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CN116829585A - Il27受体结合相关的组合物和方法 - Google Patents

Il27受体结合相关的组合物和方法 Download PDF

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CN116829585A CN202180068079.XA CN202180068079A CN116829585A CN 116829585 A CN116829585 A CN 116829585A CN 202180068079 A CN202180068079 A CN 202180068079A CN 116829585 A CN116829585 A CN 116829585A
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P·J·卢帕杜斯
D·罗卡姆
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Abstract

本发明提供了IL27R结合蛋白，所述IL27R结合蛋白结合至IL27Rα和gp130且包含抗‑IL27RαVHH抗体和抗‑gp130VHH抗体。

Description

IL27受体结合相关的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年8月5日提交的美国临时申请号63/061,562、2020年9月15日提交的美国临时申请号63/078,745和2021年1月11日提交的美国临时申请号63/135,884的优先权权益，其公开通过引用全文纳入本文以用于所有目的。
背景技术
白细胞介素-27受体(IL27R)是白细胞介素-27(IL27)的一种I型细胞因子受体。它是一种异二聚体，由IL27Rα亚基和糖蛋白130(gp130)构成。IL27由抗原呈递细胞表达，并诱导免疫系统中不同群体的T细胞分化。当IL27结合至IL27R时，信号转导途径，例如JAK-STAT和p38 MAPK途径被开启以诱导促炎或抗炎反应，这些反应涉及不同类型的细胞，如巨噬细胞、树突细胞、T细胞和B细胞。被激活的反应可能取决于IL27的外部环境。
IL-27是一种异二聚体细胞因子，由两个非共价连接的亚基p28和EBI3组成。p28亚基属于4-螺旋束细胞因子家族，而EBI3是可溶性细胞因子受体的可能的最短形式，具有两个典型的细胞因子结合结构域(Pflanz S,等,Immunity.2002年6月；16(6):779-90)。
IL-27的主要结合受体是IL-27R1(也称为TCCR-或WSX-1受体)。IL-27和IL-27R1形成具有相当大亲和力(nM)的复合物。Gp130是结合IL-27/IL-27R复合物以产生活性信号转导复合物的第二受体。Gp130对IL-27/IL-27R1复合物的结合比IL-27和IL-27R1之间的相互作用弱得多(Pflanz S,等,J Immunol.2004年2月15日；172(4):2225-31)。
IL-27胞外结构域具有5个结构域。前两个结构域形成IL-27结合结构域。通常，D1和D2之间的环提供了大部分的结合能。
其他3个结构域称为纤连蛋白III型结构域(Fn3)。各Fn3结构域的序列各不相同。
gp130受体具有6个结构域。gp130的顶部结构域D1结合IL-27的p28。D2和D3对IL-27的结合贡献很小。膜近端的3个结构域是Fn3结构域。各Fn3结构域的序列各不相同。
IL-27R的结构尚不清楚，但结构域结构是已知的。gp130的结构被称为与IL-6的复合。基于该结构，显而易见的是，Fn3结构域在能量上对IL-27R复合物的形成没有贡献。相反，gp130的结构与结构域4和5以彼此80％的角度形成‘C’。各个“高”受体中的某些残基是保守的与gp130中的D4和D5相似。这表明gp130家族的所有高受体，包括IL-27R，都形成了这种‘C’结构。(Yibin Xu,等,J Biol Chem.2010年7月9日；285(28):21214-8)。
IL-27R具有5个胞外结构域。D1和D2是细胞因子结合结构域。D3、D4和D5是Fn3结构域。由于各个受体的‘C’形，IL-27R的D5结构域和gp130的D6结构域将在膜处紧密接近。这是受体复合物能够在两种受体的胞内结构域触发JAK结合所需要的。
发明内容
本发明提供了可用于细胞受体的配对以产生可用于治疗哺乳动物对象疾病的所需效果的组合物。
本文描述的结合分子有几个优点。IL-27R的天然配体，IL-27,导致gp130和IL-27Ra接近(即通过它们对IL-27的同时结合)。然而，当IL-27在哺乳动物(特别是人)对象中被用作治疗剂时，它也可能通过多种机制引发许多不利和不良影响，包括gp130和IL-27Ra在其他细胞类型上的存在以及与其他细胞类型上的gp130和IL-27Ra的结合可能会对表达gp130和IL-27Ra的细胞产生不良影响和/或不期望的信号转导。本发明涉及调节gp130和IL-27Ra结合的多重效应的方法和组合物，从而产生所需的治疗信号转导，特别是在所需的细胞或组织亚型中，同时最小化不期望的活性和/或胞内信号转导。
在一些实施方式中，本文所述的IL-27R结合分子是IL-27受体的部分激动剂。在一些实施方式中，本文所述的结合分子被设计为使得结合分子是完全激动剂。在一些实施方式中，本文所述的结合分子被设计为使得结合分子是超级激动剂。
在一些实施方式中，结合分子通过与所需细胞类型上的gp130和IL-27Ra的结合提供最大所需的IL-27胞内信号转导，同时对其他不期望的细胞类型提供显著更少的IL-27信号转导。例如，这可以通过选择与IL-27对gp130和IL-27Ra的亲和力相比，对gp130和IL-27Ra造成不同的E最大，或具有不同亲和力的结合分子来实现。因为不同的细胞类型以不同的灵敏度响应配体与其同源受体的结合，通过调节二聚体配体(或其单个结合部分)对IL-27受体相对于野生型IL-27结合的亲和力可促进所需活性的刺激同时减少对非靶细胞的不期望的活性。
本发明提供作为IL-27受体激动剂的二价结合分子，所述二价结合分子包括：
特异性结合至gp130的胞外结构域的第一单域抗体(sdAb)(“抗-gp130 sdAb”)；和
特异性结合至IL-27Ra的胞外结构域的第二单域抗体(“抗IL-27Ra sdAb”)，
其中该抗-gp130 sdAb和抗-IL-27Ra sdAb是稳定缔合的，首先，其中用有效量的二价结合分子接触表达gp130和IL-27Ra的细胞，当被其天然同源IL-27激活时，导致gp130和IL-27Ra的二聚体化并导致IL-27受体的胞内信号转导特征。在一些实施方式中，一种或两种sdAb是scFv。在一些实施方式中，一种或两种sdAb是VHH。
在一些实施方式中，二价结合分子的一个sdAb是scFv，另一个sdAb是VHH。
在一些实施方式中，第一和第二sdAb通过化学连接共价结合。
在一些实施方式中，第一和第二sdAb作为单个连续多肽提供。
在一些实施方式中，第一和第二sdAb作为单个连续多肽提供，任选地在第一和第二sdAb的氨基酸序列之间包含间插多肽接头。
在一些实施方式中，任选地包含接头的二价结合分子，任选地表达为具有其他氨基酸序列的融合蛋白。在一些实施方式中，其他氨基酸序列是纯化柄，例如螯合肽或其他蛋白质，例如Fc分子的亚基。
一方面，本发明提供IL27受体(IL27R)结合蛋白，其特异性结合至IL27Rα亚基(IL27Rα)和糖蛋白130亚基(gp130)，其中，当结合至IL27Rα和gp130时，该结合蛋白导致IL27Rα和gp130的多聚化，且该多聚化导致与gp130和IL27Rα胞内结构域关联的JAK激酶的激活以及胞内信号转导，其中该结合蛋白包括特异性结合至IL27Rα的单域抗体(sdAb)(抗-IL27RαsdAb)和特异性结合至gp130的sdAb(抗-gp130 sdAb)。在一些实施方式中，IL27Rα和gp130的多聚化可导致下游信号转导。
在一些实施方式中，抗-IL27RαsdAb是VHH抗体(抗IL27RαVHH抗体)和/或抗-gp130sdAb是VHH抗体(抗gp130 VHH抗体)。在一些实施方式中，抗-IL27RαsdAb和抗-gp130 sdAb直接或通过肽接头连接。在一些实施方式中，肽接头包含1至50个氨基酸。在具体的实施方式中，肽接头包含GGGS的序列(SEQ ID NO:108)。
在一些实施方式中，IL27R结合蛋白包括：
第一VHH抗体，其包含相对于表1A的行的CDR1的序列具有至少90％(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性，或具有0、1、2或3个氨基酸变化，任选保守的氨基酸变化的CDR1；相对于表1A的同一行的CDR2的序列具有至少90％(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性，或具有0、1、2或3个氨基酸变化，任选保守的氨基酸变化的CDR2；和相对于表1A的同一行的CDR3具有至少90％(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性，或具有0、1、2或3个氨基酸变化，任选保守的氨基酸变化的CDR3；和
第二VHH抗体，其包含相对于表1A的同一行的CDR4的序列具有至少90％(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性，或具有0、1、2或3个氨基酸变化，任选保守的氨基酸变化的CDR1；相对于表1A的同一行的CDR5的序列具有至少90％(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性，或具有0、1、2或3个氨基酸变化，任选保守的氨基酸变化的CDR2；和相对于表1A的同一行的CDR6具有至少90％(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性，或具有0、1、2或3个氨基酸变化，任选保守的氨基酸变化的CDR3。
在一些实施方式中，IL27R结合蛋白包含与表1A所示的双VHH二聚体序列中任一个具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在某些实施方式中，抗IL27RαVHH抗体包含相对于SEQ ID NO:193-198中任一项序列具有0、1、2或3个氨基酸变化的CDR1；相对于SEQ ID NO:199-204中任一项序列具有0、1、2或3个氨基酸变化的CDR2；和相对于SEQ ID NO:205-210中任一项序列具有0、1、2或3个氨基酸变化的CDR3。在其他实施方式中，抗gp130 VHH抗体包含相对于SEQ ID NO:211-217中任一项序列具有0、1、2或3个氨基酸变化的CDR1；相对于SEQ ID NO:218-224中任一项序列具有0、1、2或3个氨基酸变化的CDR2；和相对于SEQ ID NO:225-231中任一项序列具有0、1、2或3个氨基酸变化的CDR3。
在具体的实施方式中，IL27R结合蛋白包含抗-IL27RαVHH抗体中的CDR1、CDR2和CDR3，以及抗-gp130 VHH抗体中的CDR1、CDR2和CDR3，如表1的行中所列出。
在一些实施方式中，结合蛋白包含连接至接头的N-末端的抗gp130 VHH抗体和连接至接头的C-末端的抗IL27RαVHH抗体。在一些实施方式中，抗gp130 VHH抗体包含相对于SEQ ID NO:232-237中任一项序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的序列。在一些实施方式中，抗IL27RαVHH抗体包含相对于SEQ IDNO:238-244中任一项序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的序列。
在具体的实施方式中，抗-gp130 VHH抗体和抗-IL27RαVHH抗体各包含相对于表2A的行中所列序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在某些实施方式中，结合蛋白包含与SEQ ID NO:1-42中任一项序列基本相同的序列。在某些实施方式中，结合蛋白包含相对于SEQ ID NO:1-42中任一项序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在一些实施方式中，结合蛋白包含连接至接头的N-末端的抗IL27RαVHH抗体和连接至所述接头的C-末端的抗gp130 VHH抗体。在一些实施方式中，抗IL27RαVHH抗体包含相对于SEQ ID NO:245-251中任一项序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的序列。在某些实施方式中，抗-gp130 VHH抗体包含与SEQ ID NO:252-257中任一项序列具有至少90％序列同一性的序列。
在具体的实施方式中，抗IL27RαVHH抗体和抗gp130 VHH抗体各包含相对于表3A的行中所列序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在某些实施方式中，结合蛋白包含与SEQ ID NO:43-84中任一项序列基本相同的序列。在某些实施方式中，结合蛋白包含相对于SEQ ID NO:43-84中任一项序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
另一方面，本发明提供了编码本文所述的IL27R结合蛋白的分离的核酸。在某些实施方式中，分离的核酸包含相对于表1B中序列或SEQ ID NO:109-192中任一项序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的序列。本发明还提供了包含核酸的表达载体。本发明还提供了包含表达载体的分离的宿主细胞。
在另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本文所述的IL27R结合蛋白和药学上可接受的运载体。
在另一方面，本发明提供了一种在有需要的对象中治疗自身免疫或炎性疾病、病症或病况、肿瘤性疾病或病毒感染的方法，包括向对象给予治疗有效量的本文所述的IL27R结合蛋白或本文所述的药物组合物。
在一些实施方式中，该方法进一步包括给予一种或多种选自下组的补充试剂：类固醇、Janus激酶抑制剂、钙调磷酸酶抑制剂、mTor抑制剂、IMDH抑制剂、生物制剂、疫苗和治疗性抗体。在某些实施方式中，治疗性抗体是结合选自下组的蛋白质的抗体：BLyS、CD11a、CD20、CD25、CD3、CD52,IgEIL12/IL23、IL17a、IL1β、IL4Rα、IL5、IL6R、整合素-α4β7、RANKL、TNFα、VEGF-A和VLA-4。
在某些实施方式中，该疾病、病症或病况选自：病毒感染、幽门螺杆菌感染、HTLV、器官排斥、移植物抗宿主病、自身免疫性甲状腺疾病、多发性硬化症、过敏、哮喘、神经退行性疾病，例如阿尔茨海默病、系统性红斑狼疮(SLE)、自体炎症疾病、炎性肠病(IBD)、克罗恩病、糖尿病、软骨炎、关节炎、类风湿性关节炎、幼年关节炎、幼年类风湿性关节炎、幼年类风湿性关节炎、多关节型幼年类风湿性关节炎、幼年类风湿性关节炎全身发作、幼年强直性脊柱炎、幼年肠病性关节炎、幼年反应性关节炎、幼年瑞特氏综合征、SEA综合征、幼年皮肌炎、幼年银屑病关节炎、幼年硬皮病、幼年系统性红斑狼疮、幼年血管炎、少关节型类风湿性关节炎、多关节型类风湿性关节炎、类风湿性关节炎全身发作、强直性脊柱炎、肠病性关节炎、反应性关节炎、瑞特氏综合征、SEA综合征、银屑病、银屑病关节炎、皮炎(湿疹)、剥脱性皮炎或特应性皮炎、毛发红糠疹、酒渣鼻糠疹、类银屑病、苔癣样糠疹、扁平苔藓、光泽苔藓、鱼鳞病样皮肤病、皮肤角化病、皮肤病、斑秃、坏疽性脓皮病、白癜风、类天疱疮、荨麻疹、角化病、类风湿性关节炎；脂溢性皮炎、日光性皮炎；脂溢性角化病、老年性角化病、光化性角化病、光诱导性角化病、毛囊角化病；寻常痤疮；瘢痕瘤；痣；肉赘，包括疣、湿疣或尖锐湿疣，以及人乳头状瘤病毒(HPV)感染。
本文所述的IL27R结合蛋白可用于在有需要的对象中治疗肿瘤性疾病，例如癌症(例如，实体瘤癌症；例如，非小细胞肺癌(NSCLC)、肾细胞癌(RCC)或黑色素瘤)和/或感染性疾病(例如，细菌感染和病毒感染(例如，由丙型肝炎病毒(HCV)、人乳头瘤病毒(HPV)或人免疫缺陷病毒(HIV)导致的病毒感染)。IL27R结合蛋白结合至并激活CD8+T细胞、CD4+T细胞和/或T调节(Treg)细胞。IL27R结合蛋白可以在不同的细胞类型中触发不同水平的下游信号转导。例如，通过改变IL27R结合蛋白中抗IL27RαVHH抗体和抗gp130 VHH抗体之间的接头的长度，与不期望的细胞类型相比，IL27R结合蛋白可以在期望的细胞类型中引起更高水平的下游信号转导。在一些实施方式中，通过改变接头长度，与其他细胞中的下游信号转导水平相比，IL27R结合蛋白可以在T细胞(例如CD8+T细胞)中引起更高水平的下游信号转导。在其他实施方式中，具有不同结合亲和力的不同抗IL27RαVHH抗体和具有不同结合亲和力的不同抗gp130 VHH抗体可以组合以制备不同的IL27R结合蛋白。此外，还可以改变两种抗体在结合蛋白中的取向以制备不同的结合蛋白(即，抗IL27RαVHH抗体-接头-抗gp130 VHH抗体，或抗gp130 VHH抗体-接头-抗IL27RαVHH抗体)。可以筛选不同的IL27R结合蛋白，以找到理想的结合蛋白，与不期望的细胞类型相比，该蛋白在所需的细胞类型中引起更高水平的下游信号转导。在一些实施方式中，T细胞(例如CD8+T细胞)中的下游信号转导水平是其他细胞中下游信号转导水平的至少1.1、1.5、2、3、5或10倍。
具体地，IL27R结合蛋白结合至并激活CD8+T细胞。在一些实施方式中，IL27R结合蛋白结合至并激活CXCR5+CD8+T细胞。众所周知，在例如病毒感染期间，IL27可以促进和维持记忆样CXCR5+CD8+T细胞的快速分裂。CXCR5+CD8+T细胞可以在持续感染或癌症期间维持T细胞反应，并在抗-PD1治疗后驱动CD8+T细胞的增殖爆发。因此，本文所述的IL27R结合蛋白有助于在慢性感染和肿瘤性疾病(例如癌症)中维持和增强自我更新的T细胞。
附图简要说明
附图的图1提供了本发明的二价结合分子的一个实施方式的示意图，其包含第一单域抗体(1)和第二单域抗体(3)以及接头(2)，其描述为与细胞膜(10)相关联的异二聚体受体相互作用，该异二聚体受体包含含有胞外结构域(4)、跨膜结构域(5)和与二价结合分子相互作用的胞内结构域(6)的第一受体亚基，以及包含含有胞外结构域(7)、跨膜结构域(8)和胞内结构域(9)的第二个第一受体亚基，其中二价结合分子的第一受体(6)的胞内结构域和第二受体(9)的胞内结构域在接近距离(11)内。
附图的图2提供了本发明的二价结合分子的两种说明性构型的示意图。分图A提供了说明性单多肽链二价结合分子的示意图，其包含从氨基到羧基的第一单域抗体(1)和第二单域抗体(3)和接头(2)。分图B提供了包含第一单域抗体(1)和第二单域抗体(3)和接头(2)以及杵臼(knob-into-hole)Fc结构域的二价结合分子的示意图，所述Fc结构域包含作为Fc杵(13)的第一亚基和作为Fc臼(14)的第二亚基，其中二价结合分子通过IgG铰链区序列(12)共价连接至Fc结构域亚基。
附图的图3提供了本发明的二价结合分子的两种说明性构型的示意图。分图A提供了一个说明性二价结合分子构建体的示意图，该二价结合分子构建体包含两个二价结合分子，每个结合分子附接至杵臼Fc结构域的亚基上，该构建体包含两条多肽链，第一多肽链(从氨基到羧基)包含第一单域抗体(1)、接头(2)和第二单域抗体(3)、IgG铰链序列(12)和Fc杵亚基(13)，第二多肽链(从氨基到羧基)包含第一单域抗体(1)、接头(2)和第二单域抗体(3)、IgG铰链序列(12)和Fc臼亚基(14)，其中第一和第二多肽通过杵臼Fc结构域的相互作用稳定缔合。分图B提供了结合分子构建体的替代排列的示意图，该结合分子构建体包含两条多肽，第一多肽链(从氨基到羧基)包含第一单域抗体(1)、接头(2)和第二单域抗体(3)、IgG铰链序列(12)和Fc杵亚基(13)，第二多肽链(从氨基到羧基)包含第一第二域抗体(3)、接头(2)和第一单域抗体(1)、IgG铰链序列(12)和Fc臼亚基(14)，其中第一和第二多肽通过杵臼Fc结构域的相互作用稳定缔合。
图4，分图A提供了本发明的二价结合分子的构型的替代性示意图，其中一个单域抗体附接至包含两个多肽的杵臼Fc结构域的各个亚基，第一多肽包含(从氨基到羧基)第一单域抗体(1)、IgG铰链序列(12)和Fc杵亚基(13)，第二多肽包含(从氨基到羧基)第二单域抗体(3)、IgG铰链序列(12)和Fc臼亚基(13)，其中第一和第二单域抗体通过杵臼Fc结构域的相互作用稳定缔合。
图4，分图B提供了结合分子的示意图，结合结构域是通过过渡金属配位共价复合物缔合的单域抗体。如图所示，结合分子包含两个多肽亚基：包含第一单域抗体(1)的第一亚基通过第一接头(15)附接至第一螯合肽(17)，包含第二单域抗体(3)的第二亚基通过第二接头(16)连接至第二螯合肽(18)，其中第一螯合肽(17)和第二螯合肽(18)与单过渡金属离子(“M”)形成配位共价复合物。过渡金属离子可以处于动力学不稳定或动力学惰性氧化状态。
具体实施方式
I.引言
本发明提供了可用于细胞受体的配对以产生可用于治疗疾病的所需效果的组合物。通常，提供的结合蛋白包括结合至IL27Rα的第一结构域和结合至gp130的第二结构域，使得在与表达IL27Rα和gp130的细胞接触时，结合蛋白引起IL27Rα和gp130功能性缔合，从而导致受体的功能性二聚化和下游信号转导。
本文描述的结合蛋白有几个优点。IL27R的天然配体IL27导致IL27Rα和gp130接近(即通过它们对IL27的同时结合)。然而，当IL27在哺乳动物(特别是人)对象中被用作治疗剂时，它也可能通过多种机制引发许多不利和不良影响，包括IL27Rα和gp130在其他细胞类型上的存在以及与其他细胞类型上的IL27Rα和gp130的结合可能会对表达IL27Rα和gp130的细胞产生不良影响和/或不期望的信号转导。本发明涉及调节IL27Rα和gp130结合的多重效应的方法和组合物，从而发生所需的治疗信号转导，特别是在所需的细胞或组织亚型中，同时最小化不期望的活性和/或胞内信号转导。
在一些实施方式中，本文所述的结合蛋白设计为使得结合蛋白在所需细胞类型上从与IL27Rα和gp130的结合提供最大所需的IL27胞内信号转导，同时对其他不期望的细胞类型提供显著较少的IL27信号转导。例如，这可以通过选择与IL27对IL27Rα和gp130的亲和力相比具有不同亲和力或引起对IL27Rα和gp130的不同E最大的结合蛋白来实现。因为不同的细胞类型以不同的灵敏度响应配体与其同源受体的结合，通过调节二聚体配体(或其单个结合部分)对IL-27受体相对于野生型IL-27结合的亲和力促进所需活性的刺激同时减少对非靶细胞的不期望的活性。要测量下游信号活性，可以使用多种方法。例如，在一些实施方式中，可以通过磷酸化受体和/或磷酸化STAT的存在来测量JAK/STAT信号转导。在其他实施方式中，还可以测量一种或多种下游基因的表达，其表达水平可受结合蛋白引起的下游信号转导水平的影响。
白细胞介素27(IL27)结构：
IL27是IL-12白细胞介素家族的成员。IL27是由两个亚基构成的异二聚体细胞因子：IL27A(也称为IL-27p28)和IL27B(也称为爱泼斯坦-巴尔病毒病毒诱导基因3或称“EBI3”)。人p28(hIL27A)表达为243个氨基酸的前蛋白，其包含28个氨基酸的信号序列，其在翻译后被去除，以产生215个氨基酸的成熟蛋白质。UniProtKB-Q8NEV9(IL27A_HUMAN)。p28的成熟形式(去除信号肽)具有氨基酸序列；
FPRPPGRPQLSLQELRREFTVSLHLARKLLSEVRGQAHRFAESHLPGVNLYLLPLGEQLPDVSLTFQAWRRLSDPERLCFISTTLQPFHALLGGLGTQGRWTNMERMQLWAMRLDLRDLQRHLRFQVLAAGFNLPEEEEEEEEEEEEERKGLLPGALGSALQGPAQVSWPQLLSTYRLLHSLELVLSRAVRELLLLSKAGHSVWPLGFPTLSPQP(SEQID NO:400)
人IL27B(hIL27B)表达为229个氨基酸的前蛋白，其包含20个氨基酸的信号序列，其在翻译后被去除，以产生209个氨基酸的成熟蛋白质。UniProtKB-Q14213(IL27B_HUMAN)。hIL27B的成熟形式(去除信号肽)具有氨基酸序列
RKGPPAALTLPRVQCRASRYPIAVDCSWTLPPAPNSTSPVSFIATYRLGMAARGHSWPCLQQTPTSTSCTITDVQLFSMAPYVLNVTAVHPWGSSSSFVPFITEHIIKPDPPEGVRLSPLAERQLQVQWEPPGSWPFPEIFSLKYWIRYKRQGAARFHRVGPIEATSFILRAVRPRARYYVQVAAQDLTDYGELSDWSLPATATMSLGK(SEQ ID NO:401)
白细胞介素27(IL27)受体：
IL27通过其与IL-27Rɑ(或IL27RA)和gp130组成的异二聚体受体的相互作用导致胞内信号转导。IL27对IL27受体的结合激活信号转导途径，包括JAK/STAT和p38 MAPK途径。IL27刺激不同细胞类型的促炎和抗炎反应，如巨噬细胞、树突细胞、T细胞和B细胞。反应的类型取决于环境。
人IL27受体亚基α(hIL27RA)表达为636个氨基酸的前蛋白，其包含32个氨基酸的信号序列，其在翻译后被去除，以产生604个氨基酸的成熟蛋白质。UniProtKB-Q6UWB1(I27RA_HUMAN)
hIL27RA的成熟形式(去除信号肽)具有氨基酸序列：
QGSAGPLQCYGVGPLGDLNCSWEPLGDLGAPSELHLQSQKYRSNKTQTVAVAAGRSWVAIPREQLTMSDKLLVWGTKAGQPLWPPVFVNLETQMKPNAPRLGPDVDFSEDDPLEATVHWAPPTWPSHKVLICQFHYRRCQEAAWTLLEPELKTIPLTPVEIQDLELATGYKVYGRCRMEKEEDLWGEWSPILSFQTPPSAPKDVWVSGNLCGTPGGEEPLLLWKAPGPCVQVSYKVWFWVGGRELSPEGITCCCSLIPSGAEWARVSAVNATSWEPLTNLSLVCLDSASAPRSVAVSSIAGSTELLVTWQPGPGEPLEHVVDWARDGDPLEKLNWVRLPPGNLSALLPGNFTVGVPYRITVTAVSASGLASASSVWGFREELAPLVGPTLWRLQDAPPGTPAIAWGEVPRHQLRGHLTHYTLCAQSGTSPSVCMNVSGNTQSVTLPDLPWGPCELWVTASTIAGQGPPGPILRLHLPDNTLRWKVLPGILFLWGLFLLGCGLSLATSGRCYHLRHKVLPRWVWEKVPDPANSSSGQPHMEQVPEAQPLGDLPILEVEEMEPPPVMESSQPAQATAPLDSGYEKHFLPTPEELGLLGPPRPQVLA(SEQ ID NO:402)
hIL27RA的胞外结构域(IL27RA-ECD)是484个氨基酸的多肽，对应于hIL27RA前蛋白的氨基酸33-516，并具有氨基酸序列：
QGSAGPLQCYGVGPLGDLNCSWEPLGDLGAPSELHLQSQKYRSNKTQTVAVAAGRSWVAIPREQLTMSDKLLVWGTKAGQPLWPPVFVNLETQMKPNAPRLGPDVDFSEDDPLEATVHWAPPTWPSHKVLICQFHYRRCQEAAWTLLEPELKTIPLTPVEIQDLELATGYKVYGRCRMEKEEDLWGEWSPILSFQTPPSAPKDVWVSGNLCGTPGGEEPLLLWKAPGPCVQVSYKVWFWVGGRELSPEGITCCCSLIPSGAEWARVSAVNATSWEPLTNLSLVCLDSASAPRSVAVSSIAGSTELLVTWQPGPGEPLEHVVDWARDGDPLEKLNWVRLPPGNLSALLPGNFTVGVPYRITVTAVSASGLASASSVWGFREELAPLVGPTLWRLQDAPPGTPAIAWGEVPRHQLRGHLTHYTLCAQSGTSPSVCMNVSGNTQSVTLPDLPWGPCELWVTASTIAGQGPPGPILRLHLPDNTLRWK(SEQ ID NO:403)
人gp130受体亚基(hGP130)也被称为IL6受体β亚基。UniProtKB-P40189(IL6RB_HUMAN。hGP130表达为918个氨基酸的前蛋白，其包含22个氨基酸的信号序列，信号序列在翻译后被去除，以产生896个氨基酸的成熟蛋白质。hGP130的成熟形式具有氨基酸序列：
ELLDPCGYISPESPVVQLHSNFTAVCVLKEKCMDYFHVNANYIVWKTNHFTIPKEQYTIINRTASSVTFTDIASLNIQLTCNILTFGQLEQNVYGITIISGLPPEKPKNLSCIVNEGKKMRCEWDGGRETHLETNFTLKSEWATHKFADCKAKRDTPTSCTVDYSTVYFVNIEVWVEAENALGKVTSDHINFDPVYKVKPNPPHNLSVINSEELSSILKLTWTNPSIKSVIILKYNIQYRTKDASTWSQIPPEDTASTRSSFTVQDLKPFTEYVFRIRCMKEDGKGYWSDWSEEASGITYEDRPSKAPSFWYKIDPSHTQGYRTVQLVWKTLPPFEANGKILDYEVTLTRWKSHLQNYTVNATKLTVNLTNDRYLATLTVRNLVGKSDAAVLTIPACDFQATHPVMDLKAFPKDNMLWVEWTTPRESVKKYILEWCVLSDKAPCITDWQQEDGTVHRTYLRGNLAESKCYLITVTPVYADGPGSPESIKAYLKQAPPSKGPTVRTKKVGKNEAVLEWDQLPVDVQNGFIRNYTIFYRTIIGNETAVNVDSSHTEYTLSSLTSDTLYMVRMAAYTDEGGKDGPEFTFTTPKFAQGEIEAIVVPVCLAFLLTTLLGVLFCFNKRDLIKKHIWPNVPDPSKSHIAQWSPHTPPRHNFNSKDQMYSDGNFTDVSVVEIEANDKKPFPEDLKSLDLFKKEKINTEGHSSGIGGSSCMSSSRPSISSSDENESSQNTSSTVQYSTVVHSGYRHQVPSVQVFSRSESTQPLLDSEERPEDLQLVDHVDGGDGILPRQQYFKQNCSQHESSPDISHFERSKQVSSVNEEDFVRLKQQISDHISQSCGSGQMKMFQEVSAADAFGPGTEGQVERFETVGMEAATDEGMPKSYLPQTVRQGGYMPQ(SEQ IDNO:404)
hGP130的胞外结构域(hGP130-ECD)是597个氨基酸的多肽，对应于hGP130前蛋白的氨基酸23-619，并具有氨基酸序列：
ELLDPCGYISPESPVVQLHSNFTAVCVLKEKCMDYFHVNANYIVWKTNHFTIPKEQYTIINRTASSVTFTDIASLNIQLTCNILTFGQLEQNVYGITIISGLPPEKPKNLSCIVNEGKKMRCEWDGGRETHLETNFTLKSEWATHKFADCKAKRDTPTSCTVDYSTVYFVNIEVWVEAENALGKVTSDHINFDPVYKVKPNPPHNLSVINSEELSSILKLTWTNPSIKSVIILKYNIQYRTKDASTWSQIPPEDTASTRSSFTVQDLKPFTEYVFRIRCMKEDGKGYWSDWSEEASGITYEDRPSKAPSFWYKIDPSHTQGYRTVQLVWKTLPPFEANGKILDYEVTLTRWKSHLQNYTVNATKLTVNLTNDRYLATLTVRNLVGKSDAAVLTIPACDFQATHPVMDLKAFPKDNMLWVEWTTPRESVKKYILEWCVLSDKAPCITDWQQEDGTVHRTYLRGNLAESKCYLITVTPVYADGPGSPESIKAYLKQAPPSKGPTVRTKKVGKNEAVLEWDQLPVDVQNGFIRNYTIFYRTIIGNETAVNVDSSHTEYTLSSLTSDTLYMVRMAAYTDEGGKDGPEFTFTTPKFAQGEIE(SEQID NO:405)
IL27活性
IL27由抗原呈递细胞表达。hIL27诱导免疫系统中不同T细胞群体的分化，并上调IL10。hIL27具有促炎和抗炎特性，可以调节T-辅助细胞发育，抑制T细胞增殖，刺激细胞毒性T细胞活性，诱导B细胞的同种型转换，并对先天性免疫细胞具有多种影响。在其靶细胞中有CD4 T-辅助细胞，其可以分化为1型效应细胞(TH1)、2型效应细胞(TH2)和产生IL17的辅助T细胞(TH17)。
T细胞分化
IL27通过诱导或抑制包括Th1、Th2、Th17、Tr1和Treg细胞在内的T细胞亚型，在分化中发挥重要作用。IL-27通过诱导或抑制各T细胞亚群而在很大程度上参与分化。在应答IL27中，通过STAT1信号转导通过T-β(T-bet)和标志性Th1基因的表达产生表达干扰素-γ(IFNg)的Th1细胞。表达IL4的Th2细胞通过转录因子GATA-3被IL27抑制。表达IL17、IL22和GM-CSF的Th17细胞通过STAT1和转录因子RORγt的表达被IL27抑制。Treg细胞通过STAT1和STAT3被IL27抑制。
IL27驱动原初但非记忆CD4 T细胞的快速克隆扩增。IL27还与IL-12强协同作用以触发原初CD4 T细胞的干扰素-γ/IFN-γ产生，结合至细胞因子受体WSX-1/TCCR。IL-27的另一个重要作用是其抗肿瘤活性，以及通过激活抗血管生成趋化因子的产生而具有的抗血管生成活性。
IL10的诱导
表达IL-10的Tr1细胞由IL-27通过提供抗炎反应的转录因子c-Maf诱导。IL-10的主要活性是抑制炎症反应。特异性结合至IL-27ɑ的STAT1和STAT3转录因子也参与其中。IL-27对STAT3的激活导致Treg细胞分泌IL-10增加。
II.定义
为了便于理解本公开，某些术语和短语定义于下文以及整个说明书。本文提供的定义是非限制性的，应根据本领域技术人员的知识阅读。
在描述本发明的方法和组合物之前，应理解，本发明不限于所述的方法或组合物，因为它们当然可能改变。还应理解，本文中使用的术语仅意在描述实施方式，并不旨在进行限制。
提供数值范围时，也应视作具体公开了该范围的上限和下限之间以下限单位十分之一为间隔的各中间数值，除非上下文另有明确说明。本发明还包括设定范围内任何设定数值或中间数值和该设定范围内任何其它设定数值或中间数值之间的较小范围。取决于设定范围内任何明确排除的限值，所述范围可独立地包含或排除这些较小范围的上下限，本发明也包括这些较小范围不包含限值、包含任一或两个限值的各范围。设定范围包含一个或两个限值时，本发明也包括排除所述限值之一个或两个的范围。
除非另有说明，本文所用的所有科技术语与本发明所属领域普通技术人员所理解的通常含义相同。虽然也可采用与本文所述类似或等同的任何方法和材料实施或测试本发明，但在此描述一些潜在和优选的方法和材料。本文提及的所有出版物均通过引用纳入本文，以公开和描述与所引用出版物相关的方法和/或材料。
应注意，本文和所附权利要求书所用的单数形式"一个"、"一种"和"所述"包括复数含义，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提到"细胞"包括多个这样的细胞，提到"所述肽"包括本领域技术人员已知的一或多个肽及其等同物，例如多肽，等等。
提供本文讨论的出版物仅针对其在本申请提交日之前的公开。本文中所有内容均不应解释为承认本发明不能凭借在先发明而先于这些出版物。此外，所提供的出版日期可能与实际公开日期不同，这可能需要单独确认。
除非另有说明，份数是重量份数，分子量是重均分子量，温度是摄氏度(℃)，压力是大气压或接近大气压。使用标准缩写，包括下述：bp＝碱基对；kb＝千碱基；pl＝皮升；s或sec＝秒；min＝分钟；h或hr＝小时；AA或aa＝氨基酸；kb＝千碱基；nt＝核苷酸；pg＝皮克；ng＝纳克；μg＝微克；mg＝毫克；g＝克；kg＝千克；dl或dL＝分升；μl或μL＝微升；ml或mL＝毫升；l或L＝升；μM＝微摩尔；mM＝毫摩尔；M＝摩尔；kDa＝千道尔顿；i.m.＝肌肉内(经肌肉内)；i.p.＝腹膜内(经腹膜内)；SC或SQ＝皮下(经皮下)；QD＝每日一次；BID＝每日两次；QW＝每周一次；QM＝每月一次；HPLC＝高效液相色谱；BW＝体重；U＝单元；ns＝无统计学显著性；PBS＝磷酸盐缓冲盐水；PCR＝聚合酶链式反应；HSA＝人血清白蛋白；MSA＝小鼠血清白蛋白；DMEM＝达氏改良伊氏培养基；EDTA＝乙二胺四乙酸。
应理解，在本公开内容中，根据单字母或三字母代码提及氨基酸。为了方便阅读者，单字母和三字母氨基酸代码在下表中提供：
科学文献中描述了分子生物学的标准方法(参见，例如，Sambrook和Russell(2001)《分子克隆》(Molecular Cloning)，第3版，冷泉港实验室出版社(Cold SpringHarbor Laboratory Press)，纽约冷泉港；和Ausubel,等(2001)《新编分子生物学指南》(Current Protocols in Molecular Biology),卷1-4，约翰威利父子公司(John Wileyand Sons,Inc.)纽约州纽约，其描述了在细菌细胞中克隆和DNA定点诱变(卷1)、哺乳动物细胞中和酵母中的克隆(卷2)、糖偶联物和蛋白质表达(卷3)，以及生物信息学(卷4))。科学文献描述了用于蛋白质纯化的方法，包括免疫沉淀、层析、电泳、离心和结晶，以及化学分析、化学修饰、翻译后修饰、融合蛋白的生产和蛋白糖基化(参见，例如，Coligan,等(2000)《新编蛋白质科学方案》(Current Protocols in Protein Science),卷.1-2,约翰威利父子公司(John Wiley and Sons,Inc.),纽约州)。
激活：本文所用术语“激活”用于指受体或受体复合物以反映直接和/或通过参与多组分信号转导级联产生的生物学效应，该生物学效应是对配体的结合响应，由激动剂配体结合至受体产生的。
活性：如本文所用术语“活性”是针对分子而言，以描述分子相对于测试系统(例如，试验)的特性或生物学或化学特性(例如该分子结合至另一分子的程度)或材料或细胞的物理学特性(例如细胞膜电位的改变)。这种生物学功能的例子包括但不限于生物剂的催化活性、刺激胞内信号转导的能力、基因表达、细胞增殖、调节免疫学活性(如炎症反应)的能力。“活性”通常表示为每个单元的测试试剂的生物活性水平，例如[催化活性]/[mg蛋白质]、[免疫活性]/[mg蛋白质]，活性的国际单位(IU)，[STAT5磷酸化]/[mg蛋白质]、[T-细胞增殖]/[mg蛋白质]、噬斑形成单位(plaque forming units)(pfu)等。如本文所用，术语“增殖活性”是指促进细胞增殖和复制的活性。
给药/给予：术语“给予”、“给药”和“施用”在本文中可互换使用，指的是接触对象的行为，包括用试剂与对象体外、体内或离体的细胞、组织、器官或生物流体接触(例如，直向同源物、IL2直向同源物、表达正交受体的工程改造的细胞、表达正交IL2受体的工程改造的细胞、表达正交IL2受体的CAR-T细胞、化疗剂、抗体或包含上述一种或多种的药物制剂)。试剂的给予可以通过多种本领域公认的方法中的任何一种来实现，包括但不限于局部给予、血管内注射(包括静脉内或动脉内输注)、皮内注射、皮下注射、肌内注射、腹膜内注射、吸入等。术语“给予”包括试剂与细胞、组织或器官的接触，以及试剂与液体的接触，其中液体与细胞、组织或器官接触。
亲和力：如本文所用术语“亲和力”是指第一分子(例如配体)特异性结合至第二分 子(例如受体)的程度，以平衡解离常数(KD)衡量，其为分子与其靶标之间的解离速率常数 (Koff)和分子与其靶标之间的缔合速率常数(Kon)的比率。
激动剂：如本文所用，术语“激动剂”是指特异性结合至第二试剂(“靶标”并与靶标相互作用以引起或促进靶标激活的增加的第一试剂。在一些情况下，激动剂是受体蛋白的激活剂，可以调节细胞激活、增强激活、使细胞对第二试剂的激活敏感、或上调一个或多个基因、蛋白质、配体、受体、生物学途径，其可能导致细胞增殖或导致细胞周期停止，或导致细胞死亡(如通过凋亡)的途径的表达。在一些实施方式中，激动剂是结合至受体并改变受体状态，导致生物学响应的试剂。该响应模拟受体的内源性激活剂的效果。术语“激动剂”包括部分激动剂、完全激动剂和超级激动剂。当激动剂导致所研究的受体诱发的基本完全的生物响应(即与天然存在的配体/受体结合相互作用有关的响应)时，可将这种激动剂描述为“完全激动剂”，或者，激动剂也可以被描述为部分激动剂。与激动剂相反，拮抗剂可以特异性地结合至受体，但不导致通常由受体启动的信号级联，并且可以改变激动剂在该受体上的作用。反向激动剂是指产生与激动剂方向相反的药理反应的药剂。"超级激动剂"是能够产生大于靶受体的内源性激动剂的最大响应的激动剂，因此具有超过天然配体的100％的活性。超级激动剂通常是合成分子，在比较试验中以类似的浓度评估时，在分子的天然存在形式的可评估的定量或定性参数中，其表现出大于110％、或者大于120％、或者大于130％、或者大于140％、或者大于150％、或者大于160％、或者大于170％的响应。
拮抗剂：如本文所用，术语“拮抗剂”或“抑制剂”是指与激动剂一种或多种作用相对的分子。拮抗剂可以防止、减少、抑制或中和激动剂的活性，而且拮抗剂也可以防止、抑制或减少靶标(如靶受体)的组成型活性，即使没有鉴定的激动剂。抑制剂是减少、阻断、防止、延迟激活、失活、脱敏或下调的分子，例如，基因、蛋白质、配体、受体、生物学途径或细胞。
抗体：如本文所用，术语“抗体”统称指：(a)糖基化的和非糖基化的免疫球蛋白(包括但不限于哺乳动物免疫球蛋白类别IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)，它们特异性结合至靶分子，和(b)免疫球蛋白衍生物，其包括但不限于IgG(1-4)ΔCH2、F(ab’)2、Fab、ScFv、VH、VL、四抗、三抗、双抗、dsFv、F(ab’)3、scFv-Fc和(scFv)2，它们与其来源的免疫球蛋白竞争结合至靶分子。术语抗体不限于来自任何特定哺乳动物物种的免疫球蛋白，包括鼠、人、马和骆驼抗体(例如人抗体)。术语“抗体”包括可从天然来源或用抗原免疫后从动物身上分离的抗体，以及工程改造抗体，包括单克隆抗体、双特异性抗体、三特异性、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、CDR移植的、饰面(veneered)的或去免疫化的(例如，去除T细胞表位)抗体。术语“人抗体”包括从人获得的抗体，以及从包含人免疫球蛋白基因的转基因哺乳动物中获得的抗体，使得，在抗原刺激后，转基因动物产生包含人产生的抗体的氨基酸序列特征的抗体。术语"抗体"应解释为不限于任何特定的合成方式，包括可从天然来源分离的天然存在的抗体，以及通过"重组"手段制备的工程改造抗体分子，所述工程改造的抗体分子包括从转人免疫球蛋白基因的转基因动物或由其制备的杂交瘤分离的抗体，从转化了导致抗体表达的核酸构建体的宿主细胞中分离出的抗体，从组合抗体文库(包括噬菌体展示文库)中分离出的抗体。
结合分子：如本文所用，术语“结合分子”是指可以结合两个细胞表面受体的胞外结构域的二价分子。在一些实施方式中，结合分子特异性结合两个不同的受体(或其结构域或亚基)，使得受体(或结构域或亚基)保持彼此接近，使得受体(或结构域或亚基)，包括其结构域(例如，胞内结构域)相互作用并导致下游信号转导。
CDR:如本文所用，术语“CDR”或“互补决定区”是指在重链和轻链多肽免疫球蛋白多肽的可变区内发现的非连续抗原结合位点。CDR已由Kabat等，J.Biol.Chem.252:6609-6616(1977)；Kabat等，(1991)U.S.美国卫生及公共服务部,题为“免疫学热门蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)”(本文中也称为“Kabat 1991”或“Kabat”)；由Chothia等，J.Mol.Biol.196:901-917(本文中也称为“Chothia”)；以及MacCallum等，(1996)J.Mol.Biol.262:732-745描述，其中定义包括当彼此比较时氨基酸残基的重叠或子集。不过，述及抗体或移植抗体或其变体的CDR定义意在落在本文定义或所用术语范围之内。如本文所用术语“Chothia编号”是本领域公认的术语，指基于结构环区的位置编号氨基酸残基的系统(Chothia等1986,Science 233:755-758；Chothia和Lesk 1987,JMB 196:901-917；Chothia等1992,JMB 227:799-817)。出于本公开的目的，除非另有特别说明，抗体可变区域中CDR2和3的定位遵循Kabat编号或简称为"Kabat"。抗体可变区域中CDR1的定位遵循Kabat和Chothia编号方案的混杂。
克隆型：克隆型定义为指源自同一B细胞祖细胞的结合分子的集合。如本文所用术语“克隆型”用于指属于同一种系家族、具有相同CDR3长度且在CDR3序列中具有70％或更高同源性的抗原结合分子的集合。
相当的：如本文所用，术语“相当的”用于描述可评价的定量或定性参数的两个测量结果的差异程度。例如，当可评价的定量参数的第一测量结果和该可评价参数的第二测量结果没有偏离本领域技术人员将会认为两个结果之间不会产生统计学显著性差异的范围，那么这两个测量将被视为“相当的”。在一些情况下，如果一个测量结果偏离另一个测量结果少于30％、或者少于25％、或者少于20％、或者少于15％、或者少于10％、或者少于7％、或者少于5％、或者少于4％、或者少于3％、或者少于2％或者少于1％，则测量结果可被视为“相当的”。在特定的实施方式中，如果一个测量结果偏离参考标准少于15％、或者少于10％、或者少于5％，则该测量结果与参考标准是相当的。
如本文所用，术语“下游信号转导”指由彼此相互接近的两个或更多个细胞表面受体的相互作用而导致的细胞信号转导过程。
有效浓度(EC):如本文所用，术语“有效浓度”或其缩写“EC”互换使用表示试剂(例如，hIL2突变蛋白)的浓度为足以使测试系统中给定参数改变的量。缩写“E”指的是当测试系统被暴露于测试试剂时，测试系统中观察到的给定生物学效应的量级。当反应的量级以测试试剂的浓度(“C”)的因数表示时，使用缩写“EC”。在生物系统的环境下，术语E最大指的是在响应于激活测试试剂的饱和浓度中观察到的给定生物学效应的最大量级。当提供带下标的缩写EC(例如，EC40、EC50等)时，下标是指在该浓度观察到生物学效应的E最大的百分比。例如，在测试系统中，响应于此测试试剂，测试试剂足以导致可测量的生物学参数减少这种可测量的生物学参数的最大水平的30％的浓度，针对此生物学参数，其被称为该测试试剂的“EC30”。类似地，术语“EC100”用于表示试剂的有效浓度，该浓度使得可测量参数对该试剂产生最大(100％)反应。类似地，术语EC50(其通常用于药代动力学领域)是指足以导致可测量参数半最大(50％)改变的试剂浓度。术语“饱和浓度”是指在标准温度和压力的条件下，测试试剂能够溶于标准体积的特定溶剂(例如水)的最大可能量。在药代动力学中，药物的饱和浓度通常用于表示足以使所有可用受体被药物占据的药物浓度，而EC50是给予半最大效应的药物浓度。测试试剂的特定有效浓度的EC可以相对于特定参数和测试系统的方面进行缩写。
胞外结构域：如本文所用术语“胞外结构域”或其缩写“ECD”是指细胞质膜外侧的细胞表面蛋白质部分(例如细胞表面受体)。术语“ECD”可以包括跨膜蛋白的胞质外部分或细胞表面的胞质外部分(或膜关联蛋白)。
同一性：如本文所用，在核酸或多肽的上下文中使用的术语“百分比(％)序列同一性”或“基本相同/基本同一”是指与参考序列具有至少50％序列同一性的序列。另外，百分比序列同一性可以是50％到100％之间的任何整数。在一些实施方式中，如使用标准参数通过BLAST确定的，序列与参考序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，如下所述。为了序列比较，一般将一个序列用作与测试序列比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，如果需要，指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可使用默认的程序参数，或者可指定替代性的参数。然后，序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。比较窗口包括对多个连续位置中的任何一个的区段的参考，例如至少10个残基的区段。在一些实施方式中，比较窗口具有10至600个残基，例如约10至约30个残基、约10至约20个残基、约50至约200个残基或约100至约150个残基，其中序列可以在两个序列最佳比对后，将其与相同数量的连续位置的参考序列进行比对。适合测定序列同一性百分数和序列相似性百分数的算法分别是BLAST和BLAST 2.0算法，描述于Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410和Altschul等(1977)Nucleic AcidsRes.25:3389-3402。进行BLAST分析的软件可从国家生物技术信息中心(National Centerfor Biotechnology Information)(NCBI)网站公开获得。此算法包括：首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字来鉴定高评分序列对(HSP)，与数据库序列中长度相同的字比对时它们能匹配或满足一些正值的阈值评分T。T称为相邻字评分阈值(Altschul等，同上)。这些初始相邻字命中(word hit)用作启动搜索的种子，以便找到含有它们的较长HSP。然后，沿各序列在两个方向上延伸该字命中，直到提高累积的比对评分。就核苷酸序列而言，采用参数M(一对匹配残基的奖励评分；总是>0)和N(错配残基的罚分；总是<0)计算累积评分。就氨基酸序列而言，用评分矩阵计算累积评分。出现以下情况时中止字命中在各个方向上的延伸：累积比对评分比其最大获得值降低X；由于一个或多个负评分残基比对的累积，累积评分变为零或零以下；或者达到任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X确定该比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)采用的默认值如下：字长(W)28，期望值(E)10，M＝1，N＝-2，以及比较两条链。对氨基酸序列而言，BLASTP程序使用的默认值为：字长(W)为3，期望值(E)为10，BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989))。BLAST算法也对两条序列间的相似性进行统计学分析(参见例如，Karlin和Altschul，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 90:5873-5787(1993))。BLAST算法提供的一种相似性度量是最小概率和(P(N))，它表明两条核苷酸或氨基酸序列之间偶尔发生匹配的概率。例如，如果测试氨基酸序列与参考氨基酸序列比较中的最小概率和小于约0.01，更优选小于约10-5，并且最优选小于约10-20，则认为氨基酸序列与参考序列相似。
如本文所用，术语“白细胞介素27受体”或“IL27R”指由亚基IL27Rα(IL27Rα)和糖蛋白130(gp130)形成且由配体IL27结合的异二聚体受体。IL27Rα的人序列列为UniProt IDNO.Q6UWB1。gp130的人序列列为UniProt ID NO.Q13514。
胞内信号转导：如本文所用，术语“胞内信号转导”和“下游信号转导”可互换使用，指由两个或多个彼此接近的细胞表面受体的胞内结构域(ICD)相互作用引起的细胞信号转导过程。在通过JAK/STAT途径的受体复合物中，受体亚基的ICDS的缔合使ICD的JAK结构域接近，从而启动磷酸化级联反应，其中STAT分子被磷酸化并移位至与特定核酸序列相关联的细胞核，导致细胞中特定基因的激活和表达。当被其天然同源IL27激活时，本发明的结合分子提供IL-27受体的胞内信号转导特征。要测量下游信号转导活性，可以使用多种方法。例如，在一些实施方式中，可以通过磷酸化受体和/或磷酸化STAT的存在来测量JAK/STAT信号转导。在其他实施方式中，还可以测量一种或多种下游基因的表达，其表达水平可受结合分子引起的下游信号转导水平的影响。
配体：如本文所用，术语“配体”是指表现出特异性结合至受体并导致受体生物活性改变从而使其所结合的受体的活性发生改变的分子。在一个实施方式中，术语“配体”是指可以作为受体的激动剂或拮抗剂的分子或其复合物。如本文所用，术语“配体”包括天然和合成的配体。“配体”也包括小分子，例如细胞因子的肽模拟物和抗体的肽模拟物。配体和受体的复合物被称为“配体-受体复合物”。
如本文所用，术语“接头”是指两个元件(例如蛋白质结构域)之间的连接。接头可以是共价键或肽接头。术语“键”是指化学键，例如酰胺键或二硫键，或由化学反应产生的任何种类的键，例如化学偶联。术语“肽接头”是指可用于连接两个蛋白质结构域以在两个蛋白质结构域之间提供空间和/或柔性的氨基酸或多肽。
调节：如本文所用，术语“调节”、“调制”等是指测试试剂在系统(包括生物系统或生化途径)中影响反应的能力，可以是积极或消极的，也可以是直接或间接的。
多聚化：如本文所用，术语“多聚化”是指使两个或多个细胞表面受体或其结构域或亚基彼此接近，使得受体或其结构域或亚基可以相互作用并引起胞内信号转导。
N-末端：如本文在多肽结构的上下文中使用，“N-末端”(或“氨基末端”)和“C-末端”(或“羧基末端”)分别指多肽的极氨基端和羧基端，而术语“N-末端的”和“C-末端的”分别指多肽的氨基酸序列中朝向N-末端和C-末端的相对位置，并可分别包括N-末端和C-末端残基。术语“近邻N-末端的”或“近邻C-末端的”用于指第一氨基酸残基相对于第二氨基酸残基的位置，其中第一和第二氨基酸残基共价结合以提供连续的氨基酸序列。
核酸：术语“核酸”、“核酸分子”、“多核苷酸”等在本文中可互换使用，并且是指任何长度的核苷酸的聚合形式，即脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物。多核苷酸的非限制性例子包括线性和环形核酸、信使RNA(mRNA)、互补DNA(cDNA)、重组多核苷酸、载体、探针、引物等。
操作性地连接：术语“操作性地连接”在本文中是指编码不同功能的核酸序列在组合成单个核酸序列时的关系，该核酸在被引入细胞时，提供能够在细胞中实现特定核酸序列的转录和/或翻译的核酸。例如，如果它被表达为参与多肽分泌的前蛋白，信号序列的DNA操作性地连接至多肽的DNA；如果它影响序列的转录，启动子或增强子操作性地连接至编码序列；或如果它被定位以促进翻译，核糖体结合位点操作性地连接至编码序列。通常，"操作性地连接"意为被连接的DNA序列是连续的，而且在分泌型前导的情况下，是连续的并且处于阅读段。然而，某些遗传元件，如增强子，不需要与它们产生作用的序列连续。
部分激动剂：如本文所用，术语“部分激动剂”是指特异性结合结合至并激活给定受体的分子，但相对于完全激动剂，它只具有部分激活受体。部分激动剂可以同时表现激动和拮抗作用。例如，当完全激动剂和部分激动剂同时存在时，部分激动剂作为竞争性拮抗剂，通过与完全激动剂竞争对受体的结合，相对于在不存在部分激动剂的情况下受体与完全激动剂的接触，导致受体激活净减少。临床上，当内源性配体存在的数量不足时，部分激动剂可用于激活受体，以提供所需的亚最大反应，或者当内源性配体数量过多时，它们可减少对受体的过度刺激。部分激动剂产生的最大反应(E最大)被称为其固有活性，当完全激动剂产生100％的反应时，可以用百分比表示其固有活性。在一些实施方式中，与由IL-27引起的E最大相比，IL-27结合分子具有降低的E最大。E最大反映了可通过配体(例如，本文所述的结合分子或天然细胞因子(例如，IL-27))获得的细胞类型中的最大反应水平。在一些实施方式中，本文所述的IL-27结合分子具有由IL-27引起的E最大的至少1％(例如，1％至100％、10％至100％、20％至100％、30％至100％、40％至100％、50％至100％、60％至100％、70％至100％、80％至100％、90％至100％、1％至90％、1％至80％、1％至70％、1％至60％、1％至50％、1％至40％、1％至30％、1％至20％或1％至10％)。在其他实施方式中，本文所述的IL-27结合分子的E最大大于(例如，至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％更大)天然配体IL-27的E最大。在一些实施方式中，通过改变IL-27结合分子的接头长度，IL-27结合分子的E最大可以改变。IL-27结合分子可在最需要的细胞类型中引起E最大，并在其他细胞类型中降低E最大。
多肽：如本文所用术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，并且指任何长度的氨基酸的聚合形式，其可以包括遗传编码的或非遗传编码的氨基酸，化学或生物化学修饰的或衍生的氨基酸，和具有修饰的多肽主链的多肽。这些术语包括融合蛋白，包括但不限于具有异源氨基酸序列的融合蛋白；具有异源和同源前导序列的融合蛋白；具有或不具有N-末端甲硫氨酸残基的融合蛋白；具有免疫学标签蛋白的融合蛋白；免疫学活性蛋白(例如抗原性白喉或破伤风毒素片段)的融合蛋白等等。
本文所用的术语“预防”、“防止”等是指在对象疾病、病症或病况或其症状发生之前启动的行动过程，使得暂时或永久地预防、减轻、抑制或减少对象患某种疾病、病症或病况或类似疾病的风险(例如通过没有临床症状来确定)，或推迟其发作，一般是在对象由于遗传、经验或环境因素而易患某种特定疾病、病症或病况的情况下。在某些情况下，术语“预防”、“防止”也被用来指减缓疾病、病症或病况从目前的状态向更有害的状态发展。
临近/接近：如本文所用，术语“临近/接近”是指在本文所述的结合分子结合至两个细胞表面受体或其结构域或其亚基之后两个细胞表面受体或其结构域或其亚基之间的空间邻近度或物理距离。在一些实施方式中，在结合分子结合至细胞表面受体或其结构域或其亚基后，细胞表面受体或其结构域或其亚基之间的空间邻近度可以是，例如小于约500埃，例如距离约为5埃至约500埃。在一些实施方式中，空间邻近度为小于约5埃、小于约20埃、小于约50埃、小于约75埃、小于约100埃、小于约150埃、小于约250埃、小于约300埃、小于约350埃、小于约400埃、小于约450埃、或小于约500埃。在一些实施方式中，空间邻近度为小于约100埃。在一些实施方式中，空间邻近度为小于约50埃。在一些实施方式中，空间邻近度为小于约20埃。在一些实施方式中，空间邻近度为小于约10埃。在一些实施方式中，空间邻近度的范围为约10至100埃、约50至150埃、约100至200埃、约150至250埃、约200至300埃、约250至350埃、约300至400埃、约350到450埃或约400至500埃。在一些实施方式中，空间邻近度为小于约250埃、或小于约200埃、或小于约150埃、或小于约120埃、或小于约100埃、或小于约80埃、或小于约70埃、或小于约50埃。
受体：如本文所用，术语“受体”是指具有特异性结合配体的结构域的多肽，该配体的结合导致该多肽的至少一种生物学特性的改变。在一些实施分数中，受体是“可溶性”受体，不与细胞表面关联。在一些实施方式中，受体是细胞表面受体，其包含胞外结构域(ECD)和膜关联结构域，后者用于将ECD锚定至细胞表面。在细胞表面受体的一些实施方式中，受体是跨膜多肽，其包括由通常称为跨膜结构域(transmembrane domain)(TM)的跨膜的结构域(membrane spanning domain)连接的胞内结构域(ICD)和胞外结构域(ECD)。配体结合至受体导致受体的构象改变，从而产生可测量的生物学效应。在一些情况下，如果受体是包括ECD、TM和ICD的跨膜多肽，配体结合至ECD导致由ICD的一个或多个结构域介导的可测量的胞内生物学效应，以响应于配体结合至ECD。在一些实施方式中，受体是多组分复合物的组分，以促进胞内信号转导。例如，配体可以结合未单独与任何胞内信号转导相关联的细胞表面分子，但在配体结合后促进导致胞内信号转导的多聚体复合物的形成。
重组：如本文所用，术语“重组的”用作形容词指使用重组DNA技术修饰多肽、核酸或细胞的方法。重组蛋白是使用重组DNA技术产生的蛋白，可以使用小写字母“r”(例如，rhIL2)的缩写标示，以表示产生蛋白的方法。类似地，如果细胞经修饰，通过使用重组DNA技术纳入(例如转染、转导、感染)外源核酸(例如ssDNA、dsDNA、ssRNA、dsRNA、mRNA、病毒或非病毒载体、质粒、黏粒等)，则细胞被称为“重组细胞”。用于重组DNA技术的技术和方案是本领域众所周知的，例如，可以在Sambrook等(1989)《分子克隆：实验室手册》(MolecularCloning:A Laboratory Manual)(第2版,冷泉港实验室出版社,纽约州普莱恩维尤)中和其他标准分子生物学实验手册中找到。
反应/响应/缓解：术语“反应/响应/缓解”，例如，细胞、组织、器官或生物体的反应，包括可评估的生化或生理参数(例如，浓度、密度、粘附性、增殖、激活、磷酸化、迁移、酶活、基因表达水平、基因表达率、能量消耗率(rate of energy consumption)、分化水平或状态)的定量或定性变化，其中该变化与激活、刺激或处理相关，或内部机制(如遗传编程)相关。在某些情况下，术语“激活”、“刺激”等是指由内部机制以及外部或环境因素调节的细胞激活。相反地，术语“抑制”、“下调”等则是指相反的效果。
单域抗体(sdAb)：术语“单域抗体”或“sdAb”是指具有单个(仅一个)单体可变抗体结构域的抗体。sdAb能够选择性地结合特定抗原。进一步如下定义地，VHH抗体是sdAb的一个示例。
特异性结合：本文所用的术语“特异性结合”是指一个分子结合至另一个分子的选择性或亲和性/亲和力的程度。在结合对(如本文所述的结合分子/受体、配体/受体、抗体/抗原、抗体/配体、抗体/受体结合对)的上下文中，当结合对的第一分子不以显著量结合至样品中存在的其他组分时，就称作结合对的第一分子特异性结合至结合对的第二分子。当结合对的第一分子对于第二分子的亲和力比第一分子对于样品中存在的其他组分的亲和力至少大2倍、或至少大5倍、或至少大10倍、或至少大20倍、或至少大100倍时，结合对的第一分子被称为特异性结合至结合对的第二分子。
稳定缔合：如本文所用，术语“稳定缔合”或“稳定缔合于”用于指代一个分子(例如，多肽)可以与另一个分子在延长的时间里缔合的各种方式。一个分子与另一个分子的稳定缔合可以通过多种方式作用，包括共价键合和非共价相互作用。在一些实施方式中，两个分子的稳定缔合可以通过共价键(例如肽键)作用。在其他实施方式中，两个分子的稳定缔合可以通过非共价相互作用作用。在两个分子之间提供稳定缔合的非共价相互作用的例子包括静电相互作用(例如，氢键合、离子键合、卤素结合、偶极-偶极相互作用、范德华力和π-效应(包括阳离子-π相互作用、阴离子-π相互作用和π-π相互作用))和疏水/亲水相互作用。在一些实施方式中，本发明的二价结合分子的sdAb的稳定缔合可受非共价相互作用的影响。在一个实施方式中，二价结合分子的sdAb的非共价稳定缔合可通过sdAb对“杵臼”修饰的Fc单体的偶联来实现。Fc“杵”单体与Fc“臼”单体稳定非共价缔合。特异性结合异二聚体受体的第一亚基的胞外结构域的第一sdAb与“Fc杵”单体的偶联，以及特异性结合异二聚体受体的第二亚基的胞外结构域的第二sdAb与“Fc臼”单体的偶联，提供了第一和第二sdAb的稳定缔合。杵臼修饰更全面地描述于Ridgway,等(1996)《蛋白质工程改造》(ProteinEngineering)9(7):617-621和1998年3月24日授权的美国专利号5,731,168、2010年1月5日授权的美国专利号7,642,228、2010年4月13日授权的美国专利号7,695,936以及2012年7月10日授权的美国专利号8,216,805。杵臼修饰是指在CH3结构域中两个免疫球蛋白重链之间界面的修饰，其中：i)在第一条重链的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较大侧链的氨基酸残基(例如，酪氨酸或色氨酸)替代，从表面产生突起(“杵”)和ii)在第二条重链的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较小侧链的氨基酸残基(如丙氨酸或苏氨酸)替代，从而在第二CH3结构域的界面内产生空腔(“臼”)，其中第一CH3结构域的突出侧链(“杵”)被第二CH3结构域中的空腔接收。在一个实施方式中，“杵臼修饰”包括抗体重链之一中的氨基酸取代T366W和任选地氨基酸取代S354C，和另一个抗体重链中的氨基酸取代T366S、L368A、Y407V和任选地Y349C。此外，Fc结构域可以通过在一条链上的S354和第二条链上的Y349位置引入半胱氨酸残基进行修饰，从而在Fc区的两个抗体重链之间产生稳定的二硫键(Carter,等(2001)Immunol Methods 248,7-15)。杵臼形式用于促进在具有“杵”修饰的第一Fc单体上第一多肽(例如结合IL27Rα的sdAb)的表达和在具有“臼”修饰的第二Fc单体上的第二多肽的表达，以促进异二聚体多肽偶联物的表达。
对象：术语“受体”、“个体”、“对象”和“患者”在本文中可互换使用，并指任何需要诊断、处理或治疗的哺乳动物对象，特别是人。用于治疗目的的"哺乳动物"是指被分类为哺乳动物的任何动物，包括人、家养和农场动物、非人灵长类动物，以及动物园、运动或宠物动物，例如狗、马、猫、奶牛、绵阳、山羊、猪等。在一些实施方式中，哺乳动物为人。
基本上地：本文中，术语“基本上地”指量、水平、值、数目、频率、百分比、维度、大小、量、质量或长度，其为参考量、水平、值、数目、频率、百分比、维度、大小、量、质量或长度的80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。在一个实施方式中，“基本上相同”指量、水平、值、数目、频率、百分比、维度、大小、量、质量或长度，其产生的作用(例如生理效应)约相同于参考量、水平、值、数目、频率、百分比、维度、大小、量、质量或长度。
患有：如本文所用，术语“患有”是指医生根据本领域公认的鉴定疾病、病症或病况的现有信息(包括但不限于X-射线、CT-扫描、常规实验室诊断测试(例如血细胞计数)、基因组数据、蛋白质表达数据、免疫组织化学)对对象做出的其需要或将受益于治疗的判断。术语患有通常与特定疾病状态结合使用，例如“患有肿瘤性疾病”指患者被诊断为携带肿瘤。
治疗有效量：如本文所用，术语“治疗有效量”是指向对象给予试剂，单独地或作为药物组合物或治疗方案的一部分，以单剂量或作为系列剂量的一部分，以能够对疾病、病症或病况的任何症状、方面或特征产生任何可检测的、积极影响的量。治疗有效量可以通过测量相关的生理效应来确定，并且可以结合给药方案和对对象病情的诊断分析等来调整。用于确定试剂的治疗有效量的评估参数由医生使用公认的诊断标准确定，包括但不限于指标例如年龄、体重、性别、总体健康状况、ECOG评分、可观察到的生理参数、血液浓度、血压、心电图、计算机断层扫描、X-射线等。或者或此外，还可以监测临床情境中通常评估的其他参数，以确定是否对对象给予了治疗有效量的试剂，如体温，心率，血液化学的正常化，血压的正常化，胆固醇水平的正常化，或疾病、病症或病况的任何症状、方面或特征，生物标志物水平的改变、生存期的延长、无进展生存期的延长、达到进展的时间的延长、治疗失败时间的延长、无事件生存期的延长、需要下次治疗时间的延长、客观缓解率的改善、反应持续时间的改善等，本领域的临床医生基于这些评估对象对给予试剂的反应的状况改善。
治疗/处理：术语“治疗”、“疗法”、“处理”等是指在诊断、观察到对象的疾病、病症或病况或其症状等之后，对于对象起始的行动过程(例如给予本文所述的结合分子或包含其的药物组合物)，从而暂时或永久地消除、减少、抑制、减轻或改善困扰对象的这种疾病、病症或病况的至少一个根本原因，或与这种疾病、病症或病况相关的至少一个症状。治疗包括对患有疾病的对象采取的行动过程，其中该行动过程导致对象的疾病被抑制(例如，阻止疾病、病症或病况的发展或改善与此相关的一个或多个症状)。
VHH:如本文所用，术语“VHH”是一种具有单个单体重链可变抗体结构域的sdAb。此类抗体可在天然缺乏轻链VHH的骆驼科哺乳动物(例如骆驼、美洲驼)中发现或从中产生，可通过骆驼(包括骆驼、美洲驼和羊驼)的免疫(参见例如Hamers-Casterman,等(1993)Nature363:446-448)或通过在VHH框架中构建的筛选文库(例如噬菌体文库)获得。具有给定特异性的抗体也可以来源于非哺乳动物来源，例如从软骨鱼(包但不限于鲨鱼)的免疫中获得的VHH。在特定的实施方式中，如果VHH和受体之间的平衡解离常数大于约10-6M、或者大于约10-8M、或者大于约10-10M、或者大于约10-11M、或大于约10-10M、大于约10-12M，例如通过Scatchard分析确定的，则如本文所述的双特异性VHH2结合分子中VHH结合至受体(例如天然或非天然受体对的第一受体或第二受体)(Munsen,等1980Analyt.Biochem.107:220-239)。从骆驼科动物中产生单域抗体的标准化方案在科学文献中是众所周知的。参见，例如，Vincke等(2012)《分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)》第8章,Walker,J.编(胡马纳出版社，新泽西州托托瓦)。特异性结合可使用本领域已知的技术进行评估，包括但不限于竞争ELISA、试验和/或试验。在一些实施方式中，本文所述的VHH可以是人源化的，以包含人框架区。可用于制备人源化VHH的人种系的例子包括但不限于VH3-23(例如UniProt ID:P01764)、VH3-74(例如UniProt ID:A0A0B4J1X5)、VH3-66(例如UniProt ID:A0A0C4DH42)、VH3-30(例如UniProt ID:P01768)、VH3-11(例如UniProt ID:P01762)和VH3-9(例如UniProt ID:P01782)。
VHH2 :如本文所用，术语“VHH2”和“双特异性VHH2”和“VHH二聚体”是指可互换使用以指代本发明的结合分子的亚型，其中第一和第二sdAb都是VHH，并且第一VHH结合至第一受体或其结构域或亚基，以及第二VHH结合至第二受体或其结构域或其亚基。
野生型：如本文所用，术语“野生型”或“WT”或“天然”用于指在自然界中发现且未被人为改变的氨基酸序列或核苷酸序列。
III.IL27受体结合蛋白
IL27受体(IL27R)包含IL27Rα亚基(IL27Rα)和糖蛋白130亚基(gp130)。本文提供了特异性结合至IL27Rα和gp130的IL27R结合蛋白。在一些实施方式中，IL27R结合蛋白结合至表达IL27Rα和gp130的哺乳动物细胞。在一些实施方式中，IL27R结合蛋白可以是如下所述的双特异性VHH2。
IL27R结合蛋白可以是具有结合至IL27Rα的第一VHH(抗-IL27RαVHH抗体)和结合至gp130的第二VHH(抗-gp130 VHH抗体)的双特异性VHH2，并当结合至表达IL27Rα和gp130的细胞(例如CD8+T细胞、CD4+T细胞和/或T调节(Treg)细胞)时，导致两个受体亚基的二聚化以及下游信号转导。
VHH是单域抗体(sdAb)的一种类型，其包含单个单体可变抗体结构域。像全长抗体一样，它能够选择性地结合特定抗原。VHH的互补决定区(CDR)位于单域多肽内。可以用从骆 驼科动物中发现的重链抗体对VHH进行工程改造。
示例性VHH具有约12-15kDa的分子量，其比由两条重链和两条轻链构成的传统哺乳动物抗体(150-160kDa)小得多。VHH可以在骆驼科哺乳动物(如骆驼、美洲驼、单峰驼、羊驼和骆马)中发现或产生，其天然地缺乏轻链。sdAb和VHH的描述可以见于例如De Greve等,Curr Opin Biotechnol.61:96-101,2019；Ciccarese,等,Front Genet.10:997,2019；Chanier和Chames,Antibodies(Basel)8(1),2019；和De Vlieger,等,《抗体》(Antibodies)(Basel)8(1),2018。
为了制备双特异性VHH2的结合蛋白，在一些实施方式中，可以分别合成两种VHH，然后通过接头接合在一起。或者，双特异性VHH2可以被合成为融合蛋白。具有不同结合活性的VHH和受体靶标可以配对以制备双特异性VHH2。结合蛋白可以在携带一种或两种相关受体的细胞上进行信号转导筛选。
在一些实施方式中，双特异性VHH2包含：
第一VHH抗体，其包含相对于表1A的行的CDR1的序列具有至少90％(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性，或具有0、1、2或3个氨基酸变化，任选保守的氨基酸变化的CDR1；相对于表1A的同一行的CDR2的序列具有至少90％(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性，或具有0、1、2或3个氨基酸变化，任选保守的氨基酸变化的CDR2；和相对于表1A的同一行的CDR3具有至少90％(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性，或具有0、1、2或3个氨基酸变化，任选保守的氨基酸变化的CDR3；和
第二VHH抗体，其包含相对于表1A的同一行的CDR4的序列具有至少90％(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性，或具有0、1、2或3个氨基酸变化，任选保守的氨基酸变化的CDR1；相对于表1A的同一行的CDR5的序列具有至少90％(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性，或具有0、1、2或3个氨基酸变化，任选保守的氨基酸变化的CDR2；和相对于表1A的同一行的CDR6具有至少90％(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性，或具有0、1、2或3个氨基酸变化，任选保守的氨基酸变化的CDR3。在一些实施方式中，双特异性VHH2包含与表1A所示的双VHH二聚体序列中任一个具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在一些实施方式中，本文所述的VHH可以是人源化的，以包含人框架区。可用于制备人源化VHH的人种系的例子包括但不限于VH3-23(例如UniProt ID:P01764)、VH3-74(例如UniProt ID:A0A0B4J1X5)、VH3-66(例如UniProt ID:A0A0C4DH42)、VH3-30(例如UniProtID:P01768)、VH3-11(例如UniProt ID:P01762)和VH3-9(例如UniProt ID:P01782)。
表1A：
在一些实施方式中，本文所述的IL27R结合蛋白(例如表1A)由分离的核酸编码，所述分离的核酸与下表1B中任一项的序列基本相同。在一些实施方式中，本文所述的IL27R结合蛋白(例如包含表1A的序列的IL27R结合蛋白)由分离的核酸编码，所述分离的核酸包含与下表1B的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的序列。
表1B
在一些实施方式中，双特异性VHH2包含：
抗-gp130 VHH抗体，其包含相对于SEQ ID NO:193-198中任一项的序列具有至少90％(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性，或具有0、1、2或3个氨基酸变化，任选保守的氨基酸变化的CDR1；相对于SEQ ID NO:199-204中任一项的序列具有至少90％(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性，或具有0、1、2或3个氨基酸变化，任选保守的氨基酸变化的CDR2；和相对于SEQ ID NO:205-210中任一项的序列具有至少90％(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性，或具有0、1、2或3个氨基酸变化，任选保守的氨基酸变化的CDR3；和
抗-IL27RαVHH抗体，其包含相对于SEQ ID NO:211-217中任一项的序列具有至少90％(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性，或具有0、1、2或3个氨基酸变化，任选保守的氨基酸变化的CDR1；相对于SEQ ID NO:218-224中任一项的序列具有至少90％(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性，或具有0、1、2或3个氨基酸变化，任选保守的氨基酸变化的CDR2；和相对于SEQ ID NO:225-231中任一项的序列具有至少90％(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性，或具有0、1、2或3个氨基酸变化，任选保守的氨基酸变化的CDR3。
在某些实施方式中，本文所述的双特异性VHH2包含含有CDR1、CDR2和CDR3的抗-gp130 VHH抗体和含有CDR1、CDR2和CDR3的抗-IL27RαVHH抗体，如下表1中各行所示。在一些实施方式中，抗-gp130 VHH抗体中的CDR1、CDR2和CDR3和抗-IL27RαVHH抗体中的CDR1、CDR2和CDR3相对于下表1的各行中所述的序列可以各自地、独立地包含至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性，或具有0、1、2或3个氨基酸变化，任选保守的氨基酸变化。
在一些实施方式中，双特异性VHH2包含N-末端的抗-gp130 VHH抗体和C-末端的抗-IL27RαVHH抗体。在一些实施方式中，双特异性VHH2包含N-末端的抗-IL27RαVHH抗体和C-末端的抗-gp130 VHH抗体。
表1
抗-GP130-接头-抗-Il27RαVHH
双特异性VHH2可包含(从N-末端至C-末端)，结合至gp130的第一VHH(抗-gp130 VHH抗体)、接头和结合至IL27Rα的第二VHH(抗-IL27RαVHH抗体)。换言之，接头将结合蛋白中抗-gp130 VHH的C末端接合至结合蛋白中抗-IL27RαVHH的N-末端。在一些实施方式中，纯化肽，例如六组氨酸肽((His)6或His-标签)可以被包含或不包含于双特异性VHH2中。
在某些实施方式中，本文所述的双特异性VHH2包含抗-gp130 VHH抗体，所述抗体包含与SEQ ID NO:232-237中任一项序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的序列；和抗-IL27RαVHH抗体，所述抗体包含与SEQ ID NO:238-244中任一项序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的序列。
在某些实施方式中，本文所述的双特异性VHH2包含抗-gp130 VHH抗体和抗-IL27RαVHH抗体，如以下表2A或以上表1A的各行中所述。在一些实施方式中，在表2A的各行中，抗-gp130 VHH抗体和抗-IL27RαVHH抗体可各自地、独立地相对于表2A的各行中所述序列包含至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性。在一些实施方式中，双特异性VHH2可包含抗-gp130 VHH抗体与抗-IL27RαVHH抗体之间的接头(例如，第IV节中所述的接头)，如以下表2A的各行中所述。在特定实施方式中，接头为GGGS(SEQ ID NO:108)或(GGGS)n、(GGS)nG、(GGGGS)n，如本文他处所述。抗-gp130 VHH的序列对于接头是N-末端，抗-IL27RαVHH的序列对于接头是C-末端。接头的实例在下文第IV节中进一步描述。各个VHH中的CDR序列由下划线标示。
在某些实施方式中，双特异性VHH2包含与SEQ ID NO:1-42中任一项序列基本相同的序列。这种双特异性VHH2可以具有相对于SEQ ID NO:1-42中任一项序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的序列，如下表2B中所示。在SEQ ID NO:1-42的各个序列中，接头GGGS(SEQ ID NO:108)为粗体。抗-gp130VHH的序列对于接头是N-末端，抗-IL27RαVHH的序列对于接头是C-末端。各个VHH中的CDR序列由下划线标示。
在一些实施方式中，本文所述的IL27R结合蛋白(例如，包含SEQ ID NO:1-42中任一项的序列的IL27R结合蛋白)是由分离的核酸编码，所述分离的核酸与SEQ ID NO:109-150中任一项的序列基本相同，如下表2C所列。在一些实施方式中，本文所述的IL27R结合蛋白(例如包含SEQ ID NO:1-42中任一项的序列的IL27R结合蛋白)由分离的核酸编码，所述分离的核酸包含与SEQ ID NO:109-150中任一项的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的序列，如下表2C所列。
表2C
抗-IL27RαVHH-接头-抗-GP130 VHH
双特异性VHH2可包含(从N-末端至C-末端)，结合至IL27Rα的第一VHH(抗-IL27RαVHH抗体)、接头和结合至gp130的第二VHH(抗-gp130 VHH抗体)。换言之，接头将结合蛋白中抗-IL27RαVHH的C末端接合至结合蛋白中抗-gp130 VHH的N-末端。在一些实施方式中，纯化肽，例如六组氨酸肽((His)6或His-标签)或Fc标签可以被包含在双特异性VHH2中。
在某些实施方式中，本文所述的双特异性VHH2包含抗-IL27RαVHH抗体，所述抗体包含与SEQ ID NO:245-251中任一项的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的序列；和抗-gp130 VHH抗体，所述抗体包含与SEQ ID NO:252-257中任一项序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的序列。
在某些实施方式中，本文所述的双特异性VHH2包含抗-IL27RαVHH抗体和抗-gp130VHH抗体，如以下表3A或以上表1A的各行中所述。在一些实施方式中，在表3A的各行中，抗-IL27RαVHH抗体和抗-gp130 VHH抗体可各自地、独立地包含相对于表3A的各行中所述序列包含至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性。在一些实施方式中，双特异性VHH2可包含抗-IL27RαVHH抗体与抗-gp130 VHH抗体之间的接头(例如，第IV节中所述的接头)，如以下表3A的各行中所述。在特定实施方式中，接头是GGGS(SEQ ID NO:108)。抗-IL27RαVHH的序列对于接头是N-末端，抗-gp130 VHH的序列对于接头是C-末端。接头的实例在下文第IV节中进一步描述。各个VHH中的CDR序列由下划线标示。
在某些实施方式中，双特异性VHH2包含与SEQ ID NO:43-84中任一项序列基本相同的序列。这种双特异性VHH2可以具有相对于SEQ ID NO:43-84中任一项序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的序列，如下表3B中所示。在SEQ ID NO:43-84的各个序列中，接头GGGS(SEQ ID NO:108)为粗体。抗-IL27RαVHH的序列对于接头是N-末端，抗-gp130 VHH的序列对于接头是C-末端。各个VHH中的CDR序列由下划线标示。
表3B
在一些实施方式中，本文所述的IL27R结合蛋白(例如，包含SEQ ID NO:43-84中任一项的序列的IL27R结合蛋白)是由分离的核酸编码，所述分离的核酸与SEQ ID NO:151-192中任一项的序列基本相同，如下表3C所列。在一些实施方式中，本文所述的IL27R结合蛋白(例如包含SEQ ID NO:43-84中任一项的序列的IL27R结合蛋白)由分离的核酸编码，所述分离的核酸包含与SEQ ID NO:151-192中任一项的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的序列，如下表3C所列。
表3C
其他IL27R结合蛋白
此外，其他IL27R结合蛋白可以包含在下表4中列出的抗-IL27RαVHH抗体中下划线标出的三个CDR序列，以及在SEQ ID NO:232-237中任一项的抗-gp130 VHH抗体中下划线标出的三个CDR序列。其他IL27R结合蛋白可以包含抗-IL27RαVHH抗体(例如，下表4中列出的任一个序列)和抗-gp130 VHH抗体(例如，SEQ ID NO:232-237中任一项。在一些实施方式中，结合蛋白包含N-末端的抗-IL27RαVHH抗体和C-末端的抗-gp130 VHH抗体。在一些实施方式中，结合蛋白包含N-末端的抗-gp130 VHH抗体和C-末端的抗-IL27RαVHH抗体。在一些实施方式中，结合蛋白包含在抗-IL27RαVHH抗体和抗-gp130 VHH抗体之间的接头(例如SEQ IDNO:85-108的任一项(例如SEQ ID NO:108))。在某些实施方式中，结合蛋白包含纯化标签，例如六组氨酸肽(His)6(His-标签)。
IL27R结合蛋白可以包含抗-IL27RαVHH抗体中下划线标出的三个CDR序列，以及在抗-gp130 VHH抗体中下划线标出的三个CDR序列，如下表5中各行所述。在一些实施方式中，IL27R结合蛋白包含抗-IL27RαVHH抗体和抗-gp130 VHH抗体，如以下表5的各行中所述。在一些实施方式中，结合蛋白包含N-末端的抗-IL27RαVHH抗体和C-末端的抗-gp130 VHH抗体。在一些实施方式中，结合蛋白包含N-末端的抗-gp130 VHH抗体和C-末端的抗-IL27RαVHH抗体。在一些实施方式中，结合蛋白包含在抗-IL27RαVHH抗体和抗-gp130 VHH抗体之间的接头(例如SEQ ID NO:85-108的任一项(例如SEQ ID NO:108))。在某些实施方式中，结合蛋白包含纯化标签，例如六组氨酸肽(His)6(His-标签)。
此外，IL27R结合蛋白可以包含小鼠抗IL27RαVHH抗体和小鼠抗gp130VHH抗体。在一 些情况下，由于来自各种哺乳动物物种的受体的胞外结构域之间的序列或结构相似性，用 来源于第一哺乳动物物种的IL27Rα或gp130的抗原进行免疫可以提供特异性结合至一种或 多种其他哺乳动物物种的受体的抗体。这种抗体被称为“交叉反应性的”。例如，用人源抗原 (如hIL27Rα-ECD)免疫骆驼可能会产生与鼠和人受体交叉反应的抗体。对于来源于其他哺 乳动物物种的受体的抗体交叉反应性的评估，本领域技术人员可以容易地通过，例如，使用 与本文别处所述的结合亲和力和/或特异性结合的评估相关的方法测定，例如流式细胞术 或SPR。因此术语“人IL27RαVHH”或“hIL27RαVHH”的使用仅表示用于免疫骆驼(其为VHH来源 的骆驼)的IL27Rα抗原的种类是人IL27Rα，但不应理解为限制VHH对其他哺乳动物物种的 IL27Rα分子的特异性结合亲和力。类似地，术语“小鼠IL27RαVHH”或“mIL27RαVHH”的使用仅表示用于免疫骆驼(其为VHH来源的骆驼)的IL27Rα抗原的种类是鼠IL27Rα，但不应理解为 限制VHH对其他哺乳动物物种的IL27Rα分子的特异性结合亲和力。在一些实施方式中，IL27R结合蛋白可包含如下所列的小鼠抗-IL27RαVHH抗体序列中由下划线所示的三个CDR序列，和如下所列的小鼠抗-gp130 VHH抗体序列中由下划线所示的三个CDR序列。在一些实施方式中，IL27R结合蛋白包含以下列出的小鼠抗-IL27RαVHH抗体和以下列出的小鼠抗-gp130 VHH抗体。在一些实施方式中，结合蛋白包含N-末端的小鼠抗-IL27RαVHH抗体和C-末端的小鼠抗-gp130 VHH抗体。在一些实施方式中，结合蛋白包含N-末端的小鼠抗-gp130 VHH抗体和C-末端的小鼠抗-IL27RαVHH抗体。在一些实施方式中，结合蛋白包含在小鼠抗-IL27RαVHH抗体和小鼠抗-gp130 VHH抗体之间的接头(例如SEQ ID NO:85-108的任一项(例如SEQ ID NO:108))。在某些实施方式中，结合蛋白包含纯化标签，例如六组氨酸肽(His)6(His-标签)。
小鼠抗-IL27RαVHH抗体序列的例子：
>小鼠抗-IL27RαVHH抗体_SEQ ID NO:275
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>小鼠抗-IL27RαVHH抗体_SEQ ID NO:276
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>小鼠抗-IL27RαVHH抗体_SEQ ID NO:277
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>小鼠抗-IL27RαVHH抗体_SEQ ID NO:278
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>小鼠抗-IL27RαVHH抗体_SEQ ID NO:279
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>小鼠抗-IL27RαVHH抗体_SEQ ID NO:280
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>小鼠抗-IL27RαVHH抗体_SEQ ID NO:281
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>小鼠抗-IL27RαVHH抗体_SEQ ID NO:282
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>小鼠抗-IL27RαVHH抗体_SEQ ID NO:283
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>小鼠抗-IL27RαVHH抗体_SEQ ID NO:284
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>小鼠抗-IL27RαVHH抗体_SEQ ID NO:285
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>小鼠抗-IL27RαVHH抗体_SEQ ID NO:286
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>小鼠抗-IL27RαVHH抗体_SEQ ID NO:287
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>小鼠抗-IL27RαVHH抗体_SEQ ID NO:288
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小鼠抗-gp130 VHH抗体序列的例子：
>小鼠抗-gp130 VHH抗体_SEQ ID NO:289
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>小鼠抗-gp130 VHH抗体_SEQ ID NO:290
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>小鼠抗-gp130 VHH抗体_SEQ ID NO:291
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>小鼠抗-gp130 VHH抗体_SEQ ID NO:292
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>小鼠抗-gp130 VHH抗体_SEQ ID NO:293
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>小鼠抗-gp130 VHH抗体_SEQ ID NO:294
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>小鼠抗-gp130 VHH抗体_SEQ ID NO:295
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>小鼠抗-gp130 VHH抗体_SEQ ID NO:296
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>小鼠抗-gp130 VHH抗体_SEQ ID NO:297
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>小鼠抗-gp130 VHH抗体_SEQ ID NO:298
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>小鼠抗-gp130 VHH抗体_SEQ ID NO:299
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>小鼠抗-gp130 VHH抗体_SEQ ID NO:300
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>小鼠抗-gp130 VHH抗体_SEQ ID NO:301
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>小鼠抗-gp130 VHH抗体_SEQ ID NO:302
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>小鼠抗-gp130 VHH抗体_SEQ ID NO:303
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>小鼠抗-gp130 VHH抗体_SEQ ID NO:304
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>小鼠抗-gp130 VHH抗体_SEQ ID NO:305
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>小鼠抗-gp130 VHH抗体_SEQ ID NO:306
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>小鼠抗-gp130 VHH抗体_SEQ ID NO:307
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>小鼠抗-gp130 VHH抗体_SEQ ID NO:308
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>小鼠抗-gp130 VHH抗体_SEQ ID NO:309
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>小鼠抗-gp130 VHH抗体_SEQ ID NO:310
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>小鼠抗-gp130 VHH抗体_SEQ ID NO:311
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>小鼠抗-gp130 VHH抗体_SEQ ID NO:312
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>小鼠抗-gp130 VHH抗体_SEQ ID NO:313
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>小鼠抗-gp130 VHH抗体_SEQ ID NO:314
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>小鼠抗-gp130 VHH抗体_SEQ ID NO:315
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>小鼠抗-gp130 VHH抗体_SEQ ID NO:316
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>小鼠抗-gp130 VHH抗体_SEQ ID NO:317
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>小鼠抗-gp130 VHH抗体_SEQ ID NO:318
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>小鼠抗-gp130 VHH抗体_SEQ ID NO:319
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>小鼠抗-gp130 VHH抗体_SEQ ID NO:322
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>小鼠抗-gp130 VHH抗体_SEQ ID NO:323
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>小鼠抗-gp130 VHH抗体_SEQ ID NO:324
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>小鼠抗-gp130 VHH抗体_SEQ ID NO:325
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>小鼠抗-gp130 VHH抗体_SEQ ID NO:326
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>小鼠抗-gp130 VHH抗体_SEQ ID NO:327
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>小鼠抗-gp130 VHH抗体_SEQ ID NO:328
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>小鼠抗-gp130 VHH抗体_SEQ ID NO:329
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>小鼠抗-gp130 VHH抗体_SEQ ID NO:330
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>小鼠抗-gp130 VHH抗体_SEQ ID NO:331
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>小鼠抗-gp130 VHH抗体_SEQ ID NO:332
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>小鼠抗-gp130 VHH抗体_SEQ ID NO:333
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>小鼠抗-gp130 VHH抗体_SEQ ID NO:334
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>小鼠抗-gp130 VHH抗体_SEQ ID NO:335
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>小鼠抗-gp130 VHH抗体_SEQ ID NO:336
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>小鼠抗-gp130 VHH抗体_SEQ ID NO:337
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在一些实施方式中，本文所述的VHH可以是人源化的，以包含人框架区。可用于制备人源化VHH的人种系的例子包括但不限于VH3-23(例如UniProt ID:P01764)、VH3-74(例如UniProt ID:A0A0B4J1X5)、VH3-66(例如UniProt ID:A0A0C4DH42)、VH3-30(例如UniProtID:P01768)、VH3-11(例如UniProt ID:P01762)和VH3-9(例如UniProt ID:P01782)。
在一些实施方式中，与由IL27引起的E最大相比，IL27R结合蛋白具有降低的E最大。E最大反映了可通过配体(例如，本文所述的结合蛋白或天然细胞因子(例如，IL27))获得的细胞类型中的最大反应水平。在一些实施方式中，本文所述的IL27R结合蛋白具有由IL27R引起的E最大的至少1％(例如，1％至100％之间、10％至100％之间、20％至100％之间、30％至100％之间、40％至100％之间、50％至100％之间、60％至100％之间、70％至100％之间、80％至100％之间、90％至100％之间、1％至90％之间、1％至80％之间,1％至70％之间、1％至60％之间、1％至50％之间、1％至40％之间、1％至30％之间、1％至20％之间、或者1％至10％之间)。在其他实施方式中，本文所述的IL27R结合分子的E最大大于(例如，至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％更大)天然配体IL27的E最大。在一些实施方式中，通过改变IL27R结合蛋白的接头长度，IL27R结合蛋白的E最大可以改变。IL27R结合蛋白可在最需要的细胞类型中引起E最大，并在其他细胞类型中降低E最大。
IV.接头
如前所述，本发明的结合蛋白的结合结构域可以连续接合(例如，结合蛋白中第一VHH的C末端氨基酸接合至结合蛋白中第二VHH的N-末端氨基酸)，或者结合蛋白的结合结构域可以任选地通过接头接合。接头是两个元件之间的连接，例如蛋白质结构域。在本文所述的双特异性VHH2结合蛋白中，接头是结合蛋白中两个VHH之间的连接。接头可以是共价键或肽接头。在一些实施方式中，结合蛋白中的两个VHH直接接合(即，通过共价键)。结合蛋白中两个VHH之间的接头的长度可用于调节结合蛋白的两个VH的邻近度。通过改变接头的长度，可以调整结合蛋白的总体大小和长度，以结合特定的细胞受体或其结构域或其亚基。例如，如果结合蛋白被设计为与位于同一细胞上彼此靠近的两个受体或其结构域或其亚基结合，那么可以使用短接头。在另一个例子中，如果结合蛋白被设计为结合至位于两个不同细胞上的两个受体或其结构域或其亚基，那么可以使用长接头。
在一些实施方式中，接头是肽接头。肽接头可包含1至50个氨基酸(例如，2至50、5至50、10至50、15至50、20至50、25至50、30至50、35至50、40至50、45至50、2至45、2至40、2至35、2至30、2至25、2至20、2至15、2至10、2至5个氨基酸)。接头还可以是化学接头，例如合成聚合物，例如聚乙二醇(PEG)聚合物。
在一些实施方式中，接头将结合蛋白中第一VHH的C-末端接合到结合蛋白中第二VHH的N末端。在其他实施方式中，接头将结合蛋白中第二VHH的C-末端接合到结合蛋白中第一VHH的N末端。
合适的肽接头是本领域已知的，并且包括例如含有柔性氨基酸残基如甘氨酸和丝氨酸的肽接头。在某些实施方式中，肽接头可以包含GS,GGS,GGGGS(SEQ ID NO:85),GGGGGS(SEQ ID NO:86),GGSG(SEQ ID NO:87)或SGGG(SEQ ID NO:88)的基序，例如多个或重复基序。在某些实施方式中，肽接头可以包含2至12个氨基酸，其包括GS的基序，例如GS,GSGS(SEQ ID NO:89),GSGSGS(SEQ ID NO:90),GSGSGSGS(SEQ ID NO:91),GSGSGSGSGS(SEQ IDNO:92)或GSGSGSGSGSGS(SEQ ID NO:93)。在某些其他实施方式中，肽接头可以包含3至12个氨基酸，其包括GGS的基序，例如GGS,GGSGGS(SEQ ID NO:94),GGSGGSGGS(SEQ ID NO:95)和GGSGGSGGSGGS(SEQ ID NO:96)。在另外其他实施方式中，肽接头可以包含4至20个氨基酸，其包括GGSG(SEQ ID NO:87)的基序，例如GGSGGGSG(SEQ ID NO:97),GGSGGGSGGGSG(SEQ IDNO:98),GGSGGGSGGGSGGGSG(SEQ ID NO:99)或GGSGGGSGGGSGGGSGGGSG(SEQ ID NO:100)。在其他实施方式中，肽接头可以包含GGGGS(SEQ ID NO:85)的基序，例如GGGGSGGGGS(SEQ IDNO:101)或GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:102)。
柔性接头的例子包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物、甘氨酸-丝氨酸聚合物(例如，(GmSo)n,(GSGGS)n,(GmSoGm)n,(GmSoGmSoGm)n,(GSGGSm)n,(GSGSmG)n,(GGS)nG和(GGGSm)n及其组合，其中m、n和o各自独立地选自至少1至20的整数，例如1-18、216、3-14、4-12、5-10、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)和其他柔性接头。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物是相对非结构化的，因此可以用作组分之间的中性系连(tether)。柔性接头的例子包括但不限于GGSG(SEQ ID NO:87),GGSGG(SEQ ID NO:103),GSGSG(SEQ ID NO:104),GSGGG(SEQ ID NO:105),GGGSG(SEQ ID NO:106)和GSSSG(SEQ IDNO:107)。
柔性接头的其他例子包括甘氨酸聚合物(G)n或甘氨酸-丝氨酸聚合物(例如(GS)n,(GSGGS)n,(GGGS)n和(GGGGS)n，其中n＝1至50，例如1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,10-20,20-30,30-50)。示例性的柔性接头包括但不限于GGGS(SEQ ID NO:108),GGGGS(SEQ ID NO:85),GGSG(SEQ ID NO:87),GGSGG(SEQ ID NO:103),GSGSG(SEQ ID NO:104),GSGGG(SEQ IDNO:105),GGGSG(SEQ ID NO:106)和GSSSG(SEQ ID NO:107)。
V.延长体内作用时间的修饰
本文所述的结合蛋白可以被修饰以提供延长体内寿命和/或在对象中提供延长的作用持续时间。在一些实施方式中，结合蛋白可偶联至运载体分子以提供所需的药理学特性，例如延长的半衰期。在一些实施方式中，结合蛋白可以共价地连接至IgG的Fc结构域、白蛋白或其他分子以延长其半衰期，例如，通过本领域已知的聚乙二醇化、糖基化等。
在一些实施方式中，结合蛋白偶联至Fc融合体嵌合多肽分子的功能域。Fc融合体偶联物已被证明可以增加生物药物的全身半衰期，因此，生物药物产品可以不需要频繁给药。Fc结合至衬垫在血管的内皮细胞中的新生Fc受体(FcRn)，结合后，Fc融合分子被保护，不被降解并重新释放到循环中，使分子在循环中保持更长的时间。这种Fc结合被认为是内源性IgG保持其长血浆半衰期的机制。最近的Fc融合体技术将一份生物药物的单拷贝连接至抗体的Fc区，与传统的Fc融合体偶联物相比，优化了生物药物的药代动力学和药效动力学特性。用于制备Fc融合体的"Fc区"可以是天然存在或合成的多肽，其与用木瓜蛋白酶消化IgG产生的IgG C-末端结构域同源。IgG Fc的分子量约为50kDa。本文所述的结合蛋白可以偶联至整个Fc区，或保留延长其作为嵌合多肽的部分的循环半衰期能力的较小部分。此外，全长或片段的Fc区可以是野生型分子的变体。在一个典型的呈现中，二聚体Fc的每个单体可携带异源多肽，异源多肽是相同或不同的。
在一些实施方式中，当本文所述结合蛋白要以Fc融合体的形式给予时，特别是在那些偶联至Fc二聚体的各个亚基的多肽链不同的情况下，Fc融合体可以被工程改造为具有“杵臼(knob-into-hole)修饰”。杵臼修饰更全面地描述于Ridgway,等(1996)《蛋白质工程改造》(Protein Engineering)9(7):617-621和1998年3月24日授权的美国专利号5,731,168。杵臼修饰是指在CH3结构域中两个免疫球蛋白重链之间界面的修饰，其中：i)在第一条重链的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较大侧链的氨基酸残基(例如，酪氨酸或色氨酸)替代，从表面产生突起(“杵”)和ii)在第二条重链的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较小侧链的氨基酸残基(如丙氨酸或苏氨酸)替代，从而在第二CH3结构域的界面内产生空腔(“臼”)，其中第一CH3结构域的突出侧链(“杵”)被第二CH3结构域中的空腔接收。在一个实施方式中，“杵臼修饰”包括抗体重链之一中的氨基酸取代T366W和任选地氨基酸取代S354C，和另一个抗体重链中的氨基酸取代T366S、L368A、Y407V和任选地Y349C。此外，Fc结构域可以通过在S354和Y349位置引入半胱氨酸残基进行修饰，从而在Fc区的两个抗体重链之间产生稳定的二硫键(Carter,等(2001)Immunol Methods 248,7-15)。杵臼形式用于促进在具有“杵”修饰的第一Fc单体上第一多肽的表达和在具有“臼”修饰的第二Fc单体上的第二多肽的表达，以促进异二聚体多肽偶联物的表达。
在一些实施方式中，结合蛋白可偶联至一个或多个水溶性聚合物。在本发明实践中有用的水溶性聚合物的例子包括聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、多糖(聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚(氧乙基化多元醇)、聚烯烃醇(polyolefinic alcohol))、多糖)、聚-α-羟基酸、聚乙烯醇(PVA)、聚磷腈、聚噁唑啉(polyoxazoline)(POZ)、聚(N-丙烯酰吗啉)，或其组合。
在一些实施方式中，结合蛋白可以偶联至一个或多个聚乙二醇分子或“聚乙二醇化/PEG化”。尽管PEG附接至结合蛋白的方法或位点可能不同，在某些实施方式中聚乙二醇化不改变或仅在最小程度上改变结合蛋白的活性。
在一些情况下，在制备本发明的IL27结合分子中使用本文所述的VHH序列时，VHH具有N-末端谷氨酰胺(“1Q”)残基。已观察到N-末端谷氨酰胺残基在生理条件下或接近生理条件下自发环化形成焦谷氨酸(pE)。(参见例如，Liu,等(2011)J.Biol.Chem.286(13):11211–11217)。在一些实施方式中，焦谷氨酸的形成使N-末端PEG偶联复杂化，特别是当醛化学用于N-末端PEG化时。因此，当PEG化本发明的IL27R结合分子时，特别是当使用醛化学时，在1位(例如，1Q)具有氨基酸的IL27Rα结合分子在1位被替代性氨基酸取代或在1位缺失(例如，des-1Q)。在一些实施方式中，本发明的IL27R结合分子包含选自Q1E和Q1D组的氨基酸取代。
在一些实施方式中，可以采用结合蛋白的选择性PEG化，例如，通过纳入带有侧链的非天然氨基酸以促进选择性的PEG偶联。可以选择特定的PEG化位点，使得结合蛋白的PEG化不影响其与靶受体的结合。
在某些实施方式中，半衰期的增加大于生物学活性的任何减少。适合偶联至多肽序列的PEG通常在室温溶于水，并且具有通式R(O-CH2-CH2)nO-R，其中R是氢或保护基团，例如烷基或烷醇基，其中n是1-1000的整数。当R是保护基团时，其通常具有1-8个碳。偶联至多肽序列的PEG可以是直链的或支链的。本发明考虑了支化PEG衍生物，“星形-PEG(star-PEG)”和多臂PEG。
本发明中使用的PEG的分子量不限于任何特定范围。结合蛋白的PEG组分可以具有大于约5kDa、大于约10kDa、大于约15kDa、大于约20kDa、大于约30kDa、大于约40kDa、或大于约50kDa的分子量。在一些实施方式中，分子量为约5kDa至约10kDa，约5kDa至约15kDa，约5kDa至约20kDa，约10kDa至约15kDa，约10kDa至约20kDa，约10kDa至约25kDa或约10kDa至约30kDa。直链或支链PEG分子的分子量从约2,000至约80,000道尔顿，或者约2,000至约70,000道尔顿，或者约5,000至约50,000道尔顿，或者约10,000至约50,000道尔顿，或者约20,000至约50,000道尔顿，或者约30,000至约50,000道尔顿，或者约20,000至约40,000道尔顿，或者约30,000至约40,000道尔顿。在本公开的一个实施方式中，PEG为包含两个20kD臂的40kD支链PEG。
本发明还考虑了偶联物的组合物，其中PEG具有不同的n值，因此在特定的比率下存在多种不同的PEG。例如，一些组合物包含偶联物的混合物，其中n＝1、2、3和4。在一些组合物中，n＝1的偶联物的百分比为18-25％，n＝2的偶联物的百分比为50-66％，n＝3的偶联物的百分比为12-16％，n＝4的偶联物的百分比多达5％。这种组合物可以通过本领域已知的反应条件和纯化方法生产。层析可用于分辨偶联物的馏分，然后鉴定包含具有例如附接所需数量的PEG的偶联物的馏分，从未修饰的蛋白质序列和具有附接其他数量PEG的偶联物中纯化出来。
适合偶联至多肽序列的PEG通常在室温溶于水，并且具有通式R(O-CH2-CH2)nO-R，其中R是氢或保护基团，例如烷基或烷醇基，其中n是1-1000的整数。当R是保护基团时，其通常具有1-8个碳。
两种广泛使用的第一代激活的单甲氧基PEG(mPEG)是琥珀酰亚胺基碳酸酯PEG(SC-PEG；参见，例如，Zalipsky,等(1992)Biotehnol.Appl.Biochem15:100-114)和苯并三唑甲酯PEG(BTC-PEG；参见，例如Dolence,等美国专利号5,650,234)，其优选与赖氨酸残基反应以形成氨基甲酸酯连接，但也已知与组氨酸和酪氨酸残基反应。使用PEG-醛接头通过还原性胺化靶向多肽的N-末端单个位点。
聚乙二醇化经常发生在多肽N-末端的α-氨基基团，赖氨酸残基侧链上的ε氨基基团和组氨酸残基侧链上的咪唑基团。由于大多数重组多肽具有单个α基团和若干ε基团和咪唑基团，根据接头的化学性质，可以产生许多位置异构体。本领域中已知的一般PEG化策略可在本文中应用。
PEG可以通过末端反应性基团(“间隔子")结合至本发明的结合蛋白，该基团在一个或多个多肽序列的游离氨基或羧基与聚乙二醇之间介导键合。具有可结合至游离氨基基团的间隔子的PEG包括N-羟基琥珀酰亚胺聚乙二醇，它可以通过用N-羟基琥珀酰亚胺激活聚乙二醇的琥珀酸酯来制备。
在一些实施方式中，通过纳入带有独特侧链的非天然氨基酸以促进位点特异性PEG化来促进结合蛋白的PEG化。将非天然氨基酸纳入多肽以提供功能部分以实现此类多肽的位点特异性PEG化是本领域中已知的。参见，例如Ptacin,等,(PCT国际申请号PCT/US2018/045257，2018年8月3日提交并公开于2019年2月7日，国际公开号WO 2019/028419Al。
偶联至多肽序列的PEG可以是直链的或支链的。本发明考虑了支化PEG衍生物，“星形-PEG(star-PEG)”和多臂PEG。本发明的实践中有用的具体实施方式PEG包括10kDa直链PEG-醛(例如，ME-100AL、NOF美国公司(NOF America Corporation)，北百老汇(One North Broadway)，纽约州白原市(White Plains,NY)10601USA)、10kDa直链PEG-NHS酯(例如，ME-100CS,ME-100AS,ME-100GS,ME-100HS,NOF)、20kDa直链PEG-醛(例如ME-200AL,NOF、20kDa直链PEG-NHS酯(例如，ME-200CS,ME-200AS,ME-200GS,ME-200HS,NOF)、20kDa 2-臂支链PEG-醛，该20kDA PEG-醛，其包含两个10kDA直链PEG分子(例如，GL2-200AL3,NOF)、20kDa 2-臂支链PEG-NHS酯，该20kDA PEG-NHS酯，其包含两个10kDA直链PEG分子(例如，GL2-200TS,GL200GS2,NOF)、40kDa 2-臂支链PEG-醛，该40kDA PEG-醛，其包含两个20kDA直链PEG分子(例如，GL2-400AL3)、40kDa 2-臂支链PEG-NHS酯，该40kDA PEG-NHS酯，其包含两个20kDA直链PEG分子(例如，GL2-400AL3,GL2-400GS2,NOF)、直链30kDa PEG-醛(例如，ME-300AL)和直链30kDa PEG-NHS酯。
在一些实施方式中，接头可用于接合结合蛋白和PEG分子。合适的接头包括“柔性接头”，其长度通常足以允许修饰的多肽序列与连接的组分和分子之间有一些移动。接头分子通常约6-50个原子长。接头分子也可以是，例如，芳基乙炔、含有2-10个单体单元的乙二醇寡聚物、二胺、二酸、氨基酸或其组合。合适的接头可以容易地选择，可以是任何合适的长度，例如1个氨基酸(如Gly)、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10-20、20-30、30-50或超过50个氨基酸。柔性接头的实例在第IV节中说明。此外，这些接头序列的多聚体(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10-20、20-30或30-50)可以连接在一起，以提供柔性接头，其可用于偶联两个分子。另选多肽接头，所述接头可以是化学接头，例如，PEG-醛接头。在一些实施方式中，结合蛋白在N-末端通过与N-末端乙酰转移酶和，例如，乙酰CoA的酶促反应被乙酰化。替代或除了N-末端乙酰化之外，结合蛋白可以在一个或多个赖氨酸残基处乙酰化，例如通过与赖氨酸乙酰转移酶的酶促反应。参见，例如，Choudhary等(2009)Science 325(5942):834-840。
在其他的实施方式中，结合蛋白可以被修饰为包括功能为抗原标签的其他多肽序列，例如FLAG序列。如本文所述，FLAG序列可被生物素化、高特异性的抗-FLAG抗体识别(参见例如，Blanar等(1992)Science 256:1014和LeClair,等(1992)PNAS-USA 89:8145)。在一些实施方式中，结合蛋白进一步包括C-末端的c-myc表位标签。
在一些实施方式中，结合蛋白被表达为与白蛋白分子(例如人血清白蛋白)的融合蛋白质，其在本领域中是已知的，以促进延长体内暴露。
在一些实施方式中，本发明的结合蛋白(包括这种结合蛋白的融合蛋白)被表达为具有一个或多个过渡金属螯合多肽序列的融合蛋白。纳入这种过渡金属螯合结构域促进纯化固定化金属亲和层析(IMAC)，如Smith等1986年2月11日授权的美国专利第4,569,794号所述。在本发明的实践中有用的过渡金属螯合多肽的例子描述于Smith等(同上)以及Dobeli等的1995年5月10日授权的美国专利第5,320,663号，其中的全部教导通过引用纳入此处。在本发明的实践中有用的具体过渡金属螯合多肽是包含3-6个连续的组氨酸残基的肽，例如6-组氨酸肽(His)6，在本领域经常被称为“His-标签”。
上述融合蛋白可以通过本领域已知的技术通过重组DNA方法容易地生产，通过构建重组载体，该载体包含核酸序列，该核酸序列包括与编码结合蛋白的N-末端或C-末端融合伴侣的核酸序列同框的编码结合蛋白的核酸序列，该序列可任选地进一步包括在框内的编码接头或间隔子多肽的核酸序列。
VI.药物组合物
本发明的结合蛋白可以以药学上可接受的剂型被给予对象。优选制剂取决于预期的给药方式和治疗应用。本文所述的结合蛋白的药物剂型包括生理上可接受的运载体，其本身是无毒且无治疗作用的。这种运载体的例子包括离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂，血清蛋白质如人血清白蛋白，缓冲物质如磷酸盐、蔗糖、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质，如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素基物质和PEG。多肽的局部或基于凝胶形式的运载体包括多糖，例如羧甲基纤维素钠或甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、聚氧乙烯-聚氧丙烯-嵌段共聚物、PEG、聚氨基酸、氨基酸共聚物和脂质聚合体(lipid aggregate)(例如油性液滴或脂质体)。
该药物组合物还可以包括药学上可接受的、无毒的运载体、赋形剂、稳定剂或稀释剂，其被定义为通常用于配制用于动物或人给药的药物组合物的载剂。选择稀释剂以不影响组合的生物学活性。在所用剂量和浓度下，可接受的运载体、赋形剂或稳定剂是对受者无毒的，包括：缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸缓冲剂；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁基或苄基醇；对羟基苯甲酸烷酯，如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)的多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷胺酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它糖，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；形成盐的抗衡离子，如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂例如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
用于体内给药的制剂通常为无菌的。本发明组合物的灭菌可以通过无菌滤膜过滤容易地实现。
通常，组合物被制备为可注射的，液体溶液或悬浮液；也可以制备适用于在注射前置于液体载剂中的溶液或悬浮液的固体形式。该制备还可以是乳化的或包封在脂质体或微颗粒中的，例如聚丙交酯、聚乙交酯或共聚物，用于增强辅助作用，如上所述(Langer,Science 249:1527,1990和Hanes,Advanced Drug Delivery Reviews 28:97-119,1997)。本发明的试剂可以以贮库注射(depot injection)或植入制剂的形式给予，其配制方式可以允许活性成分的维持或脉冲释放。药物组合物通常配制为无菌的基本上等渗且完全符合美国食品和药物管理局的所有良好生产规范(GMP)法规。
本文所述的结合蛋白的给予可以通过任何多种本领域认可的方法实现，包括但不限于局部、血管内注射(包括静脉或动脉内输注)、皮内注射、皮下注射、肌内注射、腹膜内注射、颅内注射、瘤内注射、结内注射、经皮、经粘膜、离子渗透递送(iontophoreticdelivery)、淋巴管内注射、(Senti和Kundig(2009)《新编过敏和临床免疫学观点》(CurrentOpinions in Allergy and Clinical Immunology)9(6):537-543)，胃内输注、前列腺内注射、膀胱内输注(如：膀胱)、呼吸道吸入器(包括喷雾器)、眼内注射、腹内注射、病灶内注射、卵巢内注射、脑内输注或注射、脑室内注射(ICVI)等。在一些实施方式中，给予包括结合蛋白本身的给予(例如，肠胃外)，以及重组载体(例如，病毒或非病毒载体)的给予，以引起结合蛋白在对象中的原位表达。或者，也可以重组修饰细胞，例如从对象分离的细胞，以表达本发明的结合蛋白。
药物组合物的剂量取决于给药途径、待治疗的疾病和对象的身体特征，例如年龄、体重、一般健康状况等因素。典型地，单个剂量中包含的结合蛋白的量可以是有效预防、延迟或治疗疾病而不引起显著毒性的量。本发明的药物组合物可以包含本文所述的结合蛋白的剂量范围如下：0.01至500mg/kg(例如，0.01至450mg、0.01至400mg、0.01至350mg、0.01至300mg、0.01至250mg、0.01至200mg、0.01至150mg、0.01至100mg、0.01至50mg、0.01至10mg、0.01至1mg、0.1至500mg/kg、1至500mg/kg、5至500mg/kg、10至500mg/kg、50至500mg/kg、100至500mg/kg、150至500mg/kg、200至500mg/kg、250至500mg/kg、300至500mg/kg、350至500mg/kg、400至500mg/kg或450至500mg/kg)以及，在更具体的实施方式中，约1至约100mg/kg(例如，约1至约90mg/kg、约1至约80mg/kg、约1至约70mg/kg、约1至约60mg/kg、约1至约50mg/kg、约1至约40mg/kg、约1至约30mg/kg、约1至约20mg/kg、约1至约10mg/kg、约10至约100mg/kg、约20至约100mg/kg、约30至约100mg/kg、约40至约100mg/kg、约50至约100mg/kg、约60至约100mg/kg、约70至约100mg/kg、约80至约100mg/kg或约90至约100mg/kg)。在一些实施方式中，本发明的药物组合物可以包含本文所述的结合蛋白的剂量范围如下：0.01至20mg/kg(例如，0.01至15mg/kg、0.01至10mg/kg、0.01至8mg/kg、0.01至6mg/kg、0.01至4mg/kg、0.01至2mg/kg、0.01至1mg/kg、0.01至0.1mg/kg、0.01至0.05mg/kg、0.05至20mg/kg、0.1至20mg/kg、1至20mg/kg、2至20mg/kg、4至20mg/kg、6至20mg/kg、8至20mg/kg、10至20mg/kg、15至20mg/kg)。医生可以根据诸如疾病程度和对象的不同参数等常规因素来调整剂量。
含有本文所述的结合蛋白的药物组合物可以每天、每周、每月、每半年、每年或根据医学需要给予有需要的对象一次或多次(例如1-10次或多次)。剂量可以以单剂量或多剂量方案提供。给药间隔时间可以随着病情的改善而减少，也可以随着患者健康状况的下降而增加。疗程可以是单剂量或在一段时期内的多剂量。在一些实施方式中，使用单剂量。在一些实施方式中，在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、21、28、30、60、90、120或180天的时间内，以两次或更多次分剂量给予。在这种分开给药方案中给予的每剂在每次给予中可以相同或可以不同。在时间段内的多天给药方案可由熟练技术人员(如医生)提供，监测给药，考虑对象对治疗的反应，包括治疗的不良反应及其调节，如上文所述。
VII.适应症
免疫疾病
本发明还提供了治疗患有疾病紊乱或病症的对象的方法，通过给予治疗有效量的本发明的IL27R结合蛋白(或编码IL27R结合蛋白的核酸，包括编码IL27R结合蛋白的重组病毒)。适用本发明的IL27R结合蛋白(包括包含IL27R结合蛋白和/或编码其的核酸分子的药学上可接受的制剂，包括编码这种IL27R结合蛋白的重组病毒)治疗的紊乱包括炎症或自身免疫疾病，包括但不限于病毒感染(例如，AIDS、流感、慢性HCV、慢性病毒性乙型、丙型或丁型肝炎)、幽门螺杆菌感染、HTLV、器官排斥、移植物抗宿主病、自身免疫性甲状腺疾病、多发性硬化、过敏、哮喘、神经退行性疾病，其包括阿尔兹海默病、系统性红斑狼疮(SLE)、自体炎症疾病、炎性肠病(IBD)、克罗恩病、糖尿病，包括1型或2型糖尿病、炎症、自身免疫疾病、特应性疾病、癌旁自身免疫疾病、软骨炎、关节炎、类风湿性关节炎、幼年关节炎、幼年类风湿性关节炎、幼年类风湿性关节炎、多关节型幼年类风湿性关节炎、幼年类风湿性关节炎全身发作、幼年强直性脊柱炎、幼年肠病性关节炎、幼年反应性关节炎、幼年瑞特氏综合征、SEA综合征(血清阴性接骨点病变关节病综合征(Seronegativity Enthesopathy ArthropathySyndrome))、幼年皮肌炎、幼年银屑病性关节炎、幼年硬皮病、幼年系统性红斑狼疮、幼年血管炎、少关节型类风湿性关节炎、多关节型类风湿关节炎、类风湿性关节炎全身发作、强直性脊柱炎、肠病性关节炎、反应性关节炎、瑞特氏综合征、SEA综合征(血清阴性、接骨点病变、关节病综合征)。
适用本发明的IL27R结合蛋白(包括包含IL27R结合蛋白和/或编码其的核酸分子的药学上可接受的制剂，包括编码这种IL27R结合蛋白的重组病毒)治疗的增殖性和/或分化性紊乱的其他例子包括，但不限于皮肤病。皮肤病可能涉及真皮、表皮或下皮层(hypodermal layer)的一个或一组细胞或层的异常活动，或真皮-表皮连接处的异常。例如，皮肤病可能涉及角质形成细胞(如过度增殖的基底和紧靠上基底的角质形成细胞)、黑素细胞、朗格汉斯细胞、默克尔细胞、免疫细胞和发现于一个或多个表皮层(如基底层(生发层)、棘层、颗粒层、透明层或角质层)的其他细胞的异常活动。在其他实施方式中，该紊乱可能涉及真皮细胞的异常活性，例如真皮内皮细胞、成纤维细胞、免疫细胞(例如肥大细胞或巨噬细胞)，其发现于真皮层，例如乳头层或网状层。
皮肤病的例子包括银屑病、银屑病关节炎、皮炎(湿疹)、剥脱性皮炎或特应性皮炎、毛发红糠疹、酒渣鼻糠疹、类银屑病、苔癣样糠疹、扁平苔藓、光泽苔藓、鱼鳞病样皮肤病、皮肤角化病、皮肤病、斑秃、坏疽性脓皮病、白癜风、类天疱疮(例如眼部瘢痕性类天疱疮或大疱性类天疱疮)、荨麻疹、角化病、类风湿性关节炎，其涉及关节囊内衬上皮相关细胞的过度增殖和炎症；皮炎例如脂溢性皮炎和日光性皮炎；角化病例如脂溢性角化病、老年性角化病、光化性角化病、光诱导性角化病和毛囊角化病；寻常痤疮；瘢痕瘤和瘢痕瘤形成的预防；痣；肉赘，包括疣、湿疣或尖锐湿疣，以及人乳头状瘤病毒(HPV)感染，例如性病湿疣；黏膜白斑病；扁平苔藓和角膜炎。皮肤病可以是皮炎，例如特应性皮炎或过敏性皮炎，如银屑病。
本发明的组合物(包括包含IL27R结合蛋白和/或编码其的核酸分子的药学上可接受的制剂，包括编码这种IL27R结合蛋白的重组病毒)也可以给予患有(或可能患有)银屑病或银屑病疾病的患者。术语"银屑病"旨在具有其医学含义，即主要累及皮肤并产生隆起、增厚、脱屑、非疤痕性病灶的疾病。病灶通常是界限分明的红斑性丘疹，覆盖着重叠的发亮鳞屑。鳞屑通常呈银色或略带乳白色。指甲经常受累，导致点蚀、指甲分离、增厚和变色。银屑病有时与关节炎相关联，可能会造成严重后果。角质形成细胞过度增殖是银屑病表皮增生的一个关键特征，同时还有表皮炎症和角质形成细胞分化减少。人们引用多种机制来解释银屑病特有的角质形成细胞过度增殖。紊乱的细胞免疫也被认为与银屑病的发病机制有关。银屑病疾病的例子包括慢性静止型银屑病、斑块型银屑病、中度至重度斑块型银屑病、寻常型银屑病、发疹型银屑病、银屑病红皮病、泛发性脓疱型银屑病、环状脓疱型银屑病或局部脓疱型银屑病。
IL27R结合蛋白与其他治疗剂的组合用于自身免疫疾病：
本发明提供了本发明的IL27R结合蛋白与一种或多种其他活性剂(“补充剂”)组合用于治疗自身免疫疾病的用途。如本文所用，术语“补充剂”包括可分别给予或引入的试剂，例如，为单独给予而单独配制的试剂(例如，可在试剂盒中提供)和/或可与IL27R结合蛋白组合给予或引入的治疗。
如本文所用，术语"与……组合"在指给予对象多种试剂时是指给予对象第一试剂至少一种其它(即第二、第三、第四、第五，等)试剂。出于本发明的目的，如果在给予第二试剂时，因给予第一试剂而产生的生物学效应在对象体内持续，使第一试剂和第二试剂的治疗作用叠加，则认为一种试剂(例如IL27R结合蛋白)与第二试剂(例如治疗性自身免疫抗体，如)组合给予。例如，治疗性抗体有时通过IV输注每两周给予一次(如治疗克罗恩病的阿达木单抗)，而本公开的IL27R结合蛋白可以更频繁地给予，如每天、BID或每周。然而，第一试剂(如依那西普(entaercept))的给药在较长的时间内提供治疗作用，第二试剂(如IL27R结合蛋白)的给予在第一试剂的治疗作用仍在进行时提供其治疗作用，因此第二试剂被认为是与第一试剂组合给予，即使第一试剂可能是在离第二试剂给予时间很远的时间点(如几天或几周)进行的。在一个实施方式中，如果第一和第二试剂同时(在彼此的30分钟内)、同期或依次给予，则认为一种试剂与第二试剂组合给予。在一些实施方式中，如果第一试剂和第二试剂在彼此约24小时内，优选在彼此约12小时内，优选在彼此约6小时内，优选在彼此约2小时内，或优选在彼此约30分钟内给予，则第一试剂被视为与第二试剂“同期”给予。术语“与……组合”也应理解为适用于第一试剂和第二试剂共同配制在单一药学上可接受的制剂中并将该共同制剂给予对象的情况。在某些实施方式中，IL27R结合蛋白和一种或多种补充剂是依次给予或应用的，例如，在给予一种试剂后给予一个或多个其他试剂。在其他实施方式中，IL27R结合蛋白和一种或多种补充剂同时给予，例如，在同一时间或大约同一时间给予两种或多种试剂；这两种或多种试剂可以存在于两种或多种分别的制剂中，或组合成单一制剂(即共同制剂)。无论这些试剂是依次或同时给予，出于本发明的目的，它们都被认为是组合给予的。
在一些实施方式中，补充剂是一种或多种选自下组的试剂：皮质类固醇(包括但不限于强的松、布地奈德、泼尼松龙(prednilisone))、Janus激酶抑制剂(包括但不限于托法替尼钙调磷酸酶抑制剂(包括但不限于环孢菌素和他克莫司)、mTor抑制剂(包括但不限于西罗莫司和依维莫司)、IMDH抑制剂(包括但不限于硫唑嘌呤、来氟米特和霉酚酸酯(mycophenolate))，生物制剂例如阿巴西普(abatcept)或依那西普(etanercept)和治疗性抗体。可以作为补充剂与本发明的IL27R结合蛋白组合给予以治疗自身免疫疾病的治疗性抗体的例子包括但不限于抗-CD25抗体(例如达克珠单抗和巴利昔单抗)、抗-VLA-4抗体(例如那他珠单抗)，抗-CD52抗体(例如阿仑单抗)，抗-CD20抗体(例如利妥昔单抗、奥瑞珠单抗)，抗-TNF抗体(例如，英夫利昔单抗和阿达木单抗)，抗-IL6R抗体(例如托珠单抗)，抗-TNFα抗体(例如阿达木单抗戈利木单抗和英夫利昔单抗)，抗-整合素-α4β7抗体(例如维多珠单抗)，抗-IL17a抗体(例如布达鲁单抗(brodalumab)或苏金单抗)，抗-IL4Rα抗体(例如达必妥(dupilumab))，抗-RANKL抗体，IL6R抗体，抗-IL1β抗体(例如卡那基单抗)，抗-CD11a抗体(例如依法利珠单抗)，抗-CD3抗体(例如莫罗单抗(muramonab))，抗-IL5抗体(例如美泊珠单抗(mepolizumab)、瑞利珠单抗)，抗-BLyS抗体(例如贝利单抗)；和抗-IL-12/IL-23抗体(例如乌司奴单抗)。
许多治疗性抗体已被批准用于对抗自身免疫疾病的临床使用。表4提供了美国食品药品监督管理局(FDA)批准的用于治疗患有自身免疫疾病的对象的抗体的例子，这些抗体可作为补充剂与本公开的IL27R结合蛋白(以及任选地额外补充剂)组合给予，以治疗指示的自身免疫疾病。
表4
肿瘤性疾病治疗
本发明提供了治疗使用IL-27R结合分子治疗患有肿瘤性疾病病症或病状的对象的方法，通过给予治疗有效量的如本文所述的IL-27R结合分子(或编码IL-27R结合分子的核酸，包括编码IL-27R结合分子的重组载体，以及修饰成表达IL-27R结合分子的真核细胞和原核细胞)。
适合治疗的肿瘤：
本发明的组合物和方法用于治疗患有肿瘤性疾病的对象，其特征为存在肿瘤，包括良性和恶性肿瘤，以及肿瘤性疾病。
适合用本发明的组合物和方法治疗的良性肿瘤的例子包括但不限于腺瘤、纤维瘤、血管瘤和脂肪瘤。适合用本发明的组合物和方法进行治疗的恶变前(pre-malignant)肿瘤的例子包括但不限于增生、异型(atypia)、化生和发育异常(dysplasia)。适合使用本发明的组合物和方法治疗的恶性肿瘤的例子包括但不限于癌(起源于上皮组织的癌，例如皮肤或衬里(line)内脏器官的组织)、白血病、淋巴瘤和肉瘤(通常起源于骨脂肪、肌肉、血管或结缔组织)。术语肿瘤还包括病毒诱发的肿瘤，例如肉赘和EB病毒诱发的疾病(即传染性单核细胞增多症)、瘢痕形成、增殖性血管疾病，包括内膜平滑肌细胞增生、再狭窄(restenosis)和血管阻塞(vascular occlusion)等。
术语“肿瘤性疾病”包括以实体瘤和非实体瘤为特征的癌症，包括但不限于乳腺癌；肉瘤(包括但不限于骨肉瘤和血管肉瘤及纤维肉瘤)，白血病，淋巴瘤，泌尿生殖系统癌症(包括但不限于卵巢癌、尿道癌、膀胱癌和前列腺癌)；胃肠道癌症(包括但不限于结肠食道癌和胃癌)；肺癌；骨髓瘤；胰腺癌；肝癌；肾癌；内分泌癌；皮肤癌；以及脑或中枢和外周神经(CNS)系统肿瘤，恶性的或良性的，包括胶质瘤和成神经细胞瘤、星形细胞瘤、骨髓增生异常症；宫颈原位癌；肠息肉；口腔白斑病；组织细胞增多症(histiocytose)，增生性瘢痕，包括瘢痕疙瘩，血管瘤；增生性动脉狭窄，银屑病，炎症性关节炎；角化过度和丘疹鳞屑性皮疹(papulosquamous eruption)，包括关节炎。
术语肿瘤性疾病包括癌。术语"癌"是指上皮或内分泌组织的恶性肿瘤，包括呼吸系统癌、胃肠系统癌、泌尿生殖系统癌、睾丸癌、乳腺癌、前列腺癌、内分泌系统癌和黑色素瘤。术语肿瘤性疾病包括腺癌。"腺癌"是指起源于腺组织或其中肿瘤细胞形成可识别的腺体结构的癌症。
如本文所用，术语"造血肿瘤性疾病(hematopoietic neoplastic disorder)"是指涉及造血来源的增生/肿瘤细胞的肿瘤性疾病，例如，起源于骨髓、淋巴或红细胞谱系，或其前体细胞。
髓系肿瘤包括但不限于骨髓增生性肿瘤、带有嗜酸性粒细胞增多症的骨髓和淋巴紊乱、骨髓增生性/骨髓增生异常性肿瘤、骨髓增生异常综合征、急性髓性白血病和相关的前体肿瘤，以及不明谱系急性白血病(acute leukemia of ambiguous lineage)。适合根据本发明内容治疗的示例性髓系紊乱包括但不限于急性早幼粒细胞白血病(APML)、急性髓细胞白血病(acute myelogenous leukemia)(AML)和慢性髓细胞白血病(chronicmyelogenous leukemia)(CML)。
淋巴肿瘤包括但不限于前体淋巴肿瘤、成熟B细胞肿瘤、成熟T细胞肿瘤、霍奇金淋巴瘤和免疫缺陷相关的淋巴增生性紊乱。适合根据本发明内容治疗的示例性淋巴疾病包括但不限于急性淋巴细胞白血病(ALL)，其包括B谱系ALL和T谱系ALL、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、原淋巴细胞白血病(PLL)、毛细胞白血病(HLL)和华氏巨球蛋白血症(WM)。
在一些情况下，造血肿瘤性疾病产生于分化不良的急性白血病(如红细胞白血病和急性巨核细胞白血病)。如本文所用，术语"造血肿瘤性疾病"是指恶性淋巴瘤，包括但不限于非霍奇金淋巴瘤及其变体、外周T细胞淋巴瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATL)、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、大颗粒淋巴细胞白血病(LGF)、霍奇金病和里-斯氏病。
确定对象是否“患有肿瘤疾病”指的是由医生根据本领域公认的鉴定疾病、紊乱或病症的现有信息(包括但不限于X-射线、CT-扫描、常规实验室诊断测试(例如血细胞计数等)、基因组数据、蛋白质表达数据、免疫组织化学)对对象做出的其需要或将受益于治疗的判断。
评估抗肿瘤效力：
本发明的方法在治疗癌症方面的效力的确定一般与实现一个或多个本领域公认的参数有关，例如病灶减少，特别是转移性病灶的减少、转移减少、肿瘤体积减少、ECOG评分的改善等等。确定对治疗的反应可以通过测量生物标志物来评估，这些生物标志物可以提供在IL-27R结合分子治疗的任何方面有用的可再现的信息，包括对象对这种治疗的反应的存在和程度以及这种治疗引起的不良反应(untoward effects)的存在和程度。例如但不限于，生物标志物包括IFNγ的增强，以及颗粒酶A、颗粒酶B和穿孔素的上调；CD8+T细胞数量和功能的增加；IFNγ的增强，CD8+T细胞上ICOS表达的增加，表达IL-10的TReg细胞增强。对治疗的反应通过临床疗效的常规衡量的改善来表征，可以使用例如，如完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、稳定的疾病(SD)和关于靶病灶的，完全缓解(CR)，"不完全缓解/稳定的疾病(SD)，如RECIST定义的，以及免疫相关的完全缓解(irCR)、免疫相关的部分缓解(irPR)和免疫相关的稳定的疾病(irSD)，如免疫相关缓解标准(irRC)所定义，是本领域技术人员考虑作为证明在哺乳动物(如人)对象中治疗肿瘤性疾病的疗效。
血清浓度的维持：
在本发明的一些实施方式中，本发明提供了用于治疗和/或预防肿瘤性疾病、病症或病况的方法和组合物，通过给予治疗有效量的IL-27R结合分子，IL-27R的结合分子的血清浓度以等于或大于这种IL-27R结合分子的治疗有效浓度的血清浓度维持大部分时间(即，大于一段时间的约50％，或者大于约60％，或者大于约70％，或者大于约80％，或者大于约90％)(例如，至少24小时，或者至少48小时，或者至少72小时，或者至少96小时，或者至少120小时，或者至少144小时，或者至少7天，或者至少10天，或者至少12天，或者至少14天，或者至少28天，或者至少45天，或者至少60天或更长)。
IL-27R结合分子与补充治疗剂的组合：
本发明提供了本发明的IL-27R结合分子与一种或多种其他活性剂(“补充剂”)组合的用途。这种进一步的组合可互换地称为“补充组合”或“补充组合疗法”，而那些与本发明的IL-27R结合分子组合使用的治疗剂被称为“补充剂”。如本文所用，术语“补充剂”包括可分别给予或引入的试剂，例如，为单独给予而单独配制的试剂(例如，可在试剂盒中提供)和/或可与IL-27R结合分子组合给予或引入的治疗。
化学治疗剂：
在一些实施方式中，补充剂是化学治疗剂/化疗剂。在一些实施方式中，补充剂是多种化疗剂的“混合物(cocktail)”。在一些实施方式中，化疗剂或混合物与一种或多种物理方法(如放射疗法)组合给予。术语“化疗剂”包括但不限于：烷化剂，例如噻替哌和环磷酰胺；烷基磺酸盐，如白消安、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮杂环丙烷，例如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米得哌(memredopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺(methylamelamine)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙烯三聚氰胺(triethylenemelamine)、三吖啶基氧化磷(trietylenephosphoramide)、三亚乙基硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羟甲基三聚氰胺(trimethylolomelamine)；氮芥类，例如苯丁酸氮芥(chiorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、盐酸甲氧氮芥、美法仑、新氮芥(novembichin)、苯乙酸氮芥胆甾醇酯(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfmaide)、尿嘧啶芥(uracil mustard)；亚硝基脲类(nitrosureas)，例如卡莫司汀、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，例如阿克拉霉素(aclacinomysins)、放射菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authramycin)、氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)(例如博来霉素A2)、放线菌素C(cactinomycin)、加利车霉素(calicheamicin)、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)及其衍生物，例如去甲氧道诺霉素(demethoxy-daunomycin)、11-脱氧柔红霉素(11-deoxydaunorubicin)、13-脱氧柔红霉素(13-deoxydaunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、衣索比星(esorubicin)、伊达比星(idambicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)，例如mitomycin C,N-methyl mitomycin C；霉酚酸、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(poffiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲菌素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢药，例如氨甲蝶呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸(denopterin)、氨甲蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；二去氮杂四氢叶酸(dideazatetrahydrofolic acid)，和叶酸；嘌呤类似物，例如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，例如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、5-FU；雄激素类，例如卡普睾酮(calusterone)、丙酸甲雄烧酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，例如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，例如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基-γ-酮戊酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；苯塔布希(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地弗法明(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elfornithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托葸醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；硝氨丙吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼(2.2-ethylhydrazide)；丙卡巴胼(procarbazine)；雷佐生(razoxane)；西佐喃(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；包菌丽酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌酸(triaziquone acid)；2,2′,2″-三氯三乙胺；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；甘托欣(gacytosine)；阿糖胞苷(Ara-C)；环磷酰胺；噻替哌；紫杉烷类，例如紫杉醇、nab-paclitaxel和多西紫杉醇；氯胺丁；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂和铂配位络合物，例如顺铂、奥沙利铂(oxaplatin)和卡铂；长春花碱；多西它赛；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本(navelbine)；诺肖林(novantrone)；替尼泊苷；道诺霉素(daunomycin)；氨蝶呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊班膦酸钠(ibandronate)；CPT11；拓扑异构酶抑制剂；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维甲酸；埃斯培拉霉素(esperamicins)；卡培他滨；紫杉烷，例如紫杉醇，多西他赛，卡巴他赛；洋红霉素(carminomycin)，阿霉素，例如4′-表阿霉素(4′-epiadriamycin)，4-阿霉素-14-苯甲酸酯(4-adriamycin-14-benzoate)，阿霉素-14-辛酸酯(adriamycin-14-octanoate)，阿霉素-14-萘乙酸酯(adriamycin-14-naphthaleneacetate)；秋水仙素(cholchicine)和任何上述药物的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
术语"化疗剂"还包括调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素剂，如抗雌激素，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、抑制芳香化酶的4(5)-咪唑类、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、克沃昔芬(keoxifene)、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬；和抗雄激素，例如氟他胺、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及上述任何一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
在一些实施方式中，补充剂是一种或多种本领域中鉴定的对治疗肿瘤性疾病有用的化学或生物试剂，包括但不限于：细胞因子或细胞因子拮抗剂，例如IL-12、INFα或抗表皮生长因子受体、伊立替康；四氢叶酸抗代谢剂，例如培美曲塞；针对肿瘤抗原的抗体、单克隆抗体和毒素的复合物、T细胞助剂、骨髓移植、或抗原呈递细胞(例如树突状细胞治疗)、抗肿瘤疫苗、复制能力型病毒、信号传导抑制剂(如或)或免疫调节剂，以实现对肿瘤生长的补充或协同抑制、非甾体抗炎药(NSAID)、环氧合酶-2(COX-2)抑制剂、类固醇、TNF拮抗剂(如和)、干扰素-β1a和干扰素-β1b以及本领域熟练的临床医生容易理解的已知化疗治疗方案中的上述一种或多种的组合，包括但不限于TAC、FOLFOX、TPC、FEC、ADE、FOLFOX-6、EPOCH、CHOP、CMF、CVP、BEP、OFF、FLOX、CVD、TC、FOLFIRI、PCV、FOLFOXIRI、ICE-V、XELOX和其他。
在一些实施方式中，IL-27R结合分子与BRAF/MEK抑制剂、激酶抑制剂(如舒尼替尼)、PARP抑制剂(如奥拉帕尼)、EGFR抑制剂(如奥西替尼(osimertinib))(Ahn,等(2016)JThorac Oncol 11:S115)、IDO抑制剂(如依帕司他(epacadostat))，和溶瘤病毒(如塔利兰帕(talimogene laherparepvec))(T-VEC)组合给予。
作为补充剂的抗肿瘤抗原抗体治疗
在一些实施方式中，“补充剂”是治疗性抗体(包括结合至一个或多个肿瘤相关抗原的双特异性和三特异性抗体，包括但不限于双特异性T细胞接合(BITE)、双亲和再靶向(DART)构建体和三特异性杀伤性接合(TriKE)构建体)。
在一些实施方式中，治疗性抗体是结合至至少一种肿瘤抗原的抗体，其选自下组：HER2(例如曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、阿多-曲妥珠单抗-美坦)，柄蛋白-4(如恩诺单抗)，CD79(如泊洛妥珠单抗维多汀)，CTLA4(如伊匹单抗)，CD22(如莫妥昔单抗假单抗)，CCR4(如莫格利珠单抗(magamuizumab))，IL23p19(如替拉珠单抗(tildrakizumab))，PDL1(如度伐鲁单抗，阿维鲁单抗，阿特珠单抗)，IL17a(如伊克珠单抗)，CD38(如达雷木单抗)，SLAMF7(如埃洛妥单抗(elotuzumab))，CD20(如利妥昔单抗，托西莫单抗，替伊莫单抗和奥法木单抗)，CD30(如本妥昔单抗维多汀)，CD33(如吉妥珠单抗奥佐米星)，CD52(如阿仑单抗)，EpCam，CEA，fpA33，TAG-72，CAIX，PSMA，PSA，叶酸结合蛋白，GD2(如地努妥昔单抗(dinuntuximab))，GD3，IL6(如司妥昔单抗(silutxumab))GM2，Ley，VEGF(如贝伐单抗)，VEGFR，VEGFR2(如雷莫芦单抗(ramucirumab))、PDGFRα(如奥拉木单抗(olartumumab))、EGFR(如西妥昔单抗、帕尼单抗和奈西妥单抗(necitumumab))，ERBB2(如曲妥珠单抗)，ERBB3，MET，IGF1R，EPHA3，TRAIL R1，TRAIL R2，RANKL RAP，生腱蛋白(tenascin)，整合素αVβ3和整合素α4β1。
经FDA批准并可作为补充剂用于治疗肿瘤性疾病的抗体治疗剂的例子包括下文表中提供的那些。
物理方法
在一些实施方式中，补充剂是一种或多种非药物治疗方式(例如，局部放疗或全身放疗或手术)。举例而言，本发明内容考虑了治疗方案，其中在放射阶段之前或之后，用包含IL-27R结合分子和一种或多种补充剂的治疗方案进行治疗。在一些实施方式中，本发明进一步考虑将IL-27R结合分子与手术(如肿瘤切除术)组合使用。在一些实施方式中，本发明进一步考虑将IL-27R结合分子与骨髓移植、外周血干细胞移植或其他类型的移植疗法组合使用。
与免疫检查点调节剂的组合：
在一些实施方式中，“补充剂”是免疫检查点调节剂，用于治疗和/或预防对象的肿瘤性疾病以及与肿瘤性疾病相关的疾病、紊乱或病症。术语“免疫检查点途径”是指由表达在抗原呈递细胞(APC)上的第一分子(例如PD1等蛋白)结合至第二分子(例如PDL1等蛋白)所触发的生物学反应，后者在免疫细胞(例如T细胞)上表达，其或通过刺激免疫反应(例如T细胞活性的上调)或抑制(例如T细胞活性的下调)调节免疫反应。参与形成调节免疫反应的结合对的分子通常被称为“免疫检查点”。由这种免疫检查点途径调节的生物学反应是由胞内信号转导途径介导的，其导致下游的免疫效应途径，例如细胞激活、细胞因子产生、细胞迁移、细胞毒性因子分泌和抗体产生。免疫检查点途径通常由第一细胞表面表达的分子结合至与免疫检查点途径相关的第二细胞表面分子而触发(例如PD1结合至PDL1，CTLA4结合至CD28等)。免疫检查点途径的激活可以导致免疫反应的刺激或抑制。
如本文所用，术语“免疫检查点途径调节剂”是指在包括免疫健全的哺乳动物在内的生物系统中抑制或刺激免疫检查点途径的活性的分子。免疫检查点途径调节剂可通过结合至免疫检查点蛋白(例如表达在抗原呈递细胞(APC)表面的那些免疫检查点蛋白，例如癌细胞和/或免疫T效应细胞)而发挥其作用，或可对免疫检查点途径中的上游和/或下游反应发挥其作用。例如，免疫检查点途径调节剂可以调节SHP2的活性，参与PD-1和CTLA-4信号转导的酪氨酸磷酸酶。术语“免疫检查点途径调节剂”包括能够至少部分下调抑制性免疫检查点功能的免疫检查点途径调节剂(本文称为“免疫检查点途径抑制剂”或“免疫检查点途径拮抗剂”)和能够至少部分上调刺激性免疫检查点功能的一种或多种免疫检查点途径调节剂(本文称为“免疫检查点途径效应物”或“免疫检查点途径激动剂”)。
免疫检查点调节剂包括但不限于免疫检查点拮抗剂(例如拮抗剂抗体)，其结合T细胞抑制性受体，包括但不限于PD1(也被称为CD279)、TIM3(T细胞膜蛋白3；也被称为HAVcr2)、BTLA(B和T淋巴细胞减弱剂；也称为CD272)、VISTA(B7-H5)受体、LAG3(淋巴细胞激活基因3；也称为CD233)和CTLA4(细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4；也称为CD152)。在一些实施方式中，免疫检查点调节剂是触发检查点途径导致免疫反应的刺激的激动剂。这种激动剂免疫检查点调节剂的例子包括但不限于调节ICOSL结合至ICOS(CD278)、B7-H6结合至NKp30、CD155结合至CD96、OX40L结合至OX40、CD70结合至CD27、CD40结合至CD40L和GITRL结合至GITR的激动剂。这种正向免疫检查点激动剂的例子包括但不限于结合T细胞激活受体的激动剂抗体，例如ICOS(例如JTX-2011,Jounce Therapeutics)、OX40(例如MEDI6383,Medimmune)、CD27(例如伐立鲁单抗(varlilumab),Celldex Therapeutics)、CD40(例如达西组单抗(dacetuzmumab)CP-870,893,罗氏(Roche),Chi Lob 7/4)、HVEM、CD28、CD137 4-1BB、CD226和GITR(例如MEDI1873,Medimmune；INCAGN1876,Agenus)。
示例性的负向免疫检查点途径抑制剂包括但不限于程序性死亡-1(PD1)途径抑制剂、程序性死亡配体-1(PDL1)途径抑制剂、TIM3途径抑制剂和抗-细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA4)途径抑制剂。
在一个实施方式中，免疫检查点途径调节剂是抑制PD1结合至PDL1和/或PDL2的负向免疫检查点途径的拮抗剂("PD1途径抑制剂)。术语PD1途径抑制剂包括干扰PD1至PDL1和/或PDL2的结合的单克隆抗体。用作治疗肿瘤性疾病的补充剂的市售可得的PD1途径抑制剂的例子包括干扰PD1结合至PDL1和/或PDL2的抗体包括但不限于纳武单抗(BMS-936558，MDX1106，商购自BristolMyers Squibb公司，新泽西州普林斯顿)，帕博利珠单抗(MK-3475，兰姆单抗，商购自默克公司(Merck and Company),新泽西州肯尼尔沃斯)和阿特珠单抗(基因泰克/罗氏(Genentech/Roche),加利福尼亚州南旧金山)。其他PD1途径抑制剂抗体在临床开发中，包括但不限于杜瓦鲁单抗(MEDI4736，阿斯利康/米迪缪尼(Medimmune/AstraZeneca))、匹利珠单抗(CT-011，CureTech)、PDR001(诺华(Novartis))、BMS-936559(MDX1105，BristolMyers Squibb)，以及阿维鲁单抗(MSB0010718C，默克/辉瑞(Merck Serono/Pfizer))和SHR-1210(因赛特医疗(Incyte))。2012年7月10日授权的美国专利号8,217,149(基因泰克公司)、2012年5月1日授权的美国专利号8,168,757(默沙东(Merck Sharp and Dohme Corp))、2011年8月30日授权的美国专利号8,008,449(美达莱(Medarex))、2011年5月17日授权的美国专利号7,943,743(美达莱公司)中描述了其他抗体PD1途径抑制剂。
术语PD1途径抑制剂不限于拮抗剂抗体。非抗体生物制剂PD1途径抑制剂也在临床开发中，包括AMP-224，PD-L2 IgG2a融合蛋白，和AMP-514，PDL2融合蛋白，正由Amplimmune和Glaxo SmithKline)进行临床开发，适体(Wang,等(2018)145:125-130)，肽PD1途径抑制剂(Sasikumar,等,2016年8月23日授权的美国专利号9,422,339，和Sasilkumar,等,2014年12月9月授权的美国专利号8,907,053)，小分子(CA-170,AUPM-170,Aurigene/Curis；Sasikumar,等,1,2,4-噁二唑和噻二唑化合物作为免疫调节剂(1,2,4-oxadiazole andthiadiazole compounds as immunomodulators)(PCT/IB2016/051266，2016年3月7日提交，2016年9月15日公开为WO2016142833A1)和Sasikumar,等2016年3月9提交的PCT/IB2016/051343并公开为WO2016142886A2),BMS-1166和Chupak LS和Zheng X.(2015)WO2015/034820 A1,EP3041822B1，授权于2017年8月9日；WO2015034820 A1；和Chupak,等2015)WO 2015/160641A2.WO 2015/160641 A2,Chupak,等Sharpe,等WO 2011082400A2，公开于2011年7月7日；美国专利号7,488,802，授权于2009年2月10日；
在一些实施方式中，IL-27R结合分子与抑制CTLA4结合至CD28的负向免疫检查点途径的拮抗剂("CTLA4途径抑制剂")组合给予。CTLA4途径抑制剂的例子在本领域是众所周知的(参见，例如，美国专利号6,682,736(Abgenix)，2004年1月27日授权；美国专利号6,984,720(美达莱公司(Medarex,Inc.))，2007年5月29日授权；美国专利号7,605,238(美达莱公司(Medarex,Inc.))，2009年10月20日授权)。
在一些实施方式中，IL-27R结合分子与抑制TIM3结合至TIM3-激活配体能力的负向免疫检查点途径的拮抗剂(“TIM3途径抑制剂”)组合给予。TIM3途径抑制剂的例子在本领域是已知的，有代表性的非限制性例子描述于2016年9月15日公开的PCT国际专利公开号WO2016/144803；Lifke,等美国专利公开号US 20160257749 A1，公开于2016年9月8日(F.Hoffman-LaRoche)；Karunsky，美国专利号9,631,026，授权于于2017年4月27日；Karunsky，Sabatos-Peyton等，美国专利号8,841,418，授权于2014年9月23日；美国专利号9,605,070；Takayanagi，等，美国专利号8,552,156，授权于2013年10月8日。
在一些实施方式中，IL-27R结合分子与LAG3和PD1的抑制剂组合给予，因为LAG3和PD1的阻断已被认为在慢性感染的情况下能协同逆转肿瘤特异性CD8+T细胞和病毒特异性CD8+T细胞之间的无反应性。IMP321(ImmuFact)正在黑色素瘤、乳腺癌和肾细胞癌中评估。通常参见Woo等,(2012)Cancer Res 72:917-27；Goldberg等,(2011)Curr.Top.Microbiol.Immunol.344:269-78；Pardoll(2012)Nature Rev.Cancer 12:252-64；Grosso等,(2007)J.Clin.Invest.117:3383-392。
在一些实施方式中，IL-27R结合分子与A2aR抑制剂组合给予。A2aR通过刺激CD4+T细胞向TReg细胞发育而抑制T细胞反应。A2aR在肿瘤免疫中特别重要，因为肿瘤中细胞更新引起的细胞死亡率很高，而死亡的细胞释放腺苷，其为A2aR的配体。此外，A2aR的缺失与感染的炎症反应增强有关，有时是病理性的。A2aR的抑制可以通过给予分子(例如阻断腺苷结合的抗体或腺苷类似物)来实现。此类试剂可以与IL-27R结合分子组合使用，用于治疗紊乱，例如癌症和帕金森病。
在一些实施方式中，IL-27R结合分子与IDO(吲哚胺2,3-双加氧酶(Indoleamine2,3-dioxygenase))的抑制剂组合给予。IDO下调免疫反应，通过氧化色氨酸介导，从而抑制T细胞的激活和诱导T细胞凋亡，创造使肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞在功能上失活或不再能够攻击对象的癌症细胞的环境。吲哚莫德(indoximod)(NewLink Genetics)是IDO抑制剂，正在对转移性乳腺癌进行评估。
如前所述，本发明提供了一种治疗哺乳动物对象的肿瘤性疾病(如癌症)的方法，通过IL-27R结合分子与调节至少一种免疫检查点途径的一种或多种试剂组合给予，其包括调节两个、三个或更多免疫检查点途径的免疫检查点途径调节剂。
在一些实施方式中，IL-27R结合分子与调节多个免疫检查点途径的免疫检查点调节剂组合给予。可通过给予作为多种免疫检查点途径的调节剂的多功能分子来调节多种免疫检查点途径。这种多重免疫检查点途径调节剂的例子包括但不限于双特异性或多特异性抗体。能够用作多种免疫检查点途径或的调节剂的多特异性抗体的例子在本领域是已知的。例如，美国专利公开号2013/0156774描述了双特异性和多特异性试剂(例如抗体)，以及它们的使用方法，用于靶向共表达PD1和TIM3的细胞。此外，BTLA和PD1的双重阻断已被证明可增强抗肿瘤免疫(Pardoll,(2012年4月)Nature Rev.Cancer 12:252-64)。本发明考虑IL-27R结合分子与靶向多种免疫检查点途径的免疫检查点途径调节剂组合使用，包括但限于结合至PD1和LAG3的双特异性抗体。因此，可以在多个层面上增强抗肿瘤免疫力，鉴于各种机制上的考虑，可以产生组合策略。
在一些实施方式中，IL-27R结合分子可与两种、三种、四种或更多的检查点途径调节剂组合给予。这种组合可能是有利的，因为免疫检查点途径可能有不同的作用机制，这就提供了从多个不同的治疗角度攻击潜在疾病、紊乱或病症的机会。
应注意，对免疫检查点途径抑制剂的治疗缓解往往比对传统化疗(如酪氨酸激酶抑制剂)的缓解表现得晚得多。在一些情况下，在开始使用免疫检查点途径抑制剂治疗后，可能需要六个月或更长时间才能观察到治疗缓解的客观指标。因此，确定是否用一种或多种免疫检查点途径抑制剂与本发明的IL-27R结合分子组合治疗，必须经过经常比传统化疗更长的进展时间(time-to-progression)。所期望的缓解可以是在这种情况下认为有利的任何结果。在一些实施方式中，期望的缓解是防止疾病、紊乱或病症的进展，而在其他实施方式中，期望的缓解是疾病、紊乱或病症的一个或多个特征的消退或稳定(例如，肿瘤大小的减少)。在另一些实施方式中，期望的缓解是减少或消除与该组合的一种或多种试剂有关的一种或多种不良反应。
作为补充剂的细胞治疗剂和方法：
在一些实施方式中，本发明的方法可以包括IL-27R结合分子的给予与细胞疗法形式的补充剂的组合，以治疗肿瘤性、自身免疫性或炎症性疾病。适合与本发明的方法组合使用的细胞疗法的例子包括但不限于工程改造的T细胞产品，其包括一种或多种激活的CAR-T细胞、工程改造的TCR细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、工程改造的Treg细胞。由于工程改造的T细胞产品在给予对象之前通常离体激活，因此提供了上调的CD25水平，包括这种激活的工程改造T细胞类型的细胞产品适合通过给予本文所述的CD25偏向化IL-27R结合分子以进一步支持。
在本发明的方法的一些实施方式中，补充剂为“嵌合抗原受体T-细胞”和“CAR-T细胞”，其可互换使用，指的是经过重组修饰以表达嵌合抗原受体的T细胞。如本文所用，术语如本文所用，术语“嵌合抗原受体”和“CAR”可互换使用，指的是包含多个功能结构域的嵌合多肽，其从氨基端到羧基端的序列依次排列为：(a)抗原结合结构域(ABD)；(b)跨膜结构域(TD)；和(c)一个或多个胞质信号转导结构域(CSD)，其中上述结构域可以任选地由一个或多个间隔子结构域连接。CAR还可进一步包括信号肽序列，其通常在翻译后处理过程中被去除，并在用包含编码CAR的核酸序列的表达载体转化的细胞表面呈递CAR。在本发明的实践中有用的CAR可以按照本领域众所周知的原理制备。参见，例如，Eshhaar等，美国专利号7,741,465B1，2010年6月22日授权；Sadelain,等(2013)Cancer Discovery 3(4):388-398；Jensen和Riddell(2015)《新编免疫学观点》(Current Opinions in Immunology)33:9-15；Gross,等(1989)PNAS(USA)86(24):10024-10028；Curran,等(2012)J Gene Med14(6):405-15。可以被修饰以纳入本发明的正交受体的市售可得CAR-T细胞产品的例子包括阿基伦赛(axicabtagene ciloleucel)(从吉利德制药公司(Gilead Pharmaceuticals)以名称市售可得)和替沙伦赛(tisagenlecleucel)(从诺华(Novartis)以名称市售可得)。在一些实施方式中，CAR-T具有特异性结合至与肿瘤细胞相关的细胞表面分子的CAR，其选自下组：GD2、BCMA、CD19、CD33、CD38、CD70、GD2、IL3Rα2、CD19、间皮素、Her2、EpCam、Muc1、ROR1、CD133、CEA、EGRFRVIII、PSCA、GPC3、Pan-ErbB和FAP。
物理方法:
在一些实施方式中，补充剂是抗-肿瘤性物理方法，包括但不限于放疗、冷冻疗法、高温疗法、手术、激光消融和质子疗法。
试剂盒：本发明还考虑了包含药物组合物IL-27R结合分子及其药物组合物的试剂盒。该试剂盒通常为容纳各种成分的物理结构形式，如下文所述，并可用于例如实施上述方法。试剂盒可以包括IL-27R结合分子，其形式为适合给予对象的药物组合物，其可以是现成的，或需要制备的形式，例如，在给予前解冻、重建或稀释。当IL-27R结合分子是需要由使用者重建的形式时，试剂盒还可以包括无菌容器，提供包括缓冲剂、药学上可接受的赋形剂等的重建介质。本发明的试剂盒可以设计为适当维持其中所含组分的必要条件(例如，冷藏或冷冻)。试剂盒可进一步包含标签或包装插页，包括其中的组分的鉴定信息和使用说明。试剂盒中的各组分可以被封装在单独的容器中，所有的各种容器可以在一个单独包装中。标签或插页可以包括制造商信息，如批号和失效日期。标签或包装插页可以，例如，整合到容纳组分的物理结构中，分别地包含在物理结构中，或固定在试剂盒的组分上(例如，安瓿、注射器或小瓶)。标签或插页可以以物理形式或计算机可读介质提供。在一些实施方式中，实际说明书并不存在于试剂盒中，而是试剂盒提供了从远程获得说明书的方法，例如，通过互联网网站，包括通过提供符合政府法规(例如，HIPAA)的密码(或可扫描的代码，如IL-27R结合分子或包含试剂盒的容器上的条形码或QR码)的安全访问。
本说明书中给出的每个最大的数字限制旨在包括每个较低的数字限制，就如同这些较低的数字限制明确写在本文中。本说明书中给出的每个最小数字限制将包括每个较高的数字限制，就如同这些较高的数字限制明确写在本文中。本说明书中给出的每一个数字范围都将包括落入这种较宽的数字范围的每个较窄的数字范围，就如同所述较窄的数字范围都明确写在本文中。
本文的任何引用不作为承认构成现有技术。对参考文献的讨论说明了其作者的主张，发明人保留对所引用文件的准确性和相关性提出质疑的权利。应理解，尽管本文引用了一些信息来源，包括科学期刊文章、专利文件和教科书；但这种引用并不构成承认这些文件中的任何一个构成本领域常见常识的一部分。
在本发明的方法的实践中作为补充剂有用的前述抗体可以单独给予或以任何抗体药物偶联物(ADC)的形式给予，其包括抗体、接头和一种或多种药物(如1、2、3、4、5、6、7或8种药物)或以修饰形式(如PEG化)。
在一些实施方式中，该补充剂是疫苗。根据Doyle,等的美国专利第5,800,819号(1998年9月1日授权)的教导，本发明的IL27R结合蛋白可与疫苗组合给予对象作为佐剂以增强对疫苗的免疫反应。可以与本发明的IL27R结合蛋白组合的疫苗的例子包括HSV疫苗，百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)，大肠杆菌疫苗，肺炎球菌疫苗(pneumococcalvaccine)，其包括多价肺炎球菌疫苗例如13，白喉，破伤风和百日咳疫苗(包括组合疫苗例如)和)，水痘疫苗，B型流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae type B)疫苗，人乳头瘤病毒疫苗例如小儿麻痹症，钩端螺旋体病疫苗(Leptospirosis vaccines)，组合呼吸道疫苗，莫拉氏菌(Moraxella)疫苗，以及减毒或灭活病毒产品，例如牛呼吸道疾病疫苗(RSV)，多价人流感疫苗例如和Quadravlent)，猫白血病病毒疫苗(feline leukemia vaccine)，传染性肠胃炎疫苗、COVID-19疫苗和狂犬病疫苗。
就预防性应用而言，药物组合物或药物以足以消除或降低风险，降低严重性或延缓疾病的发作(包括疾病的生化、组织学和/或行为症状)的量，给予对疾病易感或有疾病风险的患者，其并发症和在疾病发展过程中出现中间病理表型。
实施例
实施例1
在免疫前，骆驼在研究机构中至少适应了7天。用1×PBS(抗原总量约1mg)稀释抗原。通过SDS-PAGE评估抗原的质量以确保纯度(例如>80％)。对于首次，将10mL CFA(随后使用IFA进行6次)加入研钵中，然后将10mL抗原在1×PBS中缓慢加入研钵，用研杵研磨。将抗原和CFA/IFA研磨，直到该组分显示乳白色并且看起来难以分散。在骆驼身上的至少六个部位皮下注射在CFA中乳化的抗原，在每个部位注射约2mL(每只骆驼总共10mL)。通过注射更多的部位和更大的体积，可以产生更强的免疫反应。每周(7天)进行免疫，进行7次。每次注射后将针插入皮下空间10至15秒，以避免乳液泄漏。或者，轻轻牵拉注射器柱塞也可以防止泄漏。第7次免疫后3天采集血样。
.在免疫方案中最后一次注射后三天从骆驼身上采集100mL血。从血液中提取RNA并转录成cDNA。编码VH-CH1-铰链-CH2-CH3构建体的约900bp的逆转录序列从编码VHH-铰链-CH2-H3物质的约所需700bp片段中分离。通过巢式PCR扩增纯化的约700bp片段。使用Pst1和Not1消化扩增的序列。将约400bp的PST1/Not1消化片段插入到Pst1/Not1消化的pMECS噬菌粒载体中，使得编码VHH的序列与编码HA/His序列的DNA序列在框内。PCR产生的序列和pMECS噬菌粒的载体用Pst I和Not I消化，随后连接到pMECS/Nb重组体。连接后，通过电穿孔将产物转化到大肠杆菌(E.coli)TG1细胞中。将转化体富集在生长培养基中，然后转移到2YT+2％葡萄糖琼脂平板上。
对噬菌体库进行生物淘选以鉴定结合IL27Rα的VHH。用IL27Rα包被96孔板，并在每个孔中孵育噬菌体文库，以允许表达IL27Rα反应性VHH的噬菌体结合至板上的IL27Rα。洗涤非特异性结合的噬菌体并分离特异性结合噬菌体。选择后，在TG1细胞中扩增表达IL27Rα反应性VHH的富集噬菌体文库。重复上述生物淘选过程2-3轮，以富集针对IL27Rα的VHH选择性文库。在完成生物淘选后，分离三个96孔板的单噬菌体克隆，以在包被有抗原的板上进行周质提取物ELISA PE-ELISA)，以鉴定阳性VHH结合剂。简言之，在相同条件下用抗原和PBS包被96孔板。接下来，在37℃下封闭孔1小时。然后，向各孔中加入100μl提取的抗体并孵育1小时。随后，向各孔中加入100μl与HRP偶联的抗标签多克隆抗体，并在37℃下孵育1小时。用TMB底物显影板。通过加入H2SO4停止反应。在微量滴定板阅读器上读取450nm处的吸光度，并且抗原包被的孔的吸光度比PBS包被的对照大至少三倍的抗体是特异性结合分子，并进行序列分析。
实施例2–重组产生和纯化
将密码子优化的DNA插入物克隆到修饰的pcDNA3.4(Genewiz)中，用于在24孔板中的HEK293细胞中的小规模表达。结合蛋白基本上按照以下程序进行纯化。使用HamiltonStar自动化系统，将4x24孔块中的96x4mL上清液重新排列成4x96孔1mL块。PhyNexus微量移液吸头(Biotage,San Jose CA)吸取80μL Ni-Excel IMAC树脂(Cytiva)平衡洗涤缓冲液：PBS pH 7.4,30mM咪唑。在所有4x96孔块上浸渍PhyNexus吸头并循环进行14次1mL移液循环。PhyNexus吸头在2x1mL块中洗涤，块中装有洗涤缓冲液。PhyNexus吸头在3x0.36mL块中洗脱，块中装有洗脱缓冲液：PBS pH 7.4,400mM咪唑。PhyNexus吸头在3x1mL 0.5M氢氧化钠的块中再生。
基本上根据以下程序，使用T200对纯化的蛋白质洗脱液进行定量。将10μL的第一次96x0.36mL洗脱液转移到96孔微孔板中，并在HBS-EP+缓冲液(10mMHepes pH 7.4,150mM NaCl,1mM EDTA,0.05％Tween 20)中稀释至60μL。96个样品中的每一个都注射在先前用抗组氨酸捕获抗体(Cytiva)功能化的CM5系列S芯片上：以5μL/分钟的速度注射18秒。缓冲液洗涤60秒后记录捕获水平。在4个Biacore芯片流细胞中的每个中获得已知VHH浓度(270、90、30、10、3.3、1.1μg/mL)的标准曲线，以消除细胞间表面的可变性。使用包括特异性和非特异性的单位点结合的非线性模型，对照标准曲线对96次捕获进行内插。第一个洗脱块中的浓度在12至452μg/mL之间变化，对应于4-149μg。对5个随机选取的样品进行SDS-PAGE分析，以确保洗脱液的分子量符合预期值(约30kDa)。
基本上按照以下程序，使用Hamilton Star自动化系统对蛋白质的浓度进行标准化。在Excel电子表格中输入浓度值，其中计算移液体积以在0.22mL中稀释至50μg/mL。该电子表格以Hamilton Star方法输入，该方法致力于使用第一个洗脱块和洗脱缓冲液作为稀释剂进行稀释移液。使用0.22μm过滤板(康宁(Corning))对最终的标准化板进行无菌过滤。
实施例3
所有实验均在配备蛋白A芯片(Cytiva)的Biacore T200仪器上在10mM Hepes、150mM NaCl、0.05％(v/v)聚山梨醇酯20(PS20)和3mM EDTA(HBS-EP+缓冲液)中进行。单-FcVHH配体以5μl/分钟的速度流动18至300秒的可变时间，达到下表所列的捕获载荷。
配体捕获后，在高性能或单循环动力学模式下注射2倍稀释系列的his-加标签的细胞因子受体，其通常包含1μM和1nM之间的至少5种浓度。通过流动pH 1.5的10mM甘氨酸-HCl(60秒，50μL/分钟)实现表面再生。用Biacore T200评估软件处理减去缓冲液的感测图，并用1:1Langmuir结合模型(整体偏移设置为零)进行全局拟合，以提取动力学和亲和常数(ka，kd，kD)。R最大<100RU表示表面密度与动力学分析兼容。
使用以下公式生成计算的R最大：R最大＝载荷(RU)x配体的价态x(分析物的分子量/配体的分子量)。表面活性定义为实验/计算的R最大之比。样品信息和实验结果见下表。
抗-hGP130单-Fc VHH(配体)结合至hGP130-his(义翘神州(Sino Biological),目录号10974)
抗-hIL27Ra单-Fc VHH(配体)结合至hIL27Ra-his(Origene,目录号TP307012)
*当R最大>100时，缔合和离解动力学常数都可能被抑制。如果存在，这种效应很可能在动力学比率中被抵消，即亲和力常数。
实施例4
通过ELISA证实了所有VHH的结合。从每个克隆型中选择一个代表性VHH，使用Biacore T200通过表面等离子体共振进行进一步分析。见下文。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种IL27受体(IL27R)结合蛋白，其特异性结合至IL27Rα亚基(IL27Rα)和糖蛋白130亚基(gp130)，
其中，当所述结合蛋白结合至IL27Rα和gp130时，导致IL27Rα和gp130的多聚化，和
其中，所述结合蛋白包含特异性结合至IL27Rα的单域抗体(sdAb)(抗-IL27RαsdAb)和特异性结合至gp130的sdAb(抗-gp130 sdAb)。
2.如权利要求1所述的IL27R结合蛋白，其中所述抗-IL27RαsdAb是VHH抗体(抗-IL27RαVHH抗体)和/或所述抗-gp130 sdAb是VHH抗体(抗-gp130VHH抗体)。
3.如权利要求1至2中任一项所述的IL27R结合蛋白，其中所述抗-IL27RαsdAb和所述抗-gp130 sdAb通过肽接头接合。
4.如权利要求3所述的IL27R结合蛋白，其中所述肽接头包含1-50个氨基酸。
5.如权利要求4所述的IL27R结合蛋白，其中所述肽接头包含GGGS的序列(SEQ ID NO:108)。
6.如权利要求2-5中任一项所述的IL27R结合蛋白，其中所述抗-IL27RαVHH抗体包含相对于SEQ ID NO:193-198中任一项所述序列具有0、1、2或3个氨基酸变化的CDR1；相对于SEQID NO:199-204中任一项所述序列具有0、1、2或3个氨基酸变化的CDR2；和相对于SEQ IDNO:205-210中任一项所述序列具有0、1、2或3个氨基酸变化的CDR3。
7.如权利要求2-6中任一项所述的IL27R结合蛋白，其中所述抗-gp130VHH抗体包含相对于SEQ ID NO:211-217中任一项所述序列具有0、1、2或3个氨基酸变化的CDR1；相对于SEQID NO:218-224中任一项所述序列具有0、1、2或3个氨基酸变化的CDR2；和相对于SEQ IDNO:225-231中任一项所述序列具有0、1、2或3个氨基酸变化的CDR3。
8.如权利要求2-5中任一项所述的IL27R结合蛋白，其中所述IL27R结合蛋白包含：
第一VHH抗体，其包含相对于表1A的行的CDR1的序列具有至少90％(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性，或具有0、1、2或3个氨基酸变化，任选保守的氨基酸变化的CDR1；相对于表1A的同一行的CDR2的序列具有至少90％(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性，或具有0、1、2或3个氨基酸变化，任选保守的氨基酸变化的CDR2；和相对于表1A的同一行的CDR3具有至少90％(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性，或具有0、1、2或3个氨基酸变化，任选保守的氨基酸变化的CDR3；和
第二VHH抗体，其包含相对于表1A的同一行的CDR4的序列具有至少90％(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性，或具有0、1、2或3个氨基酸变化，任选保守的氨基酸变化的CDR1；相对于表1A的同一行的CDR5的序列具有至少90％(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性，或具有0、1、2或3个氨基酸变化，任选保守的氨基酸变化的CDR2；和相对于表1A的同一行的CDR6具有至少90％(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性，或具有0、1、2或3个氨基酸变化，任选保守的氨基酸变化的CDR3。
9.如权利要求8所述的IL27R结合蛋白，其中所述IL27R结合蛋白包含与表1A所示的双VHH二聚体序列中任一个具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
10.如权利要求2-9中任一项所述的IL27R结合蛋白，其中所述IL27R结合蛋白包含抗-IL27RαVHH抗体中的CDR1、CDR2和CDR3，以及抗-gp130VHH抗体中的CDR1、CDR2和CDR3，如表1的行中所列出的。
11.如权利要求1-14中任一项所述的IL27R结合蛋白，其中所述结合蛋白包含连接至所述接头的N-末端的抗-gp130 VHH抗体和连接至所述接头的C-末端的抗-IL27RαVHH抗体。
12.如权利要求11所述的IL27R结合蛋白，其中所述抗-gp130 VHH抗体包含与SEQ IDNO:232-237中任一项所述序列具有至少90％序列同一性的序列。
13.如权利要求11所述的IL27R结合蛋白，其中所述抗-IL27RαVHH抗体包含与SEQ IDNO:238-244中任一项所述序列具有至少90％序列同一性的序列。
14.如权利要求11所述的IL27R结合蛋白，其中所述抗-gp130 VHH抗体和所述抗-IL27RαVHH抗体中各包含相对于表2A的行中所列出的序列具有至少90％同一性的序列。
15.如权利要求11所述的IL27R结合蛋白，其中所述结合蛋白包含与SEQ ID NO:1-42中任一项所述序列具有至少90％序列同一性的序列。
16.如权利要求1所述的IL27R结合蛋白，其中所述结合蛋白包含连接至所述接头的N-末端的抗-IL27RαVHH抗体和连接至所述接头的C-末端的抗-gp130 VHH抗体。
17.如权利要求16所述的IL27R结合蛋白，其中所述抗-IL27RαVHH抗体包含与SEQ IDNO:245-251中任一项所述序列具有至少90％序列同一性的序列。
18.如权利要求16所述的IL27R结合蛋白，其中所述抗-gp130 VHH抗体包含与SEQ IDNO:252-257中任一项所述序列具有至少90％序列同一性的序列。
19.如权利要求16所述的IL27R结合蛋白，其中所述抗-IL27RαVHH抗体和所述抗-gp130VHH抗体中各包含相对于表3A的行中所列出的序列具有至少90％同一性的序列。
20.如权利要求16所述的IL27R结合蛋白，其中所述结合蛋白包含与SEQ ID NO:43-84中任一项所述序列具有至少90％序列同一性的序列。
21.一种分离的核酸，其编码如权利要求1-20中任一项所述的IL27R结合蛋白。
22.如权利要求21所述的分离的核酸，其中所述分离的核酸包含相对于表1B中序列或SEQ ID NO:109-192中任一项所述序列具有至少90％序列同一性的序列。
23.一种表达载体，其包含权利要求21所述的核酸。
24.一种分离的宿主细胞，其包含如权利要求23所述的载体。
25.一种药物组合物，包含权利要求1至20中任一项所述的IL27R结合蛋白和药学上可接受的运载体。
26.一种在有需要的对象中治疗自身免疫或炎性疾病、病症或病况、肿瘤性疾病或病毒感染的方法，包括向所述对象给予治疗有效量的权利要求1-20中任一项所述的IL27R结合蛋白或权利要求25所述的药物组合物。
27.如权利要求26所述的方法，其进一步包括给予一种或多种选自下组的补充试剂：类固醇、Janus激酶抑制剂、钙调磷酸酶抑制剂、mTor抑制剂、IMDH抑制剂、生物制剂、疫苗和治疗性抗体。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述治疗性抗体是结合选自下组的蛋白质的抗体：BLyS、CD11a、CD20、CD25、CD3、CD52、IgEIL12/IL23、IL17a、IL1β、IL4Rα、IL5、IL6R、整合素-α4β7、RANKL、TNFα、VEGF-A和VLA-4。
29.如权利要求26-28中任一项所述的方法，其中所述疾病、病症或病况选自：病毒感染、幽门螺杆菌感染、HTLV、器官排斥、移植物抗宿主病、自身免疫性甲状腺疾病、多发性硬化症、过敏、哮喘、神经退行性疾病，包括阿尔茨海默病、系统性红斑狼疮(SLE)、自体炎症疾病、炎性肠病(IBD)、克罗恩病、糖尿病、软骨炎、关节炎、类风湿性关节炎、幼年关节炎、幼年类风湿性关节炎、幼年类风湿性关节炎、多关节型幼年类风湿性关节炎、幼年类风湿性关节炎全身发作、幼年强直性脊柱炎、幼年肠病性关节炎、幼年反应性关节炎、幼年瑞特氏综合征、SEA综合征、幼年皮肌炎、幼年银屑病关节炎、幼年硬皮病、幼年系统性红斑狼疮、幼年血管炎、少关节型类风湿性关节炎、多关节型类风湿性关节炎、类风湿性关节炎全身发作、强直性脊柱炎、肠病性关节炎、反应性关节炎、瑞特氏综合征、SEA综合征、银屑病、银屑病关节炎、皮炎(湿疹)、剥脱性皮炎或特应性皮炎、毛发红糠疹、酒渣鼻糠疹、类银屑病、苔癣样糠疹、扁平苔藓、光泽苔藓、鱼鳞病样皮肤病、皮肤角化病、皮肤病、斑秃、坏疽性脓皮病、白癜风、类天疱疮、荨麻疹、角化病、类风湿性关节炎；脂溢性皮炎、日光性皮炎；脂溢性角化病、老年性角化病、光化性角化病、光诱导性角化病、毛囊角化病；寻常痤疮；瘢痕瘤；痣；肉赘，包括疣、湿疣或尖锐湿疣，以及人乳头状瘤病毒(HPV)感染。

Claims (20)

1.一种IL27受体(IL27R)结合蛋白，其特异性结合至IL27Rα亚基(IL27Rα)和糖蛋白130亚基(gp130)，
其中，当所述结合蛋白结合至IL27Rα和gp130时，导致IL27Rα和gp130的多聚化，和
其中，所述结合蛋白包含特异性结合至IL27Rα的单域抗体(sdAb)(抗-IL27RαsdAb)和特异性结合至gp130的sdAb(抗-gp130 sdAb)。
2.如权利要求1所述的IL27R结合蛋白，其中所述抗-IL27RαsdAb是VHH抗体(抗-IL27RαVHH抗体)和/或所述抗-gp130 sdAb是VHH抗体(抗-gp130VHH抗体)。
3.如权利要求1至2中任一项所述的IL27R结合蛋白，其中所述抗-IL27RαsdAb和所述抗-gp130 sdAb通过肽接头接合。
4.如权利要求3所述的IL27R结合蛋白，其中所述肽接头包含1-50个氨基酸。
5.如权利要求4所述的IL27R结合蛋白，其中所述肽接头包含GGGS的序列(SEQ ID NO:108)。
6.如权利要求2-5中任一项所述的IL27R结合蛋白，其中所述抗-IL27RαVHH抗体包含相对于SEQ ID NO:193-198中任一项所述序列具有0、1、2或3个氨基酸变化的CDR1；相对于SEQID NO:199-204中任一项所述序列具有0、1、2或3个氨基酸变化的CDR2；和相对于SEQ IDNO:205-210中任一项所述序列具有0、1、2或3个氨基酸变化的CDR3。
7.如权利要求2-6中任一项所述的IL27R结合蛋白，其中所述抗-gp130VHH抗体包含相对于SEQ ID NO:211-217中任一项所述序列具有0、1、2或3个氨基酸变化的CDR1；相对于SEQID NO:218-224中任一项所述序列具有0、1、2或3个氨基酸变化的CDR2；和相对于SEQ IDNO:225-231中任一项所述序列具有0、1、2或3个氨基酸变化的CDR3。
8.如权利要求2-5中任一项所述的IL27R结合蛋白，其中所述IL27R结合蛋白包含：
第一VHH抗体，其包含相对于表1A的行的CDR1的序列具有至少90％(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性，或具有0、1、2或3个氨基酸变化，任选保守的氨基酸变化的CDR1；相对于表1A的同一行的CDR2的序列具有至少90％(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性，或具有0、1、2或3个氨基酸变化，任选保守的氨基酸变化的CDR2；和相对于表1A的同一行的CDR3具有至少90％(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性，或具有0、1、2或3个氨基酸变化，任选保守的氨基酸变化的CDR3；和
第二VHH抗体，其包含相对于表1A的同一行的CDR4的序列具有至少90％(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性，或具有0、1、2或3个氨基酸变化，任选保守的氨基酸变化的CDR1；相对于表1A的同一行的CDR5的序列具有至少90％(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性，或具有0、1、2或3个氨基酸变化，任选保守的氨基酸变化的CDR2；和相对于表1A的同一行的CDR6具有至少90％(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性，或具有0、1、2或3个氨基酸变化，任选保守的氨基酸变化的CDR3。
9.如权利要求8所述的IL27R结合蛋白，其中所述IL27R结合蛋白包含与表1A所示的双VHH二聚体序列中任一个具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
10.如权利要求2-9中任一项所述的IL27R结合蛋白，其中所述IL27R结合蛋白包含抗-IL27RαVHH抗体中的CDR1、CDR2和CDR3，以及抗-gp130VHH抗体中的CDR1、CDR2和CDR3，如表1的行中所列出的。
11.如权利要求1-14中任一项所述的IL27R结合蛋白，其中所述结合蛋白包含连接至所述接头的N-末端的抗-gp130 VHH抗体和连接至所述接头的C-末端的抗-IL27RαVHH抗体。
12.一种分离的核酸，其编码如权利要求1-20中任一项所述的IL27R结合蛋白。
13.如权利要求21所述的分离的核酸，其中所述分离的核酸包含相对于表1B中序列或SEQ ID NO:109-192中任一项所述序列具有至少90％序列同一性的序列。
14.一种表达载体，其包含权利要求21所述的核酸。
15.一种分离的宿主细胞，其包含如权利要求23所述的载体。
16.一种药物组合物，包含权利要求1至20中任一项所述的IL27R结合蛋白和药学上可接受的运载体。
17.一种在有需要的对象中治疗自身免疫或炎性疾病、病症或病况、肿瘤性疾病或病毒感染的方法，包括向所述对象给予治疗有效量的权利要求1-20中任一项所述的IL27R结合蛋白或权利要求25所述的药物组合物。
18.如权利要求26所述的方法，其进一步包括给予一种或多种选自下组的补充试剂：类固醇、Janus激酶抑制剂、钙调磷酸酶抑制剂、mTor抑制剂、IMDH抑制剂、生物制剂、疫苗和治疗性抗体。
19.如权利要求27所述的方法，其中所述治疗性抗体是结合选自下组的蛋白质的抗体：BLyS、CD11a、CD20、CD25、CD3、CD52、IgEIL12/IL23、IL17a、IL1β、IL4Rα、IL5、IL6R、整合素-α4β7、RANKL、TNFα、VEGF-A和VLA-4。
20.如权利要求26-28中任一项所述的方法，其中所述疾病、病症或病况选自：病毒感染、幽门螺杆菌感染、HTLV、器官排斥、移植物抗宿主病、自身免疫性甲状腺疾病、多发性硬化症、过敏、哮喘、神经退行性疾病，包括阿尔茨海默病、系统性红斑狼疮(SLE)、自体炎症疾病、炎性肠病(IBD)、克罗恩病、糖尿病、软骨炎、关节炎、类风湿性关节炎、幼年关节炎、幼年类风湿性关节炎、幼年类风湿性关节炎、多关节型幼年类风湿性关节炎、幼年类风湿性关节炎全身发作、幼年强直性脊柱炎、幼年肠病性关节炎、幼年反应性关节炎、幼年瑞特氏综合征、SEA综合征、幼年皮肌炎、幼年银屑病关节炎、幼年硬皮病、幼年系统性红斑狼疮、幼年血管炎、少关节型类风湿性关节炎、多关节型类风湿性关节炎、类风湿性关节炎全身发作、强直性脊柱炎、肠病性关节炎、反应性关节炎、瑞特氏综合征、SEA综合征、银屑病、银屑病关节炎、皮炎(湿疹)、剥脱性皮炎或特应性皮炎、毛发红糠疹、酒渣鼻糠疹、类银屑病、苔癣样糠疹、扁平苔藓、光泽苔藓、鱼鳞病样皮肤病、皮肤角化病、皮肤病、斑秃、坏疽性脓皮病、白癜风、类天疱疮、荨麻疹、角化病、类风湿性关节炎；脂溢性皮炎、日光性皮炎；脂溢性角化病、老年性角化病、光化性角化病、光诱导性角化病、毛囊角化病；寻常痤疮；瘢痕瘤；痣；肉赘，包括疣、湿疣或尖锐湿疣，以及人乳头状瘤病毒(HPV)感染。
关节炎、幼年类风湿性关节炎全身发作、幼年强直性脊柱炎、幼年肠病性关节炎、幼年反应性关节炎、幼年瑞特氏综合征、SEA综合征、幼年皮肌炎、幼年银屑病关节炎、幼年硬皮病、幼年系统性红斑狼疮、幼年血管炎、少关节型类风湿性关节炎、多关节型类风湿性关节炎、类风湿性关节炎全身发作、强直性脊柱炎、肠病性关节炎、反应性关节炎、瑞特氏综合征、SEA综合征、银屑病、银屑病关节炎、皮炎(湿疹)、剥脱性皮炎或特应性皮炎、毛发红糠疹、酒渣鼻糠疹、类银屑病、苔癣样糠疹、扁平苔藓、光泽苔藓、鱼鳞病样皮肤病、皮肤角化病、皮肤病、斑秃、坏疽性脓皮病、白癜风、类天疱疮、荨麻疹、角化病、类风湿性关节炎；脂溢性皮炎、日光性皮炎；脂溢性角化病、老年性角化病、光化性角化病、光诱导性角化病、毛囊角化病；寻常痤疮；瘢痕瘤；痣；肉赘，包括疣、湿疣或尖锐湿疣，以及人乳头状瘤病毒(HPV)感染。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116829585A (zh) * 2020-08-05 2023-09-29 辛德凯因股份有限公司 Il27受体结合相关的组合物和方法
US12018085B2 (en) 2020-08-05 2024-06-25 Synthekine, Inc. Interferon-gamma R2 (IFNGR2) binding molecules comprising single-domain antibodies and method of use thereof to treat autoimmune and inflammatory diseases
US12122839B2 (en) 2020-08-05 2024-10-22 Synthekine, Inc. IFNGR binding synthetic cytokines and methods of use
US20240052047A1 (en) * 2022-08-03 2024-02-15 Pfizer Inc. Anti- il27r antibodies and methods of use thereof

Family Cites Families (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
BRPI0511755A (pt) 2004-06-01 2008-01-02 Domantis Ltd composições, fusões e conjugados de drogas e métodos de produção, tratamento e utilização
WO2005120437A2 (en) 2004-06-04 2005-12-22 Genentech, Inc. Method for treating lupus
WO2006066088A2 (en) * 2004-12-16 2006-06-22 Genentech, Inc. Methods for treating autoimmune disorders
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
NZ595262A (en) 2005-09-01 2013-03-28 Us Gov Health & Human Serv Use of il-23 and il-27 antagonists to treat autoimmune ocular inflammatory disease
EP2046809B1 (en) * 2006-07-19 2016-12-07 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Wsx-1/il-27 as a target for anti-inflammatory responses
AU2008328779B2 (en) * 2007-11-27 2014-06-05 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against HER2 and polypeptides comprising the same for the treatment of cancers and/or tumors
US20100297127A1 (en) * 2009-04-08 2010-11-25 Ghilardi Nico P Use of il-27 antagonists to treat lupus
GB201005063D0 (en) 2010-03-25 2010-05-12 Ucb Pharma Sa Biological products
UY33492A (es) 2010-07-09 2012-01-31 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
TR201802772T4 (tr) * 2010-11-17 2018-03-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Kan pıhtılaşma faktörü VIII in işlevi için alternatif işleve sahip multi-spesifik antijen bağlayıcı molekül.
WO2012088302A2 (en) 2010-12-22 2012-06-28 Abbott Laboratories Half immunoglobulin binding proteins and uses thereof
AU2012205384B2 (en) 2011-01-14 2015-09-10 Five Prime Therapeutics, Inc. IL-27 antagonists for treating inflammatory diseases
EP2714738B1 (en) 2011-05-24 2018-10-10 Zyngenia, Inc. Multivalent and monovalent multispecific complexes and their uses
EP2729488A4 (en) 2011-07-06 2015-01-14 Medimmune Llc PROCESS FOR PREPARING MULTIMANT POLYPEPTIDES
US8790651B2 (en) * 2011-07-21 2014-07-29 Zoetis Llc Interleukin-31 monoclonal antibody
WO2013059299A1 (en) 2011-10-17 2013-04-25 The Uab Research Foundation Antibodies for interferon subtypes and interferon/interferon receptor ternary complex and uses thereof
US11161906B2 (en) 2013-07-25 2021-11-02 Cytomx Therapeutics, Inc. Multispecific antibodies, multispecific activatable antibodies and methods of using the same
CN115160441A (zh) * 2013-09-26 2022-10-11 埃博灵克斯股份有限公司 双特异性纳米抗体
JP2017513818A (ja) 2014-03-15 2017-06-01 ノバルティス アーゲー キメラ抗原受容体を使用する癌の処置
AU2015258875B2 (en) 2014-05-16 2020-12-24 Baylor Research Institute Methods and compositions for treating autoimmune and inflammatory conditions
US11426468B2 (en) 2014-12-19 2022-08-30 Ablynx N.V. Cysteine linked nanobody dimers
US10927186B2 (en) 2015-05-13 2021-02-23 Ablynx N.V. T cell recruiting polypeptides based on TCR alpha/beta reactivity
JP6688551B2 (ja) 2015-05-21 2020-04-28 ハープーン セラピューティクス，インク． 三重特異性結合タンパク質と使用方法
AU2016301970A1 (en) 2015-08-06 2018-03-22 Agency For Science, Technology And Research IL2Rbeta/common gamma chain antibodies
CN107400166A (zh) 2016-05-19 2017-11-28 苏州康宁杰瑞生物科技有限公司 针对ctla4的单域抗体及其衍生蛋白
US20200016202A1 (en) * 2016-10-07 2020-01-16 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Modulation of novel immune checkpoint targets
WO2018133873A1 (zh) 2017-01-23 2018-07-26 苏州康宁杰瑞生物科技有限公司 Pd-l1结合多肽或化合物
US20200157237A1 (en) 2017-05-25 2020-05-21 The Broad Institute, Inc. Lymphocyte antigen cd5like (cd5l) monomer, homodimer, and interleukin 12b (p40) heterodimer antagonists and methods of use thereof
JP2021509021A (ja) * 2017-12-18 2021-03-18 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド レプチン受容体および／またはｇｐ１３０に結合する二重特異性抗原結合分子、ならびにその使用方法
CN117050184A (zh) 2017-12-28 2023-11-14 南京传奇生物科技有限公司 针对tigit的单域抗体和其变体
BR112020025048A2 (pt) 2018-06-13 2021-04-06 Novartis Ag Receptores de antígeno quimérico de bcma e usos dos mesmos
AU2019291627A1 (en) 2018-06-19 2020-10-08 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Engineered cells and uses thereof
WO2020144164A1 (en) 2019-01-07 2020-07-16 Bactolife Aps Pathogen binding proteins
GB201903767D0 (en) 2019-03-19 2019-05-01 Quadrucept Bio Ltd Multimers, tetramers & octamers
CN111018985B (zh) 2019-12-06 2021-06-18 南京融捷康生物科技有限公司 针对牛血清白蛋白bsa的单域抗体的应用
AU2021339381A1 (en) * 2020-08-05 2023-03-23 Synthekine, Inc. Compositions and methods related to receptor pairings
CN116829585A (zh) * 2020-08-05 2023-09-29 辛德凯因股份有限公司 Il27受体结合相关的组合物和方法

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