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CN116693710A - 一种治疗慢性阻塞性肺病的全真一气汤多糖及其制备方法与应用 - Google Patents

一种治疗慢性阻塞性肺病的全真一气汤多糖及其制备方法与应用 Download PDF

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CN116693710A
CN116693710A CN202310674040.3A CN202310674040A CN116693710A CN 116693710 A CN116693710 A CN 116693710A CN 202310674040 A CN202310674040 A CN 202310674040A CN 116693710 A CN116693710 A CN 116693710A
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张志敏
武志娟
敖然
黎宛妍
戴诗婷
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First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University
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Abstract

本发明公开了一种治疗慢性阻塞性肺病的全真一气汤多糖及其制备方法，该多糖由摩尔比为1.2：0.95：0.44：2.15：60.72：32.64：1.9的甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖以及阿拉伯糖组成。实验结果表明，本发明提供的全真一气汤多糖可降低BALF中白细胞总数及炎症因子IL‑6、TNF‑α的表达水平，减轻肺组织病理性结构破坏，缓解肺气肿的形成，同时可能通过调节IL‑13/Jak1/Stat6信号通路，降低肺组织中MUC5AC蛋白及mRNA的表达，抑制COPD中的气道黏液高分泌，改善小鼠的肺功能。

Description

一种治疗慢性阻塞性肺病的全真一气汤多糖及其制备方法与 应用
技术领域
本发明涉及一种中药复方，具体涉及一种治疗慢性阻塞性肺病的全真一气汤多糖及其制备方法。
背景技术
慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一种以持续性气流受限为特征的慢性呼吸系统疾病，气流受限通常不完全可逆且呈进行性发展。COPD的发病多由吸入有毒的气体或颗粒物、感染、遗传等因素引起，香烟烟雾是其最主要的发病原因。香烟烟雾、感染等因素可以损伤气道上皮细胞从而分泌大量促炎症因子，引起气道杯状细胞和黏膜下腺体合成并释放大量黏液，称为气道黏液高分泌，可诱发加重气道阻塞，同时纤毛清除能力受损，病原体容易反复侵袭从而加重感染，形成恶性循坏。气道黏液高分泌的主要临床表现为慢性咳嗽、咳痰，被认为是影响包括COPD等慢性气道炎症性疾病发病与临床进展、预后的重要危险因素。
目前关于COPD发病机制的研究有很多，其核心发病机制仍未完全阐明，研究得最多的是炎症、氧化应激以及蛋白酶-抗蛋白酶失衡，这三者相互影响、相互作用，贯穿了COPD发病的整个过程。呼吸道中持续存在的炎症、氧化应激以及蛋白酶-抗蛋白酶失衡可以引起黏膜细胞/杯状细胞增生和化生、气道黏液高分泌、纤维化、平滑肌细胞改变以及肺组织的破坏，气道损伤与修复反复进行，形成瘢痕组织并最终导致气流受限，发展成COPD。
全真一气汤由清代名医冯兆张所创，由熟地黄、白术、麦冬、党参、附子、五味子和牛膝共七味药组成，其中附子回阳救逆、引火归元；熟地黄滋阴补肾，麦冬养阴清肺，白术健脾祛湿，此三味药配伍共达补益肺、脾、肾三脏之功，同时可以制约附子温燥之性；党参大补元气，牛膝引火下行、补肾纳气，五味子敛阴生津，收敛五脏之气，全方大补真元，滋阴救火，是一个固本治本方，主治阴分焦躁，上实下虚，阴竭于内，阳越于外，斑疹热极烦躁，上喘下泻，或中风大病阴虚发热，吐血咳喘，临床上多用于治疗一切虚劳重症。目前还未有关于全真一气汤多糖及其用于治疗慢性阻塞性肺病的研究报道。
发明内容
发明目的：本发明的目的为通过系统研究全真一气汤多糖化学组成，并通过动物药理实验证实其具有治疗慢性阻塞性肺病的功效。
技术方案：为了实现以上目的，本发明采用的技术方案为：
一种治疗慢性阻塞性肺病的全真一气汤多糖，该多糖由摩尔比为1.2：0.95：0.44：2.15：60.72：32.64：1.9的甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖以及阿拉伯糖组成。
本发明提供的治疗慢性阻塞性肺病的全真一气汤多糖的制备方法，包括以下步骤：
取全真一气汤药材原料熟地黄，麦冬，白术，党参，制附子，牛膝，五味子，粉碎，加总药材5～20倍体积量水煎煮回流提取1～3次，每次1～2h，合并提取液，过滤，滤液减压浓缩得清膏，加入95％乙醇，搅拌均匀后静置沉淀，抽滤沉淀，真空干燥，粉碎得到深棕黄色全真一气汤粗多糖；再用大孔树脂脱色纯化得到全真一气汤多糖。
作为优选方案，本发明所述的治疗慢性阻塞性肺病的全真一气汤多糖的制备方法，包括以下步骤：
取全真一气汤药材原料熟地黄30g，麦冬10g，白术10g，党参10g，制附子10g，牛膝10g，五味子6g，粉碎，加总药材8～10倍体积量水煎煮回流提取1～2次，每次1～2h，合并提取液，过滤，滤液减压浓缩得清膏，加入4～8倍体积量的95％乙醇，搅拌均匀后静置沉淀24～48h，抽滤沉淀，于60℃中真空干燥，粉碎得到深棕黄色全真一气汤粗多糖；再用大孔树脂脱色纯化得到全真一气汤多糖。
作为更加优选方案，以上所述的治疗慢性阻塞性肺病的全真一气汤多糖的制备方法，包括以下步骤：
(1)取全真一气汤药材原料熟地黄30g，麦冬10g，白术10g，党参10g，制附子10g，牛膝10g，五味子6g，粉碎，加10倍体积量水煎煮回流提取2次，每次1h，合并2次提取液，过滤，滤液减压浓缩至密度约为1.05g/mL的清膏，向其加入4倍体积量的95％乙醇，搅拌均匀后静置沉淀24h，抽滤沉淀，于60℃中真空干燥36h，粉碎得到全真一气汤粗糖。
(2)取步骤(1)制备得到的全真一气汤粗多糖加水制成浓度20mg/mL的全真一气汤粗多糖溶液，加入预处理好的HPD100大孔树脂，调节溶液pH值为5.0，置于摇床中，125r/min，80℃下脱色4h，然后3000～5000r/min离心3～10min，取上清液样品，浓缩制备得到全真一气汤多糖。
本发明所述的全真一气汤多糖在制备防治慢性阻塞性肺病中的应用。
发明可将全真一气汤多糖和药学上可接受的载体制成片剂、胶囊剂、颗粒剂或丸剂剂型的药物。
本发明在制成片剂时，在全真一气汤多糖中添加载体乳糖或玉米淀粉，需要时加入润滑剂硬脂酸镁，混合均匀，然后压片制成片剂。
在制成胶囊剂时，将全真一气汤多糖和载体乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，然后装胶囊制成胶囊剂。
本发明在制成颗粒剂时，把全真一气汤多糖和稀释剂乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，干燥，制成颗粒剂。
有益效果：本发明提供的全真一气汤多糖和现有技术相比具有以下优点：
1、本发明通过大量实验筛选得到高纯度的全真一气汤多糖，并得到其具体单糖组成和摩尔比。
2、本发明采用香烟烟雾暴露联合LPS气道内滴注建立COPD小鼠模型，模型小鼠可出现气道黏液高分泌现象，IL-13/Jak1/Stat6信号通路分子在模型小鼠肺组织表达水平增加，可能参与COPD中黏蛋白MUC5AC表达的调控。QZYQ-DT干预可降低BALF中白细胞总数及炎症因子IL-6、TNF-α的表达水平，减轻肺组织病理性结构破坏，缓解肺气肿的形成，同时可能通过调节IL-13/Jak1/Stat6信号通路，降低肺组织中MUC5AC蛋白及mRNA的表达，抑制COPD中的气道黏液高分泌，改善小鼠的肺功能。
附图说明
图1为QZYQ-DT一般化学表征结果。A为QZYQ-DT紫外光谱图；B为QZYQ-DT红外光谱图；C为葡聚糖分子量标准品标准曲线图；D为QZYQ-DT分子量分布图；E为单糖混合标准品PMP-HPLC图；F为QZYQ-DT的HPGPC图。
图2为小鼠体重变化情况图。
图3造模结束后小鼠体重图。图中CTL：空白对照组；CS：模型组；QZYQTDT(L)：全真一气汤多糖低剂量组；QZYQTDT(M)：全真一气汤多糖中剂量组；QZYQTDT(H)：全真一气汤多糖高剂量组；SCMC：羧甲司坦组。与空白对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与模型组相比，#P<0.05。
图4为肺组织病理切片HE染色结果(200×)。
图5为各组小鼠肺泡平均截距图。图中CTL：空白对照组；CS：模型组；QZYQTDT(L)：全真一气汤多糖低剂量组；QZYQTDT(M)：全真一气汤多糖中剂量组；QZYQTDT(H)：全真一气汤多糖高剂量组；SCMC：羧甲司坦组。与空白对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与模型组相比，#P<0.05。
图6为肺组织病理切片PAS染色结果(200×)。
图7为BALF中白细胞总数图。
图8为BALF中IL-6表达量图。
图9为BALF中TNF-α表达量。图中CTL：空白对照组；CS：模型组；QZYQTDT(L)：全真一气汤多糖低剂量组；QZYQTDT(M)：全真一气汤多糖中剂量组；QZYQTDT(H)：全真一气汤多糖高剂量组；SCMC：羧甲司坦组。与空白对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与模型组相比，#P<0.05。
图10为BALF中MUC5AC相对表达量.
图11为肺组织MUC5AC mRNA相对表达量。图中CTL：空白对照组；CS：模型组；QZYQTDT(L)：全真一气汤多糖低剂量组；QZYQTDT(M)：全真一气汤多糖中剂量组；QZYQTDT(H)：全真一气汤多糖高剂量组；SCMC：羧甲司坦组。与空白对照组相比，
*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与模型组相比，#P<0.05。
图12为肺组织蛋白表达变化图。
图13为肺组织P-Stat6相对表达量图。
图14为肺组织IL-13mRNA相对表达量图。图中CTL：空白对照组；CS：模型组；QZYQTDT(L)：全真一气汤多糖低剂量组；QZYQTDT(M)：全真一气汤多糖中剂量组；QZYQTDT(H)：全真一气汤多糖高剂量组；SCMC：羧甲司坦组。与空白对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与模型组相比，#P<0.05。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1全真一气汤多糖的大孔树脂精制纯化研究
通过水提醇沉得到的全真一气汤粗多糖成分较为复杂，包括数个多糖组分以及杂蛋白质及色素等杂质，外观及颜色性状不佳。对此，应采用精制纯化工艺处理粗多糖，可得精制多糖产物。本发明对全真一气汤多糖进行大孔树脂脱色工艺考察。
1.实验材料
全真一气汤水提粗多糖，制备方法为：取熟地黄30g，麦冬10g，白术10g，党参10g，制附子10g，牛膝10g，五味子6g。按方中比例称取中药饮片，粉碎，每次加入总药材重量10倍体积的水，煎煮回流提取2次，每次1h，合并2次提取液，4层纱布过滤，滤液减压浓缩至密度约为1.05g/mL的清膏，向其加入4倍体积量的95％乙醇，搅拌均匀后静置沉淀24h，抽滤沉淀，于60℃真空干燥36h，粉碎得到深棕黄色全真一气汤粗多糖(QZYQ-CDT)粉末，密封避光放置真空干燥器中保存。
D101、HPD100、HPD600、NKA-2型号树脂(索莱宝生物科技有限公司)；X-5、H103、AB-8、HPD750树脂(天津南开大学树脂有限公司)；硫酸、蒽酮(中国国药集团)；其他试剂为国产分析纯。
Sartorius CPA225D电子天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司)；台式冷冻离心机XIR*(赛默飞世尔科技有限公司)；TU-1810紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)；HY-45气浴恒温生物摇床(江苏金坛市金城国盛实验仪器厂)；HH-4数显恒温水浴锅(国华电器有限公司)；酸度计(上海雷磁仪器厂)；多功能酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)；Synergy UV系统超纯水仪(美国Millopore公司)。
2.实验方法与结果
2.1树脂预处理
取大孔树脂X-5、H103、D101、HPD100、AB-8、HPD750、HPD600、NKA-2浸泡于95％乙醇中24h，溶胀，再用乙醇多次洗涤，直到洗涤液加在试管里面3倍量水无浑浊出现，最后用双蒸水洗到没有醇味，备用。
2.2树脂的筛选
分别准确量取5mL预处理好的以上8种树脂于250mL锥形瓶中，并向其中加入40mL10mg/mL上述全真一气汤粗多糖溶液，置于摇床中，125r/min、25℃振荡24h，3000r/min离心3min，取上清液分别测定脱色后多糖的光密度值OD621脱色后和色素的光密度值OD450脱色后，计算全真一气汤多糖的保留率和色素的脱除率，确定最佳树脂类型。
多糖保留率检测方法为：将离心后的全真一气汤粗多糖上清液用蒸馏水配制成一定浓度的多糖溶液，取2mL多糖溶液置于具塞试管中，于冰水浴中加入5mL的2mg/mL蒽酮-硫酸溶液，混匀，沸水浴加热10min，取出迅速放至冰水浴冷却20min，再放置室温平衡10min。在621nm下，采用多功能酶标仪测定该多糖液的光密度值OD621表示多糖含量，多糖保留率公式如式：
多糖脱色率检测方法为：将离心后的全真一气汤粗多糖上清液用蒸馏水配制成一定浓度的多糖溶液，于400～700nm波长范围内扫描，结果表明全真一气汤粗多糖溶液无最大吸收波长，因为多糖溶液脱色前后均为橙黄色，根据互补色原理可知，溶液主要吸收蓝色波段可见光，所以选择450n为检测波长。在450nm下，采用多功能酶标仪测定光密度值OD450表示色素的含量，多糖脱色率公式见下式：
通过比较8种大孔树脂对全真一气汤多糖的脱色率和多糖保留率(表1)，结构为交联聚苯乙烯的X-5、AB-8、NKA-2脱色率都比较低，且多糖保留率相对较低，说明这一类树脂对全真一气汤多糖的吸附能力太强，对色素吸附能力较弱，故此类树脂不适用于全真一气汤多糖的脱色。HPD系列大孔树脂的脱色率较高，多糖保留率也较高，这大概是由于这类树脂粒径范围、比表面积以及平均孔径较为相似，以上参数比较适合吸附色素、保留多糖，而该系列中极性的HPD100脱色率和多糖保留率均最高，故选择HPD100作为全真一气汤多糖的脱色大孔树脂。
表1不同大孔树脂的对全真一气汤多糖脱色能力比较
2.3单因素试验
准确量取预处理好的大孔树脂5mL，并向其中加入50mL一定浓度的全真一气汤多粗糖(QZYQ-CDT)溶液，调节溶液pH为定值，置于摇床中，125r/min、一定温度下保持脱色数小时后，进行3000r/min离心3min，取上清液分别测定脱色后多糖的光密度值OD621脱色后和色素的光密度值OD450脱色后，计算全真一气汤多糖的保留率和色素的脱除率。
考察样品浓度对全真一气汤多糖的大孔树脂脱色效果影响可知脱色率随着样品浓度的增加而下降，多糖保留率呈提高趋势，当样品浓度大于15mg/mL，脱色率变化微弱，故HPD100树脂用于正交实验的样品浓度设为15、20、25mg/mL。考察pH对全真一气汤多糖脱色效果的影响可知，在pH3.5-6.5时，HPD100树脂脱色效果最佳，此时脱色率最高并且多糖保留率也算最高，故HPD100树脂用于正交实验的pH设为4、5、6。考察脱色温度对全真一气汤多糖的大孔树脂脱色效果影响可知，在温度为70℃时，HPD100树脂脱色效果最佳，此时脱色率最高，同时多糖保留率也算最高，60和80℃脱色率和多糖保留率均可达到73％以上，故HPD100树脂用于正交实验的温度设为60、70和80℃。考察脱色时间对全真一气汤多糖脱色效果的影响可知，HPD100树脂脱色效果随着时间的延长而明显增强，同时多糖保留率在缓慢下降，8h后，脱色率降低，此时色素解吸附可能大于吸附，因此HPD100树脂用于正交的脱色时间选择4、6、8h。
2.4正交实验
在单因素实验基础上，采用正交实验法确定全真一气汤多糖的最佳脱色工艺，按照L9(34)正交表设计实验，见表2。
脱色效果评价采用综合加权评分法，权重系数均为0.5，分别把试验项中最大的指标定为100分，其他各号按下式加权综合评分：
表2 HPD100对多糖脱色正交试验因素水平表
表3 HPD100对全真一气汤多糖提取液脱色效果正交试验结果与分析
试验号 A B C D 脱色率(％) 多糖保留率(％) 评分
1 1 1 1 1 86.58 66.55 89.99
2 1 2 2 2 84.32 81.32 97.56
3 1 3 3 3 81.09 87.93 95.41
4 2 1 2 3 84.12 73.38 88.84
5 2 2 3 1 86.01 61.50 83.14
6 2 3 1 2 82.30 84.68 94.24
7 3 1 3 2 86.73 37.22 69.74
8 3 2 1 3 79.04 82.28 91.05
9 3 3 2 1 82.40 81.39 92.43
K1 91.813 87.840 93.597 90.267
K2 87.547 94.823 87.780 96.670
K3 94.167 90.863 92.150 86.590
R 6.620 6.983 5.817 10.080
所有数据均为3次平行实验的平均值，实验数据以均值±标准偏差(Mean±SD)的形式表示，应用SPSS软件进行方差分析。由方差分析表4可知，四个因素的主次顺序为四个因素的主次顺序为D＞B＞A＞C，最佳工艺条件为即样品浓度>样品pH>脱色温度>脱色时间，最佳工艺条件为A3B2C1D2，即，温度为80℃，样品pH为5，脱色时间为4h，样品浓度为20mg/mL。在此条件下，测得多糖脱色率达80.25％，多糖保留率为76.94％。
表4 HPD100对全真一气汤多糖提取液脱色效果方差分析
方差来源 偏差平方和s 自由度f F值 F(0.10)临界值 显著性
A 67.567 2.000 0.767 4.460
B 73.589 2.000 0.836 4.460
C 55.023 2.000 0.625 4.460
D 156.127 2.000 1.773 4.460
误差 352.31 8
。
本发明以X-5、H103、D101、HPD100、AB-8、HPD750、HPD100、NKA-2等8种大孔树脂对全真一气汤粗多糖进行精制和脱色处理，筛选试验结果显示，HPD100对比其他7种大孔树脂具有更好的综合脱色效果，因此选择HPD100作为全真一气汤粗多糖的脱色剂。
以HPD100大孔树脂吸附作为全真一气汤粗多糖的吸附纯化方法，对样品浓度、样品pH、脱色温度、脱色时间进行单因素优化，选择3水平进行正交试验，结果表明，全真一气汤粗多糖的最佳脱色工艺参数为：样品浓度20mg/mL、样品pH 5.0、脱色温度80℃、脱色时间4h，此时，测得多糖脱色率达80.25％，多糖保留率为76.94％。全真一气汤粗多糖经过HPD100树脂的处理，达到了较满意的脱色效果和较高多糖保留率，同时颜色由深褐色变为浅黄色。
实施例2全真一气汤多糖的制备
(1)全真一气汤处方：熟地黄30g，麦冬10g，白术10g，党参10g，制附子10g，牛膝10g，五味子6g。按方中比例称取中药饮片，粉碎，每次加入总药材重量10倍体积的水，煎煮回流提取2次，每次1h，合并2次提取液，4层纱布过滤，滤液减压浓缩至密度约为1.05g/mL的清膏(体积折算相当于投料饮片重量2倍)，向其加入4倍体积量的95％乙醇，搅拌均匀后静置沉淀24h，抽滤沉淀，于60℃中真空干燥36h，粉碎得到深棕黄色全真一气汤粗多糖粉末(QZYQ-CDT)，密封避光放置真空干燥器中保存。
(2)取步骤(1)制备得到的全真一气汤粗多糖加水制成浓度20mg/mL的全真一气汤粗多糖溶液，加入预处理好的HPD100大孔树脂，调节溶液pH值为5.0，置于摇床中，125r/min，80℃下脱色4h，然后3000r/min离心3min，取上清液样品，浓缩制备得到全真一气汤多糖(QZYQ-DT)。
实施例2多糖的结构鉴定
1、实验材料
熟地黄、麦冬、白术、党参、附子、牛膝、五味子原料均购自南京中医药大学国医堂门诊部；葡萄糖(Glc)，鼠李糖(Rha)，阿拉伯糖(Ara)，半乳糖(Gal)，木糖(Xyl)，甘露糖(Man)，葡萄糖醛酸(GlcA)，半乳糖醛酸(GalA)(上海源叶有限公司)；葡聚糖分子量标准物质Mw为3.05KDa、10.2KDa、63.3KDa(中国计量院)；葡聚糖T-10、葡聚糖T-40(北京索莱宝科技有限公司)；色谱纯乙腈、甲醇(Tedia公司)。其它市售化学品和试剂均为分析级。
2、实验方法
(1)QZYQ-DT的一般化学分析
QZYQ-DT样品的总糖含量采用以葡萄糖为标准品的苯酚硫酸法测定；QZYQ-DT样品的杂蛋白含量采用BCA法(布兰福德法)检测，以标准牛血清白蛋白为参照；QZYQ-DT样品的糖醛酸含量用间羟基联苯法测定，以半乳糖醛酸为标准品；以葡萄糖为标准品的DNS法测定还原糖含量。
(2)QZYQ-DT的UV与FITC光谱表征
通过全波长扫描紫外分光光度计在190-350nm的波长范围内检测QZYQ-DT溶液(10ug/mL)是否含有蛋白和核酸。采用压片法对QZYQ-DT进行红外分析。取适量KBr粉末于玛瑙研钵中，在红外灯下研磨，研磨至完全干燥后加入适量QZYQ-DT样品，继续研磨，使QZYQ-DT在其中分布均匀，增加研磨时间确保水分完全除掉，加入适量完全干燥QZYQ-DT于模具中，铺均匀，压片机压片呈透明均匀薄片，于傅里叶变换红外光谱仪进行红外光谱扫描，设置扫描范围为4000cm-1-400cm-1。
(3)QZYQ-DT中成分的分子量分布
采用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)检测QZYQ-DT中成分的分子量分布。精密称取10.00mg的QZYQ-DT干燥多糖样品，溶解于超纯水中，配制成浓度为2mg/mL的糖液，用水系微孔滤膜过滤后上机测定。HPGPC分析条件：进样体积为20μL，流动相为0.09mM乙酸铵，流速为0.3mL/min，色谱柱为OHpak-SH-803(5μm，4.6mm×250mm)，柱温30℃，检测器为蒸发光散射检测器(ELSD)，漂移管温度116℃，气体流量4.0L/min。同时进样等浓度的3000、10000、123000、400000、633000的标准葡聚糖对照品作为分子量检测参照。
(4)QZYQ-DT的单糖组成分析
采用PMP柱前衍生化法对QZYQ-DT的单糖组成进行分析。精确称QZYQ-DT粉末10mg，加入3mol/L的三氟乙酸溶液2.0mL超声溶解，转移至安瓿瓶，封口，105℃水解6h，放冷至室温，离心(3000r/min，10min)，取上清液减压蒸干，加甲醇溶解蒸干3次，残渣加超纯水溶解定容至1mL，制得水解后样品供试液。取适量多糖水解溶液进行单糖PMP衍生化反应，充分反应后，用氯仿萃出未反应PMP试剂，水相定容后进样HPLC分析单糖组成。HPLC条件：流动相A为pH6.7 0.1mol/L磷酸二氢钾缓冲盐，流动相B为乙腈；流速为1.0mL/min；柱温为30℃；检测波长为250nm。采用梯度洗脱的方式：0～3min，13％(B)；3～8min，13％～16(B)；8～15min，16％～23％(B)；15～30min，23％(B)。
3、结果与讨论
QZYQ-DT样品总糖含量约为96.78％，蛋白含量约为0.69％，还原糖含量为37.31％，糖醛酸含量约为9.23％；图1-A中可见在190-350nm处有一小峰，表明粗QZYQ-DT可能尚有微量蛋白与核酸成分；QZYQ-DT样品的FT-IR(图1-B)显示出3408cm-1、2967cm-1多糖特征峰，表明其的大分子多糖本质；1623cm-1，说明QZYQ-DT中含有少量糖醛酸；采用HPLC对QZYQ-DT样品分子量分布表征发现其多糖分子量分布较广(图1-D)，分子量跨度从小于3.0kDa至100.0kDa的大分子，根据峰集中在3-10kDa分子量组分是QZYQDT样品的主要成分；使用PMP衍生法对QZYQ-DT样品的单糖组成进行液相分析发现其多糖由甘露糖Man、鼠李糖Rha、葡萄糖醛酸GlcA、半乳糖醛酸GalA、葡萄糖Glc、半乳糖Gal以及阿拉伯糖Ara组成，其摩尔百分比为1.2：0.95：0.44：2.15：60.72：32.64：1.9。
实施例3药效实验
一、实验材料
1、实验动物
SPF级C57BL/6J雄性小鼠63只购自广东省医学实验动物中心，4-6周龄，体重18-22g，许可证号：SCXK(粤)2018-0002，饲养于广州医科大学实验动物中心，自由进食进水1周以适应环境。
2.实验药物
全真一气汤多糖(QZYQ-DT)由实施例1制备得到。
2.2羧甲司坦片：购自广州白云山医药集团股份有限公司白云山制药总厂，每片规格250mg。
2.3椰树牌香烟：购自广东中烟工业公司，每根香烟焦油含量11mg，烟碱含量1mg，一氧化碳含量12mg。
3.试剂与耗材
4.主要仪器
5.溶液配制
5.1组织裂解液
RIPA 1ml
PMSF 10μl
Cocktail 2 10μl
Cocktail 3 10μl
5.2 WB电泳缓冲液
Tris Base 3.03g
甘氨酸 14.42g
SDS 1g
超纯水 定容至1000ml
5.3 WB转膜缓冲液
5.4 TBST
TBS粉剂 1包
Tween-20 2ml
超纯水 定容至2000ml
5.5 WB封闭液及二抗稀释液(5％w/v牛奶)
脱脂奶粉 1g
TBST 20ml
5.6 WB一抗稀释液(5％w/v BSA含0.02％NaN3)
BSA 1g
TBST 20ml
NaN3 0.004g
5.7 10％ SDS聚丙烯酰胺凝胶(分离胶)×2块
30％丙烯酰胺溶液 5.32ml
超纯水 6.36ml
Tris.HCl(pH8.8) 4ml
10％SDS 160μl
10％AP 160μl
TEMED 16μl
5.8 5％ SDS聚丙烯酰胺凝胶(浓缩胶)×2块
30％丙烯酰胺溶液 0.99ml
超纯水 4.2ml
Tris.HCl(pH6.8) 750μl
10％SDS 60μl
10％AP 60μl
TEMED 6μl
5.9红细胞裂解液
5.10 ELISA洗涤液(Washing Buffer)
PBS粉剂 1包
Tween-20 2ml
超纯水 定容至2000ml
5.11 ELISA专用抗体稀释液
PBS 100ml
Triton X-100 300μl
Tween-80 200μl
BSA 1g
硫柳汞 0.02g
5.12 ELISA专用样品稀释液
NaHCO3 1.4001g
Na2CO3 1.7665g
超纯水 200ml
5.13 ELISA专用封闭液
PBS 100ml
BSA 1g
蔗糖 1g
叠氮钠 0.02g
二、实验方法
1.实验动物分组与饲养
选用SPF级C57BL/6J雄性小鼠，4-6周龄，体重18-22g，随机分为6组，即空白对照组、模型组、QZYQ-DT低剂量组、QZYQ-DT中剂量组、QZYQ-DT高剂量组和羧甲司坦组，饲养于广州医科大学实验动物中心，自由进食进水1周以适应环境，定期更换饮用水、饲料和垫料。
2.COPD模型制备方法
采用香烟烟雾暴露联合LPS气管内滴注的方法制作COPD稳定期小鼠模型，自制熏烟箱大小为50cm×60cm×90cm，左右两侧各有一个1.5cm×1.5cm大小圆孔与外界相通，并连接抽气系统以排出香烟烟雾，同时利用计算机PAB-S200被动吸烟动物染毒系统检测熏烟箱的湿度、温度、气体(CO、SO2、CO2)等的变化情况。空白对照组置于SPF级环境饲养，自由进食进水；造模组从造模开始第1天、第14天借助喉镜于气道滴注LPS(50μg/50μl/只)，当天不熏烟，其余每天置于自制熏烟箱中进行被动吸烟，香烟处理为2次/d，上下午各1次，每次2h(每1h换气15-20min)，上下午间隔至少3h，10支香烟/h，6d/周，造模时间共12周。造模8周后给予相应药物处理：空白对照组和模型组用生理盐水灌胃，0.25ml/d；QZYQ-DT低剂量组用相当于全真一气汤0.5倍临床剂量(0.68g/kg)灌胃，0.25ml/d；QZYQ-DT中剂量组用相当于全真一气汤1倍临床剂量(1.36g/kg)灌胃，0.25ml/d；QZYQ-DT高剂量组用全真一气汤2倍临床剂量(2.72g/kg)灌胃，0.25ml/d；羧甲司坦组用羧甲司坦水溶液1倍临床剂量(225mg/kg)灌胃，0.25ml/d，共4周，流程如下：
3.标本采集
3.1小鼠进行最后一次熏烟后称重，用阿佛汀麻醉小鼠，固定于手术板上，在颈部沿着气管切开并行气管插管，放置在Buxco小动物肺功能测量仪上采集相关肺功能数据。
3.2每只小鼠准备6只1ml注射器并提前抽好预冷的生理盐水0.6ml，气管内注入0.6ml生理盐水，灌洗双侧肺叶(或结扎左肺，灌洗右肺)，15s后回收，将回收的BALF放置于2ml离心管并置于冰上，连续操作3次，回收率最好在80％以上，标为管1，取另一个2ml离心管，重复上述操作，标为管2。采集后离心(1000转，5min)，取管1上清分装至600μl离心管，并置于-80℃保存，用于后续实验；弃掉管2上清，加入500μl红细胞裂解液，轻轻吹打重悬后加入到管1中，再轻轻吹打重悬，静置5min。管1离心(1000转，5min)，弃上清，加入1ml生理盐水(空白对照组因为细胞数量少，可只加入500μl)，轻轻吹打混匀，取10μl置于细胞计数板进行细胞计数(20μl机器计数)。计数完毕后，取适量(至少200μl，体积不够的用生理盐水补齐，内含细胞约105个，方便后期细胞分类计数)的重悬液于甩片机中，将细胞均匀甩(1000转，5min)至载玻片上。待载玻片上的细胞自然晾干后，甲醇固定1min(动作轻柔，防止细胞脱落)，室温静置待甲醇挥发。
3.3取完BALF后剪开小鼠腹部皮肤及肌层，轻轻划破膈肌暴露心脏，用1ml注射器插入右心室采集血液约500-800μl，置于1.5ml含EDTA的抗凝离心管，离心(1000转，5min)，吸取上清淡黄色血浆于新的1.5ml离心管，-80℃保存备用。继续剪开胸部皮肤及肌层，暴露肺脏，剪掉左心耳，从右心室注射生理盐水直到肺脏颜色变浅无血色，结扎右肺门，按上、中、下、圆叶剪掉右肺，分别置于不同的1.5ml离心管内，-80℃保存备用。从气道向左肺灌入10％多聚甲醛固定液，结扎左肺门并剪下左肺，放在装有10％多聚甲醛的4ml离心管内，后续脱水、包埋、切片等。
4.肺组织蛋白提取及浓度测定
4.1肺组织蛋白提取：将-80℃冻存的肺组织取出称重，按每100mg肺组织加入1ml组织裂解液，使用提前预冷的机械匀浆机上进行匀浆(shake＝20s，hold＝1min，temp＝4℃，speed＝6.0m/s，cycle＝4)，然后离心30min(4℃，12000g)，小心吸取上清置于1.5ml离心管中，-80℃冰箱长期保存。
4.2BCA法测定蛋白浓度
①按照说明书配备好产品中附带的BSA标准品，样品用水或其他不干扰显色反应的缓冲液稀释，使待测样品浓度位于标准曲线的线性部分。每个反应准备3个平行测定，标准曲线一般5-6个即可，根据标准品的浓度确定各个点的具体浓度，稀释BSA时可以用水，最好采用与样品一致或相似的溶液。如依次加入标准品(500μg/ml)0、2.5、5、10、15、20、25μl，用超纯水配平至总体积25μl，在待测样品孔的位置先加入超纯水23.75μl/孔，再依次加入待测样品1.25μl，相当于待测样品被稀释20倍，最后算得的样品浓度乘以20得到真实的样品蛋白浓度。
②制备BCA工作液，使用下述公式来确定所需的工作液总体积：(标准品的个数+待测蛋白质样品的个数)×实验重复次数×每个样品所需工作液的体积＝所需工作液的总体积。
③在每个反应孔中加入200μl工作液(A液：B液＝50：1)，盖上盖子混合30S，37℃反应30min。
④冷却到室温，在562nm波长下测量每个反应孔的吸光值，注意OD值的测定需要在1h内完成
⑤将各个标准品或待测样品的吸光值减去空白对照孔(即“0”孔)的吸光值，并绘制标准曲线，按照标准曲线计算待测样品的蛋白浓度。
⑥吸取适量样品蛋白按照2.5μg/μl浓度用组织裂解液配平成等浓度等体积的蛋白样品，加入对应体积的5×上样缓冲液，稍稍震荡离心后于沸水中煮10min，使蛋白质变性，待冷却后-80℃长期保存或分装后-20℃保存备用。
5.蛋白免疫印迹实验(Western Blotting，WB)
①电泳：提前将蛋白样品解冻，震荡离心后取适量上清蛋白(约20-50μg)加入浓缩胶凹槽中，80V恒压电泳约30min至溴酚蓝压成一条直线，再改为120V恒压电泳1h，待溴酚蓝达到凝胶底端，电泳结束。
②电转：PVDF膜预先用甲醇激活30s，将膜与凝胶按一定顺序放进三明治式电转夹中，避免产生气泡，300mA恒流电转2h，全程保持冰浴。
③封闭：将转好的膜放进装有5％牛奶封闭液的孵育盒中并置于摇床上室温孵育1h，结束后用TBST洗涤3次，每次5min，摇床上充分洗涤。
④一抗孵育：加入相应的一抗后置于摇床上缓慢摇匀，4℃孵育过夜，第二天回收一抗，用TBST洗涤3次，每次10min，摇床上充分洗涤。
⑤二抗孵育：加入相应的二抗后置于摇床上缓慢摇匀，室温孵育1h，回收二抗，用TBST洗涤3次，每次10min，摇床上充分洗涤。
⑥发光显影：将ECL化学发光液的A液和B液按1:1混合配制，滴加适量配好的发光液于膜上，均匀铺开，等待片刻后放进Tanon 5200化学发光成像系统暗室中曝光，电脑保存显影图片，使用专业分析工具进行半定量分析。
6.肺组织总RNA的提取及逆转录PCR
6.1TRIzol法总RNA提取
①取适量肺组织置于匀浆管中，每100mg肺组织加入1ml TRIzol，设置好匀浆机参数(shake＝20s，hold＝1min，temp＝4℃，speed＝6.0m/s，cycle＝4)进行匀浆。
②收集上清置于1.5ml离心管，加入200μl氯仿，上下震荡15s，使之充分混匀或呈乳液状，室温孵育5min。
③离心15min(12000g，4℃)，然后小心取出离心管置于冰上，避免摇晃。
④慢慢吸取上层清液，避免吸到中间白色蛋白层，置于一新的离心管内。
⑤向管内加入500μl异丙醇(沉淀RNA)，混匀，室温孵育10min，离心10min(12000g，4℃)。
⑥弃上清，加入事先配好的75％乙醇1ml(用DEPC水和无水乙醇配制)，离心5min(7500g，4℃)。
⑦倒掉上层乙醇，将离心管倒置固定(小心RNA倒出来)，至乙醇挥发干净(等待约30min，若管壁残留酒精较多，可用枪头吸干，但避免吸到RNA沉淀)。
⑧加入30μlDEPC水溶解RNA，-80℃长期保存，避免反复冻融。
6.2逆转录PCR反应
①在260nm波长处测定RNA浓度值(ng/μl)，逆转录需RNA1000ng(1μg)，计算得出Xμl，后续用DEPC水配平。
②冰上操作，配制反应混合液，配方见下表。为了确保配制的准确性，应先按反应数+2的标准配制Master Mix，然后分装到每个反应管中，最后加入RNA样品。上机，梯度PCR仪，42℃ 2min，4℃，取出置冰上。
试剂 使用量
5×gDNA Eraser Buffer 2μl
gDNA Eraser 1μl
Total RNA Xμl
Rnase Free dH2O 7-Xμl
Total：10μl
注：X是根据RNA浓度及上样量计算得出来的体积
③冰上操作，配制反应混合液，配方见下表。为了确保配制的准确性，应先按反应数+2的标准配制Master Mix，然后分装到每个反应管中，短暂离心混匀后上机，梯度PCR仪，37℃15min，85℃ 5s，4℃。
试剂 使用量
5×PrimeScript Buffer 2(for real time) 4μl
PrimeScript RT Enzyme Mix 1μl
RT Primer Mix 1μl
②的反应液 10μl
Rnase Free dH2O 4μl
Total：20μl
6.3qPCR反应
①取出样品置冰上，将IL-13、MUC5AC目的基因和18S内参基因的引物从-20℃冰箱中拿出解冻，引物序列如下：
②准备好八连管，每个样品3个复孔；
③在冰上按下列组分配制PCR反应体系：
制备好样品后，短暂离心，使用Bio Rad实时荧光PCR仪进行扩增，反应条件为：
以18S为内参基因，2-ΔΔCt法计算IL-13、MUC5AC的mRNA的相对表达量。
7.肺组织病理形态学分析
7.1苏木精-伊红(HE)染色
①60℃烤片20min；
②脱蜡至水：二甲苯I10min→二甲苯II 10min→无水乙醇I 5min→无水乙醇II5min→95％酒精3min→85％酒精2min→75％酒精1min；
③蒸馏水下冲洗5min；
④苏木精染色3min；
⑤蒸馏水下冲洗2min；
⑥1％盐酸乙醇浸泡1-2s；
⑦蒸馏水下冲洗5min；
⑧0.6％氨水返蓝或碳酸锂返蓝2min(可省略此步骤)，蒸馏水下冲洗2min；
⑨伊红染色10s；
⑩蒸馏水下冲洗，冲刷数次后观察颜色变化；
脱水透明：75％酒精5min→85％酒精5min→95％酒精5min→无水乙醇I 5min→无水乙醇II 5min→二甲苯I 5min→二甲苯II 5min；
晾干，中性树胶封片。
注意事项：HE染色的结果是细胞核呈蓝色，细胞质、肌纤维、胶原纤维和红细胞呈不同程度的红色。用显微镜控制细胞核的苏木素染色质量，HE染片应着色鲜红，红、蓝分明，对比清晰。染色完成后应用洁净的盖玻片和黏稠度适中的中性树胶封片，封盖处内无气泡，无外溢胶。封装完的载玻片应贴上标签，放入切片盒中，在室温条件下储存。使用专业的切片扫描仪将HE染色的结果进行扫描，将数据保存。
7.2计算肺泡平均截距(MLI)
肺组织病理切片经HE染色后，扫片机器扫描，以肺泡平均截距(Mean linearintercept，MLI)代表肺泡腔内径大小，20倍镜下随机选择5个视野，每个视野正中划十字交叉线，计算与十字交叉线相交的肺泡隔数N，测量十字线总长L，按公式MLI＝L/N计算平均肺泡截距，取其平均值以表示平均肺泡腔内径(单位：μm)；肺泡数目以放射状肺泡计数(Radical alveolar counts，RAC)表示，计数方法为：20倍镜下从呼吸性细支气管中心至远端胸膜引一垂直线，该直线上肺泡数量即为RAC，取其平均值以表示肺泡数目。
7.3过碘酸-雪夫(PAS)染色
①60℃烤片20min；
②脱蜡至水：二甲苯I10min→二甲苯II 10min→无水乙醇I 5min→无水乙醇II5min→95％酒精3min→85％酒精2min→75％酒精1min；
③蒸馏水下冲洗5min；
④过碘酸溶液氧化10min，蒸馏水下冲洗3min，甩去多余水分；
⑤雪夫试剂染色15min，蒸馏水下冲洗3min，甩去多余水分；
⑥苏木素复染2min，蒸馏水下冲洗3min，镜检；
⑦脱水透明：75％酒精5min→85％酒精5min→95％酒精5min→无水乙醇I 5min→无水乙醇II 5min→二甲苯I 5min→二甲苯II 5min；
⑧晾干，中性树胶封片。
注意事项：PAS染色的结果是糖原、中性黏液物质呈红色，胞核呈蓝色。雪夫试剂临用前半小时取出恢复室温，溶液出现淡红色时不能使用，雪夫试剂染色的时间随室温而定，夏季室温高，作用10min已足够，冬季室温低，可延长至20min左右。在有效期内已开封的染色液建议在开封后3个月内使用完，每次用后应及时拧紧瓶盖，以免挥发或变质。
8.BALF中白细胞分类计数
8.1迪夫快速染色
①准备好甲醇固定好的BALF切片，A液染色1min；
②磷酸盐溶液洗去A液，B液染色1min；
③蒸馏水洗去B液，镜检，灵活调整染色时间；
④晾干，中性树胶封片；
8.2白细胞分类计数
光学显微镜下进行分类，计算200个细胞(40倍镜下选取5个视野)，计算其中巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞等各占的百分比，并根据细胞总数计算出各类细胞的实际数量。
9.酶联免疫吸附试验(ELISA)
9.1BALF中IL-6、TNF-α、IL-13的测定
按照试剂盒说明书配制1×的包被液、稀释液、捕获抗体、检测抗体、标准品、HRP标记亲和素，测定步骤如下：
①使用ELISA专用的96孔板，加入1×捕获抗体100μl/孔，封口膜密封减少挥发，放置4℃过夜；
②倒掉包被液，加入洗涤液至少250μl/孔，浸泡1min后倒掉，用吸水纸吸干剩余的液体，重复此步骤3次；
③加入稀释液200μl/孔，密封，室温孵育1h；
④倒掉稀释液，加入250μl洗涤液至少洗涤1次；
⑤按要求加入标准品，制作标准曲线；
⑥加入待测样品100μl/孔，空白孔加入100μl稀释液，密封并室温孵育1h或4℃过夜；
⑦重复步骤②，清洗3-5次，加入检测抗体100μl/孔，密封并室温孵育1h；
⑧重复步骤②，清洗3-5次，加入HRP标记亲和素100μl/孔，密封并室温孵育30min；
⑨重复步骤②，清洗5-7次，加入TMB溶液100μl/孔，密封并室温孵育15min；
⑩加入终止液50μl/孔，酶标仪测量450nm处吸光度，根据标准曲线计算待测样品浓度。
9.2BALF中MUC5AC的测定
提前准备好样品稀释液、抗体稀释液和封闭液，根据预实验结果将样品按1:400稀释，一抗按1：500稀释，二抗按1:1000稀释。
①使用ELISA专用的96孔板，加入稀释后的样品100μl/孔，封口膜密封减少挥发，放置4℃过夜；
②倒掉样品，加入洗涤液至少250μl/孔，浸泡1min后倒掉，用吸水纸吸干剩余的液体，重复此步骤3次；
③加入封闭液200μl/孔，密封，室温孵育1h；
④重复步骤②，清洗4次，加入一抗100μl/孔，密封并室温孵育2h；
⑤重复步骤②，清洗4次，加入二抗100μl/孔，密封并室温孵育1h；
⑥重复步骤②，清洗5次，加入TMB溶液100μl/孔，密封并室温孵育15-20min；
⑦加入终止液50μl/孔终止反应，视颜色深浅可提前终止反应，酶标仪测量450nm处吸光度。
三、统计学处理
应用GraphPad Prism 5.0软件进行作图，符合正态分布的计量资料用Mean±SD表示；所有结果用SPSS16.0软件进行统计学分析，两个独立样本均数间的比较采用t检验，多组样本均数间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间进一步的两两比较采用LSD-t检验，P<0.05被认为有统计学意义。
四、实验结果
1.小鼠一般情况
造模开始之前，所有小鼠随机分配到各组，各组小鼠体重没有统计学差异(P>0.05)；造模期间，空白对照组小鼠无死亡，生长状况良好，皮毛有光泽，动作灵活，反应敏捷，进食进水正常，体重升高呈现先快后慢的趋势；模型组、QZYQ-DT低、中、高剂量组小鼠各死亡1只，羧甲司坦组小鼠死亡2只，造模小鼠皮毛枯槁无光，喜撮毛，行动迟缓，反应迟钝，精神萎靡，进食进水减少，从第三周开始体重明显下降，与空白对照组相比有显著的统计学差异(P<0.001)，之后体重增加缓慢；造模结束后各组小鼠体重数值均高于模型组，与模型组相比多糖高剂量组体重增加最明显(P<0.05)，QZYQ-DT低、中剂量组以及羧甲司坦组没有统计学差异(P>0.05)。
表5各组小鼠造模期间的体重变化(体重单位/g)
组别 N 第1天 第3周 第6周 第9周 第12周
空白对照组 10 23.0±0.8 26.8±1.3 29.2±0.6 29.9±1.2 30.8±1.3
模型组 10 23.3±1.6 22.7±1.9*** 23.1±2.0*** 23.5±1.8*** 25.1±1.7***
低剂量组 9 23.3±1.3 22.5±1.3 23.3±1.0 23.7±1.4 25.4±1.3
中剂量组 10 23.2±1.5 22.2±1.3 23.2±1.4 23.6±1.5 25.7±1.4
高剂量组 10 23.8±1.1 22.9±1.1 24.0±1.1 24.2±1.3 26.7±1.7#
羧甲司坦组 8 23.7±0.9 22.8±1.0 23.8±1.1 24.1±1.5 26.3±1.7
与空白对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与模型组相比，#P<0.05。
2.小鼠肝脾肾指数变化
小鼠固定在手术台，打开腹腔，分别摘取小鼠的脾、肝脏和右肾，用滤纸吸干残血后，称重(g)，分别除以小鼠体重(g)，得到脾脏指数、肝脏指数和肾脾脏指数，即脾脏指数＝脾脏重量(g)/小鼠体重(g)；肝脏指数＝肝脏重量(g)/小鼠体重(g)；肾脏指数＝肾脏重量(g)/小鼠体重(g)。模型组及各给药组肝脏指数均较空白对照组增高，差异有统计学意义(P<0.05)，各组间的肾脏指数和脾脏指数均没有统计学差异(P>0.05)，说明香烟烟雾暴露联合LPS气道滴注建立COPD小鼠模型可能有一定的肝损伤，需结合肝脏病理、谷草转氨酶、谷丙转氨酶等血液生化指标综合考虑，其原因有待进一步研究，数据见表6。
表6各组小鼠脏器指数
与空白对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与模型组相比，#P<0.05。
3.全真一气汤多糖延缓COPD模型小鼠肺功能下降
与空白对照组相比，模型组小鼠肺功能参数FRC、TLC、RI、Cchord显著升高(P<0.05)，FEV50/FVC、Cdyn显著降低(P<0.05)。与模型组相比，各给药组RI均下降，FEV50/FVC略有上升，但差异没有统计学意义(P>0.05)，各给药组TLC均显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)，QZYQ-DT高剂量组FRC显著降低，Cdyn显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。
表7各组小鼠肺功能参数FRC、TLC、FEV50/FVC的比较
组别 FRC(ml) TLC(ml) FEV50/FVC(％)
空白对照组 0.5507±0.0852 1.4807±0.1621 0.6387±0.1652
模型组 0.6601±0.0303** 2.0085±0.1383*** 0.4355±0.0555**
QZYQ-DT低剂量组 0.6274±0.0205 1.8446±0.1336# 0.5280±0.0927*
QZYQ-DT中剂量组 0.6077±0.0529 1.8406±0.0876# 0.5314±0.1299*
QZYQ-DT高剂量组 0.5836±0.0735# 1.8262±0.1256# 0.5498±0.0643
羧甲司坦组 0.6232±0.0464 1.8414±0.1195# 0.4784±0.0633*
与空白对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与模型组相比，#P<0.05
表8各组小鼠肺功能参数RI、Cchord、Cdyn的比较
与空白对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与模型组相比，#P<0.05
4.全真一气汤多糖减轻COPD模型小鼠肺气肿
对小鼠肺组织进行HE染色，结果显示空白组肺泡结构正常，无代偿性肺气肿形成，肺泡腔未见炎症细胞浸润；模型组肺泡腔增大，肺泡隔变薄、断裂融合形成肺大泡，代偿性肺气肿形成，局部有炎症细胞浸润，肺泡平均间距增大，与空白对照组相比，模型组肺泡平均间距由41.20±4.70μm增大到80.01±8.38μm，差异有统计学意义(P<0.05)，属典型的肺气肿病理改变。与模型组相比，各给药组肺气肿情况有改善，有少量炎症细胞浸润，平均肺泡间隔缩小，以多糖高剂量组最明显，肺泡平均间距56.88±4.92μm，差异有统计学意义(P<0.05)，说明QZYQ-DT可以改善COPD小鼠肺气肿病理改变，减少局部炎症细胞的浸润从而起到保护肺功能的作用。N＝5，多组样本均数间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，α＝0.05认为有统计学意义。
表9各组小鼠肺泡平均截距
组别 肺泡平均截距(μm)
空白对照组 41.20±4.70
模型组 80.01±8.38***
多糖低剂量组 63.95±5.66##
多糖中剂量组 60.19±9.61###
多糖高剂量组 56.88±4.92###
羧甲司坦组 64.77±7.33##
与空白对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与模型组相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001
5.肺组织PAS染色
如图5，对小鼠肺组织进行PAS染色，气道未见明显阳性结果，各组间没有明显差异，考虑原因可能是因为小鼠肺组织结构与人的肺组织结构有较大差异，同时因为黏液主要由近端支气管杯状细胞、黏膜下腺体分泌，集中在大气道，而本研究病理切片大多为远端气道，黏液分泌细胞较少。
6.全真一气汤多糖降低COPD模型小鼠肺部炎症水平
与空白对照组相比，模型组小鼠肺泡灌洗液中白细胞总数显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)，细胞因子IL-6和TNF-α均显著升高，差异有统计学意义(P<0.001)，而各给药组白细胞计数、IL-6和TNF-α均低于模型组，其中以多糖高剂量降低最明显，差异具有统计学意义(P<0.01)，多糖低剂量组白细胞计数和TNF-α比模型组降低，但没有统计学意义(P>0.05)。
表10各组小鼠BALF炎症水平
组别 白细胞总数(105个/ml) IL-6(pg/ml) TNF-α(pg/ml)
空白组 1.89±1.23 1.323±0.895 5.726±4.143
模型组 11.72±3.20* 10.178±7.087*** 18.810±3.870***
多糖低剂量组 8.88±2.49 1.633±1.161### 16.490±6.259
多糖中剂量组 7.78±2.59# 1.552±1.233### 15.548±7.524
多糖高剂量组 7.29±2.49## 1.399±1.381### 6.901±3.722###
羧甲司坦组 8.16±4.32# 2.001±0.920### 6.263±4.286###
与空白对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与模型组相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001
7.全真一气汤多糖抑制COPD模型小鼠气道黏液高分泌
ELISA结果显示，与空白对照组相比，模型组BALF中黏蛋白MUC5AC含量显著增加(P<0.001)。与模型组相对比，各给药组MUC5AC表达量均减少，差异均有统计学意义(P<0.05)，其中羧甲司坦组减少最为显著(P<0.001)，QZYQ-DT各剂量组中以高剂量组减少最为显著(P<0.001)。
qPCR结果显示，与空白对照组相比，模型组肺组织中黏蛋白MUC5AC的mRNA表达水平明显升高，但差异没有统计学意义(P>0.05)；与模型组相比，各给药组MUC5AC的mRNA表达水平均下降，但差异没有统计学意义(P>0.05)，其中QZYQ-DT组以高剂量降低最为明显。
8.全真一气汤多糖对COPD模型小鼠IL-13/Jak1/Stat6信号通路的影响
qPCR结果显示，与空白对照组相比，模型组IL-13的mRNA表达水平明显升高，但差异没有统计学意义(P>0.05)；与模型组相比，各给药组IL-13的mRNA表达水平均下降，但差异没有统计学意义(P>0.05)；QZYQ-DT低、中、高剂量组均比羧甲司坦组下降明显，其中以低剂量组下降最为明显。
WB结果显示，与空白对照组相比，模型组P-Stat6蛋白表达水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)，给药治疗后可显著降低P-Stat6蛋白的表达(P<0.05)，QZYQ-DT组高剂量组降低最为明显。各组间的Jak1、Satat6蛋白表达水平没有显著差异(P>0.05)。
以上实施方式只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人了解本发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (8)

1.一种治疗慢性阻塞性肺病的全真一气汤多糖，其特征在于，该多糖由摩尔比为1.2：0.95：0.44：2.15：60.72：32.64：1.9的甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖以及阿拉伯糖组成。
2.权利要求1所述的治疗慢性阻塞性肺病的全真一气汤多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
取全真一气汤药材原料熟地黄，麦冬，白术，党参，制附子，牛膝，五味子，粉碎，加总药材5～20倍体积量水煎煮回流提取1～3次，每次1～2h，合并提取液，过滤，滤液减压浓缩得清膏，加入95％乙醇，搅拌均匀后静置沉淀，抽滤沉淀，真空干燥，粉碎得到深棕黄色全真一气汤粗多糖；再用大孔树脂脱色纯化得到全真一气汤多糖。
3.根据权利要求2所述的治疗慢性阻塞性肺病的全真一气汤多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
取全真一气汤药材原料熟地黄30g，麦冬10g，白术10g，党参10g，制附子10g，牛膝10g，五味子6g，粉碎，加总药材8～10倍体积量水煎煮回流提取2～3次，每次1～2h，合并提取液，过滤，滤液减压浓缩得清膏，加入4～8倍体积量的95％乙醇，搅拌均匀后静置沉淀24～48h，抽滤沉淀，于60～80℃中真空干燥，粉碎得到全真一气汤粗多糖；再用大孔树脂脱色纯化得到全真一气汤多糖。
4.根据权利要求3所述的治疗慢性阻塞性肺病的全真一气汤多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取全真一气汤药材原料熟地黄30g，麦冬10g，白术10g，党参10g，制附子10g，牛膝10g，五味子6g，粉碎，加总药材10倍体积量水煎煮回流提取2次，每次1h，合并2次提取液，过滤，滤液减压浓缩至密度约为1.05g/mL的清膏，向其加入4倍体积量的95％乙醇，搅拌均匀后静置沉淀24h，抽滤沉淀，于60℃中真空干燥36h，粉碎得到全真一气汤粗多糖；
(2)取步骤(1)制备得到的全真一气汤粗多糖加水制成浓度20mg/mL的全真一气汤粗多糖溶液，加入预处理好的HPD100大孔树脂，然后调节溶液pH值为5.0，置于摇床中，125r/min，80℃下脱色4h，然后3000～5000r/min离心3～10min，取上清液，浓缩制备得到全真一气汤多糖。
5.权利要求1所述的全真一气汤多糖在制备治疗肺部疾病的药物中的应用。
6.权利要求1所述的全真一气汤多糖在制备治疗肺气肿的药物中的应用。
7.权利要求1所述的全真一气汤多糖在制备治疗慢性阻塞性肺病的药物中的应用。
8.根据权利要求5～7任一项所述的应用，将全真一气汤多糖和药学上可接受的载体制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、合剂、口服液、膏剂、贴剂、喷雾剂剂型的药物。
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