CN116789785B - 长雄蕊野生稻高产、高光效基因FarL1及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一个来自长雄蕊野生稻(Oryza longistaminata)的新基因FarL1及其应用，属于作物基因工程和分子生物学技术领域。本发明将FarL1基因导入水稻近等基因系NIL‑FarL1或在水稻9311中过表达后，其光合作用效率、穗部二次枝梗数目和每穗穗粒数明显增加。这些结果表明FarL1基因通过调控水稻光合作用和二次枝梗发育使每穗穗粒数显著增加，从而提高水稻产量。因此，FarL1基因在培育高产水稻新品种上具有巨大的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于作物基因工程和分子生物学技术领域，具体涉及一种长雄蕊野生稻高产、高光效基因FarL1及其应用。
背景技术
水稻作为世界上三大粮食作物之一，以之为主食的人口数量占据着世界人口的一半以上。随着人口数量的增长、社会的发展以及人类生活水平的不断提高，水稻的供应缺口不断扩大，因此增加全球水稻产量来填补这个缺口，对于确保21世纪的粮食安全至关重要。挖掘产量相关的优良基因是提高水稻产量的一个重要途径。长雄蕊野生稻(Oryzalongistaminata)是一种来自非洲的古老野生稻，含有丰富的遗传变异，具有茎秆粗壮抗倒伏、穗大粒多、抗病虫抗逆能力强等众多优良特性，是水稻遗传改良的重要基因资源库。发掘利用长雄蕊野生稻中高产、抗病虫等相关基因对促进水稻高产改良，保障粮食安全具有重要意义。
水稻产量主要由三因素构成：有效穗、每穗穗粒数及千粒重。对这些产量性状基因进行克隆，并将这些有利的等位基因应用到实际水稻育种工作中，无疑将会促进高产量水稻品种的培育，从而缓解由于人口迅速增长带来的粮食危机。
Far(far-red-impaired response)转录因子家族是水稻、拟南芥等植物中遗传功能相对比较保守的一个基因家族，大量的研究表明该基因家族参与植物的生长发育、光周期调控以及抗逆等生物过程，具有相当多的生物学功能。
发明内容
本发明在长雄蕊野生稻大穗渗入系材料1762(Long et al.,Crop Journal,2023,doi:10.1016/j.cj.2023.03.017)的基础上，将其与长雄蕊野生稻渗入系受体亲本9311杂交、回交，构建其近等基因系，然后利用图位克隆的方法分离了该材料中控制每穗穗粒数的高产基因FarL1。该基因是长雄蕊野生稻的一个特异基因，具有促进水稻光合作用和二次枝梗发育的功能，增加穗粒数，从而提高水稻产量，可广泛应用于水稻高产新品种的培育。
本发明的目的在于提供一种长雄蕊野生稻高产基因FarL1，并根据该基因与水稻光合作用和二次枝梗发育的关系，进而提供FarL1基因在提高水稻产量上的应用。
本发明的目的可通过下述方案实现：
本发明通过水稻有性杂交将FarL1基因导入水稻或在水稻体内表达FarL1基因发现：将FarL1基因导入水稻近等基因系NIL-FarL1或在水稻品种9311体内表达FarL1后，其光合作用效率、成熟期穗部二次枝梗数目和每穗穗粒数明显高于9311。这表明FarL1直接调控水稻光合作用效率、二次枝梗数目和每穗穗粒数。FarL1是长雄蕊野生稻特异基因，它可通过与组蛋白H3K27Me2/3去甲基化酶互作来行驶功能，而组蛋白H3K27Me2/3去甲基化酶及其功能结构域在其他重要粮食作物(高粱、玉米等)中高度保守，表明该基因对其他作物产量调控方面可能有着相似的分子机制。因此FarL1很可能也通过类似分子机制调控其他单子叶禾本科作物的产量。
FarL1，一种参与水稻光合作用和二次枝梗发育调控的蛋白质，来源于长雄蕊野生稻(Oryza longistaminata)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
为了使FarL1蛋白质便于研究和利用，可在该蛋白序列的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1.标签及其氨基酸序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6(通常为5个) | RRRRR |
| Poly-His | 2-10(通常为6个) | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tagⅡ | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
一种参与水稻光合作用、二次枝梗发育调控的FarL1基因，其核苷酸序列为SEQ IDNO.1、2或3所示序列的任一种。
SEQ ID NO.1所示核苷酸序列为基因组碱基序列，由2395个碱基组成，其中包含启动子、5'UTR、外显子、3'UTR。
SEQ ID NO.2所示核苷酸序列为cDNA编码序列。
SEQ ID NO.3所示核苷酸序列为CDS序列。
FarL1基因具有促进水稻光合作用、二次枝梗发育进而提高水稻产量的应用。相应的，扩增FarL1基因全长的引物，含有FarL1基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌，也具有促进水稻光合作用、二次枝梗发育进而提高水稻产量的应用
FarL1基因能够通过促进水稻光合作用及其增加二次枝梗数目使水稻每穗穗粒数明显增加，在培育高产水稻品种上具有重要应用价值。
扩增FarL1基因全长的引物在水稻高产量品种培育上的应用。
含有FarL1基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌在水稻高产量品种培育上的应用。
提高水稻光合作用效率、二次枝梗数目以及水稻产量可以通过杂交转移将FarL1导入栽培稻品种，或通过转基因将FarL1转入栽培稻使其正常表达或过表达来实现，具体操作方法为将FarL1基因通过利用携带FarL1基因的长雄蕊野生稻或NIL-FarL1与其他水稻品种进行有性杂交，将其导入其他水稻品种中；或通过表达载体转入到水稻体内使FarL1过表达。
为了构建含有FarL1的重组载体可选择现有的作物转化载体。所述作物转化载体包括双元农杆菌载体和可用于作物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA3301、pYLCRISPR/Cas9Pubi-B、pYLCRISPR/Cas9P35S-H、pYLCRISPR/Cas9P35S-N、pCAMBIA2301、pH7WG2D或其他编辑技术相关载体，如TALENs、ZFNs等。
为了达到利用FarL1基因改善水稻产量的目的，在构建载体时可以在基因起始位点前添加任何一种有助于改变FarL1基因表达的启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素(Ubiquitin)基因启动子(pUbi)等，此外还可以通过添加增强子的方式达到增强表达的目的。无论采用何种方式必须保证编码序列的正确性从而获得正确的FarL1蛋白结构。
可采用那些含有标记基因如：GUS基因、GFP基因，抗潮霉素基因、抗除草剂基因等的载体构建重组载体，这样更有利于实验操作以及后期的转化子筛选。
所述的含有FarL1的重组载体可以通过多种手段转化到作物组织或细胞中，如显微注射、农杆菌介导的遗传转化、通过Ti质粒、Ri质粒或病毒载体等常见的试验方法。
FarL1基因本身还可以作为分子标记应用于水稻育种中。
上述水稻包括籼稻、粳稻等。
本发明通过水稻品种间的有性杂交基因转移或转基因技术定向将FarL1转入水稻的方法来促进水稻光合作用、二次枝梗发育，说明该基因可作为提高水稻光合作用、增加二次枝梗数目应用于水稻高产农作物的育种当中。因此，FarL1基因为利用分子标记辅助育种及利用基因工程的方法培育水稻高产新品种提供了强有力的手段和工具，具有巨大的应用潜力。
附图说明
图1是长雄蕊野生稻渗入系1762的形态特征。A，渗入系1762的株型和穗型。B，渗入系1762的枝梗数与穗粒数的统计结果；PB和SB分别指一次枝梗和二次枝梗。
图2是FarL1近等基因系(NIL-FarL1)的株型和穗型。
图3是FarL1基因结构图，含有FAR1 DNA结合结构域。
图4是FarL1基因过表达载体结构示意图。
图5是FarL1基因编码蛋白的模建结构。
图6是过表达转基因植株中FarL1的分子检测。
图7是NIL-FarL1和FarL1转基因系(过表达OE)中FarL1表达水平分析。
图8是9311、NIL-FarL1和FarL1过表达系剑叶的净光合速率。
图9是FarL1过表达转基因系的株型和穗型。FarL1-OE表示FarL1过表达转基因系。
具体实施方式
下面就如何具体利用FarL1基因增加水稻光合作用、二次枝梗发育从而增加水稻每穗穗粒数，进而提高水稻产量。举例说明，但本发明并不限于以下实施方案。
下述实施例中的水稻按照常规的栽培方法进行管理：首先将新鲜的水稻种子浸种催芽，种子露白后播种在事先准备好的秧田，秧苗4叶一心期移栽到大田，然后抽穗期测试剑叶的光合作用效率，成熟期考察产量相关表型。
实施例1：9311背景下的FarL1高产近等基因系(NIL-FarL1)的创建
1、利用长雄蕊野生稻和优良籼稻品种9311进行杂交得到F1，与9311回交两次后得到BC2F1，然后套袋自交20代，获得稳定纯合的长雄蕊野生稻染色体片段渗入系群体。在该渗入系群体中，渗入系1762与受体亲本9311相比，其一次枝梗数、二次枝梗数及穗粒数显著增多(见图1)。因此选择长雄蕊野生稻大穗渗入系1762作为大穗高产基因FarL1克隆的候选材料。
2、FarL1近等基因系(NIL-FarL1)的构建。为了克隆1762中的大穗基因，将其与9311继续杂交并回交3代后套袋自交，得到单株其株型与9311几乎一样、但二次枝梗和穗粒数较9311显著增多。其在基因组水平除第8染色体长臂有一小段来自长雄蕊野生稻的DNA片段外，其他区域与9311完全一致。基因克隆显示该区段包含来自长雄蕊的大穗基因FarL1，故称为FarL1近等基因系(NIL-FarL1)。与9311相比，NIL-FarL1的穗子变大，二次枝梗数目明显增多(见图2)。进一步对NIL-FarL1基本农艺性状进行考察发现：一次枝梗数目、千粒重、结实率和有效穗这四个性状在这两种材料中没有显著性差异；但二次枝梗和每穗穗粒分别比9311增加16.34个和63.56粒，而单株产量比9311提高25.24％(见表2)。
表2.9311和近NIL-FarL1等基因系的产量性状统计
实施例2：FarL1高产转基因系的创制
1、FarL1基因全长片段的获得
利用长雄蕊野生稻染色体片段导入系1762的cDNA为模板设计引物对FarL1-F/R(引物序列见表3)，然后进行PCR扩增，扩增得到的基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。FarL1基因的结构示意图如图3所示。
表3.引物序列
| 引物名称 | 引物序列(5'-3') |
| FarL1-F | ATGGACGAGGACGAAGT |
| FarL1-R | TCACCTCCAGAACACTAGC |
2、FarL1基因过表达载体的构建
将用引物对FarL1-F/R扩增得到的产物通过重组反应插入含有强启动子(Ubiquitin启动子)的表达载体pCAMBIA1301中，利用载体上的标记基因筛选阳性克隆，得到重组表达载体FarL1-OE。
3、FarL1基因过表达转基因植株的获得
构建好的FarL1-OE转基因载体可以通过电转或热激的方法转入EHA105农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中，利用载体及农杆菌自身特性筛选得到可用于侵染水稻组织的阳性农杆菌菌株。
用含有重组质粒FarL1-OE的重组农杆菌菌株侵染9311愈伤组织，在含50mg/L潮霉素的筛选培养基上暗培养，获得阳性转基因愈伤。将阳性愈伤分化、生根、移栽获得T0代植株。通过常规的分子检测以及水稻栽培方法获得T1代植株。FarL1基因在过表达水稻系中的模型结构如图4所示，FarL1的CDS序列如SEQ ID NO.3所示；FarL1基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，该蛋白模建结构如图5所示。
4、过表达转基因植株中FarL1的检测
(1)PCR检测FarL1基因阳性株
利用常规的CTAB提取基因组DNA方法获得FarL1过表达植株及野生型植株的基因组DNA，设计pCAMBIA1301过表达载体上的正向引物(pCAMBIA1301-F)和FarL1基因特异引物(FarL1OE-R)(引物序列见表4)；以野生型植株的基因组DNA作为阴性对照，对FarL1过表达植株及野生型植株的基因组DNA进行扩增，过表达转基因植株中凡有FarL1扩增带的均为阳性(见图6)。
表4.FarL1过表达植株阳性鉴定引物序列
| 引物名称 | 引物序列(5'-3') |
| pCAMBIA1301-F | CCCTGCCTTCATACGCTATT |
| FarL1OE-R | CCTCCAGAACACTAGCTCGG |
(2)通过qRT-PCR检测FarL1基因的表达水平
Ubiquitin启动子作为单子叶植物强启动子，可以提升目的基因在植物体内的表达含量。利用常规的RNA提取方法获得FarL1过表达植株及野生型植株的总RNA，并利用反转录试剂盒(购自Invitrogen公司)获得相应的cDNA。以Actin基因作为内参，利用FarL1 RT-F/R引物对进行qRT-PCR检测FarL1的表达水平(引物序列见表5)，FarL1基因过表达植株的表达量显著提高(见图7)。
表5.FarL1基因的表达水平检测引物序列
| 引物名称 | 引物序列(5'-3') |
| FarL1 RT-F | CTTGGAGGAGATGGAGGAGTAT |
| FarL1 RT-R | AGGGTTAGGAAGTCTATGTGAATGT |
| Actin RT-F | GGAAGTACAGTGTCTGGATTGGAG |
| Actin RT-R | TCTTGGCTTAGCATTCTTGGGT |
(3)观察并统计转基因植株的二次枝梗数目
当转基因系及9311生长至开始抽穗时(5％左右的稻穗开始破口)，测定剑叶的光合作用效率(见图8)。当稻株成熟时分别收种，然后对过表达转基因材料和野生型材料(9311)进行考种，观察并统计其一次枝梗数目、二次枝梗数目、每穗穗粒数、结实率和千粒重。FarL1基因过表达植株的株型和穗型见图9；一次枝梗数目、二次枝梗数目、每穗穗粒数、结实率、千粒重、有效穗和单株产量的统计结果见表6。
表6.FarL1基因过表达植株的农业性状统计
上述案例为本发明实施方式中较好的方式之一，但上述案例仅为本发明实施方式的一部分。本发明不受上述实施方案的限制，其他基于本发明精神实质与原理进行改变、修饰、编辑、整理的实施方式均为等效置换方式，都属于本发明的一部分，受本发明保护。
Claims (7)
1. 一种长雄蕊野生稻高产、高光效基因FarL1基因，其特征在于：所述FarL1基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2. 根据权利要求1所述的FarL1基因，其特征在于：所述FarL1基因的核苷酸序列为SEQID NO.1、2或3所示序列的任一种。
3.一种权利要求1所述的FarL1基因的应用，其特征在于：所述的应用包括下述应用中的至少一种：提高水稻光合效率的应用，增加水稻二次枝梗数目的应用，增加水稻穗粒数的应用，提高水稻产量的应用，水稻高产量品种培育的应用。
4.一种含有权利要求1所述的FarL1基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌的应用，其特征在于：所述的应用包括下述应用中的至少一种：提高水稻光合效率的应用，增加水稻二次枝梗数目的应用，增加水稻穗粒数的应用，提高水稻产量的应用，水稻高产量品种培育的应用。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于：所述的水稻包括籼稻、粳稻。
6.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于：所述的应用通过杂交转移导入FarL1基因，或通过转基因提高FarL1的表达量来实现。
7.一种提高水稻产量的方法，其特征在于：为将权利要求1所述的FarL1基因通过杂交转移导入水稻，或通过表达载体转入到水稻体内使权利要求1所述的FarL1基因过表达。
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| 外源酚酸类物质对一个长雄蕊野生稻材料S37化感效应的调控作用;徐高峰等;中国水稻科学;第24卷(第01期);62-66 * |
| 非洲长雄蕊野生稻的遗传特性及其固定杂种优势研究探讨;陈建三等;中国农业科学;第28卷(第05期);22-28 * |
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