT)下封闭2小时。封闭后，将孔用PBST(补充有0.05％ Tween 20的磷酸盐缓冲盐水(PBS))洗涤四次。接下来，将待测试的抗体样品(16种独特克隆的上清液)或IgG同种型对照以25μl的体积添加到相应的孔中，并在RT下保持30分钟。然后，将25μl生物素化Hu-HGF蛋白添加到相应的孔中。将板在RT下保持60分钟。之后，将孔用PBST洗涤四次。随后添加链霉亲合素-HRP缀合二抗(以1:1000稀释)并在RT下孵育30分钟。然后将板用PBST洗涤四次。洗涤后，通过添加Amplex试剂底物使板显影，然后在SpectraMax读板器中在530nm和590nm处测量发光信号。

如图1所显示，四种克隆1D5、1F3、1H1和2C7被鉴定为具有高竞争性配体结合能力。因此，它们被选择用于制备VHH哺乳动物表达系统。

实施例3.与Cyno-抗原的交叉反应性

为了确定16种抗体与人和猴(食蟹猴属种)抗原的结合相似性，执行结合ELISA。将高结合ELISA板用1μg/mL(用1×PBS稀释)人或猴抗原包被，并在4℃下保持过夜。次日，将板在37℃下用封闭缓冲液(4％脱脂乳，于1×PBS中)封闭1小时。在封闭后，将板用PBST洗三次。将待测试抗体样品用PBS稀释，然后添加到相应的孔中(10μg/mL)。将板在37℃下(RT下)孵育1小时。在孵育后，将板用PBST洗涤三次。接下来，将二抗(生物素化抗c-Myc抗体9E-10，以1:500稀释)添加到孔中，并将板在37℃下(RT下)孵育1小时。然后将板用PBST洗涤三次。然后，将以1:1000稀释的链霉亲合素-HRP添加到每个孔中，然后将板在37℃下(RT下)孵育1小时。在孵育后，将板用PBST洗涤四次。洗涤后，通过添加Amplex试剂底物使板显影，然后在SpectraMax读板器中在530nm和590nm处测量发光信号。

如图2所显示，4种克隆1D5、1F3、1H1和2C7被鉴定为具有与人和猴抗原两者的交叉反应性。因此，它们被选择用于制备VHH哺乳动物表达系统。

实施例4.cMET VHH表达分析

cMET VHH-Fc表达使用生物层干涉测量法(BLI)(Probelife,Palo Alto,CA)进行测量。测量根据制造商的说明书执行。如图3所显示，发现2C7对cMET具有最大结合能力。然而，发现2C7是混合克隆。1H1被鉴定为纯克隆。1D5也被鉴定为混合克隆(即包含至少两种克隆)。

实施例5.通过ELISA测试cMET VHH与cMET的结合

为了测试四种鉴定的cMET VHH与cMET蛋白的结合，执行结合ELISA。实验的进行与本文所述基本上相同。结果显示于图4中。因为2C7被鉴定为混合克隆，所以1H1被鉴定为对cMET表现出最高结合能力的克隆。

实施例6.cMET VHH(上清液)与Hu-HGF结合的竞争性ELISA

为了进一步表征cMET VHH克隆，执行竞争性ELISA。将高结合ELISA板用4μg/ml的c-MET-Fc标签蛋白包被，并保持于4℃过夜。次日早晨，将孔用1％ BSA在室温(RT)下封闭2小时。将孔用PBST(补充有0.05％ Tween20的PBS)洗涤四次。将待测试的抗体样品(1D5、1H1和2C7克隆的上清液)或IgG同种型对照(11F11)以25μl的体积(最终浓度为25μg/ml)添加到相应的孔中，并在室温下保持30分钟。然后，将25μl生物素化Hu-HGF蛋白(最终浓度为5nM)添加到相应的孔中，并将板在室温下保持60分钟。将孔用PBST洗涤四次。随后添加链霉亲合素-HRP缀合二抗(以1:1000稀释)并在室温下孵育30分钟。然后将板用PBST洗涤四次。洗涤后，通过添加Amplex试剂底物使板显影，然后在SpectraMax读板器中在530nm和590nm(截止值570nm)处测量发光信号。

如图5所显示，在三个克隆内，1H1 VHH显示出对cMET的最高结合能力。换言之，1H1VHH对生物素化Hu-HGF与cMET的结合表现出最高的竞争。因此，1H1 VHH被选择用于以下实验。

实施例7.双特异性Ab的构建

如图6所显示，使用抗EGFR IgG作为骨架来制备双特异性抗体。抗cMET VHH经由接头肽连接至抗EGFR IgG的每个臂的重链可变区(VH)。当1H1 VHH(SEQ ID NO:19)连接至具有野生型Fc区的抗EGFR IgG的两个臂(VH:SEQ ID NO:23；VL:SEQ ID NO:24)时，双特异性抗体命名为1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3。1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3的另一示意性结构显示于图18A中。

实施例8.测试cMET-His标签与JNJ372类似物或1H1-cMET/EGFR-Fc(W T)-V3 BsAb的结合

为了评价双特异性抗体1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3与cMET的cMET结合能力，执行结合ELISA，并将JNJ372类似物用作阳性对照。特别地，将高结合ELISA板用4μg/ml的c-MET-His标签蛋白包被，并保持于4℃过夜。使用两种BsAb(最终浓度为25μg/ml)执行结合ELISA。次日早晨，将孔用1％ BSA在室温下封闭2小时。将孔用PBST洗涤四次。将BsAb或IgG同种型阴性对照(11F11)以50μl的体积添加到相应的孔中并孵育。在孵育后，将孔用PBST洗涤四次。之后，将HRP-缀合的山羊-抗人Fc抗体用作二抗，并添加到相应的孔中，之后进行孵育。然后将板用PBST洗涤四次。洗涤后，通过添加Amplex试剂底物使板显影。在SpectraMax读板器中在530nm和590nm(截止值570nm)处测量发光信号。

如图7所显示，1H1cMET/EGFR-Fc(WT)BsAb显示与cMET-His标签蛋白的高结合能力。与JNJ372类似物相比，1H1cMET/EGFR-Fc(WT)表现出对cMET相似的结合能力。

实施例9.测试EGFR-His标签与JNJ372类似物或1H1-cMET/EGFR-Fc(W T)-V3 BsAb的结合

为了评价双特异性抗体1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3与EGFR的结合能力，执行结合ELISA，并将JNJ372类似物用作阳性对照。特别地，将高结合ELISA板用4μg/ml的EGFR-His标签蛋白包被，并保持于4℃过夜。使用两种BsAb(最终浓度为25μg/ml)执行结合ELISA。次日早晨，将孔用1％BSA在室温下封闭2小时。将孔用PBST洗涤四次。将BsAb或IgG同种型阴性对照(11F11)以50μl的体积添加到相应的孔中并然后孵育。在孵育后，将孔用PBST洗涤四次。之后，将HRP-缀合的山羊-抗人Fc抗体用作二抗，并添加到相应的孔中，之后进行孵育。然后将板用PBST洗涤四次。洗涤后，通过添加Amplex试剂底物使板显影。在SpectraMax读板器中在530nm和590nm(截止值570nm)处测量发光信号。

如图8所显示，1H1cMET/EGFR-Fc(WT)BsAb显示与EGFR-His标签蛋白的高结合能力。与JNJ372类似物相比，1H1cMET/EGFR-Fc(WT)表现出对EGFR相似的结合能力。

实施例10.通过滴定ELISA测定与cMET和EGFR结合的EC50

为确定双特异性抗体1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3的EC50，使用从50μg/ml起至50,000ng/ml的测试抗体的5倍系列稀释液来执行结合滴定ELISA。JNJ372类似物用作阳性对照。稀释浓度为50μg/ml、10μg/ml、2μg/ml、0.4μg/ml、0.08μg/ml和0.016μg/ml。

特别地，将高结合ELISA板用4μg/ml的c-MET-His标签或EGFR-His标签蛋白包被，并保持于4℃过夜。次日早晨，将孔用1％ BSA在室温下封闭2小时。在封闭后，将孔用PBST洗涤四次。将稀释的抗体样品以50μl的体积添加到相应的孔中并孵育。在孵育后，将孔用PBST洗涤四次。之后，将HRP-缀合的山羊-抗人Fc抗体用作二抗，并添加到相应的孔中，之后进行孵育。然后将板用PBST洗涤四次。洗涤后，通过添加Amplex试剂底物使板显影。在SpectraMax读板器中在530nm和590nm(截止值570nm)处测量发光信号。

如图9所显示，对于1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3和JNJ372类似物，cMET结合的EC50值分别测定为8.6077ng/ml和4.8871ng/ml。1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V1的示意性结构显示于图中。16A中。如图10所显示，对于1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3和JNJ372类似物，EGFR结合的EC50值分别测定为9.27ng/ml和355.95ng/ml。

实施例11.cMET与JNJ372类似物和1H1cMET/EGFR(WT)结合的K_D、K_on和K_off的测定

根据制造商的说明书，使用生物层干涉测量法(BLI)技术(Probelife,Palo AltoCA)，计算与cMET结合的K_D、K_on和K_off值。结果显示于下表中。

表2.cMET/1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3

BsAb浓度(nM)	k_off(1/s)	k_on(1/Ms)	K_D(M)
				114	7.85×10^-4	2.48×10⁶	3.17×10^-10
38.1	7.85×10^-4	2.48×10⁶	3.17×10^-10
				12.7	7.85×10^-4	2.48×10⁶	3.17×10^-10
4.23	7.85×10^-4	2.48×10⁶	3.17×10^-10
				1.41	7.85×10^-4	2.48×10⁶	3.17×10^-10

表3.cMET/JNJ372类似物

BsAb浓度(nM)	k_off(1/s)	k_on(1/Ms)	K_D(M)
				133	9.13×10^-4	2.25×10⁶	4.05×10^-10
44.4	9.13×10^-4	2.25×10⁶	4.05×10^-10
				14.8	9.13×10^-4	2.25×10⁶	4.05×10^-10
4.94	9.13×10^-4	2.25×10⁶	4.05×10^-10
				1.65	9.13×10^-4	2.25×10⁶	4.05×10^-10

在单独的实验中，使用JNJ372类似物、1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V2、或1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3来测定与cMET或EGFR结合的K_D值。1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V2和1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3的示意性结构分别显示于图17A和图18A中。结果显示于下表中。

表4.

实施例12.通过竞争性ELISA使用JNJ372类似物和1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3测试cMET/HGF阻断

为了评价JNJ372类似物和1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3阻断cMET与其配体HGF的相互作用的效应，执行竞争性ELISA。将高结合ELISA板用4μg/ml的c-MET-His标签蛋白包被，并保持于4℃过夜。竞争性ELISA使用抗体样品(最终浓度为25μg/ml)和同种型对照(11F11)执行，如实施例6所述。测定了抗体样品与生物素化人HGF竞争的效应。使用链霉亲合素-HRP缀合的二抗。

如图11所显示，与JNJ372类似物相比，1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3更有效地阻断cMET/HGF相互作用。

实施例13.通过竞争性结合测定使用JNJ372类似物和1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3测定EGFR/EGF阻断

为了确定1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3是否可以阻断EGF和EGFR之间的相互作用，使用显微镜和流式细胞术测定。将NCIH1975细胞(CRL-5908)铺板到48孔板(2×10⁵个细胞/孔)的补充有10％ FBS的RPMI1640培养基中过夜。次日早晨，将细胞用1×PBS洗涤三次。然后，将细胞用含4％多聚甲醛的PBS在RT下固定15分钟。然后将细胞用1×PBS洗涤三次，然后在10％正常山羊血清(NGS)中于RT封闭30分钟。封闭后，移除NGS。将JNJ372类似物、1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3和同种型对照(11F11)添加到相应的孔中，以20μg/ml的浓度溶解于NGS中，并在RT下保持2小时。之后，添加最终浓度为2μg/ml的生物素化EGF，并将板在RT下保持一小时。

接着，将细胞用1×PBS洗涤五次。将二抗(链霉亲合素PE缀合的)以1:50的最终稀释比溶解于NGS中，然后添加到孔中，然后在RT下孵育1小时。随后，将细胞用1×PBS洗涤六次，并在荧光显微镜下成像。在成像步骤后，将细胞在FACS(荧光激活细胞分选)缓冲液中洗涤三次，并执行流式细胞术以量化测试抗体的EGF/EGFR阻断效应。

如图12A-12F所显示，1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3比JNJ372类似物更有效地阻断EGF与EGFR之间的相互作用

实施例14.用JNJ372类似物或1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3处理的NCI-H1975细胞中的cMET和EGFR的受体磷酸化的测定

NCI-H1975细胞是具有EGFR原发性和继发性激活突变的人癌细胞系，除了MET基因扩增外，其还赋予对EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的抗性。在这些细胞系中，EGFR和cMET的配体(EGF和HGF)分别可以诱导EGFR和cMET受体的磷酸化，这通过ERK和Akt蛋白的磷酸化刺激下游信号传导。为了确定1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3是否可以抑制配体诱导的EGFR和cMET的磷酸化，将NCI-H1975细胞分别在EGF和HGF的存在下与JNJ372类似物或1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3一起培养。

使用流式细胞术测定来检测磷酸-cMET(phospho-cMET)。特别地，在24孔板中，使NCI-H1975细胞在细胞饥饿培养基(补充有谷氨酰胺的RPMI培养基(从100×溶液稀释))中以50000个细胞/孔生长过夜。次日早晨，弃去培养基，将细胞用溶解于250μl/孔的饥饿培养基中的测试抗体(1.5μg/ml)在37℃和5％ CO₂下处理1小时。随后，将细胞用溶解于250μl/孔的饥饿培养基中的200ng/ml的HGF在37℃和5％ CO₂下处理15分钟。最终HGF浓度为100ng/ml。在处理15分钟后，弃去培养基并将细胞用冰冷1×PBS洗涤一次。然后，将细胞用含4％多聚甲醛(PFA)在RT下固定15分钟。在固定后，将细胞用1×PBS洗涤三次，并在PBS中于4℃储存过夜。次日早晨，将细胞用含0.1％ Triton X-100的PBS在冰上透化4-5分钟，用PBS洗涤三次，然后在10％ NGS(正常山羊血清)中封闭30分钟。封闭后，在RT下，将一抗(人/小鼠磷酸-HGFR/c-MET(Y1349)(AF3950)；Novusbio,Biotechne,MN))添加到相应的孔中(15μg/ml溶解于10％ NGS中)保持2小时。随后，将细胞用PBS洗涤三次，然后将用FACS缓冲液(2％ FBS，于PBS中)以1:25比率稀释的二抗(山羊抗兔IgG(H+L)DyLight 594；Invitrogen,Thermo Fisher,MA)添加到细胞中。然后，将细胞用PBS洗涤三次，然后在FACS缓冲液中从孔刮取下来。之后，将细胞用FACS缓冲液洗涤三次，然后用流式细胞仪(BD FACS Calibur,NJ)进行分析。

磷酸-EGFR使用ELISA试剂盒即Phospho-EGF Receptor(Tyr1173)Sandwich ELISA试剂盒#7187(Cell Signaling Tech)进行检测。类似于检测如本文所述的磷酸-cMET，在24孔板中，使NCI-H1975细胞在细胞饥饿培养基(补充有谷氨酰胺的RPMI培养基(从100×溶液稀释))中以50000个细胞/孔生长过夜。次日早晨，弃去培养基，将细胞用溶解于250μl/孔的饥饿培养基中的测试抗体(1.5μg/ml)在37℃和5％ CO₂下处理1小时。随后，将细胞用溶解于250μl/孔的饥饿培养基中的100ng/ml的EGF在37℃和5％ CO2下处理15分钟。最终EGF浓度为50ng/ml。在处理15分钟后，弃去培养基并将细胞用冰冷1×PBS洗涤一次。然后，将300ul的补充有1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)的1×裂解缓冲液添加到孔中，并将板在4℃下保持5分钟。将细胞从板上刮取下来，然后收集在1.5ml的管中。使细胞裂解物通过小直径针数次以破碎细胞。然后，将细胞裂解物在室温下以13200rpm离心10分钟。离心后收集的上清液用作细胞裂解物用于ELISA。用于检测磷酸-EGFR的ELISA根据制造商的说明书执行。

如图13A-13B所显示，发现1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3V3比JNJ372类似物更有效地降低EGFR的磷酸化(图13B)，而JNJ372类似物比1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3更能降低cMET磷酸化(图13A)。

实施例15.JNJ372类似物或1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3-处理的NCI-H1975细胞中pERK和pAkt的检测

执行功能测定以进一步测试双特异性抗体1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3。特别地，测定ERK和Akt蛋白的磷酸化状态。ERK和Akt蛋白参与了与癌细胞增殖、存活和阻碍细胞凋亡途径有关的下游信号传导。使NCIH1975细胞(CRL-5908)在24孔板(2×10⁵个细胞/孔)的补充有10％ FBS和8ng/ml Hu-HGF的RPMI1640培养基中生长过夜。为了检测pERK，使用ERK1/2(pT202/Y204+总)ELISA试剂盒(ab176660)(得自Abcam(Cambridge,UK))。为了检测pAkt，使用Phospho-Akt1(Ser473)Sandwich ELISA试剂盒#7160(得自CellSignalling Technology(Danvers,MA,US))。ELISA根据相应制造商的说明书执行。使用Pierce^TMCoomassie Plus(Bradford)测定试剂盒(96孔板中每孔150μl的试剂(具有5μl的裂解物))测定蛋白质浓度。

对于磷酸-ERK(pERK)检测，将细胞用双特异性抗体(1.5μg/ml)处理30分钟。随后，弃去培养基，并将细胞用冰冷PBS冲洗两次。然后，将350μl的1×裂解缓冲液(补充有1mMPMSF作为蛋白酶抑制剂)添加到孔中，并将裂解的细胞收集在1.5ml管中。根据ELISA方案，使用细胞裂解物。

相似地，对于磷酸-Akt(pAkt)检测，将细胞用双特异性抗体(1.5μg/ml)处理60分钟。然后，弃去培养基，并将细胞用冰冷PBS冲洗两次。然后，将350μl的1×裂解缓冲液(补充有1mM PMSF作为蛋白酶抑制剂)添加到孔中，并板在冰上保持5分钟。之后，将细胞刮取下来，并收集在1.5ml的管中。然后，使裂解的细胞通过小直径针数次以破碎细胞。随后，将细胞裂解物在室温下以13200rpm离心10分钟。离心后收集的上清液用作细胞裂解物以执行pAkt ELISA。

如图14A-14B所显示，发现在Hu-HGF存在下生长的NCI-H1975细胞中，1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3比JNJ372类似物更有效地降低pERK的比率(相对于总ERK)和pAkt的比率(相对于总Akt)。

实施例16.与JNJ372类似物相比测定1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3的效应子功能

肿瘤细胞表面越来越高水平的EGFR和cMET允许免疫效应细胞(例如NK细胞)通过Fc依赖性效应子机制(例如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC))特异性靶向和杀伤这些细胞。为了确定1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3与JNJ372类似物相比的效应子功能，如下所述执行ADCC和CDC测定。

在两种测定开始之前，将NCI-H1975细胞用钙黄绿素AM细胞渗透性染料标记。之后，将细胞用PBS短暂洗涤，然后用0.5M乙二胺四乙酸(EDTA)处理20分钟。随后，将处理的细胞以1200rpm离心5分钟，计数，然后重悬于4ml无血清培养基中(约370万个细胞用于标记)。然后，将8μl的1mM钙黄绿素AM(作为储备溶液)添加到细胞中(最终浓度为2μM钙黄绿素)。然后，将细胞在RT下于暗处孵育30分钟。然后，将细胞再次以1200rpm离心5分钟以移除培养基。在移除培养基后，将细胞用无血清培养基洗涤两次，然后平均等分到两个单独的15ml管中的4.6ml培养基中。培养基直接用于以下CDC测定分析，并补充10％ FBS用于以下ADCC测定分析。抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)

将钙黄绿素标记的细胞以100μl/孔添加到U型底96孔板中。将测试抗体以80μg/ml的稀释度添加到50μl培养基中，最终浓度为20μg/ml。然后，将50μl培养基中的360,000个NK92-CD16细胞/孔添加到标记的H1975细胞中。效应细胞与靶细胞的比率为9:1。将细胞混合物在37℃下孵育2小时45分钟。然后将30μl的10×裂解缓冲液添加到最大释放孔中，并将30μl的RPMI培养基添加到最大释放对照孔中。将板进一步孵育15分钟。孵育后，将板以1200rpm离心5分钟，并将50μl获得的上清液转移到透明孔黑色平底96孔板(Greiner)中。然后，将50μl PBS添加到上清液中。之后，在Spectramax Fluorescence读板器中在485nm和538nm(截止值530nm)处测量板的发光信号。

如图15A所显示，与1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3相比，JNJ372类似物在ADCC诱导的细胞杀伤方面更有效。对于ADCC功能，JNJ372类似物可能在Fc区具有内置突变，而1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3具有野生型Fc区。因此，可使1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3在Fc区中突变以增大其ADCC效应。

补体依赖性细胞毒性(CDC)

将钙黄绿素标记的细胞以100μl/孔添加到U型底96孔板中。将测试抗体以80μg/ml的稀释度添加到50μl培养基中，最终浓度为20μg/ml。将补体血清以20％的稀释度添加到50μl培养基中，最终浓度为5％。将细胞在37℃下孵育2小时45分钟。然后将30μl的10×裂解缓冲液添加到最大释放孔中，并将30μl的RPMI培养基添加到最大释放对照孔中。将板进一步孵育15分钟。孵育后，将板以1200rpm离心5分钟，并将50μl获得的上清液转移到透明孔黑色平底96孔板(Greiner)中。然后，将50μl PBS添加到上清液中。之后，在SpectramaxFluorescence读板器中在485nm和538nm(截止值530nm)处测量板的发光信号。

如图15B所显示，发现与JNJ372类似物相比，1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3在CDC方面同样有效。

还评价了不同浓度的1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3和JNJ372类似物的癌细胞杀伤能力。IC₅₀结果显示于下表中。

表5.

抗体	细胞杀伤IC₅₀(ng/ml)
		JNJ372类似物	195.2186
1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3	214.6154
		阴性对照(同种型)	2594.843

如图15C所显示，与JNJ372类似物相比，1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3表现出相似的细胞杀伤能力。

实施例17.结论

根据如本文所述的实验结果，下表提供了本文所述的双特异性抗体的受体结合、受体/配体阻断、信号传导，以及癌细胞杀伤效应的汇总。

表6.

1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V1、1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V2和1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3的示意性结构分别显示于图16A、图17A和图18A中。

实施例18.EGFR/cMET多特异性抗体诱导的内化

执行实验，以评估EGFR/cMET双特异性和三特异性抗体诱导的内化。特别地，内化测定使用JNJ372类似物、EGFR/cMET双特异性抗体1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3，以及EGFR/cMET三特异性抗体1H1cMET/1A12cMET/EGFR(WT)(具有三特异性-V3结构，如显示于图18B中)执行。使MDA231细胞与20μg/ml抗体混合，并在37℃下孵育30分钟。添加pHrodo标记的二抗，并与细胞一起在37℃下孵育24小时。然后收获细胞并通过FACS分析。

如图20A-20B所显示，与JNJ372类似物或1H1-cMET/EGFR-Fc(WT)-V3相比，1H1cMET/1A12cMET/EGFR(WT)显示出增强的cMET/EGFR复合物的内化。

实施例19.cMET VHH表位框并分析

根据制造商的说明书，使用生物层干涉测量法(Probelife,Palo Alto,CA)，对cMET 1H1和cMET 1A12执行cMET VHH-Fc表位框并分析(图21A-21B)。简而言之，在定量(Q)缓冲液(含有牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲盐溶液，以减少非特异性和背景信号)中使用HIS探针建立基线。将HIS探针的抗原(cMET-HIS标记的)添加到Q缓冲液中的5μg/ml cMET溶液中。Q缓冲液中的HIS探针用于回复到基线。随后，在用Q缓冲液稀释的15μg/ml抗体中，通过HIS探针进行第一抗体的缔合。最后，在用Q缓冲液稀释的5μg/ml抗体中，通过HIS探针缔合二抗。结果显示，1H1和1A12 VHH可结合cMET的不同表位。另外，1H1 VHH与其cMET表位的结合可进一步暴露1A12表位，由此增加1A12 VHH与cMet的结合亲和力(图21A)。

实施例20.三特异性Ab的构建

如图18B所显示，使用抗EGFR IgG作为骨架来制备三特异性抗体。结合cMET的两个不同表位的两个单独的VHH结构域经由接头肽连接至抗EGFR IgG的两个臂的重链可变区(VH)。当1H1 VHH(SEQ ID NO:84)连接至抗EGFR IgG的一个臂(VH:SEQ ID NO:23；VL:SEQID NO:24)且1A12 VHH(SEQ ID NO:20)连接至抗EGFR IgG的另一个臂时，三特异性抗体命名为1H1cMET/1A12cMET/EGFR(WT)。如上所讨论，1H1和1A12VHH结合cMET的不同表位。1H1VHH与其cMET表位的结合可进一步暴露1A12表位，由此增加1A12 VHH与cMet的结合亲和力。由于与EGFR相比，cMET的表达相对较小，因此三特异性抗体1H1cMET/1A12cMET/EGFR(WT)首先与细胞上的EGFR结合。三特异性抗体与EGFR的结合使1H1 VHH更接近细胞上的cMET。1H1VHH与其cMET表位的结合可进一步增加1A12表位的暴露，由此增加三特异性抗体与肿瘤细胞的结合亲和力。

实施例21. 1H1cMET/1A12cMET/EGFR(WT)和JNJ372类似物与各种NSCLC细胞的结合能力的比较

为了测定1H1cMET/1A12cMET/EGFR(WT)和JNJ372类似物与各种细胞模型的结合能力。细胞包括H1975、H1975.HGF(过表达HGF的H1975转染的细胞)以及EGFR突变型C797S-BaF3细胞。简而言之，将细胞用FACS缓冲液稀释，并添加到96孔V型底未处理的板中(5×10⁴个细胞/100μl/孔)。将1H1cMET/1A12cMET/EGFR(WT)、JNJ372类似物和对照抗体在100μl体积培养基中从2.04×10^-4nM至400nM的系列稀释液分别添加到不同的孔中，并在室温(RT)下孵育60分钟。然后，将孔用PBS洗涤四次。将FACS缓冲液(1:200稀释)中的第二Ab(山羊-抗人Fc-FITC)添加到孔中并在室温下孵育30分钟。将孔用FACS缓冲液洗涤三次。将细胞用Accutase^TM细胞脱离溶液脱离并用FACS进行分析。

如图22A-22C所显示，三特异性抗体1H1cMET/1A12cMET/EGFR(WT)与NSCLC细胞的结合优于JNJ372类似物。

实施例22.使用JNJ372类似物和1H1cMET/1A12cMET/EGFR(WT)测定EGFR/EGF阻断的竞争性结合测定

流式细胞术测定用于确定三特异性抗体1H1cMET/1A12cMET/EGFR(WT)是否可阻断EGF与EGFR之间的相互作用。为该测定采购了生物素化形式的EGF。将NSCLC细胞(例如H1975、H1975.HGF、或EGFR突变型C797S-BaF3细胞)铺板到96孔板(3×10⁵个细胞/孔)中的补充有10％ FBS的RPMI1640培养基中并培养过夜。次日早晨，将细胞用1×PBS洗涤三次。在洗涤后，添加50μl体积的期望浓度的抗体(2×)(2.04×10^-4nM至400nM)。之后(未洗涤)，向每孔添加50μl的生物素化EGF(有效浓度2μg/ml；工作浓度4μg/ml)，之后孵育45分钟。随后，将细胞用FACS缓冲液洗涤两次，并用Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水(DPBS)洗涤一次。将50μl的Accutase^TM细胞脱离溶液添加到每个孔中，并且将板在37℃下孵育5-7分钟。通过添加50μl培养基或FACS缓冲液来中和Accutase^TM细胞脱离溶液。将孔的内容物小心地转移到V型底96孔板中。将细胞用FACS缓冲液洗涤三次。将二抗(链霉亲合素缀合物-PE；1:500稀释)添加到板的每个孔中，然后将板孵育30-45分钟。在孵育后，将板用FACS缓冲液洗涤三次。最后，使细胞重悬于FACS缓冲液中，并在流式细胞仪中进行分析，以量化测试样品对EGF/EGFR的阻断。

如图23A-23C所显示，在不同的细胞模型中，1H1cMET/1A12cMET/EGFR(WT)显示出比JNJ372类似物显著更好的EGF/EGFR阻断能力。

实施例23.使用JNJ372类似物和1H1cMET/1A12cMET/EGFR(WT)测定cMET/HGF阻断的竞争性结合测定

流式细胞术测定用于确定三特异性抗体1H1cMET/1A12cMET/EGFR(WT)是否可阻断HGF(肝细胞生长因子)与cMET之间的相互作用。使用标准生物素化试剂盒(Pierce,Invitrogen)，对HGF进行生物素化。将NSCLC细胞(H1975或H1975.HGF)铺板到96孔板(3×10⁵个细胞/孔)中的补充有10％ FBS的RPMI1640培养基中并培养过夜。次日早晨，将细胞用1×PBS洗涤三次。在洗涤后，添加50μl体积的期望浓度的抗体(2×)(2.04×10^-4nM至400nM)。之后(未洗涤)，向每孔添加50μl的生物素化HGF(有效浓度5nM)，之后孵育45分钟。随后，将细胞用FACS缓冲液洗涤两次，并用DPBS(Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水)洗涤一次。将50μl的Accutase^TM细胞脱离溶液添加到每个孔中，并且将板在37℃下孵育5-7分钟。通过添加50μl培养基或FACS缓冲液来中和Accutase^TM细胞脱离溶液。将孔的内容物小心地转移到V型底96孔板中。将细胞用FACS缓冲液洗涤三次。将二抗(链霉亲合素缀合物-PE；1:500稀释)添加到板的每个孔中，并将板孵育30-45分钟。在孵育后，将板用FACS缓冲液洗涤三次。最后，使细胞重悬于FACS缓冲液中，并在流式细胞仪中进行分析，以量化测试样品对EGF/EGFR的阻断。

如图24A-24B所显示，在H1975中，1H1cMET/1A12cMET/EGFR(WT)显示出比JNJ372类似物更好的HGF/cMET阻断能力。

实施例24. 1H1cMET/1A12cMET/EGFR(WT)通过减少pMET和降解EGFR来调节cMET和EGFR下游信号传导

H1975、H1975.HGF和C797S-BaF3细胞用于研究对cMET和EGFR下游信号传导的效应。NCI-H1975细胞表示具有EGFR原发性和继发性激活突变的人癌细胞系，除了MET基因扩增外，其还赋予对EGFR TKI的抗性。在这些细胞系中，EGFR和c-Met的配体(EGF和HGF)分别诱导EGFR和c-Met受体的磷酸化，这通过ERK和Akt蛋白的磷酸化刺激下游信号传导。C797S表示具有不可处理的EGFR点突变C797S的细胞系。

为了确定三特异性抗体1H1cMET/1A12cMET/EGFR(WT)是否可抑制c-Met和EGFR的激活以及Akt和Erk的磷酸化，将NCI-H1975细胞铺板到6孔板中(3×10⁵个细胞/孔)。次日早晨，将H1975细胞在完全培养基中用抗体处理66小时，在含0.5％ FBS的培养基中血清饥饿6小时，然后用HGF刺激15分钟。将H1975-HGF细胞在完全培养基中用抗体处理48小时，然后用新鲜抗体再处理24小时。将C797S-BaF3细胞在完全培养基中用抗体处理24小时。

将细胞用冰冷PBS洗涤两次，然后在含有蛋白酶抑制剂(MedChemExpress，目录#HY-K0010)和磷酸酶抑制剂混合物(Research Products International，目录#P52100)的0.25ml的1×细胞裂解缓冲液(Cell Signaling Tech，目录#9803)中裂解。收集细胞裂解物并在4℃下以15000g离心15分钟。将澄清的裂解物与等体积的2×SDS样品缓冲液混合，并在100℃下煮沸15分钟。将样品用SDS-PAGE分离，转移到PVDF膜上，用5％脱脂奶粉封闭。将EGFR、c-Met、Akt和Erk的磷酸化分别用抗磷酸-EGFR(Y1173)(R&D Systems，目录#AF1095)、抗磷酸-c-Met(Cell Signaling Tech，目录#AF2480)、抗磷酸-Akt(Cell Signaling Tech，目录#4060S)，以及抗磷酸-Erk(Cell Signaling Tech；目录#4377S)抗体进行检测。将总EGFR、c-Met、Akt和Erk分别用抗EGFR(BioLegend，目录#617502)、抗c-Met(Cell SignalingTech，目录#3148S)、抗Akt(Cell Signaling Tech，目录#2920S)，以及抗Erk(CellSignaling Tech，目录#9107S)抗体进行检测。

如图25A所显示，1H1cMET/1A12cMET/EGFR(WT)比JNJ372类似物更有效地降解HGF-处理的H1975细胞中的EGFR。类似地，在表达HGF的H1975细胞中，三特异性抗体比JNJ372类似物更有效地介导EGFR降解和抑制p-MET(图25B中)。此外，它还诱导EGFR及其下游分子(Akt和Erk)的急剧降解(图25C)。这些结果表明1H1cMET/1A12cMET/EGFR(WT)比JNJ372类似物更有效地抑制cMet/EGFR信号传导通路。

实施例25. 1H1cMET/1A12cMET/EGFR(WT)抑制NSCLC细胞系的细胞增殖

cMET和EGFR与其相应配体的结合导致细胞增殖和存活。这是响应于cMET和EGFR配体结合的下游通路的激活而引发的。为了评估这一点，将不同的癌细胞(H1975、H1975.HGF和C797S-BaF3)铺板到96孔板(3×10⁵个细胞/孔)中的补充有10％ FBS的RPMI1640培养基中并在37℃下培养。随后，将细胞用一系列浓度的1H1cMET/1A12cMET/EGFR(WT)和JNJ372类似物(2.04×10^-4nM至400nM)处理并在37℃的培养箱中保持72小时。根据制造商的说明书，Cell-Titer Glo(Promega,Madison WI)试剂盒用于通过检测发光来评估对增殖的效应。

如图26A-26C所显示，1H1cMET/1A12cMET/EGFR(WT)比JNJ372类似物更有效地抑制NSCLC癌细胞增殖。

实施例26.JNJ372类似物和1H1cMET/1A12cMET/EGFR(WT)抗体的内化的检查

为了检查JNJ372类似物和1H1cMET/1A12cMET/EGFR(WT)抗体的内化，使用不同的细胞系(H1975、H1975.HGF、C797S-BaF3以及EGFR插入突变型D770-BaF3)。将细胞铺板到96孔板(3×10⁴个细胞/孔)中的100μL的RPMI 1640培养基(补充有10％ FBS)中，并在37℃和5％ CO₂下孵育。使贴壁细胞孵育过夜，而悬浮细胞(C797S-BaF3和D770-BaF3)在处理当天铺板。随后，将细胞用50μL的RPMI 1640培养基(补充有10％ FBS)中的一系列浓度的1H1cMET/1A12cMET/EGFR(WT)和JNJ372类似物(2.04×10^-4nM至400nM)处理，并在37℃、5％CO₂下孵育20-30分钟。之后，将pHrodo^TM-标记的二抗(AffiniPure山羊抗人IgG，Fcγ；目录#109005008)(50μl，10μg/ml)添加到细胞中，并在37℃、5％ CO₂下孵育20小时。为了量化受体的内化，使用Accutase^TM细胞脱离溶液来脱离贴壁细胞，而悬浮细胞直接使用。将细胞用FACS缓冲液洗涤四次，最后重悬于相同的缓冲液中，并使用PE通道通过FACS进行分析。

如图27A-27D所显示，在大多数NSCLC细胞中，1H1cMET/1A12cMET/EGFR(WT)在抗体内化方面比JNJ372类似物更有效。

实施例27.与JNJ372类似物相比1H1cMET/1A12cMET/EGFR(WT)的效应子功能的测定

为了确定1H1cMET/1A12cMET/EGFR(WT)与JNJ372类似物相比的效应子功能，如下所述执行ADCC(抗体依赖性细胞毒性)测定。特别地，使用H1975.GFP.Luc和稳定表达HGF的H1975.GFP.Luc(H1975.GFP.Luc.HGF)。靶标(癌细胞)与效应(PBMC)的比率为1:10，即9000个靶细胞与90,000个效应细胞混合。将癌细胞与PBMC和抗体一起铺板到96孔平底板中，总体积为100μl。将板在37℃下孵育24小时。24小时后，收集上清液并转移至96孔V型底板。将平底板中的细胞用PBS洗涤。Accutase^TM细胞脱离溶液用于解离细胞，并且含FBS的RPMI培养基用于中和Accutase^TM的效应。随后，将细胞从平底板转移到V型底板。将具有上清液的细胞离心并用FACS缓冲液洗涤三次。最后一次洗涤后，添加7AAD(Invitrogen)至1:50的最终稀释度。将细胞在暗处孵育20分钟，然后将板在具有用于检测荧光的PerCP通道的流式细胞仪上运行。

如图28A-28B所显示，1H1cMET/1A12cMET/EGFR(WT)在H1975GFP.Luc细胞中ADCC方面与JNJ372类似物相当，而JNJ372类似物在H1975GFP.Luc.HGF细胞中更好。

实施例28.体内模型中H1975+Balb/c NU/NU的4臂功效研究

为了参考JNJ372类似物评估三特异性抗体1H1cMET/1A12cMET/EGFR(WT)对肿瘤抑制的效应，如下对Balb/c NU/NU小鼠执行研究。每只小鼠在右胁腹经皮下注射0.1mL 1:1无血清培养基:基质胶混合物中的H1975肿瘤细胞(5.0×10⁶)用于肿瘤发展。当平均肿瘤尺寸达到大约100mm³(例如75-125mm³)时，荷瘤动物被随机纳入研究组中。每组由三到四只小鼠组成。开始治疗的当天表示为第0天，并且每组中的动物如图29A-29C中所述进行处理。

结果指示与JNJ372类似物相比，在H1975移植的Balb/c小鼠模型中，1H1cMET/1A12cMET/EGFR(WT)具有更好的癌细胞杀伤功效。

实施例29.体内模型中H1975-Luc-GFP-HGF+BALB/c NU/NU的4臂功效研究

为了参考JNJ372类似物评估三特异性抗体1H1cMET/1A12cMET/EGFR(WT)在过表达HGF的细胞系中对肿瘤抑制的效应，如下对Balb/c NU/NU小鼠执行研究。每只小鼠在右胁腹经皮下注射0.1mL 1:1无血清培养基:基质胶混合物中的H1975-Luc-GFP-HGF肿瘤细胞(5.0×10⁶)用于肿瘤发展。当平均肿瘤尺寸达到大约100mm³(例如75-125mm³)时，荷瘤动物被随机纳入研究组中。每组由六只小鼠组成。开始治疗的当天表示为第0天，并且每组中的动物如图30A-30C中所述进行处理。

结果指示与JNJ372类似物相比，在H1975-Luc-GFP-HGF移植的Balb/c小鼠模型中，1H1cMET/1A12cMET/EGFR(WT)具有相似的癌细胞杀伤功效。

实施例30. 1H1cMET/1A12cMET/EGFR(WT)在携带细胞系C797S-BaF3皮下异种移植物的雌性NOG小鼠中的功效评价

为了参考JNJ372类似物评估三特异性抗体1H1cMET/1A12cMET/EGFR(WT)在外显子20点突变细胞系C797S-BaF3中对肿瘤抑制的效应，如下对NOG小鼠执行研究。每只小鼠在右胁腹经皮下注射0.1mL 1:1无血清培养基:基质胶混合物中的C797S-BaF3肿瘤细胞(10.0×10⁶)用于肿瘤发展。当平均肿瘤尺寸达到大约100mm³(例如75-125mm³)时，荷瘤动物被随机纳入研究组中。每组由六只小鼠组成。开始治疗的当天表示为第0天，并且每组中的动物如图31A-31C中所述进行处理。

结果指示与JNJ372类似物相比，在C797S-BaF3移植的NOG小鼠模型中1H1cMET/1A12cMET/EGFR(WT)具有相当的癌细胞杀伤功效。

其它实施方案

应当理解，尽管已经结合本发明的具体实施方式对本发明进行了描述，但是前述描述旨在说明而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书的范围限定。其它方面、优点和修改形式在以下权利要求书的范围之内。

Claims

1.一种结合cMET(酪氨酸蛋白激酶Met)的抗体或其抗原结合片段，其包含：

包含互补决定区(CDR)1、2和3的重链抗体可变结构域(VHH)，其中所述VHH CDR1区包含与选定的VHH CDR1氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，所述VHH CDR2区包含与选定的VHH CDR2氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，并且所述VHH CDR3区包含与选定的VHHCDR3氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列；

其中所述选定的VHH CDR 1、2和3氨基酸序列是以下之一：

(1)所述选定的VHH CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:1、2和3中示出；

(2)所述选定的VHH CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:4、5和6中示出；

(3)所述选定的VHH CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:7、8和9中示出；以及

(4)所述选定的VHH CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:10、11和12中示出。

2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述VHH包含分别具有SEQ IDNO:1、2和3中所示的氨基酸序列的CDR 1、2、3。

3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述VHH包含分别具有SEQ IDNO:4、5和6中所示的氨基酸序列的CDR 1、2、3。

4.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述VHH包含分别具有SEQ IDNO:7、8和9中所示的氨基酸序列的CDR 1、2、3。

5.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述VHH包含分别具有SEQ IDNO:10、11和12中所示的氨基酸序列的CDR 1、2、3。

6.一种结合cMET的抗体或其抗原结合片段，其包含含有与选定的VHH序列至少80％相同的氨基酸序列的重链抗体可变结构域(VHH)，其中所述选定的VHH序列选自SEQ ID NO:19-22和77-84。

7.根据权利要求6所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述VHH包含SEQ ID NO:19、77、78、79、80、81、或84的序列。

8.根据权利要求6所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述VHH包含SEQ ID NO:20的序列。

9.根据权利要求6所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述VHH包含SEQ ID NO:21的序列。

10.根据权利要求6所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述VHH包含SEQ ID NO:22、82、或83的序列。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段特异性结合cMET。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是人源化抗体或其抗原结合片段。

13.一种抗体或其抗原结合片段，其包含根据权利要求1-12中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的所述VHH CDR 1、2、3。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含人IgG Fc。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含两个或更多个重链抗体可变结构域。

16.一种抗体或其抗原结合片段，其与根据权利要求1-15中任一项所述的抗体或其抗原结合片段交叉竞争。

17.一种多特异性抗体或其抗原结合片段，其包含特异性结合EGFR的第一抗原结合位点，以及特异性结合cMET的第二抗原结合位点。

18.根据权利要求17所述的多特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述第一抗原结合位点包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH和所述VL彼此缔合并且特异性结合EGFR，其中

所述重链可变区(VH)包含互补决定区(CDR)1、2和3，其中所述VH CDR1区包含与SEQ IDNO:13至少80％相同的氨基酸序列，所述VH CDR2区包含与SEQ ID NO:14至少80％相同的氨基酸序列，并且所述VH CDR3区包含与SEQ ID NO:15至少80％相同的氨基酸序列；并且

所述轻链可变区(VL)包含CDR 1、2和3，其中所述VL CDR1区包含与SEQ ID NO:16至少80％相同的氨基酸序列，所述VL CDR2区包含与SEQ ID NO:17至少80％相同的氨基酸序列，并且所述VL CDR3区包含与SEQ ID NO:18至少80％相同的氨基酸序列。

19.根据权利要求18所述的多特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区(VH)包含与SEQ ID NO:23至少90％相同的氨基酸序列，并且轻链可变区(VL)包含与SEQ IDNO:24至少90％相同的氨基酸序列。

20.根据权利要求17-19中任一项所述的多特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述第二抗原结合位点特异性结合cMET，并且所述第二抗原结合位点包含含有互补决定区(CDR)1、2和3的第一重链抗体可变结构域(VHH1)，其中所述VHH1 CDR1区包含与选定的VHH1 CDR1氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，所述VHH1 CDR2区包含与选定的VHH1 CDR2氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，并且所述VHH1 CDR3区包含与选定的VHH1 CDR3氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列；

其中所述选定的VHH1 CDR 1、2和3氨基酸序列是以下之一：

(1)所述选定的VHH1 CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:1、2和3中示出；

(2)所述选定的VHH1 CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:4、5和6中示出；

(3)所述选定的VHH1 CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:7、8和9中示出；以及

(4)所述选定的VHH1 CDR1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:10、11和12中示出。

21.根据权利要求20所述的多特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述第一重链抗体可变结构域(VHH1)包含与选定的VHH序列至少80％相同的氨基酸序列，其中所述选定的VHH序列选自SEQ ID NO:19-22和77-84。

22.根据权利要求17-21中任一项所述的多特异性抗体或其抗原结合片段，其还包含特异性结合cMET的第三抗原结合位点。

23.根据权利要求22所述的多特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述第三抗原结合位点特异性结合cMET，并且所述第三抗原结合位点包含含有互补决定区(CDR)1、2和3的第二重链抗体可变结构域(VHH2)，其中所述VHH2 CDR1区包含与选定的VHH2 CDR1氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，所述VHH2 CDR2区包含与选定的VHH2 CDR2氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，并且所述VHH2 CDR3区包含与选定的VHH2CDR3氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列；

其中所述选定的VHH2 CDR 1、2和3氨基酸序列是以下之一：

(1)所述选定的VHH2 CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:1、2和3中示出；

(2)所述选定的VHH2 CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:4、5和6中示出；

(3)所述选定的VHH2 CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:7、8和9中示出；以及

(4)所述选定的VHH2 CDR1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:10、11和12中示出。

24.根据权利要求23所述的多特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述第二重链抗体可变结构域(VHH2)包含与选定的VHH2序列至少80％相同的氨基酸序列，其中所述选定的VHH2序列选自SEQ ID NO:19-22和77-84。

25.根据权利要求17-24中任一项所述的多特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述VH和所述VL通过接头肽序列连接形成scFv。

26.根据权利要求25所述的多特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述接头肽序列包含与SEQ ID NO:37-42中任一项至少80％相同的序列。

27.一种多肽复合物，其包含

(a)第一多肽，所述第一多肽从N末端到C末端包含：第一重链抗体可变结构域(VHH)、第一铰链区、第一Fc区；

(b)第二多肽，所述第二多肽从N末端到C末端包含：重链可变区(VH)、第二铰链区，以及第二Fc区；以及

(c)第三多肽，所述第三多肽包含轻链可变区(VL)；

其中所述第一VHH特异性结合cMET，其中所述VH和所述VL彼此缔合并且特异性结合EGFR。

28.根据权利要求27所述的多肽复合物，其中所述第一铰链区和/或所述第二铰链区包含与SEQ ID NO:25-29中任一项至少80％相同的序列。

29.根据权利要求27或28所述的多肽复合物，其中所述第一Fc区和/或所述第二Fc区包含与SEQ ID NO:30或31至少80％相同的序列。

30.根据权利要求27-29中任一项所述的多肽复合物，其中所述第一多肽包含与SEQ IDNO:43或44至少80％相同的序列；其中所述第二多肽包含与SEQ ID NO:45或46至少80％相同的序列；并且/或者其中所述第三多肽包含与SEQ ID NO:47至少80％相同的序列。

31.根据权利要求27-30中任一项所述的多肽复合物，其中所述第一多肽还包含特异性结合cMET的第二VHH，其中所述第二VHH经由接头肽序列连接至所述第一VHH的N末端。

32.根据权利要求31所述的多肽复合物，其中所述接头肽序列包含与SEQ ID NO:37-42中任一项至少80％相同的序列。

33.根据权利要求31或32所述的多肽复合物，其中所述第一多肽包含与SEQ ID NO:48或49至少80％相同的序列；其中所述第二多肽包含与SEQ ID NO:50或51至少80％相同的序列；并且/或者其中所述第三多肽包含与SEQ ID NO:52至少80％相同的序列。

34.根据权利要求27-33中任一项所述的多肽复合物，其中所述第一Fc区和/或所述第二Fc区包含根据EU编号在第239位处的天冬氨酸(Asp)，和/或根据EU编号在第332位处的谷氨酸(Glu)。

35.一种多肽复合物，其包含

(a)第一多肽，所述第一多肽从N末端到C末端包含：第一重链抗体可变结构域(VHH)、第一铰链区、第一Fc区；以及

(b)第二多肽，所述第二多肽从N末端到C末端包含：单链可变片段(scFv)、第二铰链区，以及第二Fc区；

其中所述第一VHH特异性结合cMET；其中所述scFv包含重链可变区(VH)、第一接头肽序列，以及轻链可变区(VL)；其中所述VH和所述VL彼此缔合并且特异性结合EGFR。

36.根据权利要求35所述的多肽复合物，其中所述第一接头肽序列包含与SEQ ID NO:37-42中任一项至少80％相同的序列。

37.根据权利要求35或36所述的多肽复合物，其中所述第一铰链区和/或所述第二铰链区包含与SEQ ID NO:25-29中任一项至少80％相同的序列。

38.根据权利要求35-37中任一项所述的多肽复合物，其中所述第一Fc区和/或所述第二Fc区包含与SEQ ID NO:30或31至少80％相同的序列。

39.根据权利要求35-38中任一项所述的多肽复合物，其中所述第一多肽包含与SEQ IDNO:53或54至少80％相同的序列；并且/或者其中所述第二多肽包含与SEQ ID NO:55或56至少80％相同的序列。

40.根据权利要求35-39中任一项所述的多肽复合物，其中所述第一多肽还包含特异性结合cMET的第二VHH，其中所述第二VHH经由第二接头肽序列连接至所述第一VHH的N末端。

41.根据权利要求40所述的多肽复合物，其中所述第二接头肽序列包含与SEQ ID NO:37-42中任一项至少80％相同的序列。

42.根据权利要求40或41所述的多肽复合物，其中所述第一多肽包含与SEQ ID NO:57或58至少80％相同的序列；并且/或者其中所述第二多肽包含与SEQ ID NO:59或60至少80％相同的序列。

43.根据权利要求35-42中任一项所述的多肽复合物，其中所述第一Fc区和/或所述第二Fc区包含根据EU编号在第239位处的天冬氨酸(Asp)，和/或根据EU编号在第332位处的谷氨酸(Glu)。

44.一种多肽复合物，其包含

(a)第一多肽，所述第一多肽从N末端到C末端包含：第一重链抗体可变结构域(VHH1)、第一接头肽序列、第一重链可变区(VH1)、第一铰链区，以及第一Fc区；

(b)第二多肽，所述第二多肽包含第一轻链可变区(VL1)；

(c)第三多肽，所述第三多肽从N末端到C末端包含：第二重链抗体可变结构域(VHH2)、第二接头肽序列、第二重链可变区(VH2)、第二铰链区，以及第二Fc区；以及

(d)第四多肽，所述第四多肽包含第二轻链可变区(VL2)；

其中所述VHH1和所述VHH2特异性结合cMET；其中所述VH1和所述VL1彼此缔合并且特异性结合EGFR；其中所述VH2和所述VL2彼此缔合并且特异性结合EGFR。

45.根据权利要求44所述的多肽复合物，其中所述第一接头肽序列和/或所述第二接头肽序列包含与SEQ ID NO:37-42中任一项至少80％相同的序列。

46.根据权利要求44或45所述的多肽复合物，其中所述第一铰链区和/或所述第二铰链区包含与SEQ ID NO:25-29中任一项至少80％相同的序列。

47.根据权利要求44-46中任一项所述的多肽复合物，其中所述VHH1和所述VHH2的序列是相同的。

48.根据权利要求47所述的多肽复合物，其中所述第一Fc区和/或所述第二Fc区包含与SEQ ID NO:32至少80％相同的序列。

49.根据权利要求47或48所述的多肽复合物，其中所述第一多肽包含与SEQ ID NO:61或62至少80％相同的序列；其中所述第二多肽包含与SEQ ID NO:63至少80％相同的序列；其中所述第三多肽包含与SEQ ID NO:61或62至少80％相同的序列；并且/或者其中所述第四多肽包含与SEQ ID NO:63至少80％相同的序列。

50.根据权利要求44-46中任一项所述的多肽复合物，其中所述VHH1和所述VHH2的序列是不同的。

51.根据权利要求50所述的多肽复合物，其中所述第一Fc区和/或所述第二Fc区包含与SEQ ID NO:30或31至少80％相同的序列。

52.根据权利要求50或51所述的多肽复合物，其中

(1)所述第一多肽包含与SEQ ID NO:64或65至少80％相同的序列；其中所述第二多肽包含与SEQ ID NO:68至少80％相同的序列；其中所述第三多肽包含与SEQ ID NO:66或67至少80％相同的序列；并且/或者其中所述第四多肽包含与SEQ ID NO:68至少80％相同的序列；或者

(2)所述第一多肽包含与SEQ ID NO:85至少80％相同的序列；其中所述第二多肽包含与SEQ ID NO:68至少80％相同的序列；其中所述第三多肽包含与SEQ ID NO:86至少80％相同的序列；并且/或者其中所述第四多肽包含与SEQ ID NO:68至少80％相同的序列。

53.根据权利要求44-52中任一项所述的多肽复合物，其中所述第一Fc区和/或所述第二Fc区包含根据EU编号在第239位处的天冬氨酸(Asp)，和/或根据EU编号在第332位处的谷氨酸(Glu)。

54.一种多肽复合物，其包含

(a)第一多肽，所述第一多肽从N末端到C末端包含：第一重链可变区(VH1)、第一铰链区、第一Fc区；第一接头肽序列，以及第一重链抗体可变结构域(VHH1)；

(b)第二多肽，所述第二多肽包含第一轻链可变区(VL1)；

(c)第三多肽，所述第三多肽从N末端到C末端包含：第二重链可变区(VH2)、第二铰链区、第二Fc区、第二接头肽序列，以及第二重链抗体可变结构域(VHH2)；以及

(d)第四多肽，所述第四多肽包含第二轻链可变区(VL2)；

其中所述VHH1和/或所述VHH2特异性结合cMET；其中所述VH1和所述VL1彼此缔合并且特异性结合EGFR；其中所述VH2和所述VL2彼此缔合并且特异性结合EGFR。

55.根据权利要求54所述的多肽复合物，其中所述第一接头肽序列和/或所述第二接头肽序列包含与SEQ ID NO:37-42中任一项至少80％相同的序列。

56.根据权利要求54或55所述的多肽复合物，其中所述第一铰链区和/或所述第二铰链区包含与SEQ ID NO:25-29中任一项至少80％相同的序列。

57.根据权利要求54-56中任一项所述的多肽复合物，其中所述VHH1和所述VHH2的序列是相同的。

58.根据权利要求57所述的多肽复合物，其中所述第一Fc区和/或所述第二Fc区包含与SEQ ID NO:32至少80％相同的序列。

59.根据权利要求57或58所述的多肽复合物，其中所述第一多肽包含与SEQ ID NO:69或70至少80％相同的序列；其中所述第二多肽包含与SEQ ID NO:71至少80％相同的序列；其中所述第三多肽包含与SEQ ID NO:69或70至少80％相同的序列；并且/或者其中所述第四多肽包含与SEQ ID NO:71至少80％相同的序列。

60.根据权利要求54-56中任一项所述的多肽复合物，其中所述VHH1和所述VHH2的序列是不同的。

61.根据权利要求60所述的多肽复合物，其中所述第一Fc区和/或所述第二Fc区包含与SEQ ID NO:30或31至少80％相同的序列。

62.根据权利要求60或61所述的多肽复合物，其中所述第一多肽包含与SEQ ID NO:72或73至少80％相同的序列；其中所述第二多肽包含与SEQ ID NO:76至少80％相同的序列；其中所述第三多肽包含与SEQ ID NO:74或75至少80％相同的序列；并且/或者其中所述第四多肽包含与SEQ ID NO:76至少80％相同的序列。

63.根据权利要求54-62中任一项所述的多肽复合物，其中所述第一Fc区和/或所述第二Fc区包含根据EU编号在第239位处的天冬氨酸(Asp)，和/或根据EU编号在第332位处的谷氨酸(Glu)。

64.一种多肽复合物，其包含

(c)第三多肽，所述第三多肽包含轻链可变区(VL)；

其中所述第一VHH特异性结合cMET，其中所述VH和所述VL彼此缔合并且特异性结合EGFR；其中所述第一多肽还包含特异性结合cMET的第二VHH，其中所述第二VHH经由接头肽序列连接至所述第一VHH的N末端。

65.根据权利要求64所述的多肽复合物，其中所述第一铰链区和/或所述第二铰链区包含与SEQ ID NO:25-29中任一项至少80％相同的序列。

66.根据权利要求64或65所述的多肽复合物，其中所述第一Fc区和/或所述第二Fc区包含与SEQ ID NO:30或31至少80％相同的序列。

67.根据权利要求64-66中任一项所述的多肽复合物，其中所述接头肽序列包含与SEQID NO:37-42中任一项至少80％相同的序列。

68.根据权利要求64-67中任一项所述的多肽复合物，其中所述第一多肽包含与SEQ IDNO:48或49至少80％相同的序列；其中所述第二多肽包含与SEQ ID NO:50或51至少80％相同的序列；并且/或者其中所述第三多肽包含与SEQ ID NO:52至少80％相同的序列。

69.根据权利要求64-68中任一项所述的多肽复合物，其中所述第一Fc区和/或所述第二Fc区包含根据EU编号在第239位处的天冬氨酸(Asp)，和/或根据EU编号在第332位处的谷氨酸(Glu)。

70.一种多肽复合物，其包含

其中所述第一VHH特异性结合cMET；其中所述scFv包含重链可变区(VH)、第一接头肽序列，以及轻链可变区(VL)；其中所述VH和所述VL彼此缔合并且特异性结合EGFR；其中所述第一多肽还包含特异性结合cMET的第二VHH，其中所述第二VHH经由第二接头肽序列连接至所述第一VHH的N末端。

71.根据权利要求70所述的多肽复合物，其中所述第一接头肽序列和/或所述第二接头肽序列包含与SEQ ID NO:37-42中任一项至少80％相同的序列。

72.根据权利要求70或71所述的多肽复合物，其中所述第一铰链区和/或所述第二铰链区包含与SEQ ID NO:25-29中任一项至少80％相同的序列。

73.根据权利要求70-72中任一项所述的多肽复合物，其中所述第一Fc区和/或所述第二Fc区包含与SEQ ID NO:30或31至少80％相同的序列。

74.根据权利要求70-73中任一项所述的多肽复合物，其中所述第一多肽包含与SEQ IDNO:57或58至少80％相同的序列；并且/或者其中所述第二多肽包含与SEQ ID NO:59或60至少80％相同的序列。

75.根据权利要求70-74中任一项所述的多肽复合物，其中所述第一Fc区和/或所述第二Fc区包含根据EU编号在第239位处的天冬氨酸(Asp)，和/或根据EU编号在第332位处的谷氨酸(Glu)。

76.一种多肽复合物，其包含

(b)第二多肽，所述第二多肽包含第一轻链可变区(VL1)；

(d)第四多肽，所述第四多肽包含第二轻链可变区(VL2)；

其中所述VHH1和所述VHH2特异性结合cMET；其中所述VH1和所述VL1彼此缔合并且特异性结合EGFR；其中所述VH2和所述VL2彼此缔合并且特异性结合EGFR；其中所述VHH1和所述VHH2的序列是不同的。

77.根据权利要求76所述的多肽复合物，其中所述第一接头肽序列和/或所述第二接头肽序列包含与SEQ ID NO:37-42中任一项至少80％相同的序列。

78.根据权利要求76或77所述的多肽复合物，其中所述第一铰链区和/或所述第二铰链区包含与SEQ ID NO:25-29中任一项至少80％相同的序列。

79.根据权利要求76-78中任一项所述的多肽复合物，其中所述第一Fc区和/或所述第二Fc区包含与SEQ ID NO:30或31至少80％相同的序列。

80.根据权利要求76-79中任一项所述的多肽复合物，其中

81.根据权利要求76-80中任一项所述的多肽复合物，其中所述第一Fc区和/或所述第二Fc区包含根据EU编号在第239位处的天冬氨酸(Asp)，和/或根据EU编号在第332位处的谷氨酸(Glu)。

82.一种多肽复合物，其包含

(b)第二多肽，所述第二多肽包含第一轻链可变区(VL1)；

(d)第四多肽，所述第四多肽包含第二轻链可变区(VL2)；

其中所述VHH1和/或所述VHH2特异性结合cMET；其中所述VH1和所述VL1彼此缔合并且特异性结合EGFR；其中所述VH2和所述VL2彼此缔合并且特异性结合EGFR；其中所述VHH1和所述VHH2的序列是不同的。

83.根据权利要求82所述的多肽复合物，其中所述第一接头肽序列和/或所述第二接头肽序列包含与SEQ ID NO:37-42中任一项至少80％相同的序列。

84.根据权利要求82或83所述的多肽复合物，其中所述第一铰链区和/或所述第二铰链区包含与SEQ ID NO:25-29中任一项至少80％相同的序列。

85.根据权利要求82-84中任一项所述的多肽复合物，其中所述第一Fc区和/或所述第二Fc区包含与SEQ ID NO:30或31至少80％相同的序列。

86.根据权利要求82-85中任一项所述的多肽复合物，其中所述第一多肽包含与SEQ IDNO:72或73至少80％相同的序列；其中所述第二多肽包含与SEQ ID NO:76至少80％相同的序列；其中所述第三多肽包含与SEQ ID NO:74或75至少80％相同的序列；并且/或者其中所述第四多肽包含与SEQ ID NO:76至少80％相同的序列。

87.根据权利要求82-86中任一项所述的多肽复合物，其中所述第一Fc区和/或所述第二Fc区包含根据EU编号在第239位处的天冬氨酸(Asp)，和/或根据EU编号在第332位处的谷氨酸(Glu)。

88.一种核酸，其包含编码根据权利要求1-16中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、根据权利要求17-26中任一项所述的多特异性抗体或其抗原结合片段、或根据权利要求27-87中任一项所述的多肽复合物的多核苷酸。

89.根据权利要求88所述的核酸，其中所述核酸是DNA(例如cDNA)或RNA(例如mRNA)。

90.一种载体，其包含根据权利要求88或89所述的核酸的一种或多种。

91.一种细胞，其包含根据权利要求90所述的载体。

92.根据权利要求91所述的细胞，其中所述细胞是CHO细胞。

93.一种细胞，其包含根据权利要求88或89所述的核酸的一种或多种。

94.一种产生抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：

(a)在足以使细胞产生所述抗体或所述抗原结合片段的条件下，培养根据权利要求91-93中任一项所述的细胞；以及

(b)收集由所述细胞产生的所述抗体或所述抗原结合片段。

95.一种抗体-药物缀合物，其包含与治疗剂共价结合的根据权利要求1-16中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、根据权利要求17-26中任一项所述的多特异性抗体或其抗原结合片段、或根据权利要求27-87中任一项所述的多肽复合物。

96.根据权利要求95所述的抗体药物缀合物，其中所述治疗剂是细胞毒性剂或细胞抑制剂。

97.一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含根据权利要求1-16中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、根据权利要求17-26中任一项所述的多特异性抗体或其抗原结合片段、根据权利要求27-87中任一项所述的多肽复合物、或根据权利要求95或96所述的抗体-药物缀合物。

98.根据权利要求97所述的方法，其中所述受试者患有表达cMET的癌症。

99.根据权利要求97或98所述的方法，其中所述受试者患有表达EGFR的癌症。

100.根据权利要求97-99中任一项所述的方法，其中所述癌症是肺癌。

101.根据权利要求100所述的方法，其中所述癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)。

102.一种降低肿瘤生长速率的方法，所述方法包括：

使肿瘤细胞与有效量的组合物接触，所述组合物包含根据权利要求1-16中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、根据权利要求17-26中任一项所述的多特异性抗体或其抗原结合片段、根据权利要求27-87中任一项所述的多肽复合物、或根据权利要求95或96所述的抗体-药物缀合物。

103.一种杀伤肿瘤细胞的方法，所述方法包括：

104.一种杀伤肿瘤细胞的方法，所述方法包括：

105.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-16中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、根据权利要求17-26中任一项所述的多特异性抗体或其抗原结合片段、根据权利要求27-87中任一项所述的多肽复合物，以及药学上可接受的载剂。

106.一种药物组合物，其包含根据权利要求95或96所述的抗体-药物缀合物以及药学上可接受的载剂。