Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

CN116848250A - 新型昆虫抑制蛋白 - Google Patents

新型昆虫抑制蛋白 Download PDF

Info

Publication number
CN116848250A
CN116848250A CN202180088459.XA CN202180088459A CN116848250A CN 116848250 A CN116848250 A CN 116848250A CN 202180088459 A CN202180088459 A CN 202180088459A CN 116848250 A CN116848250 A CN 116848250A
Authority
CN
China
Prior art keywords
axmi
plant
protein
seq
nucleic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180088459.XA
Other languages
English (en)
Inventor
D·J·伯温
T·A·奇彻
A·R·豪
S·C·沃德豪斯
K·M·韦格纳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Monsanto Technology LLC
Original Assignee
Monsanto Technology LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Monsanto Technology LLC filed Critical Monsanto Technology LLC
Publication of CN116848250A publication Critical patent/CN116848250A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01P—BIOCIDAL, PEST REPELLANT, PEST ATTRACTANT OR PLANT GROWTH REGULATORY ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR PREPARATIONS
    • A01P7/00—Arthropodicides
    • A01P7/04—Insecticides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
    • C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C12R2001/075—Bacillus thuringiensis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/18—Erwinia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/38—Pseudomonas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/41—Rhizobium
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

公开了表现出针对鳞翅目害虫物种的毒性活性的杀虫蛋白，并且所述杀虫蛋白包括但不限于TIC13085和TIC13087。提供了DNA构建体，所述DNA构建体含有编码所公开的杀虫蛋白中的一者或多者的重组核酸序列。提供了抗鳞翅目侵扰的转基因植物、植物细胞、种子和植物部分，它们含有编码本发明的杀虫蛋白的重组核酸序列。还提供了用于检测生物样品中本发明的重组核酸序列或蛋白的存在的方法，以及使用所述TIC13085和TIC13087杀虫蛋白中的任一者防治鳞翅目物种害虫的方法。

Description

新型昆虫抑制蛋白
相关申请的引用
本申请要求2020年12月31日提交的美国临时申请第63/132,877号的权益，所述申请以引用的方式整体并入本文。
序列表的并入
含有计算机可读形式的序列表的名为“MONS486WO-sequence_listin g.txt”的文件创建于2021年12月9日。此文件为27,917字节(在MS-Wi 中测量)，通过电子提交(使用美国专利局EFS-Web提交系统)同时提交，并以引用的方式整体并入。
技术领域
本发明总体上涉及昆虫抑制蛋白领域。公开了一类新型蛋白，它们对作物植物和种子的农业相关害虫，特别是鳞翅目昆虫物种表现出昆虫抑制活性。提供了植物、植物部分和种子，包括植物和微生物细胞，以及含有编码一种或多种公开的毒素蛋白的重组多核苷酸构建体的载体。
背景技术
提高具有重要农业意义的植物(包括玉米、大豆、甘蔗、水稻、小麦、蔬菜和棉花等)的作物产量变得越来越重要。除了越来越需要农产品来为不断增长的人口提供食物、衣服和提供能源外，气候相关的影响以及不断增长的人口对将土地用于非农业实践的压力预计将减少可用于耕种的耕地面积。这些因素导致了对粮食安全的严峻预测，特别是在植物生物技术和农艺实践没有重大改进的情况下。鉴于这些压力，技术、农业技术和病虫害管理方面的环境可持续改进是在有限的可耕地上扩大作物产量的重要工具。
昆虫，特别是鳞翅目昆虫，被认为是损害大田作物，从而降低受侵扰地区的作物产量的主要原因。对农业产生负面影响的鳞翅目害虫物种包括但不限于黑粘虫(考斯夜蛾(Spodoptera cosmioides))、黑地老虎(小地老虎(Agrotis ipsilon))、玉米螟蛉(谷实夜蛾(Helicoverpa zea))、棉叶虫(棉叶波纹夜蛾(Alabama argillacea))、菜蛾(小菜蛾(Plutella xylostella))、欧洲玉米螟(大丽花螟蛾(Ostrinia nubilalis))、秋粘虫(草地贪夜蛾(Spodopte ra frugiperda))、Cry1Fa1抗性秋粘虫(草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperd a))、旧大陆棉铃虫(OWB，棉铃虫(Helicoverpa armigera))、南方粘虫(南部灰翅夜蛾(Spodoptera eridania))、大豆尺蠖(大豆夜蛾(Chrysodeixis inc ludens))、斑点棉铃虫(纹钻夜蛾(Earias vittella))、西南玉米螟(西南玉米杆草螟(Diatraeagrandiosella))、向日葵尺蠖(薄荷灰夜蛾(Rachiplusia nu))、烟草夜蛾(烟芽夜蛾(Heliothis virescens))、烟草地老虎(斜纹夜蛾(Sp odoptera litura)，又名丛毛虫)、西豆地老虎(西部豆角蛾(Striacosta albi costa))和天鹅绒豆毛虫(绒毛豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis))。
从历史上看，合成化学杀昆虫剂的密集应用在农业中被用作害虫防治剂。对环境和人类健康的关注，以及新出现的抗性问题都刺激了生物杀虫剂的研究和开发。这项研究工作导致了对包括细菌在内的各种昆虫病原微生物物种的逐步发现和使用。
当昆虫病原细菌，尤其是属于芽孢杆菌属的细菌被发现并开发为生物害虫防治剂时，生物防治模式发生了转变。苏云金芽孢杆菌(Bt)菌株已被用作杀虫蛋白的来源，因为人们发现Bt菌株对特定昆虫显示出高毒性。已知Bt菌株会产生δ-内毒素，其在孢子形成开始时和静止生长期内位于伴孢结晶包涵体中(例如，Cry蛋白)，并且还已知会产生分泌型杀昆虫蛋白。在被易感昆虫幼虫摄入后，δ-内毒素以及分泌的毒素在昆虫幼虫中肠上皮细胞表面发挥作用，破坏细胞膜，导致细胞破裂和死亡。编码杀昆虫蛋白的基因也在Bt以外的细菌物种中被鉴定，包括其它芽孢杆菌和多种其它细菌物种，例如侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporu s)、球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)(“Ls”，以前称为球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus))、日本甲虫类芽孢杆菌(Paenibacillus popi lliae)和缓病类芽孢杆菌(Paenibacillus lentimorbus)。另外，还从多种非细菌来源(包括真菌、蕨类植物和蛛形纲动物的毒液)中鉴定出杀昆虫毒素。在害虫的饮食中递送杀虫有效量的此类毒素是防治目标害虫的有效方式。对于一些易感害虫物种，杀虫有效量的特异性针对并靶向抑制必需基因的dsRNA已被确定为有效的害虫管理策略，特别是当与一种或多种杀虫蛋白结合使用时。
结晶和可溶性分泌型杀昆虫毒素对预期的目标宿主具有高度特异性，并已获得全世界的认可，并首选作为化学杀昆虫剂的替代品。例如，杀昆虫毒素蛋白已被用于各种农业应用，以保护农业上重要的植物物种免受昆虫侵扰，减少对化学杀虫剂应用的需求，并提高产量。杀昆虫毒素蛋白用于通过机械方法防治作物植物的农业相关害虫，例如喷洒以将含有各种菌株的微生物配制物分散至植物表面，以及通过使用遗传转化技术产生表达杀昆虫毒素蛋白的转基因植物和种子。
表达杀昆虫毒素蛋白的转基因植物的使用已经在全球范围内进行了调整。例如，2016年，超过2300万公顷种植了表达Bt毒素的转基因作物，并且超过7500万公顷种植了表达Bt毒素并具有除草剂耐受性状的转基因作物(ISAAA.2016.Global Status ofCommercialized Biotech/GM Crops:2016.ISAAA Brief No.52.ISAAA:Ithaca,NY)。转基因昆虫保护作物的全球使用以及这些作物中使用的杀昆虫毒素蛋白的数量有限，给选择赋予对目前使用的杀昆虫蛋白的抗性的现有昆虫等位基因施加了压力。
目标害虫对杀昆虫毒素蛋白的抗性的发展产生了对发现和开发新形式的杀昆虫毒素蛋白的持续需求，所述新形式的杀昆虫毒素蛋白可用于管理昆虫对表达杀昆虫毒素蛋白的转基因作物抗性的增加。具有改进功效并表现出对更广谱易感昆虫物种的防治的新蛋白毒素将减少可产生抗性等位基因的存活昆虫的数量。另外，在一种植物中使用两种或多种转基因杀昆虫毒素蛋白对同一害虫有毒并表现出不同的作用模式，或者两种或多种不同的毒性作用模式(例如，编码靶向抑制必需基因的dsRNA的转基因与编码肽或蛋白毒素的转基因相结合，两者都对同一昆虫物种有毒)降低了任何单一目标昆虫物种抗性的概率和抗性发展的可能性。另外，使用自限性技术，例如Oxitec Ltd提供的技术，当与本发明的蛋白一起使用时，可提高赋予表达本发明蛋白的转基因作物昆虫抗性性状的持久性(Zhou等人.2018.Evol Appl 11(5):727–738；Alphey等人.2009.Journal of Economic Entomology,102:717-732)。
因此，本发明人在本文中公开了源自苏云金芽孢杆菌物种的新型蛋白以及工程化变体蛋白和示例性重组蛋白，它们各自表现出针对目标鳞翅目物种，例如针对黑地老虎(小地老虎)、玉米螟蛉(谷实夜蛾)、欧洲玉米螟(大丽花螟蛾)、秋粘虫(草地贪夜蛾)、南方粘虫(南部灰翅夜蛾)、西南玉米螟(西南玉米杆草螟)和大豆尺蠖(大豆夜蛾)的杀昆虫活性。
发明内容
本文公开了新型杀虫蛋白TIC13085和TIC13087，它们显示出对作物植物的一种或多种害虫具有抑制活性。TIC13085和TIC13087蛋白可单独使用，或与其它杀昆虫蛋白和毒性剂一起用于配制物和植物中，从而提供目前在农业系统中使用的杀昆虫蛋白和杀昆虫化学物质的替代品。
在一个实施方案中是一种重组核酸分子，其包含与编码杀虫蛋白或其杀虫片段的多核苷酸区段可操作地连接的异源启动子，其中杀虫蛋白包含如SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:4中所示的氨基酸序列。杀虫蛋白包含与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列具有至少88％、或90％、或95％、或98％、或99％、或约100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。编码蛋白的多核苷酸区段在严格杂交条件下与具有如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6中所示的核苷酸序列的多核苷酸杂交。重组核酸分子是编码杀虫蛋白的核苷酸序列并且可在植物细胞中表达，并且当在植物细胞中表达时产生杀虫有效量的杀虫蛋白或其杀虫片段。
在另一实施方案中，重组核酸分子存在于细菌或植物宿主细胞内。预期的细菌宿主细胞至少包括农杆菌属、根瘤菌属、芽孢杆菌属、短芽孢杆菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属、克雷伯氏菌属、泛菌属和欧文氏菌属。在某些实施方案中，芽孢杆菌属是蜡样芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌，短芽孢杆菌属是侧孢短芽孢杆菌，或埃希氏菌属是大肠埃希氏菌。考虑的植物宿主细胞包括双子叶植物细胞和单子叶植物细胞。考虑的植物细胞还可包括苜蓿、香蕉、大麦、豆类、西兰花、卷心菜、芸苔(包括芥菜和油菜)、胡萝卜、木薯、蓖麻、花椰菜、芹菜、鹰嘴豆、大白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米(包括甜玉米和非甜质玉米)、三叶草、棉花(棉属)、葫芦、黄瓜、花旗松、茄子、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、啤酒花、韭菜、莴苣、火炬松、粟、甜瓜、坚果、燕麦、橄榄、洋葱、观赏植物、棕榈、牧草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松树、马铃薯、白杨、南瓜、辐射松、萝卜、油菜籽(芥花籽)、水稻、砧木、黑麦、红花、灌木、高粱、南方松、大豆、菠菜、倭瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、香枫、甘薯、柳枝稷、茶、烟草、番茄、黑小麦、草坪草、西瓜和小麦植物细胞。
在另一实施方案中，杀虫蛋白表现出针对鳞翅目昆虫的活性，所述鳞翅目昆虫包括至少黑地老虎(小地老虎)、玉米螟蛉(谷实夜蛾)、欧洲玉米螟(大丽花螟蛾)、秋粘虫(草地贪夜蛾)、南方粘虫(南部灰翅夜蛾)、西南玉米螟(西南玉米杆草螟)和大豆尺蠖(大豆夜蛾)。
本申请还考虑了包含编码杀虫有效量的杀虫蛋白TIC13085或TIC13087或其杀虫片段的重组核酸分子的细菌和植物和植物部分。重组分子(例如构建体)可包含异源启动子，其用于在细菌或植物细胞中表达编码杀虫蛋白的可操作地连接的多核苷酸区段。考虑了双子叶植物和单子叶植物。在另一实施方案中，植物进一步选自由以下组成的组：苜蓿、香蕉、大麦、豆类、西兰花、卷心菜、芸苔(例如芥花籽或油菜籽)、胡萝卜、木薯、蓖麻、花椰菜、芹菜、鹰嘴豆、大白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米(玉蜀黍，包括甜玉米和非甜质玉米)、三叶草、棉花(即棉属)、葫芦、黄瓜、花旗松、茄子、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、啤酒花、韭菜、莴苣、火炬松、粟、甜瓜、坚果、燕麦、橄榄、洋葱、观赏植物、棕榈、牧草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松树、马铃薯、白杨、南瓜、辐射松、萝卜、水稻、砧木、黑麦、红花、灌木、高粱、南方松、大豆、菠菜、倭瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、香枫、甘薯、柳枝稷、茶、烟草、番茄、黑小麦、草坪草、西瓜和小麦植物。植物部分可例如包括但不限于叶、块茎、根、茎、种子、胚、花、花序、铃、花粉、果实、动物饲料和生物质。还考虑了经加工的植物部分，例如木材或油、无法存活的磨碎种子或分离的种子、面粉或由植物叶、花、根、种子或块茎产生的淀粉。
在某些实施方案中，公开了包含重组核酸分子的种子。
在另一实施方案中，考虑了包含本申请中公开的重组核酸分子的昆虫抑制组合物。昆虫抑制组合物还可包含编码至少一种不同于本发明的杀虫蛋白的其它杀虫剂的核苷酸序列。在某些实施方案中，其它杀虫剂选自由昆虫抑制蛋白、昆虫抑制dsRNA分子和辅助蛋白组成的组。还考虑了昆虫抑制组合物中的其它杀虫剂表现出针对鳞翅目、鞘翅目或半翅目的一种或多种害虫物种的活性。昆虫抑制组合物中的其它杀虫剂可以是选自由以下组成的组的实施方案：Cry1A、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1A.105、Cry1Ae、Cry1B、Cry1C、Cry1C变体、Cry1D、Cry1E、Cry1F、Cry1A/F嵌合体、Cry1G、Cry1H、Cry1I、Cry1J、Cry1K、Cry1L、Cry2A、Cry2Ab、Cry2Ae、Cry3、Cry3A变体、Cry3B、Cry4B、Cry6、Cry7、Cry8、Cry9、Cry15、Cry34、Cry35、Cry43A、Cry43B、Cry51Aa1、ET29、ET33、ET34、ET35、ET66、ET70、TIC400、TIC407、TIC417、TIC431、TIC800、TIC807、TIC834、TIC853、TIC900、TIC901、TIC1201、TIC1415、TIC2160、TIC3131、TIC836、TIC860、TIC867、TIC869、TIC1100、VIP3A、VIP3B、VIP3Ab、AXMI-88、AXMI-97、AXMI-102、AXMI-112、AXMI-117、AXMI-100、AXMI-115、AXMI-113和AXMI-005、AXMI134、AXMI-150、AXMI-171、AXMI-184、AXMI-196、AXMI-204、AXMI-207、AXMI-209、AXMI-205、AXMI-218、AXMI-220、AXMI-221z、AXMI-222z、AXMI-223z、AXMI-224z和AXMI-225z、AXMI-238、AXMI-270、AXMI-279、AXMI-345、AXMI-335、AXMI-R1和前述的杀虫变体、IP3和其变体、DIG-3、DIG-5、DIG-10、DIG-657、DIG-11蛋白、IDP102Aa和其同源物、IDP110Aa和其同源物、TIC868、Cry1Da1_7、BCW003、TIC1100、TIC867、TIC867_23、TIC6757、TIC7941、IDP072Aa、TIC5290、TIC3668、TIC3669、TIC3670、TIC4029、TIC4064、IDP103和其同源物、PIP-50和PIP-65以及其同源物、PIP-83和其同源物、以及Cry1B.34。
还考虑了包含可检测量的本发明的重组核酸分子和毒素蛋白的商品。此类商品包括用谷物处理机装袋的商品玉米、玉米片、玉米饼、玉米粉、玉米面、玉米糖浆、玉米油、玉米青贮、玉米淀粉、玉米谷物等，以及相应的大豆、大米、小麦、高粱、木豆、花生、水果、甜瓜和蔬菜商品，包括适用情况下的果汁、浓缩物、果酱、果冻、果子酱和含有可检测量的本发明的此类多核苷酸和或多肽的此类商品的其它可食用形式、完整或加工的棉籽、棉油、棉绒、加工成饲料或食品、纤维、纸、生物质和燃料产品如源自棉油的燃料或源自轧棉机废料的粒料的种子和植物部分、完整或加工的大豆种子、大豆油、大豆蛋白、大豆粕、大豆粉、大豆片、大豆麸、大豆乳、大豆干酪、大豆酒、包含大豆的动物饲料、包含大豆的纸、包含大豆的乳脂、大豆生物质以及使用大豆植物和大豆植物部分生产的燃料产品。
本申请还考虑了一种生产种子的方法，所述种子包含编码TIC13085和TIC13087毒素蛋白的重组核酸分子。所述方法包括种植至少一粒包含编码TIC13085或TIC13087毒素的重组核酸分子的种子；从种子生长出植物；以及从植物收获种子，其中收获的种子包含编码适用毒素的参考重组核酸分子。
在另一实施方案中，提供了抗鳞翅目昆虫侵扰的植物，其中植物的细胞含有本文所述的重组核酸分子并且编码TIC13085或TIC13087毒素。
本申请还公开了防治鳞翅目物种害虫和防治鳞翅目物种害虫侵扰植物，特别是作物植物的方法。在一个实施方案中，所述方法包括首先使害虫与杀昆虫有效量的具有如SEQID NO:2或SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的杀虫蛋白接触；或者使害虫与杀昆虫有效量的一种或多种此类杀虫蛋白接触，所述杀虫蛋白由与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列具有至少88％、或90％、或95％、或98％、或99％、或约100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列构成。
本文还提供检测编码TIC13085和TIC13087毒素蛋白类别的重组核酸分子的存在的方法，其中所述方法包括使核酸样品与核酸探针接触，所述核酸探针在严格杂交条件下与来自包含编码本文提供的杀虫蛋白或其片段的多核苷酸区段的植物的基因组DNA杂交。探针在此类杂交条件下不与来自不含多核苷酸区段的其它等基因植物的基因组DNA杂交，并且探针与如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6中所示的核苷酸序列同源或互补。探针还可与编码杀虫蛋白的多核苷酸区段杂交，所述杀虫蛋白与如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列具有至少88％、或90％、或95％、或98％、或99％、或约100％氨基酸序列同一性。所述方法还使样品和探针经受严格杂交条件，并检测探针与样品的DNA(或其它多核苷酸片段，例如mRNA)的杂交。在一些实施方案中，检测TIC13085或TIC13087毒素蛋白类别成员的存在的步骤可包括ELISA或蛋白质印迹，其中识别TIC13085或TIC13087表位的抗体也识别并结合此蛋白类别的成员的相似或相同表位，但在具有与本文公开的蛋白的氨基酸序列完全不同的氨基酸序列的蛋白中。
本文还提供了检测来自TIC13085和TIC13087毒素蛋白类别的杀虫蛋白或其杀虫/杀昆虫片段的存在的方法，其中所述方法包括使生物样品与TIC13085和TIC13087毒素蛋白类别免疫反应抗体接触，并检测抗体与样品中的TIC13085和TIC13087毒素蛋白类别蛋白的结合，从而证实样品中相关蛋白的存在。在一些实施方案中，检测步骤包括ELISA或蛋白质印迹。
还考虑了一种用于防治田间鳞翅目害虫物种或害虫侵扰的方法，其中所述方法包括种植作物种子，所述种子在其基因组中含有重组核苷酸序列，所述重组核苷酸序列编码与TIC13085或TIC13087毒素蛋白或其毒性片段相似或相关的毒素蛋白，以及种植在其细胞中表达杀昆虫有效量的具有如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的杀虫蛋白的转基因/重组作物植物或种植表达杀昆虫有效量的一种或多种杀虫蛋白的作物植物，条件是至少一种杀虫蛋白具有与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列具有至少88％、或90％、或95％、或98％、或99％、或约100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；以及任选地，将一种或多种各自携带自限性基因的转基因鳞翅目害虫物种释放至田地中或附近，用于防止或延迟一种或多种鳞翅目害虫物种对毒素蛋白产生抗性。在一个实施方案中，作物植物可以是单子叶的或双子叶的。在另一实施方案中，单子叶作物植物可以是玉米、小麦、高粱、水稻、黑麦或粟。在另一实施方案中，双子叶作物植物可以是大豆、棉花或油菜。
序列简述
SEQ ID NO:1是编码从苏云金芽孢杆菌获得的TIC13085杀虫蛋白的核酸序列。
SEQ ID NO:2是TIC13085杀虫蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3是编码从苏云金芽孢杆菌获得的TIC13087杀虫蛋白的核酸序列。
SEQ ID NO:4是TIC13087杀虫蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5是用于在编码TIC13085的植物细胞中表达的合成编码序列。
SEQ ID NO:6是用于在编码TIC13087的植物细胞中表达的合成编码序列。
具体实施方式
农业害虫防治领域的一个问题可表征为需要新的毒素蛋白，所述毒素蛋白对目标害虫有效，对目标害虫物种表现出广谱毒性，能够在植物中表达而不引起不希望的农艺问题，并且与目前在植物中商业使用的毒素相比提供了一种替代的作用模式。
本文公开了以TIC13085和TIC13087为例的新型杀虫蛋白，并解决了本领域中的这些问题中的每一者，特别是针对广谱鳞翅目害虫，例如针对黑地老虎(小地老虎)、玉米螟蛉(谷实夜蛾)、欧洲玉米螟(大丽花螟蛾)、秋粘虫(草地贪夜蛾)、南方粘虫(南部灰翅夜蛾)、西南玉米螟(西南玉米杆草螟)和大豆尺蠖(大豆夜蛾)。
本申请中对TIC13085、“TIC13085蛋白”、“TIC13085蛋白毒素”、“TIC13085杀虫蛋白”、“TIC13085相关毒素”、“TIC13085相关毒素”、“TIC13085蛋白毒素类别”、“TIC13085毒素蛋白类别”等的引用是指如下的任何新型杀虫蛋白或昆虫抑制蛋白，所述蛋白包含赋予针对鳞翅目害虫的活性的具有如TIC13085(SEQ ID NO:2)中所示的氨基酸序列的任何杀虫蛋白或昆虫抑制蛋白，和其杀虫或昆虫抑制区段或其组合、由其组成、与其基本上同源、与其类似或由其衍生，包括在此类蛋白与TIC13085的比对产生约88％至约100％的任何分数百分比的氨基酸序列同一性的情况下的表现出杀虫或昆虫抑制活性的任何蛋白。TIC13085蛋白包括质体靶向和非质体靶向形式的蛋白。
本申请中对TIC13087、“TIC13087蛋白”、“TIC13087蛋白毒素”、“TIC13087杀虫蛋白”、“TIC13087相关毒素”、“TIC13087相关毒素”、“TIC13087蛋白毒素类别”、“TIC13087毒素蛋白类别”等的引用是指如下的任何新型杀虫蛋白或昆虫抑制蛋白，所述蛋白包含赋予针对鳞翅目害虫的活性的具有如TIC13087(SEQ ID NO:4)中所示的氨基酸序列的任何杀虫蛋白或昆虫抑制蛋白，和其杀虫或昆虫抑制片段或区段或其组合、由其组成、与其基本上同源、与其类似或由其衍生，包括如果此类氨基酸序列与TIC13087的氨基酸序列的比对产生约88％至约100％的任何分数百分比的氨基酸序列同一性，则表现出杀虫或昆虫抑制活性的任何蛋白。TIC13087蛋白包括质体靶向和非质体靶向形式的蛋白。
术语“区段”或“片段”在本申请中用于描述比描述TIC13085或TIC13087编码序列或蛋白的完整氨基酸或核酸序列短的连续氨基酸或核酸序列。如果将表现出昆虫抑制活性的区段或片段与SEQ ID NO:2中所示的TIC13085蛋白或SEQ ID NO:4中所示的TIC13087蛋白的相应部分进行比对，使得区段或片段与TIC13085或TIC13087蛋白内的相应氨基酸区段之间的氨基酸序列同一性为约85％或约88％至约100％的任何分数百分比，则此类区段或片段也公开于本申请中。如本文所述的片段可包含TIC13085或TIC13087蛋白的至少50个、至少100个、至少250个、至少400个、至少500个、至少600个或至少800个连续氨基酸残基。
本申请中对术语“活性(active/activity)”、“杀虫活性”或“杀虫”或“杀昆虫活性”、“昆虫抑制”、“杀虫有效”或“杀昆虫”的引用是指毒性剂，例如含有有效量的TIC13085或TIC13087蛋白的蛋白毒素抑制(抑制生长、摄食、繁殖力或生存力)、抑止(抑止生长、摄食、繁殖力或生存力)、防治(防治害虫侵扰、防治害虫对特定作物的摄食活动)或杀死(导致发病、死亡或繁殖力降低)害虫的功效。这些术语旨在包括提供杀虫有效量的对害虫有毒的蛋白的结果，其中害虫暴露于毒性蛋白导致发病、死亡、繁殖力降低或发育迟缓。这些术语还包括由于在植物中或植物上提供杀虫有效量的毒性蛋白，害虫对植物、植物组织、植物部分、种子、植物细胞或植物可能生长的特定地理位置的排斥。通常，杀虫活性是指毒性蛋白有效抑制生长、发育、生存力、摄食行为、交配行为、繁殖力或由昆虫摄食引起的不利影响的任何可测量降低的能力。毒性蛋白可由植物产生或可应用于植物或应用于植物所在位置内的环境。术语“生物活性”、“有效(effective)”、“有效(efficacious)”或其变化形式在本申请中也是可互换使用的术语，用于描述本发明的蛋白对目标害虫的作用。
当在目标害虫的饮食中提供杀虫有效量的毒性剂时，当毒性剂接触害虫时表现出杀虫活性。毒性剂可以是杀虫蛋白或本领域已知的一种或多种化学试剂。杀虫或杀昆虫化学试剂可单独使用，或彼此组合使用。化学试剂包括但不限于靶向特定基因以抑制目标害虫的dsRNA分子、有机氯化物、有机磷酸盐、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯、新烟碱类和类黄酮(ryanoids)。杀虫或杀昆虫蛋白剂包括本申请中列出的蛋白毒素，以及其它蛋白毒性剂，包括靶向鳞翅目昆虫的那些，以及用于防治其它植物害虫的蛋白毒素，例如本领域中可供用于防治鞘翅目、半翅目和同翅目物种的Cry、Vip和Cyt蛋白。
提及害虫，特别是作物植物的害虫旨在意指作物植物的害虫，特别是由TIC13085或TIC13087蛋白毒素类别防治的那些鳞翅目害虫。然而，当针对这些害虫的毒性剂与TIC13085或TIC13087蛋白或与TIC13085或TIC13087蛋白85％至约100％同一的蛋白共定位或一起存在时，提及害虫还可包括鞘翅目、半翅目和同翅目植物害虫，以及线虫和真菌。短语“一起存在”或“共定位”意在包括目标害虫已与TIC13085或TIC13087毒素蛋白以及任何其它也以相对于目标害虫的杀虫有效量存在的毒性剂接触的任何情况。“接触”在某些实施方案中旨在指存在于目标害虫的饮食中，并且所述饮食被目标害虫消耗。
TIC13085和TIC13087蛋白因共同功能而相关，并且对鳞翅目昆虫物种(包括成虫、蛹、幼虫和新生虫)的害虫表现出杀昆虫活性。
鳞翅目昆虫包括但不限于夜蛾科的粘虫、地老虎、尺蠖和夜蛾，例如秋粘虫(草地贪夜蛾)、豆芽蛾(豆梢蛾(Crocidosema aporema))、甜菜夜蛾(甜菜斜纹夜蛾)、黑粘虫(考斯夜蛾)、南方粘虫(南部灰翅夜蛾)、披肩粘虫(蓓带夜蛾(Mamestra configurata))、黑地老虎(小地老虎)、卷心菜尺蠖(粉纹夜蛾(Trichoplusia ni))、大豆尺蠖(豆夜蛾(Pseudoplusia includen s))、向日葵尺蠖(薄荷灰夜蛾(Rachiplusia nu))、天鹅绒毛虫(绒毛豆夜蛾)、绿车轴草虫(苜蓿绿夜蛾(Hypena scabra))、烟青虫(烟芽夜蛾)、粒状切根虫(粒肤地老虎(Agrotis subterranea))、粘虫(一星粘虫(Pseudaletia unipu ncta))、向日葵尺蠖(薄荷灰夜蛾)、南美荚虫(南美棉铃虫蛾(Heliothis gelotopoeon))、西部地老虎(胖地夜蛾(Agrotis orthogonia))；来自钻孔虫科的蛀虫、卷心菜、螟虫、圆锥虫、卷心菜虫和空心虫，例如，欧洲玉米螟(大丽花螟蛾)、脐橙虫(脐橙螟蛾(Amyelois transitella))、玉米根螟(玉米根结网虫(Crambus caliginosellus))、草皮螟(水稻切叶野螟(Herpetogramma licarsisalis))、向日葵蛾(向日葵斑螟(Homoeosoma electellum))、小玉米杆螟(南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellus))；卷叶虫、芽虫、种虫和果虫，例如苹果蠹蛾(苹果小卷蛾(Cydia pomonella))、葡萄果蛾(萄果实蛀虫(Endopiza viteana))、东方果蛾(梨小食心虫(Grapholita molest a))、向日葵芽蛾(向日葵芽卷叶娥(Suleimahelianthana))；以及许多其它具有重要经济意义的鳞翅目昆虫，例如菜蛾(小菜蛾)、粉铃虫(棉红铃虫(Pectinophora gossypiella))和吉普赛飞蛾(舞毒蛾(Lymantria dispar))。鳞翅目内的其它害虫包括例如棉叶虫(棉叶波纹夜蛾)、果树卷叶虫(果树黄卷蛾(Archipsargyrospila))、欧洲卷叶虫(玫瑰黄卷蛾(Archips rosana))和其它黄卷蛾物种(二化螟、亚洲稻螟或稻螟)、稻卷叶螟(稻纵卷叶螟(Cna phalocrocis medinalis))、玉米根螟(玉米根结网虫)、早熟禾螟(蓝草结网毛虫(Crambus teterrellus))、西南玉米螟(西南玉米杆草螟)、甘蔗螟(小蔗螟(Diatraea saccharalis))、红棉铃虫(棉斑实蛾(Earias insulana))、斑点棉铃虫(纹钻夜蛾)、美洲棉铃虫(棉铃虫)、玉米螟蛉(谷实夜蛾，又称大豆荚虫和棉铃虫)、烟青虫(烟芽夜蛾)、草皮螟(水稻切叶野螟)、西豆地老虎(西部豆角蛾)、欧洲葡萄蛾(葡萄花翅小卷蛾(Lobesia botrana))、柑橘潜叶蛾(桔潜蛾(Phyllocnistis citrella))、大白蝶(欧洲粉蝶(Pieris brassi cae))、小白蝶(菜粉蝶(Pieris rapae)，又称菜青虫)、甜菜夜蛾(甜菜斜纹夜蛾)、烟草地老虎(斜纹夜蛾，又称丛毛虫)和番茄潜叶虫(南美番茄叶蛾(Tuta absoluta))。
在本申请中，提及“分离的DNA分子”或者等同术语或短语旨在意指一种DNA分子，其单独存在或与其它组合物组合存在，但不在其天然环境中存在。例如，在生物体的基因组的DNA中天然存在的核酸元件(诸如编码序列、内含子序列、非翻译前导序列、启动子序列、转录终止序列等)，只要所述元件位于生物体的基因组内并且在其天然存在的基因组内的位置处，就不被认为是“分离的”。然而，这些元件中的每一个以及这些元件的子部分在本公开的范围内将是“分离的”，只要所述元件不在生物体的基因组内并且不在其天然发现的基因组内的位置。类似地，编码杀昆虫蛋白或所述蛋白的任何天然存在的杀昆虫变体的核苷酸序列将是分离的核苷酸序列，只要所述核苷酸序列不在天然发现编码所述蛋白的序列的细菌DNA内。出于本公开的目的，编码天然存在的杀昆虫蛋白的氨基酸序列的合成核苷酸序列将被认为是分离的。出于本公开的目的，任何转基因核苷酸序列，即插入植物或细菌细胞基因组中或存在于染色体外载体中的DNA的核苷酸序列将被视为分离的核苷酸序列，无论它是否存在于用于转化细胞的质粒或类似结构中、植物或细菌的基因组中，或以可检测的量存在于源自植物或细菌的组织、后代、生物样品或商品中。
在本申请中提及的术语“自限性基因”是指限制宿主存活从而导致宿主种群减少的基因。此类技术例如由Oxitech Ltd.提供。携带转基因自限性基因的转基因雄性昆虫被释放并与野生雌性一起繁殖。结果，后代继承了自限性基因的拷贝。例如，Oxitech Ltd开发的自限性菜蛾(小菜蛾)品系OX4319L携带一个雄性选择基因，所述基因利用来自性别决定基因doublesex(dsx)的序列。所述基因表达性别交替剪接，导致自限性基因的雌性特异性表达，从而阻止雌性后代存活至幼虫期之后，并允许产生仅雄性的自限性蛾群。放生后，雄性与天然存在的野生型雌性交配，导致下一代雌性后代数量减少，从而局部抑制小菜蛾种群。为了促进在菜蛾生产设施内饲养大量雄性以供释放，通过在幼虫饲料中添加四环素或合适的类似物来抑制OX4319L品系中雌性特异性dsx的表达。OX4319L还表达荧光蛋白DsRed，DsRed允许监测此品系在田间的存在(Jin等人,2013.Engineered female-specificlethality for control of pest Lepidoptera.ACS Synthetic Biology,2:160-166)。当此技术应用于含有本发明的毒素基因的植物的田间时，可延迟或防止本发明的毒素基因和蛋白所针对防治的害虫物种产生抗性，从而使含有本发明的毒素基因和蛋白的任何植物产品具有更大的耐久性。
如本申请中进一步描述，作为使用从土壤样品中生长的细菌的板刮片进行宏基因组测序工作的一部分，在从分离自爱达荷州杰纳西(Genessee,Idaho)的麦田土壤的苏云金芽孢杆菌获得的DNA中发现了编码TIC13085(SEQ ID NO:1)的开放阅读框(ORF)。编码序列被克隆并在微生物宿主细胞中表达，以产生用于生物测定的重组蛋白。使用重组微生物宿主细胞衍生的TIC13085蛋白进行的生物测定表现出对鳞翅目物种秋粘虫(FAW，草地贪夜蛾)、大豆尺蠖(SBL，大豆夜蛾)和西南玉米螟(SWC，西南玉米杆草螟)的活性。在本申请中还进一步描述，作为使用从土壤中获取的细菌板刮片进行宏基因组测序工作的一部分，在从分离自北达科他州阿什利(Ashley,North Dakota)的麦田土壤的苏云金芽孢杆菌获得的DNA中发现了编码TIC13087(SEQ ID NO:3)毒素蛋白的开放阅读框(ORF)。使用重组微生物宿主细胞衍生的TIC13087蛋白进行的生物测定显示出对鳞翅目物种黑地老虎(BCW，小地老虎)、玉米螟蛉(CEW，谷实夜蛾)和西南玉米螟(SWC，西南玉米杆草螟)的活性。
产生设计用于植物细胞的合成编码序列以表达TIC13085(SEQ ID NO:5)和TIC13087(SEQ ID NO:6)。表达TIC13085的大豆植物表现出对鳞翅目物种秋粘虫(FAW，草地贪夜蛾)、南方粘虫(SAW，南部灰翅夜蛾)和大豆尺蠖(SBL，大豆夜蛾)的活性。表达TIC13087的大豆植物表现出针对鳞翅目物种玉米螟蛉(CEW，谷实夜蛾)，也称为大豆荚虫(SPW)的活性。表达TIC13085的玉米植物表现出对鳞翅目物种欧洲玉米螟(ECB，大丽花螟蛾)、秋粘虫(FAW，草地夜蛾)和西南玉米螟(SWC，西南玉米杆草螟)的活性。表达TIC13087的玉米植物表现出对鳞翅目物种玉米螟蛉(CEW，谷实夜蛾)、欧洲玉米螟(ECB，大丽花螟蛾)和西南玉米螟(SWC，西南玉米杆草螟)的活性。
对于在植物细胞中的表达，TIC13085(SEQ ID NO:2)和TIC13087(SEQ ID NO:4)蛋白可表达为驻留在胞质溶胶中或靶向植物细胞内的各种亚细胞器。例如，将蛋白靶向至叶绿体或质体可能会导致转基因植物中表达蛋白水平的增加，同时防止出现异常表型。靶向还可使转基因事件中害虫抗性功效的增加。目标肽或转运肽是一条短的(3-70个氨基酸长)肽链，可将蛋白转运至细胞的特定区域，包括细胞核、线粒体、内质网(ER)、叶绿体、质外体、过氧化物酶体和质膜。在蛋白被转运(或输入)至适用的细胞器后，一些目标肽被信号肽酶从蛋白上切下。为了靶向叶绿体，蛋白含有大约40-50个氨基酸的转运肽。有关叶绿体转运肽用途的描述，参见美国专利第5,188,642号和第5,728,925号。许多叶绿体定位蛋白作为前体从核基因表达，并通过N末端定位的叶绿体转运肽(CTP)靶向至叶绿体。此类分离的CTP的实例包括但不限于与相关的那些：核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶的小亚基(SSU)、铁氧还蛋白、铁氧还蛋白氧化还原酶、光捕获复合物蛋白I和蛋白II、硫氧还蛋白F、烯醇丙酮酰莽草酸磷酸合酶(EPSPS)以及美国专利第7,193,133号中描述的转运肽。已经在体内和体外证明，非叶绿体蛋白可通过使用与异源CTP的蛋白融合物而靶向叶绿体，并且CTP足以将蛋白靶向叶绿体。已显示掺入合适的叶绿体转运肽，例如拟南芥EPSPS CTP(CTP2)(参见Klee等人,Mol.Gen.Genet.210:437-442,1987)或矮牵牛(Petunia hybrida)EPSPS CTP(CTP4)(参见della-Cioppa等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:6873-6877,1986)可将异源EPSPS蛋白序列靶向至转基因植物中的叶绿体(参见美国专利第5,627,061号；第5,633,435号；和第5,312,910号；以及EP 0218571；EP 189707；EP 508909；和EP 924299)。为了将TIC13085或TIC13087毒素蛋白靶向至叶绿体，将编码叶绿体转运肽的序列置于可操作地连接的5ˊ，并与编码已设计用于在植物细胞中表达的TIC13085或TIC13087毒素蛋白的合成编码序列同框。
考虑可使用TIC13085和TIC13087的氨基酸序列产生与TIC13085和TIC13087相关的额外毒素蛋白序列，以产生具有新特性的新蛋白。可比对TIC13085和TIC13087毒素蛋白，以将氨基酸序列水平的差异组合成新的氨基酸序列变体，并对编码变体的重组核酸序列进行适当的改变。
本公开进一步考虑可通过使用本领域已知的各种基因编辑方法在植物中工程改造TIC13085和TIC13087蛋白毒素类别的改进变体。用于基因组编辑的此类技术包括但不限于ZFN(锌指核酸酶)、大范围核酸酶、TALEN(转录激活因子样效应核酸酶)和CRISPR(成簇的规律间隔短回文重复序列)/Cas(CRISPR相关)系统。这些基因组编辑方法可用于将植物细胞内转化的毒素蛋白编码序列改变为不同的毒素编码序列。具体而言，通过这些方法，毒素编码序列内的一个或多个密码子被改变以设计新的蛋白氨基酸序列。或者，替换或删除编码序列内的片段，或将额外DNA片段插入编码序列，以设计新的毒素编码序列。新的编码序列可编码具有新特性，例如增加的活性或抗害虫谱的毒素蛋白，以及提供针对其中已经对原始昆虫毒素蛋白产生抗性的害虫物种的活性。包含基因编辑的毒素编码序列的植物细胞可通过本领域已知的方法用于产生表达新毒素蛋白的完整植物。
还考虑TIC13085或TIC13087或其蛋白变体的片段可以是截短形式，其中从蛋白的N末端、C末端、中间或其组合中删除一个或多个氨基酸，其中片段和变体保留昆虫抑制活性。这些片段可以是TIC13085或TIC13087的天然或合成变体或衍生蛋白变体，但至少应保留TIC13085或TIC13087全长毒素蛋白的昆虫抑制活性。
类似于TIC13085或TIC13087蛋白的蛋白可使用本领域已知的各种基于计算机的算法来鉴定和相互比较(参见表1)。本申请中报告的氨基酸序列同一性是使用以下默认参数进行Clustal W比对的结果：权重矩阵：blosum，空位开放罚分：10.0，空位延伸罚分：0.05，亲水空位：开，亲水残基：GPSNDQERK，残基特异性空位罚分：开(Thompson等人(1994)Nucleic Acids Research,22:4673-4680)。氨基酸同一性百分比通过100％乘以(氨基酸同一性/受试蛋白的长度)的乘积进一步计算。其它比对算法在本领域中也是可用的，并且提供与使用Clustal W比对获得的结果相似的结果，并且在本文中被考虑。
如果所述蛋白用于查询，例如在Clustal W比对中，并且如SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:4中所示的本发明的蛋白被鉴定为此类比对中的命中，其中查询蛋白沿查询蛋白的长度表现出至少87％至约100％(即约88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或此范围内的任何分数百分比)的氨基酸同一性，则预期表现出针对鳞翅目昆虫物种的昆虫抑制活性的蛋白与TIC13085或TIC13087相关。
使用Clustal W算法将示例性TIC13085和TIC13087蛋白相互比对。如表1中所报告，创建了每种蛋白的氨基酸序列同一性百分比的成对矩阵。这些毒素蛋白在比对序列的整个长度上表现出82％的氨基酸序列同一性，并且TIC13085中的803个氨基酸中有663个氨基酸与TIC13087中的802个氨基酸在位置上相同。
表1.示例性TIC13085和TIC13087蛋白的成对矩阵显示。
除了氨基酸序列同一性百分比之外，TIC13085和TIC13087还可通过氨基酸序列长度和其它特征相对于一级结构(保守的氨基酸基序)进行比较。TIC13085和TIC13087蛋白毒素的特征报告于表2中。
表2.TIC13085和TIC13087蛋白毒素的选定特征。
如本申请的实施例中进一步描述，编码TIC13085和TIC13087的合成核酸序列被设计用于植物，分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6中所示。
可根据本领域已知的转化方法和技术构建包含重组核酸分子序列的表达盒和载体并将其引入植物，例如玉米、大豆或棉花植物细胞中。例如，农杆菌介导的转化描述于美国专利申请公开案2009/0138985A1(大豆)、2008/0280361A1(大豆)、2009/0142837A1(玉米)、2008/0282432(棉花)、2008/0256667(棉花)、2003/0110531(小麦)、2001/0042257A1(甜菜)、美国专利第5,750,871号(芥花)、第7,026,528号(小麦)和第6,365,807号(水稻)，以及Arencibia等人(1998)Transgenic Res.7:213-222(甘蔗)中。转化细胞可再生为表达TIC13085和TIC13087的转化植物，并通过使用从转化植物获得的植物叶盘在鳞翅目害虫幼虫存在下进行的生物测定证明杀虫活性。植物可通过再生、种子、花粉或分生组织转化技术衍生自植物细胞。转化植物的方法是本领域已知的。
作为传统转化方法的替代方案，可将DNA序列(如转基因，一个或多个表达盒等)经由定点整合插入或整合至植物或植物细胞的基因组内的特定位点或基因座中。因此，本公开的一个或多个重组DNA构建体和一个或多个分子可包含供体模板序列，所述供体模板序列包含至少一种转基因、表达盒或其它DNA序列，以用于插入至植物或植物细胞的基因组中。这种用于定点整合的供体模板还可包含侧接插入序列(即，待被插入至植物基因组中的序列、转基因、盒等)的一个或两个同源臂。本公开的一个或多个重组DNA构建体还可包含一个或多个表达盒，所述表达盒编码位点特异性核酸酶和/或任何一个或多个相关蛋白以进行定点整合。这一个或多个核酸酶表达盒可与供体模板存在于同一分子或载体中(顺式)，或存在于单独的分子或载体中(反式)。用于定点整合的若干方法在本领域中是已知的，这些方法涉及切割基因组DNA以在所需的基因组位点或基因座处产生双链断裂(DSB)或切口的不同的蛋白(或蛋白复合物和/或指导RNA)。简而言之，如本领域所理解，在修复由核酸酶引入的DSB或切口的过程中，供体模板DNA可被整合至DSB或切口的位点处的基因组中。供体模板中一个或多个同源臂的存在可促进在经由同源重组的修复过程中插入序列被采用并被靶向至植物基因组中，尽管插入事件可通过非同源末端连接(NHEJ)发生。可使用的位点特异性核酸酶的实例包括锌指核酸酶、工程化的或天然的大范围核酸酶、TALEN-核酸内切酶和RNA指导的核酸内切酶(例如，Cas9或Cpf1)。对于使用RNA指导的位点特异性核酸酶(例如，Cas9或Cpf1)的方法，所述一个或多个重组DNA构建体还将包含编码一个或多个指导RNA以将核酸酶引导至植物基因组内的所需位点的序列。
编码细菌和植物表达的TIC13085和TIC13087蛋白的重组核酸序列组合物可用重组DNA构建体表达，其中具有编码蛋白的ORF(开放阅读框)的多核苷酸区段与遗传调控/表达元件，例如启动子和在所述构建体预期的系统中受控表达所必需的任何其它调节元件可操作地连接。非限制性实例包括与TIC13085或TIC13087蛋白编码序列可操作地连接以在植物中表达蛋白的植物功能启动子，或与TIC13085或TIC13087蛋白编码序列可操作地连接以在Bt细菌或其它芽孢杆菌属中表达蛋白的Bt功能启动子。其它可与TIC13085或TIC13087蛋白编码序列可操作地连接的元件包括但不限于增强子、操纵子、内含子、未翻译的前导序列、编码的蛋白固定标签(HIS-标签)、易位肽(即质体转运肽、信号肽)、翻译后修饰酶的多肽序列、核糖体结合位点、转录终止子和RNAi靶位点。在此提供的示例性重组多核苷酸分子包括但不限于与例如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的多核苷酸可操作地连接的异源启动子，所述多核苷酸编码具有如SEQ ID NO:2(由SEQ ID NO:1和SEQID NO:5编码)和SEQ ID NO:4(由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:6编码)中所示的氨基酸序列的相应多肽或蛋白。异源启动子也可与编码质体靶向TIC13085或TIC13087的合成DNA编码序列可操作地连接。编码本文公开的蛋白的重组核酸分子的密码子可被同义密码子取代(本领域称为沉默取代)。
包含TIC13085或TIC13087蛋白编码序列的重组DNA构建体还可包含编码一种或多种昆虫抑制剂的DNA区域，所述区域可被配置为与编码TIC13085或TIC13087蛋白、昆虫抑制dsRNA分子、或辅助蛋白的DNA序列同时表达或共表达。辅助蛋白包括但不限于辅助因子、酶、结合伴侣或其它有助于昆虫抑制剂有效性的试剂，例如，通过帮助其表达、影响其在植物中的稳定性、优化低聚自由能、增加其毒性以及增加其活性谱。例如，辅助蛋白可促进一种或多种昆虫抑制剂的摄取，或增强毒性剂的毒性作用。
可组装重组DNA构建体以使得所有蛋白或dsRNA分子都从一个启动子表达，或者每个蛋白或dsRNA分子处于单独的启动子控制或其某种组合之下。本发明的蛋白可从多基因表达系统表达，其中TIC13085或TIC13087中的一者或两者从共同的核苷酸区段表达，所述核苷酸区段还含有其它开放阅读框和启动子，这取决于所选择的表达系统的类型。例如，细菌多基因表达系统可利用单个启动子从单个操纵子内驱动多重连接/串联开放阅读框的表达(即，多顺反子表达)。在另一实例中，植物多基因表达系统可利用多重未连接或连接的表达盒，每个表达盒表达不同的蛋白或其它试剂，例如一个或多个dsRNA分子。
包含TIC13085或TIC13087蛋白编码序列的重组多核苷酸或重组DNA构建体可通过载体，例如质粒、杆状病毒、合成染色体、病毒粒子、粘粒、噬菌粒、噬菌体或病毒载体递送至宿主细胞。此类载体可用于实现TIC13085或TIC13087蛋白编码序列在宿主细胞中的稳定或瞬时表达，或所编码多肽的随后表达。包含TIC13085或TIC13087蛋白编码序列并被引入宿主细胞的外源重组多核苷酸或重组DNA构建体在本申请中称为“转基因”。
本文提供了含有表达TIC13085或TIC13087或相关家族毒素蛋白编码序列中的任何一者或多者的重组多核苷酸的转基因细菌、转基因植物细胞、转基因植物和转基因植物部分。术语“细菌细胞”或“细菌”可包括但不限于农杆菌属、芽孢杆菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属、假单胞菌属、短芽孢杆菌属、克雷伯氏菌属、欧文氏菌属或根瘤菌属细胞。术语“植物细胞”或“植物”可包括但不限于双子叶植物或单子叶植物。术语“植物细胞”或“植物”还可包括但不限于苜蓿、香蕉、大麦、豆类、西兰花、卷心菜、芸苔(例如芥花籽或油菜籽)、胡萝卜、木薯、蓖麻、花椰菜、芹菜、鹰嘴豆、大白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米(包括非甜质玉米和甜玉米)、三叶草、棉花、葫芦、黄瓜、花旗松、茄子、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、啤酒花、韭菜、莴苣、火炬松、粟、甜瓜、坚果、燕麦、橄榄、洋葱、观赏植物、棕榈、牧草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松树、马铃薯、白杨、南瓜、辐射松、萝卜、水稻、砧木、黑麦、红花、灌木、高粱、南方松、大豆、菠菜、倭瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、香枫、甘薯、柳枝稷、茶、烟草、番茄、黑小麦、草坪草、西瓜和小麦植物细胞或植物。在某些实施方案中，提供了转基因植物和从转基因植物细胞再生的转基因植物部分。在某些实施方案中，转基因植物可通过切割、折断、研磨或以其它方式从植物分离所述部分而从转基因种子获得。在某些实施方案中，植物部分可以是种子、铃、叶、花、茎、根或其任何部分，或转基因植物部分的不可再生部分。如本上下文中所用，转基因植物部分的“不可再生”部分是不能被诱导形成整株植物或不能被诱导形成能够进行有性和/或无性繁殖的整株植物的部分。在某些实施方案中，植物部分的不可再生部分是转基因种子、铃、叶、花、茎或根的一部分。
提供了制备包含昆虫、鳞翅目抑制量的TIC13085或TIC13087蛋白的转基因植物的方法。此类植物可通过将编码本申请中提供的任何蛋白的重组多核苷酸引入植物细胞，并选择源自表达昆虫、鳞翅目抑制量的蛋白的所述植物细胞的植物来制备。植物可通过再生、种子、花粉或分生组织转化技术衍生自植物细胞。转化植物的方法是本领域已知的。
本文还公开了加工植物产品，其中加工产品包含可检测量的TIC13085或TIC13087、其昆虫抑制区段或片段、或其任何区别部分。在某些实施方案中，加工产品选自由以下组成的组：植物部分、植物生物质、油、粗粉、糖、动物饲料、面粉、薄片、麸皮、棉绒、壳、加工种子和种子。在某些实施方案中，加工产品是不可再生的。植物产品可包括源自转基因植物或转基因植物部分的商品或其它商业产品，其中商品或其它产品可通过检测编码或包含TIC13085或TIC13087的区别部分的核苷酸区段或表达的RNA或蛋白而通过商业来追踪。
表达TIC13085或TIC13087蛋白的植物可通过与表达其它毒素蛋白和/或表达其它转基因性状(例如除草剂耐受性基因、赋予产量或胁迫耐受性性状的基因等)的转基因事件育种来杂交，或者可在单个堆叠载体中组合此类性状，以便所有特征都相互关联。
如实施例中进一步描述，TIC13085或TIC13087蛋白编码序列和与TIC13085或TIC13087具有显著百分比同一性的序列可使用本领域普通技术人员已知的方法，例如聚合酶链式反应(PCR)、热扩增和杂交来鉴定。例如，蛋白TIC13085或TIC13087可用于产生与相关蛋白特异性结合的抗体，并可用于筛选和寻找其它密切相关的蛋白成员。
此外，编码TIC13085或TIC13087毒素蛋白的核苷酸序列可用作探针和引物，用于筛选以使用热循环或等温扩增和杂交方法鉴定所述类别的其它成员。例如，源自如SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:6所示的序列的寡核苷酸可用于确定源自商品的脱氧核糖核酸样品中TIC13085或TIC13087转基因的存在或不存在。考虑到使用寡核苷酸的某些核酸检测方法的灵敏度，预期源自如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6中所示的序列的寡核苷酸可用于检测源自汇集来源的商品中的TIC13085或TIC13087转基因，其中只有一小部分商品源自含有任何转基因的转基因植物。进一步认识到，此类寡核苷酸可用于在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQID NO:5和SEQ ID NO:6中的每一者中引入核苷酸序列变异。此类“诱变”寡核苷酸可用于鉴定在转基因植物宿主细胞中表现出一系列昆虫抑制活性或不同表达的TIC13085和TIC13087氨基酸序列变体。
核苷酸序列同源物，例如由在严格杂交条件下与本申请中公开的每个或任何序列杂交的核苷酸序列编码的杀昆虫蛋白，也是本发明的一个实施方案。本发明还提供了一种检测与第二核苷酸序列杂交的第一核苷酸序列的方法，其中第一核苷酸序列(或其反向互补序列)编码杀虫蛋白或其杀虫片段并与第二核苷酸序列杂交。在这种情况下，第二核苷酸序列可以是在严格杂交条件下呈现为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ IDNO:6的任何核苷酸序列。核苷酸编码序列在适当杂交条件，例如严格杂交条件下相互杂交，并且由这些核苷酸序列编码的蛋白与针对任何一种其它蛋白产生的抗血清发生交叉反应。如本文定义的严格杂交条件包括至少在42℃下杂交，然后在室温下用2X SSC、0.1％SDS洗涤两次，每次5分钟，然后在65℃下在0.5X SSC、0.1％ SDS中洗涤两次，每次30分钟。在甚至更高温度下的洗涤构成甚至更严格的条件，例如68℃的杂交条件，随后在68℃下在含有0.1％ SDS的2xSSC中洗涤。
本领域技术人员将认识到，由于遗传密码的冗余，许多其它序列能够编码此类相关蛋白，并且那些序列在它们发挥表达芽孢杆菌菌株或植物细胞中的杀虫蛋白的功能的程度上是本发明的实施方案，当然认识到许多这样的冗余编码序列在这些条件下不会与编码TIC13085和TIC13087变体的天然芽孢杆菌序列杂交。本申请考虑了使用本领域普通技术人员已知的这些和其它鉴定方法来鉴定TIC13085和TIC13087变体蛋白编码序列以及与TIC13085和TIC13087变体蛋白编码序列具有相当大的百分比同一性的序列。
本公开还考虑了使用本领域已知的分子方法来工程改造和克隆商业上有用的蛋白，包括来自杀虫蛋白的蛋白嵌合体；例如，嵌合体可由TIC13085或TIC13087蛋白的区段组装得到额外的有用实施方案，包括将TIC13085或TIC13087蛋白区段与不同于TIC13085或TIC13087蛋白和相关蛋白的不同蛋白区段组装。TIC13085或TIC13087蛋白可与其它芽孢杆菌、类芽孢杆菌或其它杀虫蛋白进行比对(无论这些蛋白在系统发育上是否密切相关)，并且可鉴定每个此类蛋白的区段，所述区段可用于比对的蛋白之间的取代，从而构建嵌合蛋白。此类嵌合蛋白可进行害虫生物测定分析，并表征与衍生出嵌合体中每个此类区段的亲本蛋白相比存在或不存在增加的生物活性或扩展的目标害虫谱。通过与其它蛋白交换结构域或区段或通过使用本领域已知的定向进化方法，可进一步工程改造多肽的杀虫活性以使其对特定害虫或更广泛的害虫具有活性。
本申请中公开了用TIC13085或TIC13087蛋白防治昆虫，特别是鳞翅目昆虫侵扰作物植物的方法。此类方法可包括种植包含昆虫或鳞翅目抑制量的TIC13085或TIC13087毒素蛋白的植物。在某些实施方案中，此类方法还可包括以下任何一者或多者：(i)将包含或编码TIC13085或TIC13087毒素蛋白的任何组合物应用于植物或产生植物的种子；以及(ii)用编码TIC13085或TIC13087毒素蛋白的多核苷酸转化植物或产生植物的植物细胞。一般而言，预期可在组合物中、在微生物中或在转基因植物中提供TIC13085或TIC13087毒素蛋白以赋予针对鳞翅目昆虫的昆虫抑制活性。
在某些实施方案中，TIC13085或TIC13087毒素蛋白的重组核酸分子是昆虫抑制组合物的杀昆虫活性成分，所述组合物通过在适合表达TIC13085或TIC13087毒素蛋白的条件下培养重组芽孢杆菌或任何其它经转化以表达TIC13085或TIC13087毒素蛋白的重组细菌细胞来制备。可通过干燥、冻干、均化、提取、过滤、离心、沉淀或浓缩表达/产生所述重组多肽的此类重组细胞的培养物来制备此类组合物。此类过程可产生芽孢杆菌或其它昆虫病原性细菌细胞提取物、细胞悬浮液、细胞匀浆、细胞裂解物、细胞上清液、细胞滤液或细胞团块。通过获得如此产生的重组多肽，包含重组多肽的组合物可包括细菌细胞、细菌孢子和伴孢包涵体，并且可配制用于各种用途，包括作为农业昆虫抑制喷雾产品或作为饮食生物测定中的昆虫抑制配制物。
在一个实施方案中，为了降低抗性发展的可能性，包含TIC13085或TIC13087蛋白的昆虫抑制组合物还可包含至少一种额外多肽，其表现出针对相同鳞翅目昆虫物种的昆虫抑制活性，但不同于TIC13085或TIC13087毒素蛋白。此类组合物的可能的额外多肽包括昆虫抑制蛋白和昆虫抑制dsRNA分子。使用此类核糖核苷酸序列防治害虫的一个实例描述于Baum等人(美国专利公开案2006/0021087A1)中。用于防治鳞翅目害虫的此类额外多肽可选自由以下组成的组：昆虫抑制蛋白，例如但不限于Cry1A(美国专利第5,880,275号)、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1A.105、Cry1Ae、Cry1B(美国专利公开案第10/525,318号)、Cry1C(美国专利第6,033,874号)、Cry1D、Cry1Da和其变体、Cry1E、Cry1F和Cry1A/F嵌合体(美国专利第7,070,982号；第6,962,705号和第6,713,063号)、Cry1G、Cry1H、Cry1I、Cry1J、Cry1K、Cry1L、Cry1型嵌合体，例如但不限于TIC836、TIC860、TIC867、TIC869和TIC1100(国际申请公开案WO2016/061391(A2))、TIC2160(国际申请公开案WO2016/061392(A2))、Cry2A、Cry2Ab(美国专利第7,064,249号)、Cry2Ae、Cry4B、Cry6、Cry7、Cry8、Cry9、Cry15、Cry43A、Cry43B、Cry51Aa1、ET66、TIC400、TIC800、TIC834、TIC1415、Vip3A、VIP3Ab、VIP3B、AXMI-001、AXMI-002、AXMI-030、AXMI-035和AXMI-045(美国专利公开案第2013-0117884A1号)、AXMI-52、AXMI-58、AXMI-88、AX MI-97、AXMI-102、AXMI-112、AXMI-117、AXMI-100(美国专利公开案第2013-0310543A1号)、AXMI-115、AXMI-113、AXMI-005(美国专利公开案第2013-0104259A1号)、AXMI-134(美国专利公开案第2013-0167264A1号)、AXMI-150(美国专利公开案2010-0160231A1)、AXMI-184(美国专利公开案2010-0004176A1)、AXMI-196、AXMI-204、AXMI-207、AXMI-209(美国专利公开案2011-0030096A1)、AXMI-218、AXMI-220(美国专利公开案2014-0245491A1)、AXMI-221z、AX MI-222z、AXMI-223z、AXMI-224z、AXMI-225z(美国专利公开案2014-0196175A1)、AXMI-238(美国专利公开案2014-0033363A1)、AX MI-270(美国专利公开案2014-0223598A1)、AXMI-345(美国专利公开案2014-0373195A1)、AXMI-335(国际申请公开案WO2013/134523(A2))、DIG-3(美国专利公开案2013-0219570A1)、DIG-5(美国专利公开案2010-0317569A1)、DIG-11(美国专利公开案2010-0319093A1)、Af IP-1A和其衍生物(美国专利公开案2014-0033361A1)、AfIP-1B和其衍生物(美国专利公开案2014-0033361A1)、PIP-1APIP-1B(美国专利公开案2014-0007292A1)、PSEEN3174(美国专利公开案2014-0007292A1)、AECFG-592740(美国专利公开案2014-0007292A1)、Pput_1063(美国专利公开案2014-0007292A1)、DIG-657(国际申请公开案WO2015/195594A2)、Pput_1064(美国专利公开案2014-0007292A1)、GS-135和其衍生物(美国专利公开案2012-0233726A1)、GS153和其衍生物(美国专利公开案2012-0192310A1)、GS154和其衍生物(美国专利公开案2012-0192310A1)、GS155和其衍生物(美国专利公开案2012-0192310A1)、美国专利公开案2012-0167259A1中所述的SEQ ID NO:2和其衍生物、美国专利公开案2012-0047606A1中所述的SEQ ID NO:2和其衍生物、美国专利公开案2011-0154536A1中所述的SEQ ID NO:2和其衍生物、美国专利公开案2011-0112013A1中所述的SEQ ID NO:2和其衍生物、美国专利公开案2010-0192256A1中所述的SEQ ID NO:2和4和其衍生物、美国专利公开案2010-0077507A1中所述的SEQ ID NO:2和其衍生物、美国专利专利公开案2010-0077508A1中所述的SEQ IDNO:2和其衍生物、美国专利公开2009-0313721A1中所述的SEQ ID NO:2和其衍生物、美国专利公开案2010-0269221A1中所述的SEQ ID NO:2或4和其衍生物、美国专利第7,772,465(B2)号中所述的SEQ ID NO:2和其衍生物、WO2014/008054A2中所述的CF161_0085和其衍生物、美国专利公开案US2008-0172762A1、US2011-0055968A1和US2012-0117690A1中所述的鳞翅目毒性蛋白和其衍生物；US7510878(B2)中所述的SEQ ID NO:2或4和其衍生物、美国专利第7812129(B1)号中所述的SEQ ID NO:2或4和其衍生物；IPD110Aa和同源物(国际申请公开案WO2019/178038A2)；TIC868(美国专利US10233217)、Cry1Da1_7(美国专利US10059959)、BCW003(美国专利US10703782)、TIC1100(美国专利US10494408)、TIC867(美国专利US10669317)、TIC867_23(美国专利US10611806)、TIC6757(美国专利US10155960)、TIC7941(美国专利公开案2020-0229445A1)、对鳞翅目物种有毒的蕨类毒素，例如美国专利10,227,608中公开的那些，等等。
在其它实施方案中，此类组合物/配制物还可包含至少一种额外多肽，其对不被本发明的其它昆虫抑制蛋白抑制的昆虫表现出昆虫抑制活性以扩展获得的昆虫抑制谱。例如，为了防治半翅目害虫，本发明的昆虫抑制蛋白的组合可与半翅目活性蛋白，例如TIC1415(美国专利公开案2013-0097735A1)、TIC807(美国专利第8609936号)、TIC834(美国专利公开案2013-0269060A1)、AXMI-036(美国专利公开案2010-0137216A1)和AXMI-171(美国专利公开案2013-0055469A1)一起使用。此外，用于防治鞘翅目害虫的多肽可选自由以下组成的组：昆虫抑制蛋白，例如但不限于Cry3Bb(美国专利第6,501,009号)、Cry1C变体、Cry3A变体、Cry3、Cry3B、Cry34/35、5307、AXMI134(美国专利公开案2013-0167264A1)、AXMI-184(美国专利公开案2010-0004176A1)、AXM I-205(美国专利公开案2014-0298538A1)、AXMI-207(美国专利公开案2013-0303440A1)、AXMI-218、AXMI-220(美国专利公开案20140245491A1)、AXMI-221z、AXMI-223z(美国专利公开案2014-0196175A1)、AXMI-279(美国专利公开案2014-0223599A1)、AXMI-R1和其变体(美国专利公开案2010-0197592A1)、TIC407、TIC417、TIC431、TIC807、TIC853、TIC901、TIC1201、TIC3131、DIG-10(美国专利公开案2010-0319092A1)、eHIPs(美国专利申请公开案第2010/0017914号)、IP3和其变体(美国专利公开案2012-0210462A1)、假单胞菌毒素IDP072Aa(美国专利申请公开案第2014/055128号)和ω己毒素-Hv1a(美国专利申请公开案US2014-0366227A1)。
可与TIC13085和TIC13087类昆虫抑制蛋白组合的用于防治鞘翅目、鳞翅目和半翅目害虫的额外多肽可在Neil Crickmore维护的苏云金芽孢杆菌毒素命名法网站上(在万维网上的btnomenclature.info)找到。广泛地，考虑了本领域普通技术人员已知的任何昆虫抑制蛋白可与TIC13085或TIC13087家族蛋白在植物中(通过育种或分子堆积组合)或在组合物或配制物中组合用作生物杀虫剂或生物杀虫剂的组合。
昆虫对某些杀昆虫剂产生抗药性的可能性在本领域中已有记载。一种昆虫抗性管理策略是使用表达两种不同昆虫抑制剂的转基因作物，所述昆虫抑制剂通过不同的作用模式起作用。因此，任何对其中一种昆虫抑制剂具有抗性的昆虫都可以通过另一种昆虫抑制剂来防治。另一种昆虫抗性管理策略使用未被保护免受目标鳞翅目害虫物种侵害的植物，为此类未受保护的植物提供避难所。一个特定实例描述于美国专利第6,551,962号中，所述专利的全部内容以引用的方式并入。
其它实施方案，例如设计用于防治也受本文公开的蛋白防治的害虫的局部应用杀虫化学品可直接应用于土壤(土壤灌溉)，应用于表达本文公开的蛋白的生长植物，或配制以应用于含有编码一种或多种公开的蛋白的一种或多种转基因的种子，所述化学品与蛋白一起用于种子处理、喷洒、滴沥或擦拭配制物中。用于种子处理的此类配制物可与本领域已知的各种粘合剂和增粘剂一起施用。此类配制物可含有在作用方式上与公开的蛋白具有协同作用的杀虫剂，使得配制物杀虫剂通过不同的作用方式起作用以防治可由公开的蛋白防治的相同或相似的害虫，或者此类杀虫剂用于防治范围更广的宿主范围内的害虫或TIC13085和TIC13087杀虫蛋白无法有效防治的植物害虫物种。
前述组合物/配制物可进一步包含农业上可接受的载体，例如诱饵、粉末、粉尘、团块、颗粒、喷雾、乳液、胶体悬浮液、水溶液、芽孢杆菌孢子/晶体制剂、种子处理剂、转化以表达一种或多种蛋白的重组植物细胞/植物组织/种子/植物、或转化以表达一种或多种蛋白的细菌。根据重组多肽固有的昆虫抑制或杀昆虫抑制水平和应用于植物或饮食测定的配制物水平，组合物/配制物可包括各种重量的重组多肽，例如0.0001％至0.001％至0.01％至1％至99％重量的重组多肽。
综上所述，本领域技术人员应理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可对所公开的具体方面进行改变并且仍然获得相同或相似的结果。因此，本文公开的具体结构和功能细节不应被解释为限制性的。应理解，本文引用的每篇参考文献的全部公开内容都并入本申请的公开内容中。
实施例
实施例1
TIC13085和TIC13087的发现、克隆和表达
一种编码新型苏云金芽孢杆菌(Bt)杀虫蛋白的序列已被鉴定、克隆、序列确认并在昆虫生物测定中进行了测试。杀虫蛋白TIC13085是从收集自爱达荷州杰纳西的麦田的土壤的板刮片宏基因组测序工作的Bt中鉴定和分离的。杀虫蛋白TIC13087是从收集自北达科他州阿什利的麦田的土壤的板刮片宏基因组测序工作的Bt中鉴定和分离的。用于宏基因组板刮片的环境样品经过处理以富集内生孢子形成细菌，并以每板大约100个菌落的密度接种。培养后，刮板以提供每个板的DNA样品。对DNA样品进行测序和组装，以使用pFam分析和与已知昆虫毒素的同源性来寻找潜在的杀昆虫蛋白。新型TIC13085和TIC13087蛋白被鉴定为属于Vip3毒素蛋白类别。TIC13085和TIC13087分别与源自解硫胺素类芽孢杆菌(Paenibacillus thiaminolyticus)的登录号WP_119791737具有87.20％和84.69％的同一性。登录号WP_119791737的蛋白对黑地老虎(小地老虎)、玉米螟蛉(谷实夜蛾)、秋粘虫(FAW，草地贪夜蛾)、甜菜夜蛾(甜菜斜纹夜蛾)和烟草夜蛾(烟芽夜蛾)表现出杀昆虫活性(Estruch等人(1996)Vip3A,a novel Bacillus thuringiensis vegetativeinsecticidal protein with awide spectrum of activities against Lepidopteraninsects.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:5389-5394)。
使用本领域已知的方法克隆和/或合成TIC13085和TIC13087编码序列，并将其引入大肠埃希氏菌(Ec)表达载体中，与Ec可表达启动子和编码用于蛋白纯化的一系列连续组氨酸氨基酸残基(即，组氨酸或“HIS”标签)的序列有效连接。TIC13085和TIC13087的蛋白制剂用于生物测定。
实施例2
TIC13085和TIC13087在昆虫生物测定中证明了鳞翅目活性
杀虫蛋白TIC13085和TIC13087在Ec中表达，并测定了对各种鳞翅目物种的毒性。还测定了TIC13085和TIC13087对各种鞘翅目和半翅目物种的毒性。
测定了TIC13085和TIC13087对以下各者的毒性：鳞翅目昆虫物种黑地老虎(BCW，小地老虎)、玉米螟蛉(CEW，谷实夜蛾，也称为大豆荚虫)、秋粘虫(FAW，草地贪夜蛾)、南方粘虫(SAW，南部灰翅夜蛾)、大豆尺蠖(SBL，大豆夜蛾)、和西南玉米螟(SWC，西南玉米杆草螟)；鞘翅目物种西部玉米根虫(WCR，玉米根萤叶甲)；和半翅目物种新热带褐臭虫(NBSB，英雄美洲蝽(Euschistus heros))。使用重组微生物宿主细胞衍生的TIC13085蛋白的生物测定证明了对鳞翅目物种FAW、SBL和SWC的活性。使用微生物宿主细胞衍生的TIC13087蛋白的生物测定证明了对鳞翅目物种BCW、CEW和SWC的活性。
实施例3
用于植物内表达的TIC13085和TIC13087的合成编码序列。
合成(人工)编码序列被设计用于在编码TIC13085和TIC13087的植物细胞中表达。
合成序列是根据美国专利5,500,365中一般描述的方法合成的，以避免某些有害的问题序列，例如富含ATTTA和A/T的植物聚腺苷酸化序列，同时保留天然芽孢杆菌蛋白的氨基酸序列。植物合成编码序列是为TIC13085(SEQ ID NO:5)和TIC13087(SEQ ID NO:6)设计的。
使用本领域已知的技术将编码TIC13085和TIC13087的每个合成编码序列引入植物转化载体中。用于转化大豆植物的所得转化载体包含用于表达TIC13085或TIC13087杀虫蛋白的第一转基因盒，其包含可操作地连接至前导子的5ˊ的组成型启动子，所述前导子可操作地连接至编码TIC13085或TIC13087的合成编码序列的5ˊ，这反过来可操作地连接至3ˊUTR的5ˊ；和第二转基因盒，其用于使用大观霉素选择来选择转化的植物细胞。用于转化玉米植物的所得转化载体包含用于表达TIC13085或TIC13087杀虫蛋白的第一转基因盒，其包含可操作地连接至前导子的5ˊ的组成型启动子，所述前导子可操作地连接至内含子的5ˊ，所述内含子可操作地连接至编码TIC13085或TIC13087的合成编码序列的5ˊ，这反过来可操作地连接至3ˊUTR的5ˊ；和第二转基因盒，其用于使用草甘膦选择来选择转化的植物细胞。
实施例4
当在稳定转化的大豆植物中表达时，TIC13085和TIC13087蛋白赋予鳞翅目毒性活性
使用本领域已知的方法克隆包含设计成表达TIC13085和TIC13087杀虫蛋白的转基因盒的二元植物转化载体。所得载体用于稳定转化大豆植物。从转化体收获组织并用于针对各种鳞翅目昆虫物种的昆虫生物测定。
使用农杆菌介导的转化方法，如实施例3中所述地用二元转化载体转化大豆植物。通过本领域已知的方法诱导转化的细胞形成植物。使用植物叶盘进行的生物测定类似于美国专利第8,344,207号中描述的那些。将一只不到一天大的新孵化的新生幼虫放在每个叶盘样品上，并允许喂养大约四天。使用未转化的大豆植物获得组织以用作阴性对照。针对秋粘虫(FAW，草地贪夜蛾)、南方粘虫(SAW，南部灰翅夜蛾)、大豆尺蠖(SBL，大豆夜蛾)和大豆荚虫(SPW，谷实夜蛾)评估来自每个二元载体的多重转化R0单拷贝插入事件。用TIC13085转化的R0大豆植物表现出针对FAW、SBL和SAW的活性。用TIC13087转化的R0大豆植物表现出针对SPW的活性。
允许表达TIC13085和TIC13087的所选R0大豆植物自花授粉并产生R1大豆种子。表达TIC13085的R1大豆植物针对SAW、SBL和VBC进行了测定。表达TIC13085的R1大豆植物针对SBL、SPW和VBC进行了测定。表达TIC13085的R1大豆植物表现出针对SAW、SBL和VBC的活性。表达TIC13087的R1大豆植物表现出针对VBC和SPW的活性。
实施例5
在稳定转化的玉米植物中表达的TIC13085和TIC13087赋予鳞翅目毒性活性
使用本领域已知的方法克隆包含设计成表达TIC13085和TIC13087杀虫蛋白的转基因盒的二元植物转化载体。所得载体用于稳定转化玉米植物。从转化体收获组织并用于针对各种鳞翅目昆虫物种的昆虫生物测定。
使用农杆菌介导的转化方法，如实施例3中所述地用二元转化载体转化玉米植物。通过本领域已知的方法诱导转化的细胞形成植物。使用植物叶盘进行的生物测定类似于美国专利第8,344,207号中描述的那些。将一只不到一天大的新孵化的新生幼虫放在每个叶盘样品上，并允许喂养大约四天。使用未转化的玉米植物获得组织以用作阴性对照。针对玉米螟(CEW，谷实夜蛾)、欧洲玉米螟(ECB，大丽花螟蛾)、秋粘虫(FAW，草地贪夜蛾)、西南玉米螟(SWC，西南玉米杆草螟)和黑地老虎(BCW，小地老虎)评估来自每个二元载体的多重转化R0单拷贝插入事件。从插入植物中的单个重组构建体表达TIC13085的R0玉米植物表现出抗FAW、ECB和SWC的活性。从插入植物中的单个重组构建体表达TIC13087的R0玉米植物表现出抗CEW、ECB、SWC和BCW的活性。
将选择的表达TIC13087的R0玉米植物与非转基因优良玉米植物杂交。对表达TIC13087的所得F1杂合植物进行了抗黑地老虎(BCW，小地老虎)的测定。表达TIC13087的F1杂合植物表现出抗BCW的活性。
按照本公开内容不需要过度实验可制得和执行本文公开和要求保护的所有组合物。虽然本发明的组合物已根据前述说明性实施方案进行了描述，但对于本领域技术人员将显而易见的是，在不背离本发明的真正概念、精神和范围的情况下，可将变化、改变、修改和更改应用于本文所述的组合物。更确切地，将显而易见的是化学和生理学相关的某些药剂可替代本文所述的药剂，同时将实现相同或相似的结果。对本领域技术人员来说显而易见的所有这些类似的替代和修改均被认为是在附加的权利要求书所定义的本发明的精神、范围和概念内。
本说明书中引用的所有出版物和公开的专利文件均以引用的方式并入本文中，其程度如同每个单独的出版物或专利申请都具体且单独地指示以引用的方式并入一般。

Claims (28)

1.一种重组核酸分子，所述重组核酸分子包含与编码杀虫蛋白或其杀虫片段的多核苷酸区段可操作地连接的异源启动子，其中任选地：
a.所述杀虫蛋白包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
b.所述杀虫蛋白包含与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4具有至少88％、或90％、或95％、或98％、或99％、或约100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；或
c.所述多核苷酸区段在严格杂交条件下与具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:6的核苷酸序列的多核苷酸杂交。
2.如权利要求1所述的重组核酸分子，其中：
a.所述重组核酸分子在植物细胞中表达以产生杀虫有效量的所述杀虫蛋白或杀虫片段；或
b.所述重组核酸分子与载体可操作地连接，并且所述载体选自由质粒、噬菌粒、杆粒、粘粒和细菌或酵母人工染色体组成的组。
3.如权利要求1所述的重组核酸分子，所述重组核酸分子存在于宿主细胞内，其中所述宿主细胞选自由细菌细胞和植物细胞组成的组。
4.如权利要求3所述的重组核酸分子，其中所述细菌宿主细胞来自选自由以下组成的组的细菌属：农杆菌属、根瘤菌属、芽孢杆菌属、短芽孢杆菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属、克雷伯氏菌属、泛菌属和欧文氏菌属。
5.如权利要求4所述的重组核酸分子，其中所述芽孢杆菌属是蜡样芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌，所述短芽胞杆菌属是侧孢短芽胞杆菌，并且所述埃希氏菌属是大肠埃希氏菌。
6.如权利要求2所述的重组核酸，其中所述植物细胞是双子叶植物或单子叶植物细胞。
7.如权利要求6所述的重组核酸，其中所述植物细胞选自由以下组成的组：苜蓿、香蕉、大麦、豆类、西兰花、卷心菜、芸苔、芥花籽、胡萝卜、木薯、蓖麻、花椰菜、芹菜、鹰嘴豆、大白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米(包括非甜质玉米和甜玉米)、三叶草、棉花、葫芦、黄瓜、花旗松、茄子、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、啤酒花、韭菜、莴苣、火炬松、粟、甜瓜、坚果、燕麦、橄榄、洋葱、观赏植物、棕榈、牧草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松树、马铃薯、白杨、南瓜、辐射松、萝卜、油菜籽、水稻、砧木、黑麦、红花、灌木、高粱、南方松、大豆、菠菜、倭瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、香枫、甘薯、柳枝稷、茶、烟草、番茄、黑小麦、草坪草、西瓜和小麦植物细胞。
8.如权利要求1所述的重组核酸分子，其中所述蛋白表现出针对鳞翅目害虫的杀昆虫活性。
9.如权利要求8所述的重组核酸分子，其中所述鳞翅目害虫选自由以下组成的组：黑地老虎(小地老虎)、玉米螟蛉(谷实夜蛾)、欧洲玉米螟(大丽花螟蛾)、秋粘虫(草地贪夜蛾)、南方粘虫(南部灰翅夜蛾)、西南玉米螟(西南玉米杆草螟)和大豆尺蠖(大豆夜蛾)。
10.一种包含权利要求1所述的重组核酸分子的植物或其一部分，其中在所述植物的细胞内产生杀虫有效量的杀虫蛋白或其杀虫片段。
11.如权利要求10所述的植物，其中所述植物是单子叶植物或双子叶植物或其一部分。
12.如权利要求10所述的植物，其中所述植物选自由以下组成的组：苜蓿、香蕉、大麦、豆类、西兰花、卷心菜、芸苔、芥花籽、胡萝卜、木薯、蓖麻、花椰菜、芹菜、鹰嘴豆、大白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米(包括非甜质玉米和甜玉米)、三叶草、棉花、葫芦、黄瓜、花旗松、茄子、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、啤酒花、韭菜、莴苣、火炬松、粟、甜瓜、坚果、燕麦、橄榄、洋葱、观赏植物、棕榈、牧草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松树、马铃薯、白杨、南瓜、辐射松、萝卜、油菜籽、水稻、砧木、黑麦、红花、灌木、高粱、南方松、大豆、菠菜、倭瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、香枫、甘薯、柳枝稷、茶、烟草、番茄、黑小麦、草坪草、西瓜和小麦。
13.一种由权利要求10所述的植物产生的种子，其中所述种子包含所述重组核酸分子。
14.一种包含权利要求1所述的重组核酸分子的昆虫抑制组合物。
15.如权利要求14所述的昆虫抑制组合物，所述昆虫抑制组合物还包含编码不同于所述杀虫蛋白或其杀虫片段的杀虫剂的核苷酸序列。
16.如权利要求15所述的昆虫抑制组合物，其中所述杀虫剂选自由昆虫抑制蛋白、昆虫抑制dsRNA分子、化学分子和辅助蛋白组成的组，其中所述杀虫剂对与所述杀虫蛋白或其杀虫片段相同的害虫有毒。
17.如权利要求15所述的昆虫抑制组合物，其中所述杀虫剂表现出针对鳞翅目、鞘翅目或半翅目的一种或多种害虫物种的活性。
18.如权利要求15所述的昆虫抑制组合物，其中所述杀虫剂选自由以下组成的组：Cry1A、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1A.105、Cry1Ae、Cry1B、Cry1C、Cry1C变体、Cry1D、Cry1E、Cry1F、Cry1A/F嵌合体、Cry1G、Cry1H、Cry1I、Cry1J、Cry1K、Cry1L、Cry2A、Cry2Ab、Cry2Ae、Cry3、Cry3A变体、Cry3B、Cry4B、Cry6、Cry7、Cry8、Cry9、Cry15、Cry34、Cry35、Cry43A、Cry43B、Cry51Aa1、ET29、ET33、ET34、ET35、ET66、ET70、TIC400、TIC407、TIC417、TIC431、TIC800、TIC807、TIC834、TIC853、TIC900、TIC901、TIC1201、TIC1415、TIC2160、TIC3131、TIC836、TIC860、TIC867、TIC869、TIC1100、VIP3A、VIP3B、VIP3Ab、AXMI-88、AXMI-97、AXMI-102、AXMI-112、AXMI-117、AXMI-100、AXMI-115、AXMI-113和AXMI-005、AXMI134、AXMI-150、AXMI-171、AXMI-184、AXMI-196、AXMI-204、AXMI-207、AXMI-209、AXMI-205、AXMI-218、AXMI-220、AXMI-221z、AXMI-222z、AXMI-223z、AXMI-224z和AXMI-225z、AXMI-238、AXMI-270、AXMI-279、AXMI-345、AXMI-335、AXMI-R1和其变体、IP3和其变体、DIG-3、DIG-5、DIG-10、DIG-657、DIG-11蛋白、IDP102Aa和其同源物、IDP110Aa和其同源物、TIC868、Cry1Da1_7、BCW003、TIC1100、TIC867、TIC867_23、TIC6757、TIC7941、IDP072Aa、TIC5290、TIC3668、TIC3669、TIC3670、IDP103和其同源物、PIP-50和PIP-65以及其同源物、PIP-83和其同源物、以及Cry1B.34。
19.如权利要求14所述的昆虫抑制组合物，所述昆虫抑制组合物定义为包含表达来自权利要求1所述的重组核酸分子的所述杀虫蛋白的植物细胞。
20.一种由权利要求10所述的植物或其部分生产的商品，其中所述商品包含可检测量的所述重组核酸分子、所述杀虫蛋白或其杀虫片段。
21.如权利要求20所述的商品，所述商品选自由以下组成的组：用谷物处理机装袋的商品玉米、玉米片、玉米饼、玉米粉、玉米面、玉米糖浆、玉米油、玉米青贮、玉米淀粉、玉米谷物等，以及相应的大豆、大米、小麦、高粱、木豆、花生、水果、甜瓜和蔬菜商品，包括适用情况下的果汁、浓缩物、果酱、果冻、果子酱和含有可检测量的本申请的此类多核苷酸和或多肽的此类商品的其它可食用形式、完整或加工的棉籽、棉油、棉绒、加工成饲料或食品、纤维、纸、生物质和燃料产品如源自棉油的燃料或源自轧棉机废料的粒料的种子和植物部分、完整或加工的大豆种子、大豆油、大豆蛋白、大豆粕、大豆粉、大豆片、大豆麸、大豆乳、大豆干酪、大豆酒、包含大豆的动物饲料、包含大豆的纸、包含大豆的乳脂、大豆生物质以及使用大豆植物和大豆植物部分生产的燃料产品。
22.一种产生包含权利要求1所述的重组核酸分子的后代种子的方法，所述方法包括：
a.种植包含所述重组核酸分子的第一种子；
b.从步骤a的所述种子生长出植物；以及
c.从所述植物收获所述后代种子，其中所收获的种子包含所述重组核酸分子。
23.一种抗昆虫侵扰的植物，其中所述植物的细胞包含权利要求1所述的重组核酸分子。
24.一种用于防治鳞翅目物种害虫侵扰的方法，所述方法包括：
a.使所述害虫与杀昆虫有效量的具有如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的杀虫蛋白接触；或
b.使所述害虫与杀昆虫有效量的一种或多种杀虫蛋白接触，所述杀虫蛋白包含与SEQID NO:2或SEQ ID NO:4具有至少88％、或90％、或95％、或98％、或99％、或约100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
25.一种检测包含植物基因组DNA的样品中权利要求1所述的重组核酸分子的存在的方法，所述方法包括：
a.使所述样品与核酸探针接触，所述核酸探针在严格杂交条件下与来自包含权利要求1所述的重组核酸分子的植物的基因组DNA杂交，并且在此类杂交条件下不与来自不包含权利要求1所述的重组核酸分子的其它等基因植物的基因组DNA杂交，其中所述探针与SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:6；或编码杀虫蛋白的序列同源或互补，所述杀虫蛋白包含与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4具有至少88％、或90％、或95％、或98％、或99％、或约100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；
b.使所述样品和所述探针经受严格杂交条件；以及
c.检测所述核酸探针与所述重组核酸分子的杂交。
26.一种检测包含蛋白的样品中杀虫蛋白或其片段的存在的方法，其中所述杀虫蛋白包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列；或所述杀虫蛋白包含与SEQ ID NO:2或SEQID NO:4具有至少88％、或90％、或95％、或98％、或99％、或约100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；所述方法包括：
a.使所述样品与免疫反应性抗体接触；以及
b.检测所述杀虫蛋白或其片段的存在。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述检测步骤包括ELISA或蛋白质印迹。
28.一种杀昆虫有效量的蛋白，所述蛋白包含如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列。
CN202180088459.XA 2020-12-31 2021-12-23 新型昆虫抑制蛋白 Pending CN116848250A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063132877P 2020-12-31 2020-12-31
US63/132,877 2020-12-31
PCT/US2021/065096 WO2022146874A1 (en) 2020-12-31 2021-12-23 Novel insect inhibitory proteins

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116848250A true CN116848250A (zh) 2023-10-03

Family

ID=82259642

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180088459.XA Pending CN116848250A (zh) 2020-12-31 2021-12-23 新型昆虫抑制蛋白

Country Status (14)

Country Link
US (1) US11673922B2 (zh)
EP (1) EP4271188A1 (zh)
KR (1) KR20230127241A (zh)
CN (1) CN116848250A (zh)
AR (1) AR124533A1 (zh)
AU (1) AU2021412979A1 (zh)
CA (1) CA3206691A1 (zh)
CL (1) CL2023001850A1 (zh)
CO (1) CO2023008716A2 (zh)
CR (1) CR20230292A (zh)
MX (1) MX2023007858A (zh)
PE (1) PE20240230A1 (zh)
UY (1) UY39599A (zh)
WO (1) WO2022146874A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117965394A (zh) * 2024-03-28 2024-05-03 中国农业科学院植物保护研究所 一种用于防治草地贪夜蛾和番茄潜叶蛾的苏云金芽孢杆菌

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024123727A1 (en) * 2022-12-07 2024-06-13 Monsanto Technology Llc Novel insect inhibitory proteins
CN117003842B (zh) * 2023-10-07 2023-12-12 莱肯生物科技(海南)有限公司 控制斜纹夜蛾害虫的方法

Family Cites Families (81)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0189707B1 (en) 1984-12-28 1993-08-25 Plant Genetic Systems N.V. Recombinant dna which can be introduced into plant cells
NZ217113A (en) 1985-08-07 1988-06-30 Monsanto Co Production of eucaryotic plants which are glyphosate resistant, vectors (transformation and expression), chimeric gene and plant cells
US5750871A (en) 1986-05-29 1998-05-12 Calgene, Inc. Transformation and foreign gene expression in Brassica species
US5312910A (en) 1987-05-26 1994-05-17 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase
ATE206462T1 (de) 1989-02-24 2001-10-15 Monsanto Technology Llc Synthetische pflanzengene und verfahren zu ihrer herstellung
US5633435A (en) 1990-08-31 1997-05-27 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases
FR2673643B1 (fr) 1991-03-05 1993-05-21 Rhone Poulenc Agrochimie Peptide de transit pour l'insertion d'un gene etranger dans un gene vegetal et plantes transformees en utilisant ce peptide.
ES2163400T3 (es) 1991-05-15 2002-02-01 Monsanto Technology Llc Metodo de creacion de una planta de arroz transformada.
TR199800294T1 (xx) 1996-06-21 1999-10-21 Monsanto Company Sabit transforme edilen verimli bu�day �retim y�ntemleri.
US6017534A (en) 1996-11-20 2000-01-25 Ecogen, Inc. Hybrid Bacillus thuringiensis δ-endotoxins with novel broad-spectrum insecticidal activity
US6713063B1 (en) 1996-11-20 2004-03-30 Monsanto Technology, Llc Broad-spectrum δ-endotoxins
US5942664A (en) 1996-11-27 1999-08-24 Ecogen, Inc. Bacillus thuringiensis Cry1C compositions toxic to lepidopteran insects and methods for making Cry1C mutants
US6489542B1 (en) 1998-11-04 2002-12-03 Monsanto Technology Llc Methods for transforming plants to express Cry2Ab δ-endotoxins targeted to the plastids
US6501009B1 (en) 1999-08-19 2002-12-31 Monsanto Technology Llc Expression of Cry3B insecticidal protein in plants
EP1235921B1 (en) 1999-12-07 2007-03-14 Monsanto Technology LLC Sugarbeet regeneration and transformation
US6551962B1 (en) 2000-10-06 2003-04-22 Monsanto Technology Llc Method for deploying a transgenic refuge
AU2002312285A1 (en) 2001-07-19 2003-03-03 Monsanto Technology Llc A novel method for the production of transgenic plants
US20060112447A1 (en) 2002-08-29 2006-05-25 Bogdanova Natalia N Nucleotide sequences encoding cry1bb proteins for enhanced expression in plants
EP2402441A1 (en) 2004-04-09 2012-01-04 Monsanto Technology, LLC Compositions and methods for control of insect infestations in plants
CA2734716A1 (en) 2004-06-09 2005-12-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plastid transit peptides
MX2007012147A (es) 2005-04-01 2008-03-12 Athenix Corp Axmi-027, axmi-036 y axmi-038, una familia de genes delta-endotoxina y metodos para su uso.
AP2519A (en) 2005-08-31 2012-11-29 Monsanto Technology Llc Nucleotide sequences encoding insecticidal proteins
MX2009000774A (es) 2006-07-21 2009-02-17 Pioneer Hi Bred Int Gen novedoso de bacillus thuringiensis con actividad lepidoptera.
CA2658677C (en) 2006-07-21 2014-04-22 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity
CN102977196B (zh) 2006-12-08 2016-03-16 先锋高级育种国际公司 新苏云金芽孢杆菌晶体多肽、多核苷酸及其组合物
AU2008226448B2 (en) 2007-03-09 2013-05-02 Monsanto Technology Llc Method of meristem excision and transformation
RU2497830C2 (ru) 2007-03-28 2013-11-10 Зингента Партисипейшнс Аг Гибридный инсектицидный белок, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая такой белок, трансгенные растения и их семена, содержащие такой белок, способ получения белка и его применение
US8609936B2 (en) 2007-04-27 2013-12-17 Monsanto Technology Llc Hemipteran-and coleopteran active toxin proteins from Bacillus thuringiensis
US7947869B2 (en) 2007-05-08 2011-05-24 Monsanto Technology Llc Methods for inducing cotton embryogenic callus
US7772465B2 (en) 2007-06-26 2010-08-10 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity
BRPI0815980A2 (pt) 2007-08-31 2015-06-16 Monsanto Technology Llc Métodos e aparelhos para isolar substancialmente tecidos de planta
US8283524B2 (en) 2008-05-15 2012-10-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc Bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity
WO2009151748A1 (en) 2008-06-11 2009-12-17 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity
NZ602352A (en) 2008-06-25 2014-06-27 Athenix Corp Toxin genes and methods for their use
PE20140867A1 (es) 2008-07-02 2014-07-19 Athenix Corp Axmi-115, axmi-113, axmi-005, axmi-163 y axmi-184: proteinas insecticidas y metodos para su uso
US8445749B2 (en) 2008-09-19 2013-05-21 Pioneer Hi Bred International Inc Bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity
US20100077507A1 (en) 2008-09-22 2010-03-25 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel Bacillus Thuringiensis Gene with Lepidopteran Activity
CA2747812A1 (en) 2008-12-22 2010-07-01 Athenix Corporation Pesticidal genes from brevibacillus and methods for their use
ES2534581T3 (es) 2008-12-23 2015-04-24 Athenix Corporation Gen AXMI-150 de la delta-endotoxina y métodos para su uso
BRPI0924154A2 (pt) 2009-01-23 2015-08-25 Pioneer Hi Bred Internacional Inc Mólecula de ácido nucleico isolada, construção de dna, célula hospedeira, planta transgênica, semente transformada, polipetídeo isolado com atividade pesticida, composição e métodos para controlar uma população de praga de insetos, para exterminar uma praga de insetos, para produzir um polipeptídeo com atividade pesticida e para proteger uma planta de uma praga.
EP2393929A1 (en) 2009-02-05 2011-12-14 Athenix Corporation Variant axmi-r1 delta-endotoxin genes and methods for their use
MX2011008955A (es) 2009-02-27 2011-09-30 Athenix Corp Proteinas pesticidas y metodos de uso de las mismas.
CA2754845A1 (en) 2009-03-11 2010-12-09 Athenix Corporation Axmi-030 insecticidal protein from bacillus thuringiensis and methods for use
WO2010120452A1 (en) 2009-04-17 2010-10-21 Dow Agrosciences Llc Dig-3 insecticidal cry toxins
AU2010260305A1 (en) 2009-06-16 2011-12-15 Dow Agrosciences Llc DIG-11 insecticidal Cry toxins
RU2012101277A (ru) 2009-06-16 2013-07-27 ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи Инсектицидные cry-токсины dig-10
US8461422B2 (en) 2009-06-16 2013-06-11 Dow Agrosciences Llc DIG-5 insecticidal Cry toxins
AU2010278843B2 (en) 2009-07-31 2016-05-19 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Axmi-192 family of pesticidal genes and methods for their use
US8772577B2 (en) 2009-11-12 2014-07-08 Pioneer Hi Bred International Inc Bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity
WO2011084324A2 (en) 2009-12-21 2011-07-14 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity
BR112012020705B8 (pt) 2010-02-18 2022-07-05 Athenix Corp Molécula de ácido nucleico recombinante, vetor, célula hospedeira microbiana, polipeptídeo recombinante com atividade pesticida, composição, bem como métodos para o controle de uma população de pragas de lepidópteros, para matar uma praga de lepidóptero, para a produção de um polipeptídeo com atividade pesticida, para a proteção de uma planta de uma praga, e para aumentar o rendimento em uma planta
AR080201A1 (es) 2010-02-18 2012-03-21 Athenix Corp Genes delta-endotoxinicos de bacillus thuringiensis (axmi218, axmi219, axmi220, axmi226, axmi227, axmi228, axmi229, axmi230, y axmi231), y metodos para su uso
US8802934B2 (en) 2010-08-19 2014-08-12 Pioneer Hi Bred International Inc Bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity
US8822762B2 (en) 2010-12-28 2014-09-02 Pioneer Hi Bred International Inc Bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity
MX2013008392A (es) 2011-01-24 2013-08-12 Pioneer Hi Bred Int Nuevos genes de bacillus thuringiensis con actividad lepidoptera.
CN103459601A (zh) 2011-02-11 2013-12-18 先锋国际良种公司 具有对抗玉米根虫的活性的合成杀昆虫蛋白
US8878007B2 (en) 2011-03-10 2014-11-04 Pioneer Hi Bred International Inc Bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity
WO2012135436A1 (en) 2011-03-30 2012-10-04 Athenix Corp. Axmi238 toxin gene and methods for its use
GB201105418D0 (en) 2011-03-31 2011-05-18 Univ Durham Pesticide
MX346662B (es) 2011-04-07 2017-03-27 Monsanto Technology Llc Familia de toxinas inhibidoras de insectos activas contra insectos hemipteros y lepidopteros.
UY34014A (es) * 2011-04-15 2012-11-30 Dow Agrosciences Llc Genes sintéticos para expresar proteínas en células de maíz, construcciones, plantas transgénicas, métodos para controlar pestes y composiciones
AR087367A1 (es) 2011-07-28 2014-03-19 Athenix Corp Gen de la toxina axmi 270 y sus metodos de empleo
ES2647596T3 (es) 2011-07-28 2017-12-22 Athenix Corp. Variantes de proteínas AXMI205 y métodos para su uso
CN103975065B (zh) 2011-07-29 2018-08-10 阿森尼克斯公司 Axmi279杀虫基因及其使用方法
WO2013134535A1 (en) 2012-03-08 2013-09-12 Athenix Corp. Axmi345 delta-endotoxin gene and methods for its use
CA2866239C (en) 2012-03-08 2020-07-28 Athenix Corp. Bacillus thuringiensis toxin gene axmi335 and methods for its use
AR090622A1 (es) 2012-04-06 2014-11-26 Monsanto Technology Llc Proteinas toxicas para especies de insectos hemipteros
US9688730B2 (en) 2012-07-02 2017-06-27 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
US9475847B2 (en) 2012-07-26 2016-10-25 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
ES2776730T3 (es) 2013-09-13 2020-07-31 Pioneer Hi Bred Int Proteínas insecticidas y métodos para su uso
CA2939156A1 (en) 2014-02-07 2015-08-13 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
KR20170020760A (ko) 2014-06-20 2017-02-24 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨 곤충 해충의 방제에 유용한 영양 살곤충 단백질
US10316329B2 (en) 2014-10-16 2019-06-11 Monsanto Technology Llc Proteins toxic or inhibitory to lepidopteran insects
CR20170198A (es) 2014-10-16 2017-06-29 Monsanto Technology Llc Proteínas quiméricas insecticidas novedosas tóxicas o inhibidoras de plagas de lepidópteros
MY189597A (en) 2014-10-16 2022-02-18 Monsanto Technology Llc Lepidopteran-active cry1da1 amino acid sequence variant proteins
JP7297443B2 (ja) 2015-08-27 2023-06-26 モンサント テクノロジー エルエルシー 新規防虫タンパク質
US10626151B2 (en) * 2016-10-10 2020-04-21 Monsanto Technology Llc Insect inhibitory proteins
BR112019014278A2 (pt) 2017-01-12 2020-03-03 Monsanto Technology Llc Proteínas tóxicas pesticidas ativas contra insetos lepidópteros
AU2019234562B2 (en) 2018-03-14 2024-08-01 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins from plants and methods for their use
CN112955555B (zh) 2019-01-22 2024-09-03 孟山都技术公司 新型昆虫抑制性蛋白
UY39585A (es) * 2020-12-23 2022-07-29 Monsanto Technology Llc Proteínas que exhiben actividad inhibidora de insectos frente a plagas con importancia agrícola de plantas de cultivo y semillas

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117965394A (zh) * 2024-03-28 2024-05-03 中国农业科学院植物保护研究所 一种用于防治草地贪夜蛾和番茄潜叶蛾的苏云金芽孢杆菌
CN117965394B (zh) * 2024-03-28 2024-06-11 中国农业科学院植物保护研究所 一种用于防治草地贪夜蛾和番茄潜叶蛾的苏云金芽孢杆菌

Also Published As

Publication number Publication date
CR20230292A (es) 2023-11-01
UY39599A (es) 2022-07-29
MX2023007858A (es) 2023-07-07
WO2022146874A1 (en) 2022-07-07
PE20240230A1 (es) 2024-02-16
US20220220160A1 (en) 2022-07-14
CL2023001850A1 (es) 2023-12-15
CO2023008716A2 (es) 2023-08-09
US11673922B2 (en) 2023-06-13
KR20230127241A (ko) 2023-08-31
EP4271188A1 (en) 2023-11-08
AU2021412979A1 (en) 2023-07-06
AR124533A1 (es) 2023-04-05
CA3206691A1 (en) 2022-07-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11905520B2 (en) Insect inhibitory proteins
CN112955555B (zh) 新型昆虫抑制性蛋白
US11673922B2 (en) Insect inhibitory proteins
CN109952024B (zh) 新型昆虫抑制蛋白
US20180346925A1 (en) Novel insect inhibitory proteins
CN116669556A (zh) 新型昆虫抑制蛋白
CN110678067B (zh) 新型昆虫抑制蛋白
CN112368296A (zh) 新型昆虫抑制性蛋白
CN114525289B (zh) 新型昆虫抑制性蛋白
US10036037B2 (en) Insect inhibitory proteins
US20240200092A1 (en) Novel insect inhibitory proteins
US12104162B2 (en) Insect inhibitory proteins
OA21316A (en) Novel insect inhibitory proteins.
CN117616117A (zh) 新型昆虫抑制蛋白

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination