CN116712561A - 含n-亚甲基酰胺连接子的抗体-药物偶联物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种可以用于连接抗体和对恶性细胞具有毒性的药物的连接结构，并获得经由该连接结构将抗体和细胞毒性药物连接而成的式(I)所示的抗体‑药物偶联物，式中各基团定义见说明书，该抗体‑药物偶联物具有显著的抗肿瘤效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域。具体地说，本发明提供一种保护亚甲基酰胺及其类似结构连接子的抗体-药物偶联物、其制备方法及应用。
背景技术
以抗体为靶向的偶联物是一类非常有效的治疗药物，对肿瘤疾病的治疗效果尤为明显。药物和抗体的连接需要连接子，连接子的作用不仅仅是起到一个连接体功能，更重要的是控制药物在细胞内的释放方式和释放速度，从而关系到药物的药效。
现有连接子释放技术有对氨基苯甲醇甲酸酯酰胺(PAB-carbonyl片段)，半缩甲醛胺(hemiaminal)，能切断的肽链(cleavable)，不能切断的肽链(non-cleavable)等。开发更多含有在细胞内可被切断连接子的抗体-药物偶联物具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可以用于连接抗体和对恶性细胞具有毒性的药物的连接结构，并获得经由该连接结构将抗体和细胞毒性药物连接而成的抗体-药物偶联物，该抗体-药物偶联物具有显著的抗肿瘤效果。
本发明的一方面，提供一种式(I)所示的抗体-药物偶联物：
式中，
D为细胞毒性药物，Ab为抗体；
LD选自不存在或C1-C3亚烷基；
X选自N、O或S；
R1选自不存在、氢、氘、C1-C6烷基或卤素取代的C1-C6烷基；
R2选自氢、氘、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、酰基、磺酰基；
L1选自-L11-L12-L13-；其中，L11、L12、L13各自独立地选自不存在、-C＝O-、C1-C6亚烷基或-O-C1-C6亚烷基；
L2选自C1-C6亚烷基或C1-C6酰基，所述C1-C6亚烷基或C1-C6酰基任选地被一个或多个R3取代；
R3选自苯基取代或未取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基；
LP为由2-7个氨基酸构成的肽残基；
Z选自-Lz-Lj-，其中，Lz选自-C(＝O)-C1-C8亚烷基或-C(＝O)-(CH2CH2O)2-6-CH2CH2NH-，Lj为可偶联抗体的接头。
在一些具体实施方式中，R1选自不存在、氢、氘、C1-C3烷基或卤素取代的C1-C3烷基；
优选地，R1选自不存在、氢、氘或卤素取代的C1-C3烷基；
优选地，R1选自不存在、氢、氘或F、Cl、Br、I取代的C1-C3烷基；
优选地，R1选自不存在、氢、氘或F取代的C1-C3烷基；
优选地，R1选自不存在、氢、氘、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、氟乙基、二氟乙基或三氟乙基；
优选地，R1选自不存在、氢、二氟乙基或三氟乙基。
在一些具体实施方式中，R2选自氢、氘、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、-C(＝O)C1-C6烷基或-S(＝O)2C1-C6烷基；
优选地，R2选自氢、氘、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、-C(＝O)C1-C6烷基或-S(＝O)2C1-C3烷基；
优选地，R2选自氢、氘、C1-C3烷基、C1-C3烷氧基、-C(＝O)C1-C3烷基或-S(＝O)2C1-C3烷基；
优选地，R2选自氢、氘、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、甲酰基、乙酰基、甲磺酰基或乙磺酰基；
优选地，R2选自氢、甲基、甲氧基、甲酰基或甲磺酰基；
优选地，R2选自氢、甲基、甲酰基或甲磺酰基。
在一些具体实施方式中，L11、L12、L13各自独立地选自不存在、-C＝O-、C1-C2亚烷基或C1-C2亚烷基-O-，条件是，当L11为-C＝O-时，R2不为氢；
优选地，L11、L12、L13各自独立地选自不存在、-C＝O-、-CH2-或-OCH2-；
优选地，L1选自-C(＝O)CH2OCH2-、-C(＝O)CH2O-或-CH2-。
在一些具体实施方式中，L2选自C1-C3亚烷基或C1-C3酰基，所述C1-C3亚烷基或C1-C3酰基任选地被一个或多个R3取代；
优选地，L2选自亚甲基、亚乙基或-C(＝O)CH2-，所述亚甲基、亚乙基或-C(＝O)CH2-任选地被一个或多个R3取代；
优选地，R3选自C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或苯基取代的C1-C6烷基；
优选地，R3选自C1-C6烷基或苯基取代的C1-C6烷基；
优选地，R3选自C1-C4烷基或苯基取代的C1-C3烷基；
优选地，R3选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、苯基甲基或苯基乙基；
优选地，R3选自甲基、异丙基、异丁基或苯基甲基；
优选地，L2选自-CH2-、-CH2CH2-、
优选地，L2选自-CH2-、-CH2CH2-、
在一些具体实施方式中，L2选自-CH2-、-CH2CH2-、
在一些具体实施方式中，所述氨基酸选自苯丙氨酸(Phe)、甘氨酸(Gly)、缬氨酸(Val)、丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)或谷氨酸(Glu)；
优选地，所述所述氨基酸选自苯丙氨酸(Phe)、甘氨酸(Gly)、缬氨酸(Val)、丙氨酸(Ala)或亮氨酸(Leu)；
优选地，Lp选自由2-5个选自苯丙氨酸(Phe)、甘氨酸(Gly)、缬氨酸(Val)、丙氨酸(Ala)或亮氨酸(Leu)的氨基酸构成的肽残基；
优选地，Lp选自由2、3或4个选自苯丙氨酸(Phe)、甘氨酸(Gly)、缬氨酸(Val)、丙氨酸(Ala)或亮氨酸(Leu)的氨基酸构成的肽残基；
优选地，Lp选自-Val-Cit-、-Gly-Lys-、-Gly-Leu-、-Val-Ala-、-Gly-Phe-、-GLy-Gly-Lys-、-Gly-Gly-Phe-、-Gly-Val-Ala-、-Gly-Gly-Val-、-Gly-Leu-Val-、-Gly-Phe-Gly-或-Gly-Gly-Leu-；
优选地，Lp选自-Gly-Leu-、-Gly-Phe-、-Gly-Gly-Phe-、-Gly-Val-Ala-、-Gly-Gly-Val-、-Gly-Leu-Val-、-Gly-Phe-Gly-或-Gly-Gly-Leu-；
优选地，Lp选自
优选地，Lp选自
在一些具体实施方式中，Lj选自所示位置表示与抗体相连，所示位置表示与LZ基团相连；
优选地，Lz选自-C(＝O)-C1-C8亚烷基或-C(＝O)-(CH2CH2O)2-6-CH2CH2NH-；
优选地，Lz选自-C(＝O)-(CH2CH2O)2-6-CH2CH2NH-；
优选地，Lz选自-C(＝O)-(CH2CH2O)2-4-CH2CH2NH-；
优选地，Lz选自-C(＝O)-(CH2CH2O)2-CH2CH2NH-；
优选地，Z选自
在一些具体实施方式中，所述细胞毒性药物选自喜树碱及其衍生物。
在一些具体实施方式中，所述细胞毒性药物选自
在一些具体实施方式中，所述抗体为抗肿瘤相关抗原抗体。
在一些具体实施方式中，所述肿瘤相关抗原抗体选自抗Her2抗体、抗Trop2抗体、抗B7H3抗体、抗5T4、抗Nectin-4抗体、抗CD20抗体和抗ROR1抗体。
在一些具体实施方式中，式(I)所示的化合物结构如式(II)所示：
式中，R2、L1、L2、Lp、Z、Ab各自定义同式(I)抗体-药物偶联物；
优选地，L1选自-C(＝O)CH2OCH2-或-C(＝O)CH2O-；
优选地，L2选自-CH2-或-CH2CH2-；
优选地，选自在一些具体实施方式中，式(I)所示的抗体-药物偶联物结构如式(III)所示：
式中，R1、R2、R4、Lp、Z、Ab各自定义同式(I)抗体-药物偶联物；
优选地，R4选自氢、苯基取代或未取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基；
优选地，R4选自氢、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或苯基取代的C1-C6烷基；
优选地，R4选自氢、C1-C6烷基或苯基取代的C1-C6烷基；
优选地，R4选自氢、C1-C4烷基或苯基取代的C1-C3烷基；
优选地，R4选自氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、苯基甲基或苯基乙基；
优选地，R4选自氢、甲基、异丙基、异丁基或苯基甲基；
优选地，R4选自氢、甲基或异丙基。
在一些具体实施方式中，式(I)所示的抗体-药物偶联物结构如式(IV)所示：
式中，R2、L1、L2、Lp、Z、Ab各自定义同式(I)抗体-药物偶联物；
优选地，L1、L2各自独立地选自C1-C3亚烷基；
优选地，L1为-CH2-，L2为-CH2CH2-。
在一些具体实施方式中，选自以下结构：
在一些具体实施方式中，选自以下结构：
其中，R1定义同式(I)抗体抗体-药物偶联物。
以下化合物与抗体连接得到的抗体-药物偶联物，
以下化合物与抗体连接得到的抗体-药物偶联物，
在一些具体实施方式中，所述抗体为HS627抗体或IP140B抗体，所述HS627的重链氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述IP140B抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，其轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
以下抗体-药物偶联物，
其中，2＜n＜8。
本发明的另一方面，提供一种上述抗体-药物偶联物的制备方法，其选自以下合成路线：
合成路线1：
式1-1化合物反应得到式1-2化合物；式1-2化合物与D-OH反应得到式1-3化合物；式1-3化合物脱去Fmoc保护基团得到式1-4化合物；式1-4化合物与H-Lp-OH缩合得到式1-5化合物；式1-5化合物与Z’-OH缩合得到式1-6化合物；式1-6化合物与抗体连接得到式1-7化合物。
合成路线2：
式1-2化合物反应得到式2-2化合物；式2-2化合物与化合物R1-NH-LD-D反应得到式2-3化合物；式2-3化合物脱去Fmoc保护基团得到式2-4化合物；式2-4化合物与H-Lp-OH缩合得到式2-5化合物；式2-5化合物与Z’-OH缩合得到式2-6化合物；式2-6化合物与抗体连接得到式2-7化合物。
合成路线3：
式3-1化合物与R2-Cl反应得到式3-2化合物；式3-2化合物反应得到式3-3化合物；式3-3化合物与D-OH反应得到式3-4化合物；式3-4化合物脱去Fmoc保护基团得到式3-5化合物；式3-5化合物与H-Lp-OH缩合得到式3-6化合物；式3-6化合物与Z’-OH缩合得到式3-7化合物；式3-7化合物与抗体连接得到式3-8化合物。
合成路线4：
式4-1化合物与R2-Cl反应得到式4-2化合物；式4-2化合物反应得到式4-3化合物；式4-3化合物进一步反应得到式4-4化合物；式4-4化合物与R1-NH-LD-D反应得到式4-5化合物；式4-5化合物反应得到式4-6化合物；式4-6化合物与H-Lp-OH缩合得到式4-7化合物；式4-7化合物与Z’-OH缩合得到式4-8化合物；式4-8化合物与抗体连接得到式4-9化合物。
合成路线5：
式5-1化合物反应得到式5-2化合物；式5-2化合物与R1-NH-LD-D反应得到式5-3化合物；式5-3化合物反应得到式5-4化合物；式5-4化合物与H-Lp-OH缩合得到式5-5化合物；式5-5化合物与Z’-OH缩合得到式5-6化合物；式5-6化合物与抗体连接得到式5-7化合物。
上述各反应路线中，R1、R2、R3、LD、D、Lp、Z、Ab各自定义同前。
Z’选自-Lz-Lj’，其中，Lz定义同前，Lj’选自
本发明的另一方面，提供一种药物组合物，其包括上述抗体-药物偶联物与药学上可接受的载体。本发明的另一方面，提供上述抗体-药物偶联物或药物组合物在制备抗肿瘤药物中的用途。
本发明的另一方面，提供一种抑制有需要患者肿瘤疾病的方法，其包括向有需要的患者施用上述抗体-药物偶联物或药物组合物。
在一些具体实施方案中，上述抗体-药物偶联物或药物组合物的施用量为治疗有效量。
在一些具体实施方式中，所述肿瘤选自实体瘤。
在一些具体实施方式中，所述肿瘤选自肺癌、非小细胞肺癌、食管鳞癌、卵巢癌、食管腺癌或乳腺癌。
附图说明
图1为测试例1中ADC3b体内抑制NCI-H1975肺癌CDX模型肿瘤生长曲线图。
图2为测试例1中ADC3b体内抑制NCI-H1975肺癌CDX模型解剖后肿瘤照片。
图3为测试例1中ADC11b、15b体内抑制NCI-H1975肺癌CDX模型肿瘤生长曲线图。
图4为测试例1中ADC11b、15b体内抑制NCI-H1975肺癌CDX模型解剖后肿瘤照片。
图5为测试例1中ADC16b体内抑制Calu-6非小细胞肺癌CDX模型肿瘤生长曲线图。
图6为测试例1中ADC16b体内抑制Calu-6非小细胞肺癌CDX模型解剖后肿瘤照片。
图7为测试例1中ADC16b体内抑制KYSE-150食管鳞癌CDX模型肿瘤生长曲线图。
图8为测试例1中ADC16b体内抑制KYSE-150食管鳞癌CDX模型解剖后肿瘤照片。
图9为测试例1中ADC11b、15b、2b体内抑制KYSE-150食管鳞癌CDX模型肿瘤生长曲线图。
图10为测试例1中ADC11b、15b、2b体内抑制KYSE-150食管鳞癌CDX模型解剖后肿瘤照片。
图11为测试例1中ADC16b体内抑制ES-2卵巢癌CDX模型肿瘤生长曲线图。
图12为测试例1中ADC16b体内抑制ES-2卵巢癌CDX模型解剖后肿瘤照片。
图13为测试例1中ADC7b、9b、8b体内抑制OE-21食管腺癌CDX模型肿瘤生长曲线图。
图14为测试例1中ADC7b、9b、8b体内抑制OE-21食管腺癌CDX模型解剖后肿瘤照片。
图15为测试例1中ADC11b、15b、2b、10b体内抑制MDA-MB-231三阴人乳腺癌CDX模型肿瘤生长曲线图。
图16为测试例1中ADC11b、15b、2b、10b体内抑制MDA-MB-231三阴人乳腺癌CDX模型解剖后肿瘤照片。
具体实施方式
I.定义
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文使用的和除非另作说明，术语“包含”，“包括”，“具有”，“含有”，包括其语法上的等同形式，通常应当理解为开放式且非限制性的，例如，不排除其他未列举的要素或步骤。
本公开化合物可以是不对称的，例如，具有一个或多个立体异构体。除非另有说明，所有立体异构体都包括，如对映异构体和非对映异构体。所述的立体异构体包括几何异构(如顺式、反式结构)和光学异构(如对映异构体)，以单体、消旋体、外消旋混合物及其药学上可接受的盐组成的治疗物。本公开的含有不对称碳原子的化合物可以以光学活性纯的形式或外消旋形式被分离出来。光学活性纯的形式可以从外消旋混合物拆分，或通过使用手性原料或手性试剂合成。外消旋体、非对映异构体、对映异构体都包括在本公开的范围之内。
本文中的数字范围，是指给定范围中的各个整数。例如，“C1-C6”是指该基团可具有1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子、4个碳原子、5个碳原子或6个碳原子。
当任何变量(例如Rn)在化合物的组成或结构中出现一次以上时，其在每一种情况下的定义都是独立的。因此，例如，如果一个基团被1-5个R所取代，则所述基团可以任选地至多被5个R所取代，并且每种情况下的R都有独立的选项。此外，取代基和/或其变体的组合只有在这样的组合会产生稳定的化合物的情况下才是被允许的。
术语“C1-C6烷基”指具有1到6个碳原子的直链或支链烷基。烷基具体实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基，及其各种支链异构体等。
术语“烷氧基”指-O-(烷基)和-O-(非取代的环烷基)，其中烷基的定义如上所述。烷氧基的非限制性实例包括：甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基、环己氧基。烷氧基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、疏基、氢基、硝基、氯基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、羧基或羧酸酯基。
术语“酰基”意指-C(＝O)R，其中R是经取代的或未经取代的烷基、经取代的或未经取代的环烷基、经取代的或未经取代的杂烷基。
术语“磺酰基”意指-S(＝O)2R，其中R是经取代的或未经取代的烷基、经取代的或未经取代的环烷基、经取代的或未经取代的杂烷基。
是指化学键连接处。需要说明的是，本发发明所记载的结构片段(例如-L11-L12-L13-或-Lz-Lj-)，在无特别说明的时候，代表由左到右的顺序连接相应基团，例如当-L12-为C1-C2亚烷基-O-时，其表示C1-C2亚烷基-O-的左侧连接-L11-，右端连接-L13-。
药物或药物组合物
本公开的药物或药物组合物可以经口地、局部地、肠胃外地或粘膜地(例如，含服地、通过吸入或直肠地)以包含常规的非-毒性药学可接受的载体的剂量单位配制剂施用。通常希望使用口服途径。所述活性试剂可以经口地以胶囊、片剂等形式(参见Remington：The Science and Practice of Pharmacy，20th Edition)施用。
术语“治疗”包括抑制、缓解、预防或消除与所治疗的疾病、病症或失调相关的一种或多种症状或副作用。
术语“抑制”的使用是相对于对照的。本领域技术人员将容易地确定用于每个实验的适当对照。例如，将用化合物处理的受试者或细胞中的降低了的反应与未用化合物处理的受试者或细胞中的反应进行比较。
术语“药物组合物”意指包含本公开所述化合物或其药学上可接受的盐，以及依施用方式和剂型的性质而定的至少一种选自以下药学上可接受的成分的组合物，包括但不限于：载体、稀释剂、佐剂、赋形剂、防腐剂、填充剂、崩解剂、润湿剂、乳化剂、悬浮剂、甜味剂、矫味剂、香味剂、抗菌剂、抗真菌剂、润滑剂、分散剂、温敏材料、温度调节剂、黏附剂、稳定剂、助悬剂等。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指无毒的但能达到预期效果的药物或药剂的足够用量。在本发明的实施方式中，在根据本发明对患者进行治疗时，给定药物的量取决于诸多因素，如具体的给药方案、疾病或病症类型及其严重性、需要治疗的受治疗者或宿主的独特性(例如体重)，但是，根据特定的周围情况，包括例如已采用的具体药物、给药途径、治疗的病症、以及治疗的受治疗者或宿主，施用剂量可由本领域已知的方法常规决定。通常，就成人治疗使用的剂量而言，施用剂量典型地在0.02-5000mg/天，例如约1-1500mg/天的范围。该所需剂量可以方便地被表现为一剂、或同时给药的(或在短时间内)或在适当的间隔的分剂量，例如每天二、三、四剂或更多分剂。本领域技术人员可以理解的是，尽管给出了上述剂量范围，但具体的有效量可根据患者的情况并结合医师诊断而适当调节。
术语“抗体-药物偶联物(antibody-drug conjugate，ADC)”是通过一个化学链接将具有生物活性的小分子药物连接到单抗上，单抗作为载体将小分子药物靶向运输到目标细胞中。本文所述“抗体偶联药物”含义同抗体-药物偶联物。缩写：
MS：甲磺酰基；
AC：乙酰基；
Fmoc：9-芴甲氧羰基；
构成所述肽残基LP的氨基酸，Val：缬氨酸，其结构式为Ala：丙氨酸，其结构式为Gly：甘氨酸，其结构式为Phe：苯丙氨酸，其结构式为Leu：亮氨酸，其结构式为
本发明中，所述肽残基LP可通过本领公知的氨基酸缩合方法得到，本发明对此不做特别限定。
本发明中，抗体和用于连接抗体的接头Lj可以通过本领域公知的方法连接得到。例如，当Lj结构为 时，其可以是通过与抗体上的硫醇等可反应基团反应连接得到，本发明对此不做特别限定。
II.具体实施例
本实施例中制备ADC使用但不限于HS627抗体和IP140B抗体，HS627抗体重链氨基酸序列如下(SEQ ID NO:1)：
轻链氨基酸序列如下(SEQ ID NO:2)：
IP140B抗体的重链氨基酸序列如下(SEQ ID NO:3):
轻链氨基酸序列如下(SEQ ID NO:4):
如无特别说明，本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
制备例1：中间体的1-5的制备
中间体1(Intermediate 1)的合成
中间体1的合成参照文献(WO2019195665A1)方法：在250mL反应瓶中加入Fmoc-Gly-Gly-OH(5g，14.11mol)，DMF(50mL)，搅拌溶解，依次加入醋酸铜(768mg,4.23mmol)，醋酸(1.69g,28.22mmol)，四乙酸铅(6.872g，15.5mmol)，加热至60℃搅拌反应20min，将反应液倒进冰水中，用乙酸乙酯萃取，干燥，重结晶，得到类白色固体产物Intermediate 1(3.2g,产率66％)；LCMS:(M+1)+369.21(理论值：368.14)。
中间体2(Intermediate2)的合成
中间体2的合成参照文献(WO2019195665A1)方法：在100ml三口瓶中，加入Intermediate 1(1g,2.7mmol),DCM(10mL)和TMSCl(8mL)，在氩气保护下室温搅拌2h，减压浓缩得到白色固体Intermediate 2(产率～100％)不经纯化直接用于下一步反应；LCMS:(M+1)+344.80(理论值：344.09)。
中间体3a和3b的合成(Intermediate 3a和3b)的合成
(1)中间体3a的合成
在250mL反应瓶中加入Fmoc-NHCH2CH2NHCH2COOH(5g,14.7mmol)，DCM(70mL),TEA(4.46g,44.07mmol),乙酰氯(2.31g,29.38mmol),室温搅拌反应4h，减压下去除溶剂，得到固体产物Fmoc-NHCH2CH2N(Ac)CH2COOH(5.62g，产率100％)；LCMS:(M+1)+383.16(理论值：382.15)。
在反应瓶中加入Fmoc-NHCH2CH2N(Ac)CH2COOH(2g,5.23mmol)，THF(30mL),Cu(OAc)2(351.5mg,1.94mmol),Pb(OAc)4(3.48g,7.84mmol)以及乙酸(691mg,11.51mmol),反应液在室温搅拌0.5h，减压下去除溶剂,重结晶得到固体产物Intermediate 3a Fmoc-NHCH2CH2N(Ac)CH2OAc(1.95g，产率94.1％)；1H NMR(500MHz,DMSO-d6,ppm):δ7.89(d,J＝7.5Hz,2H),7.68(t,J＝6.3Hz,2H),7.42(t,J＝7.5Hz,2H),7.34(t,J＝7.5Hz,2H),5.31(d,J＝18.7Hz,2H),4.34(dd,J＝20.0,6.9Hz,2H),4.23(d,J＝6.9Hz,1H),3.46-3.39(m,2H),3.12-3.20(m,2H),2.11(s,3H),2.04(s,3H)；13C NMR(126MHz,DMSO-d6,ppm)δ171.67,170.74,156.65,144.37,141.22,128.08,127.53,125.62,120.57,74.41,65.81,47.21,46.01,39.08,21.66,21.19；LCMS:(M+1)+397.17(计算值：396.17)。
(2)中间体3b的合成
在250mL反应瓶中加入Fmoc-NHCH2CH2NHCH2COOH(2g，5.88mmol)，DCM(70mL),TEA(1.78g,17.7mmol),MsCl(1.35g,11.8mmol),反应液在室温下搅拌4h，减压下去除溶剂,得到Fmoc-NHCH2CH2N(Ms)CH2COOH固体产物(2.46g，产率100％)；LCMS:(M+1)+419.12(理论值：418.12)。
在反应瓶中加入Fmoc-NHCH2CH2N(Ms)CH2COOH(2g,4.78mmol)，THF(30mL),Cu(OAc)2(321.5mg,1.77mmol),Pb(OAc)4(3.18g,7.17mmol)以及乙酸(631mg,10.51mmol),在室温下搅拌0.5h，减压下去除溶剂,得到Intermediate 3b Fmoc-NHCH2CH2N(Ms)CH2OAc固体(1.95g，产率94.3％)；1H NMR(500MHz,DMSO-d6,ppm):δ7.89(d,J＝7.5Hz,2H),7.69(d,J＝7.5Hz,2H),7.42(t,J＝7.6Hz,2H),7.33(t,J＝7.1Hz,2H),5.30(s,2H),4.32(d,J＝6.7Hz,2H),4.23(d,J＝6.8Hz,1H),3.32(t,J＝6.1Hz,2H),3.23(t,J＝6.1Hz,2H),3.02(s,3H),2.05(s,3H)；13C NMR(126MHz,DMSO-d6,ppm)δ170.74,156.67,144.34,141.21,128.08,127.54,125.61,120.57,72.53,65.90,47.17,46.31,39.97,36.24；LCMS:(M+1)+433.14(计算值：432.14)。
中间体4a和4b(Intermediate 4a,4b)的合成
(1)中间体4a的合成
向反应瓶中加入N-(氨乙基)邻苯二甲酰亚胺(0.6g,2.65mmol)，DCM(50mL),DIEA(0.684g,5.29mmol),AcCl(0.25g,3.18mmol),室温下搅拌反应4h，加入饱和食盐水(50mL)，分离DCM层，水相用二氯甲烷萃取两次(50ml x 2)，合并有机相干燥，减压下去除溶剂，得到化合物N-(乙酰胺乙基)邻苯二甲酰胺(550mg,产率89.4％)；LCMS:(M+1)+233.02(理论值：232.08)。
向反应瓶中加入取上述N-(乙酰胺乙基)邻苯二甲酰胺(0.55g,2.37mmol)，多聚甲醛(95.4mg,3.18mmol),DCM(12mL)和TMSCl(3mL),在50℃下搅拌反应12h,减压下去除溶剂,得到Intermediate 4a(585mg，产率88％)；1H NMR(600MHz,DMSO-d6,ppm):δ7.88–7.71(m,4H),4.76–4.51(m,2H),3.77–3.42(m,4H),1.91(s,3H)；LCMS:(M+1)+280.95(理论值：280.06)。.
(2)中间体4b的合成
向反应瓶中加入N-(氨乙基)邻苯二甲酰亚胺(0.6g,2.65mmol)，DCM(50mL),DIEA(0.684g,5.29mmol),MsCl(0.364g,3.18mmol),室温下搅拌反应4h，加入饱和食盐水(50mL)，分离DCM层，水相用二氯甲烷萃取两次(50ml x 2)，合并有机相干燥，减压下去除溶剂，得到化合物N-(甲磺酰胺乙基)邻苯二甲酰胺(700mg，产率98％)；LCMS:(M+1)+269.05(理论值：268.05)。
在反应瓶中加入取上述N-(甲磺酰胺乙基)邻苯二甲酰胺(0.71g,2.65mmol)，多聚甲醛(95.4mg,3.18mmol),DCM(12mL)和TMSCl(3mL),在50℃下搅拌反应12h,减压下去除溶剂,得到Intermediate 4b(838.5mg，产率100％)；1H NMR(600MHz,DMSO-d6,ppm):δ7.98–7.65(m,4H),4.85–4.54(m,2H),3.85–3.64(m,2H),3.50–3.30(m,2H),2.84(s,3H)；13C NMR(150MHz,DMSO-d6,ppm)δ168.2,168.2,134.8,134.8,132.1,132.1,123.5,123.5,70.0,42.5,40.1,36.2；LCMS:(M+1)+318.03(理论值：316.76)。
中间体5a-c的合成(Intermediate 5a-c)的合成
(1)中间体5a的合成
在500ml单口瓶中加入邻苯二甲酰甘氨酸(5g,24.39mmol)，用DCM(175mL)溶解，加入DMF(100uL)，反应液用冰浴冷却至0℃，氩气保护下滴加草酰氯(6.15g,48.78mmol)，反应液继续在0℃搅拌1.5h，减压浓缩，浓缩物溶于DCM(90mL)，冷却至0℃,然后滴加7M的氨甲醇溶液(10.45ml，73mmol)，继续在室温下搅拌反应2h，加入正己烷，过滤，干燥滤饼，得到邻苯二甲酰甘氨酰胺(4.05g,产率81％)；1H NMR(600MHz,DMSO-d6):δ7.87–7.86(m,4H),7.84(s,1H),7.26(s,1H),4.17(s,2H)；13C NMR(151MHz,DMSO-d6):δ168.54,168.05,162.96,134.98,132.15,45.79；LCMS:(M+1)+204.87(理论值：204.05)。
向反应瓶中加入5mL无水DCM，化合物2-(邻苯二甲酰亚氨基)乙酰胺(200mg,979.5μmol)，多聚甲醛(470.15mg,3.92mmol)和TMSCl(1.25mL)，反应液在50℃下搅拌2h，减压出去溶剂，硅胶柱层析纯化，得到Intermediate 5a(R＝H)(220mg，产率89％，HPLC 95％)；1HNMR(500MHz,CDCl3,ppm):δ7.91–7.89(m,2H),7.77–7.75(m,2H),5.44(d,2H),4.73(s,2H)；13C NMR(151MHz,DMSO-d6):δ170.20,167.84,134.86,132.25,123.52,48.57,15.24；LCMS：(M+1)+253.15(理论值：252.15)。
(2)中间体5b的合成
在500mL单口瓶中加入邻苯二甲酰缬氨酸(5g,20.22mmol)，干燥的DCM(175mL)和DMF(100μL)，反应液用冰浴冷却至0℃，氩气保护下滴加草酰氯(5.13g,40.44mmol)，在0℃搅拌1.5h，减压去除溶剂，浓缩物溶于DCM(90mL)中，冷却至0℃，滴加7M的氨甲醇溶液(8.66mL,60.6mmol)，温搅下继续拌反应2h，加入正己烷，过滤，干燥滤饼得到邻苯二甲酰缬氨酸酰胺(2.98g,产率61％)；LCMS:(M+1)+247.02(理论值：246.10)。
将上述制备得邻苯二甲酰缬氨酸酰胺(1g,4.06mmol)溶解在DCM(10mL)中，加入TMSCl(5mL)和多聚甲醛(550.4mg,18mmol)，封管、升温至40℃反应1.5h,冷却至室温，过滤，浓缩得到5b(1.19g,产率100％)；1H NMR(600MHz,DMSO-d6，ppm):δ8.01–7.70(m,4H),4.75–4.42(m,2H),4.42–4.15(m,1H),2.82–2.60(m,1H),1.08–0.83(m,6H)；LCMS:(M+1)+294.97(理论值：294.08)。
(3)中间体5c的合成
在500ml单口瓶中加入邻苯二甲酰丙氨酸(5g,22.8mmol)，DCM(175mL)，DMF(100μL)，反应液用冰浴冷却至0℃，氩气下滴加草酰氯(5.79g,45.6mmol)，在0℃下搅拌1.5h，减压去除溶剂，浓缩物溶于DCM(90mL)，冷却至0℃，滴加7M的氨甲醇溶液(9.78ml,68.5mmol)，在室温继续搅拌反应2h，加入正己烷，过滤，干燥滤饼得到邻苯二甲酰丙氨酸酰胺(4.5g,产率92％)；1H NMR(600MHz,DMSO-d6,ppm):δ7.84(d,J＝4.9Hz,3H),7.63(s,1H),7.45(s,1H),7.19(d,J＝10.6Hz,1H),4.69(q,J＝7.2Hz,1H),1.56(d,J＝7.3Hz,3H)；13C NMR(151MHz,DMSO-d6,ppm):δ171.23,167.96,134.81,132.25,123.45,48.58,15.42；LCMS:(M+1)+219.05(理论值：218.07)。
将上述制备得邻苯二甲酰丙氨酸酰胺(1g,4.5mmol)溶解在DCM(10mL)中，加入TMSCl(5mL)和多聚甲醛(550.4mg,18mmol)，封管、升温至40℃反应1.5h,冷却至室温，过滤，浓缩得到5c(1.22g,产率100％)；1H NMR(500MHz,CDCl3,ppm):δ7.85(dd,J＝5.4,3.1Hz,2H),7.78–7.72(m,2H),7.19(s,1H),5.23–5.13(m,2H),5.03–4.74(m,2H),1.69(d,J＝7.3Hz,3H)；LCMS:(M+1)+266.98(理论值：266.05)。
中间体6a、6b的合成(Intermediate 6a、6b)的合成
(1)中间体6a的合成
将三氟乙胺盐酸盐(100mg,0.74mmol)和7-甲基-10,11-亚甲基二氧喜树碱(100mg,0.25mmol)溶于DMSO(3mL)中，搅拌加热至120℃反应1h，冷却后加入甲基叔丁基醚，过滤，硅胶柱层析纯化得到产物7-(N-2,2,2,-三氟乙基)胺乙基-10,11-亚甲基二氧喜树碱(49mg,产率38％,HPLC 99％)；1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.71(s,1H),7.54(s,1H),7.29(s,1H),6.55(s,1H),6.34(d,J＝2.0Hz,2H),5.48(d,J＝3.0Hz,2H),5.30(s,2H),3.42(s,2H),3.42(s,2H),3.29(s,2H),1.92(dd,J＝14.4,7.3Hz,2H),0.94(t,J＝7.3Hz,4H)；LC-MS(M+H)+518.34(理论值517.15)。
(2)中间体6b的合成
向反应瓶中加入二氟乙胺(1.0g,12mmol)，盐酸(1.4mL,16mmol)和7-甲基-10,11-亚甲基二氧喜树碱(1.0g,2.46mmol)和DMSO(5mL)，搅拌加热至120℃反应1h，冷却，加异丙醇，抽滤，硅胶柱层析纯化得到产物7-(N-2,2,-二氟乙基)胺乙基-10,11-亚甲基二氧喜树碱(393mg,产率32％,HPLC 95％)；LC-MS(M+H)+500.13(理论值499.16)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.68(s,1H),7.52(s,1H),7.28(s,1H),6.58(s,1H),6.33(s,2H),6.02(t,J＝56.6Hz,1H),5.47(s,2H),5.26(s,2H),3.26(s,3H),2.94(s,4H),1.92(s,2H),0.93(s,3H)；LC-MS(M+H)+500.13(理论值499.16)。
实施例1：7-[N-(2,2-二氟乙基)-N-(溴乙酰胺乙氧基乙氧基丙酰-Gly-Gly-Phe-Gly-亚甲基)]氨乙基-10,11-亚甲基二氧喜树碱(1)
向反应瓶中加入7-(N-2,2,-二氟乙基)胺乙基-10,11-亚甲基二氧喜树碱(payload 1,100mg，0.2mmol)，DCM(5mL)，三乙胺和Intermediate 2(0.93g,2.7mmol)，反应液室温反应2小时，加水(10mL)用DCM(20mL*3)萃取，浓缩有机相，硅胶柱层析纯化得到化合物10a(121mg,75％)；LCMS:(M+1)+808.13(理论值：807.28)。
在反应瓶中加入1a(121mg,0.149mg),DMF(1mL)，哌啶(100μL)，反应液在室温下搅拌1h，加入甲基叔丁基醚(20mL)，离心，去除上清液，干燥，得到1b(68mg,产率78％)；LCMS:(M+1)+586.21(理论值：585.20)。
在反应瓶中加入1b(68mg,0.11mmol),DMF(2mL)，DIPEA(15mg,0.11mmol)，反应液在室温下搅拌，依次加入Fmoc-Gly-Gly-Phe-OH(56mg,0.11mmol)，HATU(42mg,0.11mmol),反应液在室温下继续过夜,减压下除去溶剂，硅胶柱层析纯化得到产品1c(107mg,产率86％)；LCMS:(M+1)+1069.09(理论值：1068.38)。
在反应瓶中加入1c(107mg,0.1mmol)，DMF(1mL)，哌啶(100μL)，反应液在室温下搅拌1h，加入甲基叔丁基醚(20mL)，离心，去除上清液，干燥，得到1d(56mg,产率66％)；LCMS:(M+1)+847.23(理论值：846.31)。
在反应瓶中加入DCM(3mL),1d(56mg,0.066mmol),溴乙酰氨乙氧基乙氧丙酸(19.2mg,0.066mmol)和DIC(8.4mg,0.066mmol),反应液在室温下搅拌90min，浓缩，硅胶柱层析纯化得到黄色固体1(12mg，产率16％)；LCMS:(M+1)+1126.24(理论值：1125.33)。
ADC-1a:化合物1和HER2单抗HS627形成抗体偶联药物
取HS627抗体(20.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，然后再加入0.1M乙二胺四乙酸二钠的溶液(25μL)，加入配置好的TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04ml)，室温25℃旋转转盘反应90min。
将化合物1(0.90mg，0.8mmol)溶于0.09ml的DMA中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应2h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM L-组氨酸醋酸盐缓冲液，pH6.0，120mM蔗糖，0.2g/L聚山梨酯20，得到ADC-1a(3.4mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝7.5
ADC-1b:化合物1和5T4单抗IP140B形成抗体偶联药物
取IP140B抗体(20.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，然后再加入0.1M乙二胺四乙酸二钠的溶液(25μL)，加入配置好的TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04ml)，室温25℃旋转转盘反应90min。
将化合物1(0.90mg，0.8mmol)溶于0.09ml的DMA中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应2h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM组氨酸溶液，250mM山梨醇，0.02％吐温80，pH5.7，得到ADC-1b(3.1mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝7.6
实施例2：7-[N-(2,2,2-三氟乙基)-N-(溴乙酰胺乙氧基乙氧基丙酰-Gly-Leu-Gly-亚甲基)]氨乙基-10,11-亚甲基二氧喜树碱(2)
向反应瓶中加入7-(N-2,2,2,-三氟乙基)胺乙基-10,11-亚甲基二氧喜树碱(payload 2，100mg，0.19mmol)，DCM(5mL)，Intermediate 2(665.3mg,1.9mmol)，反应液在室温搅拌2小时，浓缩反应液，硅胶柱层析纯化，得到化合物2a(47mg,产率30％)；LCMS:(M+1)+826.19(理论值：825.26)。
在反应瓶中加入2a(47mg,0.056mmol)，DMF(1mL)，哌啶(100μL)，室温下搅拌1h，加入甲基叔丁基醚(20mL)，离心，去除上清液，干燥，得到2b(21mg,产率60％)；LCMS:(M+1)+604.03(理论值：603.19)。
在反应瓶中加入2b(21mg,0.034mmol),DMF(2mL)，DIPEA(4.49mg,0.034mmol),反应液在室温下搅拌溶清，依次加入Fmoc-氨乙氧基乙氧丙酰-Gly-Leu(19.8mg,0.034mmol)，HATU(13.23mg,0.034mmol),反应液在室温下搅拌1h，浓缩，硅胶柱层析纯化，得到化合物2c(35mg,产率87.5％)；LCMS:(M+1)+1155.22(理论值：1154.46)。
在反应瓶中加入2c(35mg,0.03mmol)，DMF(1mL)，哌啶(100μL)，室温下搅拌1h，加入甲基叔丁基醚(20mL)，离心，去除上清液，干燥，得到2d(22mg,产率78.9％)；LCMS:(M+1)+933.65(理论值：932.95)。
在反应瓶中依次加入DCM(3mL),2d(22mg,0.023mmol),溴乙酸(7mg,0.023mmol)和DIC(2.97mg,0.023mmol),室温搅拌90min，浓缩，硅胶柱层析纯化，得到黄色固体2(19mg，产率77％)；LCMS:(M+1)+1053.27(理论值：1052.31)。
ADC-2a：化合物2和HER2单抗HS627形成抗体偶联药物
取HS627抗体(20.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，然后再加入0.1M乙二胺四乙酸二钠的溶液(25μL)，加入配置好的TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04ml)，室温25℃旋转转盘反应90min。
将化合物2(0.84mg，0.8mmol)溶于0.08ml的DMA中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应2h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM L-组氨酸醋酸盐缓冲液，pH6.0，120mM蔗糖，0.2g/L聚山梨酯20，得到ADC-2a(3.3mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝7.1
ADC-2b:化合物2和5T4单抗IP140B形成抗体偶联药物
取IP140B抗体(20.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，然后再加入0.1M乙二胺四乙酸二钠的溶液(25μL)，加入配置好的TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04ml)，室温25℃旋转转盘反应90min。
将化合物2(0.84mg，0.8mmol)溶于0.08ml的DMA中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应2h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM组氨酸溶液，250mM山梨醇，0.02％吐温80，pH5.7，得到ADC-2b(3.1mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝7.0
实施例3：7-[N-(2,2,2-三氟乙基)-N-(溴乙酰胺乙氧基乙氧基丙酰-Gly-Gly-Phe-Gly-亚甲基)]氨乙基-10,11-亚甲基二氧喜树碱(3)
向反应瓶中加入2b(70mg,0.11mmol)，DMF(2mL)，HATU(41.8mg,0.11mmol)，DIPEA(14.19mg.0.11mmol)和Fmoc-Gly-Gly-Phe-OH(55.11mg,0.11mmol),反应液在室温下搅拌6h，加入DCM(200mL)，饱和氯化钠水溶液洗涤,无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析纯化得黄色固体3a(108mg,产率85％)；LCMS:(M+1)+1087.25(理论值：1086.37)。
在反应瓶中加入3a(108mg,0.099mmol)，DMF(1mL)，哌啶(77mg,0.99mmol)，室温搅拌1h，加入甲基叔丁基醚(30mL)，离心，去除上清液，减压下去除溶剂，得到3b固体(43mg，产率50％)直接用于下一步反应；LCMS:(M+1)+865.29(理论值：864.31)。
在反应瓶中依次加入DCM(2mL),3b(43mg,0.049mmol),溴乙酰胺乙氧基乙氧基丙酸(15mg,0.049mmol)和DIC(6.27mg,0.049mmol),室温搅拌90min，将反应液注射入25g C18预柱(先用乙腈平衡，然后用水平衡，水相含0.1％TFA)，然后通过中压反相C18色谱法(梯度：5％至40％乙腈在水中，时间30min)洗脱，冻干，得到黄色固体3(21mg，产率37.5％)；LCMS:(M+1)+1144.28(理论值：1143.32)。
ADC-3a:化合物3和HER2单抗HS627形成抗体偶联药物
取HS627抗体(20.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，然后再加入0.1M乙二胺四乙酸二钠的溶液(25μL)，加入配置好的TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04ml)，室温25℃旋转转盘反应90min。
将化合物3(0.92mg，0.8mmol)溶于0.09ml的DMA中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应2h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM L-组氨酸醋酸盐缓冲液，pH6.0，120mM蔗糖，0.2g/L聚山梨酯20，得到ADC-3a(3.2mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝6.2
ADC-3b:化合物3和5T4单抗IP140B形成抗体偶联药物
取IP140B抗体(20.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，然后再加入0.1M乙二胺四乙酸二钠的溶液(25μL)，加入配置好的TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04ml)，室温25℃旋转转盘反应90min。
将化合物3(0.92mg，0.8mmol)溶于0.09ml的DMA中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应2h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM组氨酸溶液，250mM山梨醇，0.02％吐温80，pH5.7，得到ADC-3b(3.3mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝6.5
实施例4：7-[N-(2,2,2-三氟乙基)-N-(溴乙酰胺乙氧基乙氧基丙酰-Gly-Val-Ala-Gly-亚甲基)]氨乙基-10,11-亚甲基二氧喜树碱(4)
向反应瓶中加入2b(70mg,0.11mmol)，DMF(2mL)，HATU(41.8mg,0.11mmol)，DIPEA(14.19mg.0.11mmol)和Fmoc-Gly-Val-Ala-OH(51.37mg,0.11mmol),室温下搅拌6h，加入DCM(200mL)，饱和氯化钠溶液洗涤,无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析纯化得黄色固体13a(100.1mg,产率87％)；LCMS:(M+1)+1053.06(理论值：1052.39)。
在反应瓶中加入4a(100.1mg,0.095mmol)，DMF(0.5mL),哌啶(74mg,0.95mmol)，室温下搅拌1h，加入甲基叔丁基醚(30mL)，离心，去除上清液，减压下去除溶剂，得到4b固体(49mg，产率62％)直接用于下一步反应；LCMS:(M+1)+831.27(理论值：830.32)。
在反应瓶中依次加入DCM(2mL),4b(49mg,0.059mmol)，溴乙酰胺乙氧基乙氧基丙酸(17.6mg,0.059mmol)和DIC(7.43mg,0.059mmol),室温下搅拌90min，将反应液注射入25gC18预柱(先用乙腈平衡，然后用水平衡，水相含0.1％TFA)，然后通过中压反相C18色谱法(梯度：5％至40％乙腈在水中，时间30min)洗脱，冻干，得到黄色固体4(15mg，产率22％)；LCMS:(M+1)+1110.28(理论值：1109.33)。
ADC-4a:化合物4和HER2单抗HS627形成抗体偶联药物
取HS627抗体(20.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，然后再加入0.1M乙二胺四乙酸二钠的溶液(25μL)，加入配置好的TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04ml)，室温25℃旋转转盘反应90min。
将化合物4(0.89mg，0.8mmol)溶于0.09ml的DMA中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应2h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM L-组氨酸醋酸盐缓冲液，pH6.0，120mM蔗糖，0.2g/L聚山梨酯20，得到ADC-4a(3.1mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝6.3
ADC-4b:化合物4和5T4单抗IP140B形成抗体偶联药物
取IP140B抗体(20.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，然后再加入0.1M乙二胺四乙酸二钠的溶液(25μL)，加入配置好的TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04ml)，室温25℃旋转转盘反应90min。
将化合物4(0.89mg，0.8mmol)溶于0.09ml的DMA中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应2h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM组氨酸溶液，250mM山梨醇，0.02％吐温80，pH5.7，得到ADC-4b(3.3mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝6.6
实施例5：溴乙酰胺乙氧基乙氧基丙酰-Gly-Leu-乙二胺(Ac)-亚甲基氧乙酰依沙替康(5)
在反应瓶中加入Intermediate 3a(1.95g,4.92mmol),DCM(25mL)，羟基乙酸苄酯(8.17g，49.2mmol)，PPTS(123.6mg，0.492mmol)，反应液搅拌下加热回流过夜，加入EtOAc(200mL)，用食盐水水(3x 200mL)洗涤，无水MgSO 4干燥，过滤并真空浓缩，硅胶柱层析纯化，得到5a白色粉末(2.43g，产率98.3％)；LCMS:(M+1)+503.21(理论值：502.21)。
在反应瓶中次加入5a(200mg,0.398mmol)，DBU(30.3mg,0.199mmol)，室温搅拌反应1h，得到5b直接用于下一步反应。在5b反应液中加入PPTS(50mg,0.298mmol)，DIPEA(60.9mg,0.471mmol),PEG2-Gly-Leu(224mg,0.392mmol),HATU(298.4mg,0.785mmol),室温搅拌反应2h，减压下去除溶剂,得到5c固体(236.8mg，产率72.5％)；LCMS:(M+1)+832.41(理论值：831.41)。
将上述得到的化合物5c(0.3g，0.36mmol)溶于MeOH(5mL)中，加入钯碳催化剂(90mg)后，室温搅拌，再加入三乙基硅氢(0.42g，3.61mmol)，室温搅拌0.5h，通过硅藻土过滤除去不溶物，减压除去滤液中的溶剂，得到5d固体(267.5mg，产率100％)；LCMS:(M+1)+742.36(理论值：741.36)。
将Exatecan(100mg,0.188mmol)溶于DMF(2mL)，再依次将DIPEA(48.6mg,0.376mmol),5d(167.5mg,0.226mmol),HATU(143mg,0.376mmol),室温搅拌反应2h，减压下去除溶剂,得到5e固体(196.4mg，产率90.1％)；LCMS:(M+1)+1159.51(理论值：1158.51)。
在反应瓶中依次加入5e(196.4mg,0.17mmol)，哌啶(144.4mg,1.7mmol)，室温搅拌反应0.5h，加入甲基叔丁基醚(30mL)，离心，去除上清液，减压下去除溶剂，得到5f固体(135.6mg，产率85.4％)直接用于下一步反应；LCMS:(M+1)+937.44(理论值：936.44)。
在反应瓶中依次加入DCM(2mL),5f(100mg,0.107mmol),溴乙酸(17.8mg,0.128mmol)和DIC(16.2mg,0.128mmol),室温搅拌反应90min，加入TFA(0.1mL)，继续反应30min，将反应液注射入25g C18预柱(先用乙腈平衡，然后用水平衡，水相含0.1％TFA)，然后通过中压反相C18色谱法(梯度：5％至40％乙腈在水中，时间30min)洗脱，冻干，得到黄色固体5(30.1mg，产率26.6％)；LCMS:(M+1)+1058.26(理论值：1056.36)。
ADC-5a:化合物5和HER2单抗HS627形成抗体偶联药物
取HS627抗体(20.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，然后再加入0.1M乙二胺四乙酸二钠的溶液(25μL)，加入配置好的TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04ml)，室温25℃旋转转盘反应90min。
将化合物5(0.85mg，0.8mmol)溶于0.09ml的DMA中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应2h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM L-组氨酸醋酸盐缓冲液，pH6.0，120mM蔗糖，0.2g/L聚山梨酯20，得到ADC-5a(3.1mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝6.6
ADC-5b:化合物5和5T4单抗IP140B形成抗体偶联药物
取IP140B抗体(20.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，然后再加入0.1M乙二胺四乙酸二钠的溶液(25μL)，加入配置好的TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04ml)，室温25℃旋转转盘反应90min。
将化合物5(0.85mg，0.8mmol)溶于0.09ml的DMA中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应2h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM组氨酸溶液，250mM山梨醇，0.02％吐温80，pH5.7，得到ADC-5b(3.3mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝6.5
实施例6：溴乙酰胺乙氧基乙氧基丙酰-Gly-Leu-乙二胺(Ms)-亚甲基氧乙酰依沙替康(6)
在反应瓶中加入Intermediate 3b(0.5g，1.16mmol),DCM(5mL)，羟基乙酸苄酯(8.17g，49.2mmol)，PPTS(29.1mg，0.116mmol)，反应液搅拌加热回流过夜，冷却至室温，加入EtOAc(200mL)，用水(3x 200mL)洗涤，无水MgSO 4干燥，过滤并真空浓缩，硅胶柱层析纯化，得到6a白色粉末(536.8mg，产率86.2％)；LCMS:(M+1)+539.18(理论值：538.18)。
在反应瓶中依次加入6a(200mg,0.371mmol)，DBU(28.3mg,0.186mmol)，室温搅拌反应1h，得到6b，加入PPTS(31.2mg,0.186mmol)，DIPEA(48mg,0.371mmol),PEG2-Gly-Leu(179.8mg,0.316mmol),HATU(141.2mg,0.371mmol),室温下搅拌反应2h，减压下去除溶剂，得到6c固体(215.6mg，产率66.9％)；LCMS:(M+1)+868.37(理论值：867.37)。
将上述得到的化合物6c(0.15g，0.173mmol)溶于MeOH(5mL)中，加入钯碳催化剂(50mg)，室温搅拌，再加入三乙基硅氢(0.2g，1.73mmol)，室温下继续搅拌0.5h，通过硅藻土过滤除去不溶物，减压除去滤液中的溶剂，得到6d固体(134.43mg，产率100％)；LCMS:(M+1)+778.33(理论值：777.33)。
将Exatecan(110mg,0.207mmol)溶于DMF(2mL)，依次加入DIPEA(80.2mg,0.62mmol),6d(161mg,0.207mmol),HATU(157.4mg,0.414mmol),室温下搅拌反应2h，减压下去除溶剂,得到6e固体(213.5mg，产率86.3％)；LCMS:(M+1)+1195.33(理论值：1194.47)。
在反应瓶中依次加入6e(140mg,0.117mmol)，哌啶(99.7mg,1.17mmol)，室温下搅拌反应0.5h，加入甲基叔丁基醚(30mL)，离心，去除上清液，减压下去除溶剂，得到6f固体(80mg，产率70.2％)直接用于下一步反应；LCMS:(M+1)+973.41(理论值：972.41)。
在反应瓶中依次加入DCM(2mL),6f(80mg,0.082mmol),溴乙酸(13.7mg,0.099mmol)和DIC(12.5mg,0.099mmol),室温下搅拌反应90min，加入0.1mL的TFA，继续反应30min,最后将反应液注射入25g C18预柱(先用乙腈平衡，然后用水平衡，水相含0.1％TFA)，然后通过中压反相C18色谱法(梯度：5％至40％乙腈在水中，时间30min)洗脱，冻干，得到黄色固体6(30.1mg，产率26.6％)；LCMS:(M+1)+1094.33(理论值：1092.33)。ADC-6a:化合物6和HER2单抗HS627形成抗体偶联药物
取HS627抗体(20.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，然后再加入0.1M乙二胺四乙酸二钠的溶液(25μL)，加入配置好的TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04ml)，室温25℃旋转转盘反应90min。
将化合物6(0.87mg，0.8mmol)溶于0.09ml的DMA中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应2h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM L-组氨酸醋酸盐缓冲液，pH6.0，120mM蔗糖，0.2g/L聚山梨酯20，得到ADC-6a(3.2mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝6.3
ADC-6b:化合物6和5T4单抗IP140B形成抗体偶联药物
取IP140B抗体(20.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，然后再加入0.1M乙二胺四乙酸二钠的溶液(25μL)，加入配置好的TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04ml)，室温25℃旋转转盘反应90min。
将化合物6(0.87mg，0.8mmol)溶于0.09ml的DMA中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应2h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM组氨酸溶液，250mM山梨醇，0.02％吐温80，pH5.7，得到ADC-6b(3.3mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝6.6
实施例7：7-[N-(2,2,2-三氟乙基)-N-(溴乙酰胺乙氧基乙氧基丙酰-Gly-Phe-Gly-亚甲基)]胺乙基-10,11-亚甲基二氧喜树碱(7)
向反应瓶中加入无水DCM(2mL)，7-(N-2,2,2,-三氟乙基)胺乙基-10,11-亚甲基二氧喜树碱(100mg,162.5μmol)，Intermediate 5a(61.58mg,243.75μmol)和DIPEA(42.01mg,325μmol)，反应在40℃下搅拌12h，减压下去除溶剂,硅胶柱层析纯化，得到化合物7a(100mg,产率83.9％)；LCMS：(M+1)+734.41(理论值：733.41)。
在反应瓶中加入无水甲醇(2mL),中间体7a(100mg,136.3μmol)，水合肼(40.94mg,817.82μmol),反应在60℃下搅拌12h，反应液加入饱和食盐水(10mL)，用DCM/i-PrOH＝4:1萃取4次，无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂得到化合物2b(70mg,产率85％,HPLC 94％)；LCMS：(M+1)+604.16(理论值：603.16)。
在装有无水DMF(1.5mL)的单口烧瓶中加入FmocPEG2-Gly-PheOH(70.01mg,115.98μmol),HATU(66.15mg,173.97μmol),TEA(22.48mg,173.97μmol),室温下搅拌5min，加入化合物2b(70mg 115.98μmol)，室温下继续搅拌2h，反应液加入饱和食盐水(10mL)，用DCM/i-PrOH＝4:1萃取4次，无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去溶剂得到化合物7c(90mg,产率65.3％)；LCMS：(M+1)+1189.42(理论值：1188.42)。
向反应瓶中加入化合物7c(90mg,75.68μmol),无水DCM(1.5mL)，哌啶(64.44mg,756.8μmol)，室温下搅拌反应30min，向反应液中加入甲基叔丁基醚，离心分离固体，重复2次，将白色沉淀物干燥得到化合物7d(45mg,产率61.5％,HPLC 94％)；LCMS：(M+1)+967.23(理论值：966.23)。
在装有无水DCM(1.5mL)的烧瓶中加入溴乙酸(9.7mg,69.81μmol),DIC(8.81mg,69.81μmol),室温下搅拌5min，加入化合物7d(45mg,46.54μmol),室温下继续搅拌反应1h，硅胶柱层析纯化，得到7(27mg,产率53.3％,HPLC 97％)；LCMS：(M+1)+1087.35(理论值：1086.35)。
ADC-7a:化合物7和HER2单抗HS627形成抗体偶联药物
取HS627抗体(20.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，然后再加入0.1M乙二胺四乙酸二钠的溶液(25μL)，加入配置好的TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04ml)，室温25℃旋转转盘反应90min。
将化合物7(0.87mg，0.8mmol)溶于0.09ml的DMA中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应2h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM L-组氨酸醋酸盐缓冲液，pH6.0，120mM蔗糖，0.2g/L聚山梨酯20，得到ADC-7a(3.1mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝7.5
ADC-7b:化合物7和5T4单抗IP140B形成抗体偶联药物
取IP140B抗体(20.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，然后再加入0.1M乙二胺四乙酸二钠的溶液(25μL)，加入配置好的TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04ml)，室温25℃旋转转盘反应90min。
将化合物7(0.87mg，0.8mmol)溶于0.09ml的DMA中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应2h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM组氨酸溶液，250mM山梨醇，0.02％吐温80，pH5.7，得到ADC-7b(3.3mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝7.6
实施例8：7-[N-(2,2,2-三氟乙基)-N-(溴乙酰胺乙氧基乙氧基丙酰-Gly-Gly-Val-亚甲基)]胺乙基-10,11-亚甲基二氧喜树碱(8)
向反应瓶中加入无水DCM(2mL)，7-(N-2,2,2,-三氟乙基)胺乙基-10,11-亚甲基二氧喜树碱(90mg,146.2μmol)，Intermediate 5b(64.64mg,219.3μmol)和DIPEA(37.79mg,292.4μmol)，反应在40℃下搅拌12h，减压下去除溶剂,硅胶柱层析纯化，得到化合物8a(100mg,产率88.2％,HPLC 95％)；LCMS：(M+1)+776.25(理论值：775.25)。
在反应瓶中加入无水甲醇(2mL)，加入化合物8a(100mg,128.91μmol)，水合肼(38.72mg,773.46μmol),反应液在60℃下搅拌12h，反应液加入饱和食盐水(10ml)，用DCM/i-PrOH＝4:1萃取4次，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩溶剂得到化合物8b(75mg,产率90％,HPLC 94％)；LCMS：(M+1)+646.3(理论值：645.3)。
在反应瓶中加入无水DMF(1.5mL)，FmocPEG2-GLy-Gly-OH(59.65mg,116.16μmol),HATU(66.26mg,174.24μmol),TEA(17.63mg,174.24μmol)，反应液在室温下搅拌5min，加入化合物8b(75mg 116.16μmol)，继续在室温下反应2h，反应液加入饱和食盐水(10mL)，用DCM/i-PrOH＝4:1萃取4次，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩溶剂得到化合物8c(82mg,产率61.8％,HPLC 96％)；LCMS：(M+1)+1141.41(理论值：1140.41)。
向反应瓶中加入化合物8c(82mg,71.85μmol),无水DCM(1.5mL)，哌啶(61.18mg,718.5μmol)，反应液在室温下搅拌30min，向反应液中加入甲基叔丁基醚，离心分离固体，重复2次，将白色沉淀物干燥得到化合物8d(52mg,产率86.1％,HPLC 94％)；LCMS：(M+1)+919.2(理论值：918.2)。
在反应瓶中加入无水DCM(1.5mL)，溴乙酸(11.79mg,84.88μmol)和DIC(10.71mg,84.88μmol).反应液在室温下搅拌5min，加入化合物8d(52mg,56.58μmol)，反应液在室温继续反应1h，减压下浓缩溶剂，硅胶柱层析纯化，得到8(42mg,产率71.4％,HPLC 98％)；LCMS：(M+1)+1039.23(理论值：1038.23)。
ADC-8a:化合物8和HER2单抗HS627形成抗体偶联药物
取HS627抗体(20.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，然后再加入0.1M乙二胺四乙酸二钠的溶液(25μL)，加入配置好的TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04ml)，室温25℃旋转转盘反应90min。
将化合物8(0.83mg，0.8mmol)溶于0.08ml的DMA中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应2h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM L-组氨酸醋酸盐缓冲液，pH6.0，120mM蔗糖，0.2g/L聚山梨酯20，得到ADC-8a(3.1mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝7.6
ADC-8b:化合物8和5T4单抗IP140B形成抗体偶联药物
取IP140B抗体(20.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，然后再加入0.1M乙二胺四乙酸二钠的溶液(25μL)，加入配置好的TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04ml)，室温25℃旋转转盘反应90min。
将化合物8(0.83mg，0.8mmol)溶于0.08ml的DMA中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应2h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM组氨酸溶液，250mM山梨醇，0.02％吐温80，pH5.7，得到ADC-8b(3.3mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝7.6
实施例9：7-[N-(2,2,2-三氟乙基)-N-(溴乙酰胺乙氧基乙氧基丙酰-Gly-Val-Ala-亚甲基)]胺乙基-10,11-亚甲基二氧喜树碱(9)
向反应瓶中加入无水DCM(2mL)，7-(N-2,2,2,-三氟乙基)胺乙基-10,11-亚甲基二氧喜树碱(90mg,146.2μmol)，中间体5c(61.34mg,219.3μmol)和DIPEA(37.79mg,292.4μmol)，反应在40℃下搅拌12h，减压下去除溶剂,硅胶柱层析纯化，得到化合物9a(95mg,产率89.2％,HPLC 95％)；LCMS:(M+1)+748.22(理论值：747.22)。
向装有无水甲醇(2mL)的单口烧瓶中加入化合物9a(95mg,128.91μmol)，水合肼(38.72mg,773.46μmol)，反应液在60℃下搅拌12h，反应液加入饱和食盐水(10ml)，用DCM/i-PrOH＝4:1萃取4次，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩后得到化合物9b(75mg产率88.5,HPLC93％)；LCMS：(M+1)+618.56(理论值：617.56)。
向装有无水DMF(1.5mL)的单口烧瓶中加入FmocPEG2-GLy-Gly-OH(59.65mg,116.16μmol),HATU(66.26mg,174.24μmol),TEA(17.63mg,174.24μmol)，反应液在室温下搅拌5min，加入化合物9b(75mg 116.16μmol).室温下继续反应2h，反应液加入饱和食盐水(10mL)，用DCM/i-PrOH＝4:1萃取4次，无水硫酸钠干燥，浓缩得到化合物9c(82mg,产率78.6％,HPLC 94％)；LCMS：(M+1)+1155.43(理论值：1154.43)。
反应瓶中加入化合物9c(82mg,71.85μmol)，无水DCM(1.5mL)，哌啶(61.18mg,718.5μmol)，室温下搅拌反应30min，加入甲基叔丁基醚有白色沉淀产生，离心分离固体，重复2次，将白色沉淀物干燥得到化合物9d(52mg,产率85.6％,HPLC 95％)；LCMS：(M+1)+933.35(理论值：932.35)。
向装有无水DCM(1.5mL)的单口烧瓶中加入溴乙酸(11.79mg,84.88μmol),DIC(10.71mg,84.88μmol).室温下搅拌5min，加入化合物9d(52mg,56.58μmol)，室温下继续搅拌反应1h，硅胶柱层析纯化，得到9(50mg,产率85.5％,HPLC 96％)；LCMS：(M+1)+1055.27(理论值：1054.27)。
ADC-9a:化合物9和HER2单抗HS627形成抗体偶联药物
取HS627抗体(20.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，然后再加入0.1M乙二胺四乙酸二钠的溶液(25μL)，加入配置好的TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04ml)，室温25℃旋转转盘反应90min。
将化合物9(0.84mg，0.8mmol)溶于0.08ml的DMA中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应2h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM L-组氨酸醋酸盐缓冲液，pH6.0，120mM蔗糖，0.2g/L聚山梨酯20，得到ADC-9a(3.1mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝7.7
ADC-9b:化合物9和5T4单抗IP140B形成抗体偶联药物
取IP140B抗体(20.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，然后再加入0.1M乙二胺四乙酸二钠的溶液(25μL)，加入配置好的TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04ml)，室温25℃旋转转盘反应90min。
将化合物9(0.84mg，0.8mmol)溶于0.08ml的DMA中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应2h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM组氨酸溶液，250mM山梨醇，0.02％吐温80，pH5.7，得到ADC-9b(3.2mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝7.6
实施例10：10-(溴乙酰胺乙氧基乙氧基丙酰-Gly-Leu-乙二胺(Ms)-亚甲基)氧-7-乙基喜树碱(10)
在反应瓶中加入7-乙基-10-羟基喜树碱(0.1g,0.255mmol)，DCM(5mL),DIEA(65.9mg,0.51mmol)和Intermediate 4(84.8mg,0.268mmol),反应液在40℃下搅拌反应1h，减压下去除溶剂,硅胶柱层析纯化，得到化合物10a(145.1mg，产率84.6％)；LCMS:(M+1)+673.71(理论值：672.71)。
向反应瓶中加入化合物10a(0.1g,0.149mmol)，MeOH(5mL),80％水合肼(55.8mg,0.892mmol),反应液在60℃下搅拌反应2h，加入饱和食盐水20ml，用二氯甲烷萃取三次(10ml X 3)，合并有机相干燥，减压下去除溶剂,得到化合物10b(73.2mg，产率90.8％)；LCMS:(M+1)+543.61(理论值：542.61)。
将上述得到的化合物10b(100mg,0.184mmol)溶于DMF(2mL)中，再依次加入DIPEA(47.6mg,0.369mmol),Fmoc-PEG2-GLy-Leu-OH(105mg,0.184mmol),HATU(70.1mg,0.184mmol),反应液在室温下搅拌反应2h，减压下去除溶剂,硅胶柱层析纯化，得到化合物10c(184.5mg，产率91.5％)；LCMS:(M+1)+1195.25(理论值：1194.25)。
在反应瓶中依次加入化合物10c(100mg,0.091mmol)，哌啶(77.8mg,0.914mmol)，反应液在室温下搅拌反应0.5h，加入甲基叔丁基醚(30mL)，离心,去除上清液，重复三次，得到化合物10d(80mg，产率100％)LCMS:(M+1)+873.01(理论值：872.01)。
在反应瓶中依次加入DCM(2mL),化合物10d(70mg,0.08mmol),溴乙酸(22.3mg,0.16mmol)和DIC(20.3mg,0.16mmol),室温搅拌反应90min，减压下去除溶剂,硅胶柱层析纯化，得到淡黄色固体10(65.3mg，产率81.9％)；LCMS:(M+1)+994.33(理论值：992.94)。
ADC-10a:化合物10和HER2单抗HS627形成抗体偶联药物
取HS627抗体(20.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，然后再加入0.1M乙二胺四乙酸二钠的溶液(25μL)，加入配置好的TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04ml)，室温25℃旋转转盘反应90min。
将化合物10(0.79mg，0.8mmol)溶于0.08ml的DMA中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应2h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM L-组氨酸醋酸盐缓冲液，pH6.0，120mM蔗糖，0.2g/L聚山梨酯20，得到ADC-10a(3.2mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝7.1
ADC-10b:化合物10和5T4单抗IP140B形成抗体偶联药物
取IP140B抗体(20.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，然后再加入0.1M乙二胺四乙酸二钠的溶液(25μL)，加入配置好的TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04ml)，室温25℃旋转转盘反应90min。
将化合物10(0.79mg，0.8mmol)溶于0.08ml的DMA中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应2h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM组氨酸溶液，250mM山梨醇，0.02％吐温80，pH5.7，得到ADC-10b(3.2mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝7.2
实施例11：2-[N-甲基-N-(溴乙酰胺乙氧基乙氧基丙酰-Gly-Leu-Gly-亚甲基)]胺氧乙酰依沙替康(11)
将Boc-N-甲基盐酸羟胺(15g，101.9mmol)溶解在异丙醇(100mL)中，加入溴乙酸苄酯(27.709g，121.4mmol)和DIPEA(15.7g,121.7mmol)，在氩气保护下搅拌升温至85℃反应3h，浓缩反应液，加入乙酸乙酯(100mL)溶解，饱和食盐水洗涤(30mL*3)，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析纯化，得到中间体11a(24g,产率80％,HPLC 98％)；LCMS:(M+1)+296.08(理论值：295.14)。
在100mL的单口瓶中加入二氯甲烷(20mL),11a(2g,6.8mmol),搅拌均匀后，滴加4N盐酸的乙酸乙酯溶剂(10mL)，室温搅拌反应过夜，浓缩，得到11b(1.32g,产率100％,HPLC96％)；LCMS:(M+1)+195.99(理论值：195.06)。
将5a(1g,3.9mmol)溶解在DCM(5mL)中，加入11b(0.77g,3.9mmol)和DIPEA(290.79mg,2.24mmol),封管、升温至50℃反应过夜，冷却至室温，浓缩，硅胶柱层析纯化，得到11c(1.2g,产率75％,HPLC 91％)；LCMS:(M+1)+412.06(理论值：411.14)。
在100mL的单口瓶中加入11c(1.2g,2.9mmol)，甲醇(5mL)和10％钯碳(0.1g),氢气置换后，室温常压反应2h，过滤，浓缩，得到11d(0.91g,产率97％,HPLC 93％)；LCMS:(M+1)+322.01(理论值：321.10)。
向反应瓶中加入依沙替康磺酸盐(0.26g,0.5mmol)，DMF(2mL)，HATU(0.19g,0.5mmol)，DIPEA(0.129g.1mmol)和11d(0.176g,0.55mmol),室温下搅拌反应15h，加入DCM(200mL)，饱和氯化钠溶液洗涤,无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析纯化，得黄色固体11e(0.46g,产率66％,HPLC 92％)；LCMS:(M+1)+739.11(理论值：738.24)。
将11e(0.1g,0.12mmol)溶解在MeOH(5mL)中，加入水合肼(66mg,1.32mmol)，封管、升温至60℃反应2h,冷却至室温，反应液倒入饱和食盐水中(100mL)，用乙酸乙酯(200mL)萃取，浓缩得到11f(0.06g,产率72％,HPLC 94％)；LCMS:(M+1)+609.14(理论值：608.24)。
称取11f(60mg,0.098mmol)溶于DMF(2mL)中，加入DIPEA(25mg,0.197mmol)，搅拌下依次加入Fmoc-PEG2-Gly-Leu-OH(55.76mg,0.098mmol)，HATU(37.5mg,0.098mmol)，室温下搅拌反应1h，浓缩，硅胶柱层析纯化，得到化合物11g(85mg,产率75％,HPLC 91％)；LCMS:(M+1)+1160.27(理论值：1159.50)。
在10mL的单口瓶中加入11g(85mg,0.069mmol)，加入DMF(1mL)溶解，然后加入哌啶(100μL)，室温下反应1h，加入甲基叔丁基醚(20mL)，离心，去除上清液，干燥，得到11h(31mg,产率46％,HPLC 93％)；LCMS:(M+1)+938.02(理论值：937.43)。
在反应瓶中依次加入DCM(3mL),11h(31mg,0.032mmol),溴乙酸(8.9mg,0.064mmol)和DIC(8.01mg,0.064mmol),室温下搅拌反应90min，浓缩，硅胶柱层析纯化,得到黄色固体11(25mg，产率63％,HPLC 95％)；LCMS:(M+1)+1058.24(理论值：1057.36)。
ADC-11a:化合物11和HER2单抗HS627形成抗体偶联药物
取HS627抗体(20.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，然后再加入0.1M乙二胺四乙酸二钠的溶液(25μL)，加入配置好的TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04ml)，室温25℃旋转转盘反应90min。
将化合物11(0.85mg，0.8mmol)溶于0.08ml的DMA中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应2h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM L-组氨酸醋酸盐缓冲液，pH6.0，120mM蔗糖，0.2g/L聚山梨酯20，得到ADC-11a(3.3mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝7.5
ADC-11b:化合物11和5T4单抗IP140B形成抗体偶联药物
取IP140B抗体(20.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，然后再加入0.1M乙二胺四乙酸二钠的溶液(25μL)，加入配置好的TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04ml)，室温25℃旋转转盘反应90min。
将化合物11(0.85mg，0.8mmol)溶于0.08ml的DMA中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应2h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM组氨酸溶液，250mM山梨醇，0.02％吐温80，pH5.7，得到ADC-11b(3.2mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝7.6
实施例12：2-[N-甲基-N-(溴乙酰胺乙氧基乙氧基丙酰-Gly-Val-Ala-亚甲基)]胺氧乙酰依沙替康(12)
取5c(0.2g,0.75mmol)溶解在DCM(5mL)中，加入11b(146mg,0.75mmol)和DIPEA(290.79mg,2.24mmol),封管、升温至50℃反应过夜，冷却至室温，硅胶柱层析纯化，得到产品12a(0.27g,产率84％,HPLC 95％)；LCMS:(M+1)+426.21(理论值：425.36)。
在100mL的单口瓶中加入12a(0.27g,3.9mmol)，甲醇(5mL)和10％钯碳(0.1g),氢气置换后，室温常压反应2h，过滤，浓缩得到12b(0.20g,产率95％,HPLC 93％)；LCMS:(M+1)+336.08(理论值：335.11)。
在反应瓶中加入依沙替康磺酸盐(0.26g,0.5mmol)，DMF(2mL)，HATU(0.19g,0.5mmol)，DIPEA(0.129g.1mmol)和12b(200mg,0.59mmol),室温下搅拌反应15h，加入DCM(200mL)，饱和氯化钠溶液洗涤,无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析纯化，得黄色固体12c(0.3g,产率81％,HPLC 92％)；1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.72-8.66(m,1H),8.49(d,J＝8.8Hz,1H),7.79-7.71(m,1H),7.70(s,3H),7.28(s,1H),6.51(s,1H),5.39(d,J＝17.2Hz,3H),5.23-5.19(s,1H),5.00(s,1H),4.68(q,J＝7.3Hz,1H),4.18(s,3H),4.12–4.01(m,1H),3.18(d,J＝17.1Hz,1H),3.07(d,J＝17.6Hz,1H),2.37(s,3H),2.00-1.92(m,2H),1.87-1.80(m,2H),1.29(m,J＝7.2Hz,3H),1.25-1.05(m,1H),0.84(q,J＝13.5,7.5Hz,3H)；LCMS:(M+1)+753.12(理论值：752.26)。
将12c(0.1g,0.13mmol)溶解在MeOH(5mL)中，加入水合肼(39.9mg,0.79mmol)，封管、升温至60℃反应2h,冷却至室温，反应液倒入饱和食盐水(100mL)中，用乙酸乙酯(200mL)萃取，浓缩得到12d(0.07g,77％,HPLC 92％)；1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.91(t,J＝6.0Hz,1H),8.58(d,J＝8.9Hz,1H),8.17(s,3H),7.66(d,J＝10.8Hz,1H),7.27(s,1H),6.52(s,1H),5.58(td,J＝8.3,7.9,4.8Hz,1H),5.39(s,2H),5.19(d,J＝19.0Hz,1H),5.01(d,J＝18.9Hz,1H),4.35(dd,J＝13.2,6.3Hz,1H),4.25(dd,J＝12.1,4.7Hz,1H),4.20(d,J＝2.3Hz,2H),3.97-3.88(m,1H),3.18(dt,J＝17.1,5.9Hz,1H),3.13-3.03(m,1H),2.53(s,3H),2.31(d,J＝1.9Hz,3H),2.26–2.09(m,2H),1.93-1.77(m,J＝7.2Hz,2H),1.37(d,J＝6.9Hz,3H),0.86(t,J＝7.3Hz,3H)；LCMS:(M+1)+623.15(理论值：622.26)。
称取12d(70mg,0.112mmol)溶于DMF(2mL)中，加入DIPEA(29mg,0.224mmol)，搅拌下依次加入Fmoc-PEG2-Gly-Val-OH(62.16mg,0.112mmol)，HATU(42.56mg,0.112mmol)，室温搅拌反应1h，浓缩，硅胶柱层析纯化，得到化合物12e(81mg,产率62％,HPLC 91％)；1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.50(d,J＝8.9Hz,1H),8.24(t,J＝6.3Hz,1H),8.11(t,J＝5.7Hz,1H),7.99(d,J＝7.2Hz,1H),7.86(d,J＝7.5Hz,2H),7.74(dd,J＝9.8,7.4Hz,2H),7.67(d,J＝7.5Hz,2H),7.39(t,J＝7.4Hz,2H),7.35-7.26(m,4H),6.52(s,1H),5.75(s,2H),5.59(dt,J＝9.2,6.1Hz,1H),5.41(d,J＝2.0Hz,2H),5.25(d,J＝18.9Hz,1H),5.09(d,J＝18.8Hz,1H),4.33-3.99(m,8H),3.70(m,J＝16.6,5.7Hz,2H),3.57(t,J＝6.5Hz,2H),3.46(s,4H),3.39(d,J＝6.0Hz,2H),3.26-3.06(q,J＝6.1Hz,5H),2.48(d,J＝2.4Hz,3H),2.41-2.29(m,5H),2.17(q,J＝6.5Hz,2H),1.93-1.77(m,3H),1.14(d,J＝7.1Hz,3H),0.86(t,J＝7.3Hz,3H),0.82-0.66(m,6H)；LCMS:
(M+1)+1160.24(理论值：1159.50)。
在反应瓶中加入12e(81mg,0.069mmol)，加入DMF(1mL)，哌啶(100μL)，室温下反应1h，加入甲基叔丁基醚(20mL)，离心，去除上清液，干燥，得到12f(32mg,产率49％,HPLC93％)；1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.53(d,J＝8.9Hz,1H),8.28(t,J＝6.3Hz,1H),8.13(t,J＝5.7Hz,1H),8.01(d,J＝7.2Hz,1H),7.77(t,J＝10.2Hz,5H),7.30(s,1H),6.53(s,1H),5.60(dt,J＝8.9,6.0Hz,1H),5.41(s,2H),5.27(d,J＝18.9Hz,1H),5.13(d,J＝19.0Hz,1H),4.28(dd,J＝13.2,6.7Hz,1H),4.24-4.12(m,3H),4.12-4.03(m,2H),3.79-3.64(m,2H),3.63-3.48(m,8H),3.27-3.08(m,2H),2.97(h,J＝5.7Hz,2H),2.47(s,3H),2.37(dd,J＝7.8,4.3Hz,5H),2.18(q,J＝6.4Hz,2H),1.85(qq,J＝14.0,7.2Hz,3H),1.15(d,J＝7.1Hz,3H),0.86(t,J＝7.3Hz,3H),0.71(dd,J＝13.3,6.8Hz,6H)；LCMS:(M+1)+938.02(理论值：937.43)。
在反应瓶中依次加入DCM(3mL),12f(32mg,0.034mmol),溴乙酸(9.5mg,0.068mmol)和DIC(8.6mg,0.068mmol),室温下搅拌反应90min，浓缩，硅胶柱层析纯化,得到黄色固体12(22mg,产率61％,HPLC 95％)；1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.49(d,J＝8.9Hz,1H),8.33(t,J＝5.7Hz,1H),8.24(t,J＝6.2Hz,1H),8.11(t,J＝5.8Hz,1H),7.98(d,J＝7.1Hz,1H),7.75(d,J＝8.5Hz,1H),7.70(d,J＝10.8Hz,1H),7.28(s,1H),5.64-5.54(m,1H),5.40(s,2H),5.23(d,J＝18.9Hz,1H),5.04(d,J＝18.9Hz,1H),4.33-3.97(m,6H),3.85(s,2H),3.70(qd,J＝16.5,5.7Hz,3H),3.57(t,J＝6.5Hz,4H),3.52-3.37(m,4H),3.26-3.17(m,4H),3.14-3.06(m,1H),2.47(s,3H),2.41-2.28(m,5H),2.24-2.11(m,J＝6.9,6.0Hz,2H),1.84(dh,J＝20.8,7.0Hz,3H),1.14(d,J＝7.1Hz,3H),0.85(t,J＝7.3Hz,3H),0.70(dd,J＝11.4,6.8Hz,6H)；LCMS:(M+1)+1058.24(理论值：1057.36)。
ADC-12a:化合物12和HER2单抗HS627形成抗体偶联药物
取HS627抗体(20.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，然后再加入0.1M乙二胺四乙酸二钠的溶液(25μL)，加入配置好的TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04ml)，室温25℃旋转转盘反应90min。
将化合物12(0.85mg，0.8mmol)溶于0.08ml的DMA中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应2h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM L-组氨酸醋酸盐缓冲液，pH6.0，120mM蔗糖，0.2g/L聚山梨酯20，得到ADC-12a(3.3mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝7.6
ADC-12b:化合物12和5T4单抗IP140B形成抗体偶联药物
取IP140B抗体(20.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，然后再加入0.1M乙二胺四乙酸二钠的溶液(25μL)，加入配置好的TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04ml)，室温25℃旋转转盘反应90min。
将化合物12(0.85mg，0.8mmol)溶于0.08ml的DMA中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应2h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM组氨酸溶液，250mM山梨醇，0.02％吐温80，pH5.7，得到ADC-12b(3.2mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝7.7
实施例13：2-[N-甲基-N-(溴乙酰胺乙氧基乙氧基丙酰-Gly-Gly-Val-亚甲基)]胺氧乙酰依沙替康(13)
将5b(0.2g,0.68mmol)溶解在DCM(5mL)中，加入11a(133mg,0.68mmol)和DIPEA(175mg,1.36mmol),封管、升温至50℃反应过夜，冷却至室温，浓缩，硅胶柱层析纯化，得到产品13a(0.27g,产率90％,HPLC 93％)；LCMS:(M+1)+454.11(理论值：453.19)。
在反应瓶中加入13a(0.27g,0.59mmol)，甲醇(5mL)和10％钯碳(0.1g),氢气置换后，室温常压反应2h，过滤，浓缩得到产品13b(0.20g,产率95％,HPLC 91％)；LCMS:(M+1)+364.03(理论值：363.14)。
取依沙替康磺酸盐(0.26g,0.5mmol)溶解于DMF(2mL)，加入HATU(0.19g,0.5mmol)，DIPEA(0.129g.1mmol)和13b(0.2g,0.55mmol),室温下搅拌反应15h，加入DCM(200mL)，饱和氯化钠溶液洗涤,无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析纯化，得黄色固体13c(0.32g,产率84％,HPLC 94％)；LCMS:(M+1)+781.12(理论值：780.29)。
将13c(0.1g,0.12mmol)溶解在MeOH(5mL)中，加入水合肼(66mg,1.32mmol)，封管、升温至60℃反应2h,冷却至室温，反应液倒入饱和食盐水(100mL)中，用乙酸乙酯(200mL)萃取，浓缩得到13d(0.06g,产率72％,HPLC 90％)；LCMS:(M+1)+651.06(理论值：650.29)。
称取13d(60mg,0.092mmol)溶于DMF(2mL)中，加入DIPEA(24mg,0.184mmol)，搅拌下依次加入Fmoc-PEG2-Gly-Gly-OH(47.3mg,0.092mmol)，HATU(35.07mg,0.092mmol)，室温下搅拌反应1h，浓缩，硅胶柱层析纯化，得到化合物13e(86mg,产率81％,HPLC 91％)；LCMS:(M+1)+1146.28(理论值：1145.49)。
在反应瓶中加入13e(86mg,0.075mmol)，DMF(1mL)，哌啶(100μL)，室温下搅拌反应1h，加入甲基叔丁基醚(20mL)，离心，去除上清液，干燥，得到13f(36mg,产率52％,HPLC纯度89％)；LCMS:(M+1)+924.00(理论值：923.42)。
向反应瓶中依次加入DCM(3mL),13f(36mg,0.039mmol),溴乙酸(10.6mg,0.078mmol)和DIC(9.8mg,0.078mmol),室下温搅拌反应90min，浓缩，硅胶柱层析纯化得到黄色固体13(17mg,产率42.5％,HPLC 95％)；LCMS:(M+1)+1044.25(理论值：1043.34)。
ADC-13a:化合物13和HER2单抗HS627形成抗体偶联药物
取HS627抗体(20.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，然后再加入0.1M乙二胺四乙酸二钠的溶液(25μL)，加入配置好的TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04ml)，室温25℃旋转转盘反应90min。
将化合物13(0.83mg，0.8mmol)溶于0.08ml的DMA中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应2h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM L-组氨酸醋酸盐缓冲液，pH6.0，120mM蔗糖，0.2g/L聚山梨酯20，得到ADC-13a(3.1mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝7.6
ADC-13b:化合物13和5T4单抗IP140B形成抗体偶联药物
取IP140B抗体(20.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用Na2HPO4溶液调pH至7.2，然后再加入0.1M乙二胺四乙酸二钠的溶液(25μL)，加入配置好的TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04ml)，室温25℃旋转转盘反应90min。
将化合物13(0.83mg，0.8mmol)溶于0.08ml的DMA中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应2h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM组氨酸溶液，250mM山梨醇，0.02％吐温80，pH5.7，得到ADC-13b(3.2mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝7.4
实施例14：2-[N-甲基-N-(溴乙酰胺乙氧基乙氧基丙酰-Gly-Leu-Val-亚甲基)]胺氧乙酰依沙替康(14)
取13a(0.10g,0.15mmol)溶解于DMF(2mL)，加入HATU(1.17g,0.31mmol)，DIPEA(0.4g.0.31mmol)和Fmoc-PEG2-Gly-Leu-OH(176mg,0.31mmol),反应液在室温下搅拌反应15h，加入DCM(200mL)，饱和氯化钠溶液洗涤,无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析纯化，得到黄色固体14a(150mg,产率83％,HPLC 96％)；LCMS:(M+1)+1202.35(理论值：1201.55)。
将14a(150mg,0.12mmol)溶于DMF(0.5mL)中，加入哌啶(90mg,1.2mmol)，室温下搅拌反应1h，加入甲基叔丁基醚(30mL)，离心，去除上清液，减压下去除溶剂，干燥，得到固体产物14b(63mg，产率49％,HPLC 93％)直接用于下一步反应；LCMS:(M+1)+980.11(理论值：979.48)。
在反应瓶中依次加入DCM(3mL),14b(63mg,0.064mmol),溴乙酸(17mg,0.128mmol)和DIC(16.2mg,0.128mmol),室温下搅拌反应90min，浓缩，硅胶柱层析纯化，得到黄色固体产物14(34mg,产率49％,HPLC 95％)；LCMS:(M+1)+1100.04(理论值：1099.40)。
ADC-14a:化合物14和HER2单抗HS627形成抗体偶联药物
取HS627抗体(20.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，然后再加入0.1M乙二胺四乙酸二钠的溶液(25μL)，加入配置好的TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04ml)，室温25℃旋转转盘反应90min。
将化合物14(0.88mg，0.8mmol)溶于0.09ml的DMA中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应2h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM L-组氨酸醋酸盐缓冲液，pH6.0，120mM蔗糖，0.2g/L聚山梨酯20，得到ADC-14a(3.2mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝7.7
ADC-14b:化合物14和5T4单抗IP140B形成抗体偶联药物
取IP140B抗体(20.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，然后再加入0.1M乙二胺四乙酸二钠的溶液(25μL)，加入配置好的TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04ml)，室温25℃旋转转盘反应90min。
将化合物14(0.88mg，0.8mmol)溶于0.09ml的DMA中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应2h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM组氨酸溶液，250mM山梨醇，0.02％吐温80，pH5.7，得到ADC-14b(3.2mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝7.4
实施例15：2-[N-甲基-N-(溴乙酰胺乙氧基乙氧基丙酰-Gly-Phe-Gly-亚甲基)]胺氧乙酰依沙替康(15)
称取11f(60mg,0.098mmol)溶于DMF(2mL)中，加入DIPEA(25mg,0.197mmol)，搅拌下依次加入Fmoc-PEG2-Gly-Phe-OH(59.02mg,0.098mmol)，HATU(37.5mg,0.098mmol)，反应液在室温下搅拌反应1h，浓缩，硅胶柱层析纯化，得到化合物15a(92mg,产率79％,HPLC93％)；LCMS:(M+1)+1194.36(理论值：1193.49)。
在反应瓶中加入15a(92mg,0.077mg)，DMF(1mL)和哌啶(100μL)，反应液在室温下搅拌反应1h，加入甲基叔丁基醚(20mL)，离心，去除上清液，干燥，得到15b(45mg,产率60％,HPLC 92％)；LCMS:(M+1)+972.38(理论值：971.42)。
向反应瓶中依次加入DCM(3mL),15b(45mg,0.046mmol),溴乙酸(12.60mg,0.092mmol)和DIC(11.67mg,0.092mmol),反应液在室温下搅拌反应90min，浓缩，硅胶柱层析纯化,得到黄色固体15(15mg,产率30％,HPLC 94％)；LCMS:(M+1)+1092.28(理论值：1091.34)。
ADC-15a:化合物15和HER2单抗HS627形成抗体偶联药物
取HS627抗体(20.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，然后再加入0.1M乙二胺四乙酸二钠的溶液(25μL)，加入配置好的TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04ml)，室温25℃旋转转盘反应90min。
将化合物15(0.87mg，0.8mmol)溶于0.09ml的DMA中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应2h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM L-组氨酸醋酸盐缓冲液，pH6.0，120mM蔗糖，0.2g/L聚山梨酯20，得到ADC-15a(3.2mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝7.7
ADC-15b:化合物15和5T4单抗IP140B形成抗体偶联药物
取IP140B抗体(20.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，然后再加入0.1M乙二胺四乙酸二钠的溶液(25μL)，加入配置好的TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04ml)，室温25℃旋转转盘反应90min。
将化合物15(0.87mg，0.8mmol)溶于0.09ml的DMA中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应2h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM组氨酸溶液，250mM山梨醇，0.02％吐温80，pH5.7，得到ADC-15b(3.2mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝7.6
实施例16：2-[N-甲基-N-(溴乙酰胺乙氧基乙氧基丙酰-Gly-Val-Ala-Gly-亚甲基)]胺氧乙酰依沙替康(16)
称取11f(50mg,0.082mmol)溶于DMF(2mL)中，加入DIPEA(10.578mg,0.082mmol)，搅拌溶清，依次加入Fmoc-PEG2-Gly-Val-Ala-OH(51.41mg,0.082mmol)，HATU(32mg,0.082mmol),室温搅拌反应1h,反应用硅胶柱层析纯化，得到化合物16a(79mg,产率78％,HPLC 96％)；LCMS:(M+1)+1216.52(理论值：1217.32)。
在10ml的单口瓶中，加入16a(79mg,0.064mg)，溶解于DMF(1mL)，加入100ul的哌啶，室温下反应1h，加入甲基叔丁基醚(20mL)，离心，去除上清液，所得固体再用少量甲醇溶清，干燥，得拿到16b(26mg,产率45％,HPLC 95％)；LCMS:(M+1)+994.46(理论值：995.08)。
在10ml的单口瓶中,依次加入DCM(3mL),16b(26mg,0.026mmol),溴乙酸(7.2mg,0.052mmol)和DIC(6.6mg,0.052mmol),室温搅拌反应90min，浓缩,硅胶柱层析纯化,得到16黄色固体(12mg，产率41％,HPLC 98.5％)；LCMS:(M+1)+1114.38(理论值：1115.01)。
ADC-16a:化合物16和HER2单抗HS627形成抗体偶联药物
取HS627抗体(10.0mg/mL,10mg,0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，加入5mM乙二胺四乙酸二钠的溶液(20mg/ml,84μL)，加入配置好的6eq TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04mL)，在25℃旋转转盘反应90min。
将化合物16(0.89mg，0.8mmol)溶于DMA(0.09mL)中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应16h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM L-组氨酸醋酸盐缓冲液，pH6.0，120mM蔗糖，0.02％吐温80，得到ADC-16a(3mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝7.80
ADC-16b:化合物16和5T4单抗IP140B形成抗体偶联药物
取IP140B抗体(10.0mg/mL，10mg，0.066mmol)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.2，加入5mM乙二胺四乙酸二钠的溶液(20mg/mL,84μL)，加入配置好的6eq TCEP·HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液(10mM，0.04mL)，25℃旋转转盘反应90min。
将化合物16(0.89mg，0.8mmol)溶于DMA(0.09mL)中，加入到上述溶液体系中，混匀，室温旋转转盘反应16h，反应完毕后用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为20mM L-组氨酸醋酸盐缓冲液，pH6.0，120mM蔗糖，0.02％吐温80，得到ADC-16b(2.9mg/ml，2ml)。
UV-HPLC计算平均值：n＝7.78
测试例1:ADC体内抑制肿瘤生长活性
ADC体外抑制活性测试方法：人非小细胞肺癌Calu-6、人肺癌细胞NCI-H1975、OE-21食管腺癌、人食管鳞癌细胞KYSE-150、人卵巢癌细胞ES-2和人乳腺癌细胞MDA-MB-231于体外单层培养，细胞饱和度为80％-90％时，用胰酶-EDTA消化，离心弃上清，PBS重悬细胞，将细胞悬液调整至合适浓度，将Calu-6、NCI-H1975、KYSE-150、OE-21和MDA-MB-231细胞(2-10×106cells/0.1ml)皮下接种BALB/c裸小鼠)将ES-2细胞皮下接种于NOD-SCID小鼠，定期观察动物及移植瘤生长情况，待瘤体积长到100-200mm3左右，根据瘤体积和体重进行随机分组，即溶媒对照组(或Vehicle组，注射生理盐水)和ADC给药组(溶于生理盐水)，每组6只动物。静脉注射给药，给药频率为Q4D，共给药2次(第一次给药的时间记为Day 1,Day 5第二次给药)，小鼠分组及给药设置见表1。每周2次用游标卡尺测量肿瘤长径a(mm)、短径b(mm)和小鼠体重，根据以下公式计算肿瘤体积(tumor volume,V)：V＝1/2×a×b2(mm3)，其中a和b分别表示肿瘤长和宽，并绘制生长曲线，最后剥取肿瘤并称重。统计分析基于试验结束时肿瘤体积和荷瘤鼠体重的数据运用GraphPad Prism软件进行分析得到抑瘤结果。图中，对照组“\”表示该组无结果，未测肿瘤状况；实验组无对应肿瘤、“肿瘤缩小为0”、“肿瘤消失为0”表示在相应解剖动物体内没有发现肿瘤残留。
表1：小鼠分组及给药设置
Claims (10)
1.式(I)所示的抗体-药物偶联物：
式中，
D为细胞毒性药物，Ab为抗体；
LD选自不存在或C1-C3亚烷基；
X选自N、O或S；
R1选自不存在、氢、氘、C1-C6烷基或卤素取代的C1-C6烷基；
R2选自氢、氘、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、酰基、磺酰基；
L1选自-L11-L12-L13-；其中，L11、L12、L13各自独立地选自不存在、-C＝O-、C1-C6亚烷基或-O-C1-C6亚烷基；
L2选自C1-C6亚烷基或C1-C6酰基，所述C1-C6亚烷基或C1-C6酰基任选地被一个或多个R3取代；
R3选自苯基取代或未取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基；
LP为由2-7个氨基酸构成的肽残基；
Z选自-Lz-Lj-，其中，Lz选自-C(＝O)-C1-C8亚烷基或-C(＝O)-(CH2CH2O)2-6-CH2CH2NH-，Lj为可偶联抗体的接头。
2.根据权利要求1所述的抗体-药物偶联物，其中，R1选自不存在、氢、氘、C1-C3烷基或卤素取代的C1-C3烷基；
优选地，R1选自不存在、氢、氘或卤素取代的C1-C3烷基；
优选地，R1选自不存在、氢、氘或F、Cl、Br、I取代的C1-C3烷基；
优选地，R1选自不存在、氢、氘或F取代的C1-C3烷基；
优选地，R1选自不存在、氢、氘、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、氟乙基、二氟乙基或三氟乙基；
优选地，R1选自不存在、氢、二氟乙基或三氟乙基；
优选地，R2选自氢、氘、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、-C(＝O)C1-C6烷基或-S(＝O)2C1-C6烷基；
优选地，R2选自氢、氘、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、-C(＝O)C1-C6烷基或-S(＝O)2C1-C3烷基；
优选地，R2选自氢、氘、C1-C3烷基、C1-C3烷氧基、-C(＝O)C1-C3烷基或-S(＝O)2C1-C3烷基；
优选地，R2选自氢、氘、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、甲酰基、乙酰基、甲磺酰基或乙磺酰基；
优选地，R2选自氢、甲基、甲氧基、甲酰基或甲磺酰基；
优选地，R2选自氢、甲基、甲酰基或甲磺酰基。
3.根据权利要求1或2所述的抗体-药物偶联物，其中，L11、L12、L13各自独立地选自不存在、-C＝O-、C1-C2亚烷基或C1-C2亚烷基-O-，条件是，当L11为-C＝O-时，R2不为氢；
优选地，L11、L12、L13各自独立地选自不存在、-C＝O-、-CH2-或-OCH2-；
优选地，L1选自-C(＝O)CH2OCH2-、-C(＝O)CH2O-或-CH2-；
优选地，L2选自C1-C3亚烷基或C1-C3酰基，所述C1-C3亚烷基或C1-C3酰基任选地被一个或多个R3取代；
优选地，L2选自亚甲基、亚乙基或-C(＝O)CH2-，所述亚甲基、亚乙基或-C(＝O)CH2-任选地被一个或多个R3取代；
优选地，R3选自C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或苯基取代的C1-C6烷基；
优选地，R3选自C1-C6烷基或苯基取代的C1-C6烷基；
优选地，R3选自C1-C4烷基或苯基取代的C1-C3烷基；
优选地，R3选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、苯基甲基或苯基乙基；
优选地，R3选自甲基、异丙基、异丁基或苯基甲基；
优选地，L2选自-CH2-、-CH2CH2-、
优选地，L2选自-CH2-、-CH2CH2-、
优选地，L2选自-CH2-、-CH2CH2-、
4.根据权利要求1-3任一项所述的抗体-药物偶联物，其中，所述氨基酸选自苯丙氨酸(Phe)、甘氨酸(Gly)、缬氨酸(Val)、丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)或谷氨酸(Glu)；
优选地，所述所述氨基酸选自苯丙氨酸(Phe)、甘氨酸(Gly)、缬氨酸(Val)、丙氨酸(Ala)或亮氨酸(Leu)；
优选地，Lp选自由2-5个选自苯丙氨酸(Phe)、甘氨酸(Gly)、缬氨酸(Val)、丙氨酸(Ala)或亮氨酸(Leu)的氨基酸构成的肽残基；
优选地，Lp选自由2、3或4个选自苯丙氨酸(Phe)、甘氨酸(Gly)、缬氨酸(Val)、丙氨酸(Ala)或亮氨酸(Leu)的氨基酸构成的肽残基；
优选地，Lp选自-Val-Cit-、-Gly-Lys-、-Gly-Leu-、-Val-Ala-、-Gly-Phe-、-GLy-Gly-Lys-、-Gly-Gly-Phe-、-Gly-Val-Ala-、-Gly-Gly-Val-、-Gly-Leu-Val-、-Gly-Phe-Gly-或-Gly-Gly-Leu-；
优选地，Lp选自-Gly-Leu-、-Gly-Phe-、-Gly-Gly-Phe-、-Gly-Val-Ala-、-Gly-Gly-Val-、-Gly-Leu-Val-、-Gly-Phe-Gly-或-Gly-Gly-Leu-；
优选地，Lp选自
优选地，Lj选自 所示位置表示与抗体相连，所示位置表示与LZ基团相连；
优选地，Lz选自-C(＝O)-C1-C8亚烷基或-C(＝O)-(CH2CH2O)2-6-CH2CH2NH-；
优选地，Lz选自-C(＝O)-(CH2CH2O)2-6-CH2CH2NH-；
优选地，Lz选自-C(＝O)-(CH2CH2O)2-4-CH2CH2NH-；
优选地，Lz选自-C(＝O)-(CH2CH2O)2-CH2CH2NH-；
优选地，Z选自
5.根据权利要求1-4任一项所述的抗体-药物偶联物，所述细胞毒性药物选自喜树碱及其衍生物；
优选地，所述细胞毒性药物选自
优选地，所述抗体为抗肿瘤相关抗原抗体；
优选地，所述肿瘤相关抗原抗体选自抗Her2抗体、抗Trop2抗体、抗B7H3抗体、抗5T4、抗Nectin-4抗体、抗CD20抗体和抗ROR1抗体。
6.根据权利要求1-5任一项所述的抗体-药物偶联物，式(I)所示的化合物结构如式(II)、式(III)、或式(IV)所示：
式(II)中，R2、L1、L2、Lp、Z、Ab各自定义同式(I)抗体-药物偶联物；
优选地，L1选自-C(＝O)CH2OCH2-或-C(＝O)CH2O-；
优选地，L2选自-CH2-或-CH2CH2-；
优选地，选自
式(III)中，R1、R2、R4、Lp、Z、Ab各自定义同式(I)抗体-药物偶联物；
优选地，R4选自氢、苯基取代或未取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基；
优选地，R4选自氢、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或苯基取代的C1-C6烷基；
优选地，R4选自氢、C1-C6烷基或苯基取代的C1-C6烷基；
优选地，R4选自氢、C1-C4烷基或苯基取代的C1-C3烷基；
优选地，R4选自氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、苯基甲基或苯基乙基；
优选地，R4选自氢、甲基、异丙基、异丁基或苯基甲基；
优选地，R4选自氢、甲基或异丙基；
式(IV)中，R2、L1、L2、Lp、Z、Ab各自定义同式(I)抗体-药物偶联物；
优选地，L1、L2各自独立地选自C1-C3亚烷基；
优选地，L1为-CH2-，L2为-CH2CH2-。
7.根据权利要求1-6任一项所述的抗体-药物偶联物，其中，选自以下结构：
其中，R1定义同式(I)抗体-药物偶联物。
8.根据权利要求1-7任一项所述的抗体-药物偶联物，其是由以下化合物与抗体连接得到：
优选地，所述抗体为HS627抗体或IP140B抗体，所述HS627的重链氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示，其轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述IP140B抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，其轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
9.药物组合物，其包括权利要求1-8任一项所述的抗体-药物偶联物与药学上可接受的载体。
10.权利要求1-8任一项所述的抗体-要求偶联物或权利要求9所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的用途；
优选地，所述肿瘤选自实体瘤，更优选自肺癌、非小细胞肺癌、食管鳞癌、卵巢癌、食管腺癌或乳腺癌。
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