CN116836257A

CN116836257A - 骨桥蛋白纯化方法

Info

Publication number: CN116836257A
Application number: CN202310789087.4A
Authority: CN
Inventors: 罗述博; 张永久; 解庆刚; 冷友斌; 耿驰; 林丹; 周鑫; 刘洋; 关海舟; 陆思宇
Original assignee: Heilongjiang Moseidong Technology Co ltd; Heilongjiang Feihe Dairy Co Ltd
Current assignee: Heilongjiang Moseidong Technology Co ltd; Heilongjiang Feihe Dairy Co Ltd
Priority date: 2023-06-29
Filing date: 2023-06-29
Publication date: 2023-10-03

Abstract

本发明涉及一种分离骨桥蛋白的方法，所述方法包括：阴离子交换树脂处理的步骤，使用所述阴离子交换树脂对含有骨桥蛋白的乳液进行分离，在洗脱液的作用下得到富集了骨桥蛋白的成分(A)；浓缩的步骤，使用浓缩膜以将所述成分(A)进行浓缩；以及任选的脱盐的步骤、干燥的步骤中的一项或多项，其中，所述阴离子交换树脂处理的步骤中，所述阴离子交换树脂的工作温度为55℃以下；所述阴离子交换树脂为颗粒状树脂，所述颗粒的粒径为大于100μm。

Description

骨桥蛋白纯化方法

技术领域

本发明属于食品原料的加工生产领域，具体而言，涉及一种蛋白的分离纯化的方法，更具体而言，涉及一种人源或动物源的骨桥蛋白的分离、提取或浓缩方法。

背景技术

骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)是一种高度翻译后修饰的糖蛋白，它由多种组织合成并出现在几乎所有的体液中，OPN在母乳中含量很高，占人乳中总蛋白质含量的10％以上，据文献报道，在泌乳早期的乳汁中约为138mg/L，在泌乳后期约为157mg/L，使其成为五种最丰富的母乳蛋白质之一。

当前婴儿配方食品最主要的研究方向就是母乳化，因此母乳作为黄金标准，如何使产品更加贴近母乳，就是乳品行业研究的重点领域。骨桥蛋白作为母乳蛋白的重要组成部分，在牛乳中的含量却较低。除了含量上的差异，其结构上也存在一定差异，母乳骨桥蛋白具体由298个氨基酸组成，是一种可与钙结合的活性分泌性磷酸化糖蛋白，而牛乳OPN具体由262个氨基酸组成，同时人乳OPN中含有高达34种磷酸丝氨酸和2种磷酸苏氨酸。目前研究表明，其在肠道增殖和成熟、脑髓鞘形成、神经发育以及免疫发育中起着重要的作用。体外研究中，通过将b-OPN(bovin OPN)与人类新生儿胃液一起孵育，发现b-OPN具有与人OPN相当的抵抗胃液消化能力，而在10周龄小鼠的实验中发现摄入b-OPN会提高血浆OPN水平。人乳OPN还参与喂养儿的大脑发育、行为与学习认知能力等相关神经组织发育。

为了防止配方食品喂养的婴儿摄入较低的骨桥蛋白从而对其生长和发育、免疫应答、半乳糖代谢和细胞骨架重塑有负面效应，为了解决这一差距，婴儿配方食品制造商旨在增大其婴儿配方食品中的骨桥蛋白的浓度。如何通过工艺技术将其从牛乳中分离提取出来是当前技术的难点，有了高纯度的蛋白原料，就能够进一步优化婴幼儿食品配方，使其更加接近母乳。

与乳铁蛋白相似，牛乳中OPN浓度比人乳中含量要低很多，而且乳基婴儿配方奶粉中OPN浓度甚至更低。近年来，随着科学家对骨桥蛋白的研究，一些新的分离方法被开发出来用于OPN的纯化和分离。例如：

引用文献1中公开了一种牛乳中骨桥蛋白的提取方法，解决了现有技术提取纯度低的问题，用离子交换色谱加两步疏水色谱制备骨桥蛋白，纯度在40％左右。

引用文献2中公开了一种使用浓缩给料分离骨桥蛋白的方法，选择乳原料(乳清)常温下控制其pH为酸性，电导在4-10mS/cm，先经过一种阴离子交换介质，收集所吸附的蛋白。

引用文献3中公开了一种提取物及其用途，其从富含α-乳白蛋白的乳清蛋白提取物中提取骨桥蛋白，制备方法通过将乳清蛋白酸化，进行脱钙，随后稀释收集沉淀物即是最终产物。

引用文献4中公开了一种骨桥蛋白的分离方法和分析方法，其采用强阴离子交换色谱柱对含骨桥蛋白的待测试物进行HPLC分离，得到骨桥蛋白样品，其中，强阴离子交换色谱柱中的填充物材料包括与三甲基氨丙基键合的表面多孔型硅胶、或与三甲基氨丙基键合的微孔乙基乙烯基苯交联55％二乙烯基苯聚合物。

引用文献5中公开了一种骨桥蛋白分离方法，通过调节pH值使包括骨桥蛋白在内的部分蛋白沉淀，通过添加盐溶液将沉淀溶解，得到富含骨桥蛋白的溶液，再通过调节pH将骨桥蛋白沉淀，得率在70％以上。

引用文献6中公开了一种使用包含CMP或酪蛋白种类的给料分离骨桥蛋白的方法，其使用该乳原料的一个窄窗位的pH和比电导，能够很好的分离骨桥蛋白。具体条件为：在25℃以下，pH＝3.6～6.5，比电导在4～10mS/cm。通过阴离子交换介质收集了等电点小于5的蛋白质，其中包含骨桥蛋白。

另外，在对于骨桥蛋白的使用方面也进行了如下的一些探索。例如：

引用文献7中公开了一种乳铁蛋白-骨桥蛋白-铁络合物，该组合物用于治疗或预防铁缺乏症。

引用文献8中公开了一种促神经发育营养组合物及其制备和应用，包含2’-岩藻糖基乳糖和骨桥蛋白，还可以进一步包含酪蛋白。

此外，从市售的商品来看，目前市售的高纯度产品，蛋白含量78％以上，其中骨桥蛋白占总蛋白的95％以上；同时还有低纯度的产品，纯度在20％以上。所使用的基本工艺为牛乳通过酸凝或酶凝得到酸乳清或甜乳清(pH＝4～5)，超滤处理样品，阴离子交换树脂吸附骨桥蛋白，随后用盐洗脱，超滤并添加CaCl₂，保存截留液，随后杀菌处理，喷雾干燥。

尽管上述现有技术已经对于骨桥蛋白的分离和应用进行了一定程度的研究，但对于高效分离骨桥蛋白以及工业化大规模生产方面，仍然不能说是充分的，仍然具有进一步探讨的余地。

引用文献：

引用文献1：CN101485381A

引用文献2：CN103476787B

引用文献3：CN111447842A

引用文献4：CN113567573A

引用文献5：CN115073580A

引用文献6：CN103492408A

引用文献7：CN105377059A

引用文献8：CN114586983A

发明内容

发明要解决的问题

尽管如上所述，对于骨桥蛋白的分离已经进行了各种尝试。已经有的共识在于，化学沉淀法步骤较为复杂，通常产品纯度受到限制，并且还会引入新的化学物质。而基于离子交换树脂的层析技术，虽然有利于提高纯度，但效率不高，因此规模化受到限制，并且也受到成本上升的影响。

进一步，在长期的工业化实践中，申请人也进一步的发现了如下的问题，例如：

引用文献1中的牛乳中骨桥蛋白的提取方法，解决了现有技术提取纯度低的问题，用离子交换色谱加两步疏水色谱制备骨桥蛋白，纯度在40％左右。在离子交换色谱分离过程中，采用了搅拌静置的方法进行吸附，所采用的树脂为DEAE-Sephacel阴离子交换树脂，需要低温长时间才能达到吸附效果，在经过离子交换色谱后还要经过疏水色谱，不仅步骤复杂，同时还要引入大量盐溶液，极大限制了提取效率和效果。

引用文献3中通过将乳清蛋白酸化，调节pH值脱钙，随后稀释并调高pH值，收集沉淀物即是最终产物。已经发现，首先，酸化蛋白会造成部分蛋白的变性，影响相关产品的使用特性，并引入其他化学试剂，不利于产品后期应用，同时利用化学沉淀方式提取的骨桥蛋白，纯度偏低，无法满足高提取率和高纯度的要求。

引用文献6中使用乳原料的一个窄窗位的pH和比电导，能够很好的分离骨桥蛋白。可在25℃以下，pH3.6～6.5，比电导在4～10mS/cm的条件下，通过阴离子交换介质收集了等电点小于5的蛋白质，其中包含骨桥蛋白。该工艺流速慢，处理量小，同时严格限制了pH和比电导，增加了操作过程中的难度，在产业化过程中控制极为困难。

另外，上述方案基本上仍然属于停留在小规模实验室阶段的提取技术，同时未对离子交换树脂的工作条件等因素做出进一步的探讨。此外，也不应当将现有的针对骨桥蛋白的HPLC检测方法与本发明的工业分离纯化方式混淆，前者重点在于分离和浓度检测，而不是最终产物的纯度和纯化效率。

因此，本发明所要解决的技术问题首要的在于提供一种适合于工业化大规模生产的基于离子交换树脂的骨桥蛋白的分离和纯化技术，通过调整阴离子交换树脂的特性和工作条件，能够在不影响蛋白活性的同时，缩短骨桥蛋白的保留时间，同时也能够抑制产品中乳糖、乳清蛋白或者酪蛋白含量的增加。

用于解决问题的方案

通过发明人长期的研究，发现通过如下技术方案的实施能够解决上述的技术问题：

[1].本发明提供了一种分离骨桥蛋白的方法，其中，所述方法包括：

阴离子交换树脂处理的步骤，使用所述阴离子交换树脂对含有骨桥蛋白的乳液进行分离，在洗脱液的作用下得到富集了骨桥蛋白的成分(A)；

浓缩的步骤，使用浓缩膜以将所述成分(A)进行浓缩；

以及任选的脱盐的步骤、干燥的步骤中的一项或多项，

其中，

所述阴离子交换树脂处理的步骤中，所述阴离子交换树脂的工作温度为55℃以下；

所述阴离子交换树脂为颗粒状树脂，所述颗粒的粒径为大于100μm。

[2].根据[1]所述的方法，其中，所述含有骨桥蛋白的乳液的固含量为6～20质量％，油脂的含量为1质量％以下。

[3].根据[1]或[2]所述的方法，其中，所述含有骨桥蛋白的乳液中乳液粒径在10μm以下。

[4].根据[1]～[3]任一项所述的方法，其中，所述含有骨桥蛋白的乳液在与阴离子交换树脂接触前，经过加热处理，所述加热温度为25～60℃。

[5].根据[1]～[4]任一项所述的方法，其中，所述阴离子交换树脂处理的步骤中，所述洗脱液为卤化一价金属盐的水溶液。

[6].根据[5]所述的方法，其中，使用作为第一洗脱液的卤化一价金属盐的水溶液以洗脱碳水化合物以及乳清蛋白成分；使用作为第二洗脱液的卤化一价金属盐的水溶液以洗脱骨桥蛋白成分，所述第二洗脱液的离子强度大于所述第一洗脱液的离子强度。

[7].根据[1]～[6]任一项所述的方法，其中，所述阴离子交换树脂处理的步骤中，所述阴离子交换树脂的工作温度为4～15℃或42℃～55℃。

[8].根据[1]～[7]任一项所述的方法，其中，所述浓缩的步骤中，所述浓缩膜的孔径为30kDa以下。

[9].根据[1]～[8]任一项所述的方法，其中，所述浓缩的步骤中，通过浓缩膜将成分(A)浓缩至体积的1/20～1/50。

[10].根据[1]～[9]任一项所述的方法，其中，在所述浓缩的步骤后依次包括脱盐的步骤、杀菌的步骤以及干燥的步骤，所述脱盐的步骤中，经过脱盐处理的体系的电导率小于2mS/cm。

发明的效果

通过上述技术方案的实施，本发明能够得到如下的技术效果：

1)通过对阴离子交换树脂的特性以及工作条件的优化，能够在不损害蛋白活性的前提下，对骨桥蛋白成分进行分离，同时降低骨桥蛋白的保留时间，显著提高处理效率；

2)通过对阴离子交换树脂的特性以及工作条件的优化，能够减少骨桥蛋白中的杂质成分的含量，提高最终产品的纯度，本发明的骨桥蛋白固体物的纯度可以在宽范围内调整，最高可以得到80％以上的纯度；

3)通过对阴离子交换树脂的特性以及工作条件的优化，提高骨桥蛋白的纯度，因此可以无需后续纯化色谱(疏水色谱)的使用，进一步提高了纯化工艺的整体效率。

4)本发明的骨桥蛋白的纯化方法，对于处理对象的要求不高，可以是人或动物的未经处理的乳液，或者也可以是已经被加工了的乳制品，例如乳粉等。

5)本发明的纯化方法在具有改善的分离纯度的前提下，操作简便高效，更有利于工业化的大规模生产，并且在得到良好纯度的骨桥蛋白的同时也可以得到高纯度的乳清蛋白成分。

附图说明

图1：实施例1中骨桥蛋白提取过程的色谱图；

图2：实施例1中的冻干样和无菌液体；

图3：骨桥蛋白纯度检测图谱(红色为标准样品图)

图4：标准曲线。

具体实施方式

以下将详细说明本发明的各种示例性实施例、特征和方面。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。

另外，为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。

如无特殊声明，本说明书中所使用的单位均为国际标准单位，并且本发明中出现的数值，数值范围，均应当理解为包含了工业生产中所不可避免的系统性误差。

本说明书中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。

本说明书中，对于阴离子交换树脂，在描述阴离子交换树脂的“粒径”或者使用“粒径”时，表示平均粒径。

本说明书中，使用“数值A～数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。

在本发明中，使用“以上”或“以下”表示的数值范围是指包含本数的数值范围。

在本发明中，使用“任选”或“任选地”表示某些物质、组分、执行步骤、施加条件等因素使用或者不使用。

本发明中，使用“Da”表示分子量的单位“Dalton”，即“道尔顿”。

在本发明中，如没有特殊说明，所使用的“常温”通常指的23±2℃时的温度。

在本发明中，所使用的单位名称均为国际标准单位名称，并且如果没有特别声明，所使用的“％”均表示重量或质量百分含量。

本说明书中，使用“婴幼儿”表示年龄3岁以下的人类群组。

本说明书中，术语“约”或“基本上”、“实质上”可以表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因前述测试装置或方法所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本发明所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处，“约”通常是指实际数值与理论模型或理论数据的标准偏差在2％、更优选为1％范围以内。

在本发明中，所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素(例如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方案中，并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。

本发明主要是提供一种基于阴离子交换树脂的、适合于工业化规模生产的且生产效率显著改善的骨桥蛋白的分离方法，该方法对处理对象的要求不高，并且通过对阴离子交换树脂处理的步骤中阴离子交换树脂的特性和工作条件的优化，能够在保证蛋白活性的同时，提高分离纯度以及显著提高分离效率。

本发明主要基于以下的见解而得到：

现有技术中基于阴离子交换树脂的骨桥蛋白纯化的方法，其层析层材质通常使用约几十微米或者100微米以下的颗粒状树脂材质，这主要是考虑到充分的吸附作用以对骨桥蛋白进行足够的保留，以提高其产率和纯度，但这极大的影响了工作效率，延长了骨桥蛋白的保留时间，同时，即使经过阴离子交换树脂分离的组分，仍然需要经过例如疏水性层析层的处理才能得到可接受纯度的骨桥蛋白产品，这更加降低了生产效率。另外，现有技术中无论对于将要处理的含骨桥蛋白成分还是工作时阴离子交换树脂，均控制在约10℃以下的较低温度，以避免蛋白成分的变性。

而本发明已经意外的发现，在使用阴离子交换树脂对骨桥蛋白进行浓缩时，增加作为固定相的阴离子树脂颗粒的粒径(同时优化阴离子树脂工作时的温度条件)，不仅能够极大的减少骨桥蛋白的保留时间，同时也能够将其与乳糖、乳清蛋白和酪蛋白进行更好的分离。虽然其中机理尚不完全明确，但认为，上述操作中，固定相的表面吸附、蛋白成分与固定相的电荷作用以及蛋白成分之间在操作温度下相互作用的减弱三者之间获得了更好的平衡。

(处理对象)

对于本发明的处理对象，原则上没有特别的限定，只要是包含骨桥蛋白的成分即可。

对于这样的处理对象，可以是来自于人或动物的含乳成分。优选地，可以为源自于牛、羊、马、骆驼等的含乳成分，更优选的，可以为源自于牛的含乳成分。

对于这样的处理对象，可以以乳液的方式而进行本发明的纯化工艺。这样的乳液可以直接使用未经处理或经过部分处理的乳液，也可以是固体乳，例如乳粉等经过与水混合而得到的乳液。

在一些具体的实施方案中，从有利于后续阴离子交换树脂处理的角度考虑，本发明的含有骨桥蛋白的乳液是经过脱脂处理的乳液。

对于脱脂的方式，原则上没有特别限制，可以使用常规的脱脂方式，例如膜过滤或者离心分离，优选的使用离心分离以去除乳液中的油脂。在一些优选的实施方案中，对于通过脱脂处理的、并且可以直接进行阴离子交换树脂处理的乳液，以该乳液的总质量计，所述油脂的含量为1质量％以下，优选为0.8质量％以下，更优选为0.6质量％以下。

(前处理)

进一步，已经发现，通过合适的前处理可以使得后续的阴离子交换树脂处理更为高效的进行。

对于含有骨桥蛋白的乳液的前处理，可以包括固含量的调整、乳液粒径的调整以及热处理。

对于固含量的调整，控制含有骨桥蛋白的乳液达到合适的固含量有利于提高处理效率，优选地，该乳液的固含量为6～20质量％，更优选为8～16质量％。同样，以该乳液的总质量计，所述油脂的含量可以为1质量％以下，优选为0.8质量％以下，更优选为0.6质量％以下，例如0.3质量％以下，0.1质量％以下等。

对于乳液粒径的调整，已经发现，通过控制乳液中粒径的范围可以更好的适合于大粒径的阴离子树脂颗粒的吸附，一方面起到对大粒径颗粒比表面积的补充作用，另一方面，可以减少蛋白质成分之间的相互作用。在一些优选的实施方案中，所述含有骨桥蛋白的乳液中乳液最大粒径在10μm以下，更优选为8μm以下。

对于热处理，尽管现有技术中并不建议在阴离子交换树脂处理前对处理对象进行热处理，以避免蛋白质的变性，但本发明已经发现，适当的热处理并不会引起所担心的蛋白质变性，还可以使得乳液中蛋白质成分之间的相互(电荷)作用、以及碳水化合物与蛋白质之间的吸附作用减弱，尤其是配合合适的乳液粒径，可以更好的在后续过程中分离乳清蛋白等成分。因此，在本发明一些优选的实施方案中，在进行阴离子交换树脂处理前，可将含有骨桥蛋白的乳液加热到25～60℃，优选为23～50℃，另外，对于加热时间，从抑制蛋白变性的角度考虑可以控制在1小时内，例如0.4～0.8小时。

(阴离子交换树脂处理的步骤)

对于前述(处理得到)的含有骨桥蛋白的溶液，通过阴离子交换树脂进行处理。

对于本发明的阴离子交换树脂可以包括基质和阳离子基团。

在一些具体的实施方案中，所述基质可以例如包含多糖，或甚至基本上由其组成。特别优选交联多糖。有用的多糖的实例是纤维素、琼脂糖，和/或葡聚糖。另外，该基质还可以是包含一种非碳水化合物聚合物或甚至基本上由其组成。有用的非碳水化合物聚合物的实例是甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯、和/或苯乙烯-二乙烯基苯。

作为阳离子基团，可以例举的包括氨基，或甚至基本上由其组成。叔氨基是特别优选的并且在适当的pH条件下生成季铵基。季铵基为阴离子交换介质提供了强阴离子交换特性。或另外地，这些阳离子基团可以包含一种或多种伯氨基或仲氨基。大量的伯氨基或仲氨基典型地为阴离子交换介质提供了弱阴离子交换特性。

对于本发明的阴离子交换树脂，可以以颗粒形式使用，所述颗粒的粒径大于100μm，优选为110～200μm，例如120μm、150μm、180μm等。已经发现，增大粒径的同时，能够显著提高纯化分离效率，增加处理通量，并且也不至于引起酪蛋白成分的过度溶出。另外，在如下文所述的阴离子交换树脂工作温度等条件的配合下，仍然能够将碳水化合物、乳清蛋白和酪蛋白与骨桥蛋白进行有效分离，得到高纯度的骨桥蛋白产品。

在本发明一些优选的实施方案中，可用的阴离子交换树脂可以通过商购获得，例如默赛东、思拓凡、百林科等品牌的阴离子交换树脂。

通过阴离子交换树脂处理，主要是分离其中的碳水化合物(例如乳糖)、乳清蛋白以及酪蛋白成分。其中，碳水化合物不具有电荷、乳清蛋白的吸附和电荷作用较弱，相比于骨桥蛋白而言，更容易从阴离子交换树脂上洗脱，而酪蛋白与阴离子交换树脂的结合性相对于骨桥蛋白与阴离子交换树脂而言更强，因此，骨桥蛋白相比于酪蛋白更优先被洗脱。

因此，作为纯化/分离处理时可用的洗脱液可以包括第一洗脱液和第二洗脱液，其中，二者可以为卤化一价金属盐的水溶液，优选为第一主族金属的氯化物，例如氯化钠、氯化钾等。

进一步，第一和第二洗脱液存在离子强度上的不同以执行不同的洗脱功能，其中第二洗脱液的离子强度高于第一洗脱液。在一些具体的实施方案中，第一洗脱液的浓度可以为2.8％(m/V％)以下，优选为1％～2.5％(m/V％)，更优选为1.5％～2.2％(m/V％)；第二洗脱液的浓度可以为大于2.8％(m/V％)，优选为3％～12％(m/V％)，更优选为4％～10％(m/V％)。其中，所述第一洗脱液用于洗脱所述碳水化合物以及乳清蛋白等与阴离子交换树脂弱结合的成分，第二洗脱液用于洗脱骨桥蛋白成分，同时防止酪蛋白(β-酪蛋白)的溶出。另外，对于洗脱液中可以使用的其他成分，例如缓冲性成分或pH调节成分，没有特别限制，可以参考本领域常规的操作方式选择使用。

进一步，对于本发明的纯化/分离处理时阴离子交换树脂的温度，尽管现有技术中出于低温有利于吸附的原理，通常需要将阴离子交换树脂的工作温度控制在例如6℃以下，或者至多不会超过40℃。而本发明认为，在使用了上述粒径特性的树脂的情况下，即使使得阴离子交换树脂工作温度在不超过55℃，优选为4～55℃的宽范围内工作，由于保留时间被缩短，也不会导致骨桥蛋白的变性和杂质的升高。

尽管原理不完全清楚，但存在如下推测：

工作温度对于树脂和乳液中蛋白等物质同时存在影响，其中，调整温度可以使得乳液接触树脂时其中的不同种蛋白构象和相互作用发生改变，更高的热运动导致一些存在相互物理或静电吸附的蛋白得到活化，例如减轻乳铁蛋白与骨桥蛋白之间的静电作用，也降低了酪蛋白和骨桥蛋白之间的相互作用。进一步，在洗脱液的作用下，能够更快的使得碳水化合物成分和乳清蛋白成分洗脱，进而，在合适的温度下，树脂颗粒的吸附性被适当的降低，因此，骨桥蛋白也能够更快地从阴离子树脂中脱离而不导致酪蛋白的溶出，从而不仅提高了处理效率，也提高了产物的纯度。

因此，在本发明一些具体的实施方案中，所述阴离子交换树脂的工作温度优选为4～15℃或42℃～55℃以最大程度避开微生物生长的适宜温度区间，其中，前者温度下，认为树脂粒径对于处理效率产生主要贡献，而在后者温度下，温度和粒径对处理效率产生主要贡献。因此，更优选的，所述阴离子交换树脂的工作温度为42℃～55℃。

在上述条件下第一洗脱液洗脱组分被去除或另行收集成分(A’)以分离其中的乳清蛋白，而第二洗脱液的洗脱组分为富集有骨桥蛋白的成分，即成分(A)。

对于阴离子交换树脂处理的步骤中的处理时间，通常可以为不超过10min，优选的可以为6min以下，更优选的，可以为1～3min。该过程可以通过改变含有骨桥蛋白的乳液的固含量以及洗脱液的流量和压力而调整。

(浓缩的步骤)

本发明中，对于上述成分(A)可以进行进一步的膜处理以进一步的浓缩或纯化。

从效率和浓缩效果的平衡角度考虑，浓缩膜的孔径可以为30kDa以下，优选为5～30kDa，例如10kDa、15kDa等，以进一步的去除低分子量的成分从而提高骨桥蛋白的纯度。

相比于现有技术通过阴离子交换树脂处理的组分需要进一步的使用疏水色谱处理而实现满意纯度的方法，本发明在阴离子交换处理后使用膜浓缩的处理手段能够更进一步的提高处理量和处理效率。

进一步，在本发明一些优选的实施方案中，通过浓缩膜以将成分(A)浓缩为原体积的1/50～1/20，例如1/30、1/40等，以得到浓缩成分(B)。

(其他的步骤)

在得到上述的浓缩成分(B)之后，可以使用任选的后处理方式以得到最终的骨桥蛋白产品。

对于这些后处理方式，包括脱盐的步骤、杀菌的步骤、干燥的步骤等中的一种或多种。

在本发明一些具体的实施方案中，以依次使用脱盐的步骤、杀菌的步骤和干燥的步骤对所述浓缩成分(B)进行处理。

对于脱盐的步骤，可以例举的包括使用超滤膜进行处理，优选地，经过脱盐处理的体系的电导率小于2mS/cm。

对于杀菌的步骤，可以例举的包括巴氏杀菌处理，可以列举的温度为60～80℃，杀菌时间为15s～30min。在一些具体的实施方案中，杀菌处理后可以得到20质量％～30质量％的富含骨桥蛋白的无菌液体，菌落总数小于50000cfu/g。

对于干燥的步骤，可以包括冷冻干燥、喷雾干燥等方式，直到制成脱盐浓缩液。

另外，对于上述的富集了乳清蛋白的成分(A’)，任选的，也可以进一步通过浓缩和后处理步骤而得到纯化的乳清蛋白。对于这些处理步骤，原则上本发明没有特别的限制。

对于本发明所提供的方法最终得到的骨桥蛋白的纯度可以在较宽的范围内调整，例如调整阴离子交换树脂处理的步骤，和浓缩的步骤的工作条件，使得纯度可以在5％以上的宽范围内实现，在兼顾处理效率的情况下，可以实现高达80％以上的纯度，在一些优选的实施方案中所述纯度可以在50～85％之间进行调节，总产率可以在40％以上。

实施例

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

<骨桥蛋白含量定量检测>：

(实验材料)

水，GB/T 6682，一级。氯化钠(NaCl)。三氟乙酸(TFA，CF₃CO₂H)。乳酸(CH₃CH(OH)COOH)。氯化钙(CaCl₂)。三羟甲基氨基甲烷溶液(1mol/L，pH＝8.0)。TFA水溶液(0.1％)；乳酸溶液(10％)：氯化钙溶液(500mM)；流动相A(pH＝8.0)：20mM三羟甲基氨基甲烷和10mMNaCl组成的pH＝8.0的缓冲溶液。流动相B(pH＝8)：20mM三羟甲基氨基甲烷和800mM NaCl组成的pH＝8.0的缓冲溶液。

(仪器设备)

高效液相色谱：配紫外检测器或二极管阵列检测器；天平：感量0.1mg，0.01g；水浴锅；pH计：精度为0.01；涡旋混和器；超声波振荡器。

(试样提取)

液体试样提取

准确称取30g(精确至0.1mg)试样，加入4mL氯化钙溶液，摇匀后，于70℃下水浴20min。从水浴锅取出后冷却室温，用乳酸溶液调整pH至4.3，纯水定容至50mL，摇匀，滤纸过滤，滤液用0.22μm滤膜过滤到进样瓶中，待上机测定。

固体试样提取

准确称取5g(精确至0.1mg)，用30mL40℃～50℃的水溶解，漩涡震荡5min。加入4mL氯化钙溶液，摇匀后，于70℃下水浴20min。从水浴锅取出后冷却室温，用乳酸溶液调整pH至4.3，纯水定容至50mL，摇匀，滤纸过滤，滤液用0.22μm滤膜过滤到进样瓶中，待上机测定。骨桥蛋白含量较高的乳清粉，定容过滤后，用流动相A稀释2～10倍，用0.22μm滤膜过滤到进样瓶中，待上机测定。

(液相色谱参考条件)

色谱柱：多层网络状多孔聚甲基丙烯酸酯型季铵盐阴离子交换色谱柱5μm，4.6*100mm；

柱温：40℃；

检测波长：220nm；

进样量：10μL；

洗针液：0.1％TFA水溶液。

梯度洗脱条件见表2。

表2流动相洗脱条件

(标准曲线制作)

取标准系列溶液，以骨桥蛋白标准峰面积为纵坐标，以标准溶液浓度为横坐标，

绘制标准曲线，得到标准曲线回归方程，参见图4。

(试样溶液的测定)

将试样溶液注入高效液相色谱仪，测定峰面积，根据标准曲线得到待测液中骨桥蛋白的浓度。

(试验数据处理)

试样中骨桥蛋白的质量分数X计，数值以克每百克(mg/100g)表示，按下列公式计算：

式中：

C—被测组分曲线计算浓度，单位为微克每升(mg/L)；

V—样液最终定容体积，单位为毫升(mL)；

m—试样质量，单位为克(g)；

f—稀释倍数；

当骨桥蛋白含量≥100mg/100g时，计算结果保留四位有效数字；当骨桥蛋白含量＜100mg/100g时，计算结果保留三位有效数字。

实施例1

按照以下步骤制备骨桥蛋白：

取脂肪含量小于0.1％，最大粒径小于8微米的脱脂牛奶乳液，温度在4℃～10℃之间，利用默赛东的阴离子交换树脂(平均粒径120μm)对脱脂牛乳进行离子交换处理，以便使带阴离子电荷的蛋白吸附到离子交换树脂上，牛奶在树脂柱中的保留时间为3min，然后用水将乳液顶出。

第一步洗脱采用约4个柱体积的1.5％的氯化钠溶液进行洗脱，得到杂蛋白溶液；

第二步洗脱采用约4个柱体积的3％的氯化钠溶液进行洗脱，得到骨桥蛋白盐溶液；

将洗脱得到的洗脱液一和洗脱液二分别利用孔径为10kDa的膜将料液浓缩10倍，然后洗滤脱盐处理，以便获得纯化的乳清蛋白和骨桥蛋白，脱盐后料液的固型物含量在5％，电导率1.5mS/cm。

冷冻干燥或低温喷雾干燥或者膜滤除菌：将上述乳清蛋白和骨桥蛋白分别进行冷冻干燥得到冻干蛋白粉；或者将上述乳清蛋白和骨桥蛋白分别进行低温喷雾干燥得到喷干的蛋白粉；或者将上述乳清蛋白和骨桥蛋白分别进行膜滤除菌或者72～75℃，15秒巴氏杀菌，制备成无菌乳清蛋白和骨桥蛋白液体包。

图1为实施例中提取过程的色谱图，图2所示为实施例1中制备的冻干样和无菌液体，图3为骨桥蛋白纯度检测图谱。

实施例2

按照以下步骤制备骨桥蛋白：

取脂肪含量小于0.5％，最大粒径小于8微米的脱脂牛奶乳液，温度在50℃～55℃之间，利用与实施例1相同的阴离子交换树脂对该乳液进行离子交换处理，以便使包含骨桥蛋白的乳清蛋白吸附到离子交换树脂上，牛奶在树脂柱中的保留时间为1.5min，上样结束后用水将乳液顶出。

第一步洗脱采用约4个柱体积的2％的氯化钠溶液进行洗脱，得到杂蛋白溶液；

第二步洗脱采用约4个柱体积的6％的氯化钠溶液进行洗脱，得到骨桥蛋白溶液；

将洗脱得到的杂蛋白溶液和骨桥蛋白溶液分别利用孔径为5kDa的膜将料液浓缩30倍，然后洗滤脱盐处理，以便获得纯化的骨桥蛋白，脱盐后料液的固型物含量在12％，电导率小于1.8mS/cm。

冷冻干燥或低温喷雾干燥或者膜滤除菌：将上述产品进行冷冻干燥得到冻干蛋白粉；或者将上述产品进行低温喷雾干燥得到喷干的蛋白粉；或者将上述产品进行膜滤除菌或者72～75摄氏度，15秒巴氏杀菌，制备成无菌液体包。

实施例3

按照以下步骤制备骨桥蛋白：

第一步洗脱采用约4个柱体积的2.2％的氯化钠溶液进行洗脱，得到杂蛋白溶液；

实施例4

按照以下步骤制备骨桥蛋白：

取脂肪含量小于0.1％，最大粒径小于10微米的脱脂牛奶乳液，温度在50℃～55℃之间，利用与实施例1相同的阴离子交换树脂对该乳液进行离子交换处理，以便使包含骨桥蛋白的乳清蛋白吸附到离子交换树脂上，牛奶在树脂柱中的保留时间为2min，上样结束后用水将乳液顶出。

第一步洗脱采用约5个柱体积的2.5％的氯化钠溶液进行洗脱，得到杂蛋白溶液；

将洗脱得到的杂蛋白溶液和骨桥蛋白溶液分别利用孔径为5kDa的膜将料液浓缩30倍，然后洗滤脱盐处理，以便获得纯化的骨桥蛋白，脱盐后料液的固型物含量在12％，电导率小于0.5mS/cm。

对比例1

采用默赛东公司粒径为70μm的与实施例1树脂相同材质的阴离子交换树脂树脂填料进行提取分离。

按照以下步骤制备骨桥蛋白：

取脂肪含量小于0.1％，最大粒径小于10微米的脱脂牛奶乳液，温度在50℃～55℃之间，利用阴离子交换树脂对该乳液进行离子交换处理，以便使包含骨桥蛋白的乳清蛋白吸附到离子交换树脂上，牛奶在树脂柱中的保留时间为5min(由于孔径较小，为了保证设备运行压力在适当范围，只能降低流速，增加保留时间)，上样结束后用水将乳液顶出。

下表1表示了实施例和对比例中得到的骨桥蛋白粉的纯度和收率，其中纯度测试根据上文<骨桥蛋白含量定量检测>方法进行：

表1

	纯度/％	得率/％
			实施例1	51.05	43.01
实施例2	70.69	74.11
			实施例3	81.29	65.83
实施例4	80.26	66.41
			对比例1	42.11	40.76

需要说明的是，尽管以具体实例介绍了本发明的技术方案，但本领域技术人员能够理解，本发明应不限于此。

以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。本文中所用术语的选择，旨在最好地解释各实施例的原理、实际应用或对市场中的技术改进，或者使本技术领域的其它普通技术人员能理解本文披露的各实施例。

Claims

1.一种分离骨桥蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括：

浓缩的步骤，使用浓缩膜以将所述成分(A)进行浓缩；

以及任选的脱盐的步骤、干燥的步骤中的一项或多项，

其中，

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有骨桥蛋白的乳液的固含量为6～20质量％，油脂的含量为1质量％以下。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述含有骨桥蛋白的乳液中乳液最大粒径在10μm以下。

4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述含有骨桥蛋白的乳液在与阴离子交换树脂接触前，经过加热处理，所述加热温度为25～60℃。

5.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，所述阴离子交换树脂处理的步骤中，所述洗脱液为卤化一价金属盐的水溶液。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，使用作为第一洗脱液的卤化一价金属盐的水溶液以洗脱碳水化合物以及乳清蛋白成分；使用作为第二洗脱液的卤化一价金属盐的水溶液以洗脱骨桥蛋白成分，所述第二洗脱液的离子强度大于所述第一洗脱液的离子强度。

7.根据权利要求1～6任一项所述的方法，其特征在于，所述阴离子交换树脂处理的步骤中，所述阴离子交换树脂的工作温度为4～15℃或42℃～55℃。

8.根据权利要求1～7任一项所述的方法，其特征在于，所述浓缩的步骤中，所述浓缩膜的孔径为30kDa以下。

9.根据权利要求1～8任一项所述的方法，其特征在于，所述浓缩的步骤中，通过浓缩膜将所述成分(A)浓缩至体积的1/20～1/50。

10.根据权利要求1～9任一项所述的方法，其特征在于，在所述浓缩的步骤后依次包括脱盐的步骤、杀菌的步骤以及干燥的步骤，所述脱盐的步骤中，经过脱盐处理的体系的电导率小于2mS/cm。