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CN116640201A - 调控MfERF026基因在紫花苜蓿生长发育和耐胁迫中的应用 - Google Patents

调控MfERF026基因在紫花苜蓿生长发育和耐胁迫中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了调控MfERF026基因在紫花苜蓿生长发育和耐胁迫中的应用，属于植物基因工程技术领域。本发明提供了黄花苜蓿ERF转录因子MfERF026基因调控制剂在调控紫花苜蓿生长发育、增强紫花苜蓿耐旱性和耐冷性中的应用。黄花苜蓿ERF转录因子MfERF026基因在紫花苜蓿中抑制表达可使紫花苜蓿耐旱性和耐冷性增强；黄花苜蓿ERF转录因子MfERF026基因在紫花苜蓿中抑制表达，可以达到调控紫花苜蓿生长的效果，加快紫花苜蓿的生长速率，使叶片数量增多。MfERF026基因抑制表达为培育高抗、高产和高蛋白的豆科牧草新品种提供新的理论基础和候选基因。

Description

调控MfERF026基因在紫花苜蓿生长发育和耐胁迫中的应用
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及调控MfERF026基因在紫花苜蓿生长发育和耐胁迫中的应用。
背景技术
转录因子（transcription factor，TF）也称反式作用因子，是能够与真核基因启动子区域中的顺式作用元件发生特异性相互作用的DNA结合蛋白，通过他们之间以及与其他相关蛋白质间的相互作用，激活或抑制其靶基因的转录。近年来，相继从高等植物中分离出一系列调控干旱、低温、高盐、激素、病源反应及发育等相关基因表达的转录因子。AP2/EREBP乙烯应答元件结合蛋白转录因子家族是广泛存在于植物中的一个超大转录因子家族，家族成员在植物的生长发育、器官构建、逆境胁迫及激素信号应答中发挥重要调控作用。
紫花苜蓿（Medicago sativa L.）蛋白质含量高，维生素种类丰富，所调制的饲料口感极好，为各种家畜所喜食，是我国种植面积最广的人工牧草之一。因此紫花苜蓿的种植对经济、环境、农业的可持续发展均有长远意义。而长期的干旱条件，往往对紫花苜蓿的生长产生不利影响，进而降低紫花苜蓿的存活率，影响紫花苜蓿的产量等。
目前改良紫花苜蓿新品种的技术缺乏，如果能通过分子遗传学与基因编辑等技术手段改善紫花苜蓿抗旱能力和增加紫花苜蓿的生长速率，将极大促进紫花苜蓿在生产中的应用，而如何实现对紫花苜蓿耐旱能力的技术较为缺乏。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的提供一种ERF转录因子MfERF026基因调控制剂在调控紫花苜蓿生长发育、耐旱性和耐冷性中的应用。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了黄花苜蓿ERF转录因子MfERF026基因调控制剂在促进紫花苜蓿生长发育、提高紫花苜蓿耐旱性和提高紫花苜蓿耐冷性中的任一种或者两种以上中的应用，所述MfERF026基因编码的蛋白质包括如下A1~A4中的任一种；
A1、氨基酸序列为SEQ ID NO.2的蛋白质；
A2、将A1经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
A3、与A1或A2所限定的氨基酸序列具有80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
A4、在A1~A3中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。
优选的，所述MfERF026基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述调控制剂包括沉默或降低所述MfERF026基因表达的制剂。
优选的，降低MfERF026基因表达制剂包括MfERF026基因表达的干扰RNA。
本发明提供了一种tasiRNA，所述tasiRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。
本发明提供了一种基于上述技术方案所述tasiRNA得到的降低MfERF026基因表达的碱基片段，所述碱基片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。
本发明提供了一种用于扩增上述技术方案所述碱基片段的引物对，所述引物对包括上游引物MfERF026 RNAi-F和下游引物MfERF026 RNAi-R；所述上游引物MfERF026 RNAi-F如SEQ ID NO.14所示，所述下游引物MfERF026 RNAi-R如SEQ ID NO.15所示。
本发明提供了一种降低MfERF026基因表达的表达载体，所述表达载体包括上述技术方案所述的碱基片段。
本发明提供了一种基于上述技术方案所述表达载体构建得到的工程菌。
本发明提供了一种转基因紫花苜蓿的构建方法，包括以下步骤：
将上述技术方案所述工程菌侵染紫花苜蓿叶片，得到转化后的紫花苜蓿叶片；
将转化后的紫花苜蓿叶片进行组织培养，得到MfERF026基因抑制表达的转基因紫花苜蓿。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种黄花苜蓿ERF转录因子MfERF026基因调控制剂在促进紫花苜蓿生长发育、提高紫花苜蓿耐旱性和提高紫花苜蓿耐冷性中的任一种或者两种以上中的应用，所述MfERF026基因编码的蛋白质包括如下A1~A4中的任一种；A1、氨基酸序列为SEQ IDNO.2的蛋白质；A2、将A1经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；A3、与A1或A2所限定的氨基酸序列具有80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；A4、在A1~A3中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。
本发明采用转基因技术，将抑制MfERF026基因表达的表达载体整合到紫花苜蓿基因组，初步定向改变紫花苜蓿发育和抗旱性以及耐冷性。
在本发明中，所述黄花苜蓿ERF转录因子MfERF026基因在紫花苜蓿中抑制表达可使紫花苜蓿耐旱性增强。本发明通过抑制MfERF026基因的表达，可以提高紫花苜蓿在干旱条件下的存活率，减小干旱条件下紫花苜蓿的细胞膜损伤程度，使其保持在正常水平，进而提高紫花苜蓿的抗旱能力。在发明中，所述黄花苜蓿ERF转录因子MfERF026基因在紫花苜蓿中抑制表达可使紫花苜蓿耐冷性增强。本发明通过抑制MfERF026基因的表达，可以提高紫花苜蓿的-7℃~-8℃条件下的存活率和降低-7℃~-8℃低温条件对紫花苜蓿细胞膜的损伤，进而提高紫花苜蓿的耐冷性。在本发明中，所述黄花苜蓿ERF转录因子基因在紫花苜蓿中抑制表达可促进紫花苜蓿生长发育，使紫花苜蓿生长速率加快和/或叶片增多。本发明通过抑制紫花苜蓿中MfERF026基因的表达，可以达到调控紫花苜蓿生长的效果。通过抑制紫花苜蓿中MfERF026基因的表达可以加快紫花苜蓿的生长速率，使紫花苜蓿叶片数量增多。综上，MfERF026基因抑制表达使紫花苜蓿株高增加，分蘖数增加，三叶数增加，耐旱性和耐冷性增强，为培育高抗、高产、高蛋白的豆科牧草新品种提供新的理论基础和候选基因。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为黄花苜蓿中MfERF026在低温胁迫条件下的相对表达情况图；
图2为黄花苜蓿中MfERF026在盐胁迫条件下的相对表达情况图；
图3为黄花苜蓿中MfERF026在干旱胁迫条件下的相对表达情况图；
图4为黄花苜蓿中MfERF026在ABA胁迫条件下的相对表达情况图；
图5为MfERF026蛋白亚细胞定位实验中激光共聚焦显微镜观察结果图；
图6为转录激活实验中，MfERF026基因5种不同目的片段融合表达载体的酵母转化子在不同培养基上的培养结果图；
图7为MfERF026的转基因株系验证结果图；
图8为转基因株系#26和#29以及野生型紫花苜蓿的生长情况图；
图9为野生型植株和转基因植株#26和#29的株高、分蘖数、三叶数和分节数统计结果图；
图10为野生型植株和转基因植株#26和#29单叶重量、单叶面积和单叶比叶重统计结果图；
图11为野生型植株和转基因植株#26和#29单叶长度、单叶宽度和单叶长宽比统计结果图；
图12为耐旱试验前野生型植株和转基因植株的生长状态图；
图13为干旱胁迫3周时野生型植株和转基因植株的生长状态图；
图14为复水一周时野生型植株和转基因植株的生长状态图；
图15为耐旱性试验存活率统计结果图；
图16为干旱胁迫前和干旱胁迫后的电导率统计结果图；
图17为MfERF026干旱胁迫生理生化指标测定结果图；
图18为野生型和转基因株系的耐冷性试验过程中植株的生长情况图；
图19为野生型和转基因株系的耐冷性试验存活率结果图；
图20为野生型和转基因株系的耐冷性试验电导率检测结果图。
具体实施方式
本发明提供了黄花苜蓿ERF转录因子MfERF026基因调控制剂在促进紫花苜蓿生长发育、提高紫花苜蓿耐旱性和提高紫花苜蓿耐冷性中的任一种或者两种以上中的应用，所述MfERF026基因编码的蛋白质包括如下A1~A4中的任一种；
A1、氨基酸序列为SEQ ID NO.2的蛋白质；
A2、将A1经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
A3、与A1或A2所限定的氨基酸序列具有80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
A4、在A1~A3中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。
在本发明中，所述MfERF026基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体如下：
MNSSTIEQPHNSETKSSSNSSPPPPPSQSLQIKGIRDTSKHPVYRGVRMRNWGKWVSEIREPKKKSRIWLGTFPTPEMAARAHDVAALSIKGSAAILNFPELVNLLPRPASLAPRDIQAAATKAAHMEFPSSTASYELTEIIELPRLGNVGDFGKEFVFMDSIDTSWMFQPPCLQTMEDAIWSDIYNNYS。
在本发明中，MfERF026蛋白定位于细胞核中；MfERF026蛋白的C端具有转录激活活性。
在本发明中，所述MfERF026基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.1所示，具体如下：
5’-ATGAATAGTAGTACTATTGAACAACCTCATAACTCAGAAACCAAGAGTAGCTCAAATTCATCACCACCACCACCACCATCACAATCCCTACAAATAAAAGGCATAAGAGACACAAGCAAGCATCCAGTATACCGTGGTGTCCGAATGCGAAATTGGGGAAAATGGGTGTCCGAAATTCGTGAGCCTAAGAAAAAATCCCGAATATGGCTCGGCACATTTCCCACACCAGAAATGGCAGCTCGAGCACACGATGTAGCTGCTCTTAGTATAAAAGGAAGCGCCGCCATTCTCAACTTCCCTGAGTTAGTAAACTTGCTTCCTCGTCCGGCTTCACTCGCTCCCCGTGATATTCAAGCAGCCGCTACCAAAGCCGCTCACATGGAGTTTCCATCTTCAACAGCTTCATATGAATTGACTGAGATAATTGAGCTTCCTCGTTTGGGAAACGTTGGAGATTTTGGAAAGGAGTTTGTATTTATGGATTCCATTGATACTTCGTGGATGTTTCAGCCTCCTTGCTTGCAAACCATGGAAGATGCGATTTGGAGTGACATTTATAATAACTATAGCTAG-3’。
在本发明中，所述调控制剂优选包括沉默或降低所述MfERF026基因表达的制剂。本发明所述降低MfERF026基因表达的制剂优选包括MfERF026基因表达的干扰RNA。
本发明所述提高紫花苜蓿耐旱性包括提高干旱条件下紫花苜蓿的存活率和/或减小干旱条件下紫花苜蓿的细胞膜损伤程度。本发明通过降低MfERF026基因表达，可以提高紫花苜蓿的耐旱性，提高紫花苜蓿在干旱条件下的存活率，能够使干旱条件下紫花苜蓿的电导率保持较低水平，减小干旱条件下紫花苜蓿的细胞膜损伤程度。
本发明所述提高紫花苜蓿耐冷性包括提高寒冷条件下紫花苜蓿的存活率和/或减小寒冷条件下紫花苜蓿的细胞膜损伤程度。本发明通过降低MfERF026基因表达，可以提高紫花苜蓿的-7℃~-8℃条件下的存活率和降低-7℃~-8℃低温条件对紫花苜蓿细胞膜的损伤，进而提高紫花苜蓿的耐冷性。
在本发明中，所述促进紫花苜蓿生长发育优选包括促进紫花苜蓿生长和/或使紫花苜蓿叶片增多。本发明通过降低MfERF026基因的表达可以促进紫花苜蓿的生长，使紫花苜蓿株高增加，分蘖数和分节数增加，同时能够使三叶数增加。
本发明提供了一种tasiRNA，所述tasiRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，具体为：5’-TTCAGAGGTGAAGACACACGTA-3’。
本发明提供了一种上述技术方案所述tasiRNA在抑制MfERF026基因表达中的应用。在本发明中，所述tasiRNA可以把MfERF026基因的mRNA降解，通过阻断MfERF026蛋白的形成，进而完成MfERF026基因的抑制表达。在本发明中，所述tasiRNA优选与靶基因片段连接后，导入紫花苜蓿中发挥抑制靶基因表达的效果。在本发明中，所述tasiRNA优选连接于靶基因片段的5’端之前；所述靶基因片段优选为靶基因3’端300bp左右的序列。本发明所述tasiRNA除能降低MfERF026基因表达外，还可以对其他基因有干扰表达效果。
本发明提供了一种基于上述技术方案所述tasiRNA得到的降低MfERF026基因表达的碱基片段，所述碱基片段的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.17所示。本发明提供的所述碱基片段抑制表达MfERF026基因的效率为87%~99%，有明显的抑制表达作用。
本发明提供了一种用于扩增上述技术方案所述碱基片段的引物对。在本发明中，所述引物对优选包括上游引物MfERF026 RNAi-F和下游引物MfERF026 RNAi-R；所述上游引物MfERF026 RNAi-F的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.14所示，具体为：5’-CGGGATCCTTCAGAGGTGAAGACACACGTAGATGTAGCTGCTCTTAGTAT-3’；所述下游引物MfERF026 RNAi-R的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.15所示，具体为：5’-GCTCTAGACTAGCTATAGTTATTATAAATG-3’所示。在本发明中，所述碱基片段包括BamH I和Xba I限制性内切酶酶切位点，方便与表达载体连接。
在本发明中，所述上游引物MfERF026 RNAi-F中带有上述技术方案所述tasiRNA。本发明优选以黄花苜蓿cDNA为模板通过MfERF026 RNAi-F和MfERF026 RNAi-R获得SEQ IDNO.17所示的碱基片段。在本发明中，所述碱基片段为带有tasiRNA的MfERF026基因的片段。所述碱基片段能够实现降低MfERF026基因的表达。
本发明提供了一种降低MfERF026基因表达的制剂，所述制剂包括上述技术方案所述的碱基片段的表达盒、载体或转基因细胞中的一种或两种以上。
本发明提供了一种降低MfERF026基因表达的表达载体，所述表达载体包括上述技术方案所述的碱基片段。在本发明中，所述表达载体优选包括pCAM1307质粒。
本发明提供了一种基于上述技术方案所述降低MfERF026基因表达的表达载体构建得到的工程菌。在本发明中，所述工程菌优选包括农杆菌EHA105。
本发明提供了一种转基因紫花苜蓿的构建方法，包括以下步骤：
将上述技术方案所述工程菌侵染紫花苜蓿叶片，得到转化后的紫花苜蓿叶片；
将转化后的紫花苜蓿叶片进行组织培养，得到MfERF026基因抑制表达的转基因紫花苜蓿。
本发明将上述技术方案所述工程菌侵染紫花苜蓿叶片，得到转化后的紫花苜蓿叶片。
在本发明中，所述工程菌优选将上述技术方案所述抑制MfERF026基因表达的表达载体转化工程菌，筛选阳性工程菌，得到工程菌。
在本发明中，所述抑制MfERF026基因表达的表达载体优选包括重组质粒pCAM1307-RNAi-MfERF026。在本发明中，所述工程菌优选包括农杆菌EHA105。本发明对所述表达载体转化农杆菌的方法没有特殊限定，采用本领域常规转化方法均可。本发明所述转化方法优选包括液氮速冻和热激；所述液氮速冻的时间优选为2min；所述热激的时间优选为30s。转化完成后，本发明优选筛选阳性菌落，得到阳性农杆菌。本发明筛选阳性菌落的方法优选包括将转化后的农杆菌初代培养后，进行固体培养。本发明进行初代培养的培养基优选为YEB培养基；所述初代培养的温度优选为28℃；所述初代培养的时间优选为4h，所述初代培养优选在190rpm条件下进行。初代培养完成后，本发明优选将所述农杆菌进行固体培养。本发明所述固体培养的培养基优选为含有卡那霉素和利福平的YEB固体培养基；所述YEB固体培养基中卡那霉素的质量浓度优选为50mg/L，利福平的质量浓度优选为75mg/L。本发明所述固体培养的温度优选为28℃，所述固体培养的时间优选为2d。本发明所述固体培养的方式优选为倒置培养。培养完成后，筛选得到的菌落即为阳性菌落；所述阳性菌落即为阳性工程菌，简称为工程菌。
得到阳性工程菌后，本发明将阳性工程菌侵染紫花苜蓿叶片，得到转化后的紫花苜蓿叶片。
得到阳性工程菌后，本发明优选将阳性菌落进行扩大培养。本发明扩大培养用培养基优选为YEB培养基。本发明所述扩大培养的温度优选为28℃。本发明优选通过扩大培养得到OD600值为0.6~0.8的农杆菌菌液。得到农杆菌菌液后，本发明优选通过离心后弃上清，收集阳性农杆菌菌体。本发明所述离心的转速优选为2400rpm；所述离心的时间优选为15min。得到阳性农杆菌菌体后，本发明优选重悬农杆菌菌体，得到农杆菌侵染液。本发明优选使用含100µmol/L乙酰丁香酮的SH3α液体培养基重悬农杆菌菌体。
得到农杆菌侵染液后，本发明优选通过农杆菌侵染液侵染紫花苜蓿叶片，得到转化后的紫花苜蓿叶片。本发明所述紫花苜蓿叶片优选为中苜一号叶片，更优选为培育4~6周生长状态良好的叶片。本发明优选通过EHA105介导的叶盘法转化紫花苜蓿。在进行转化前，本发明优选将紫花苜蓿叶片依次进行清洗和灭菌，得到预处理的紫花苜蓿叶片。本发明所述清洗优选采用超纯水进行清洗。清洗完成后，本发明优选进行灭菌。本发明所述灭菌优选采用次氯酸漂洗液和Tween-20混合溶液进行。在本发明中，所述次氯酸漂洗液中次氯酸的质量百分含量优选为7%。在本发明中，所述Tween-20和次氯酸漂洗液的体积比优选为1:3000。本发明所述灭菌的时间优选为10~13min。得到预处理的紫花苜蓿叶片后，本发明优选将预处理的紫花苜蓿叶片和农杆菌侵染液进行混合，得到紫花苜蓿侵染体系。得到紫花苜蓿侵染体系后，本发明优选对紫花苜蓿侵染体系进行真空渗透。本发明进行真空渗透的压强优选为0.08~0.09MPa；所述真空渗透的时间优选为10min。真空渗透完成后，本发明优选弃置农杆菌悬液，在灭菌滤纸上吸除叶片表面的农杆菌，得到转化后的紫花苜蓿叶片。
得到转化后的紫花苜蓿叶片后，本发明优选将转化后的紫花苜蓿叶片进行组织培养，得到MfERF026基因抑制表达的转基因紫花苜蓿。
本发明优选在共培养基上对转化后的紫花苜蓿进行暗培养，得到初培养外植体。本发明所述暗培养的温度优选为24℃；所述暗培养的时间优选为24~30h。得到初培养外植体后，本发明优选将初培养外植体移入选择培养基上进行继代培养，得到愈伤组织。本发明所述继代培养的温度优选为24℃；所述继代培养优选每2周继代一次；所述继代培养的时间优选为5~6周。本发明所述继代培养优选培养至愈伤组织形成。本发明所述继代培养过程优选进行暗培养。
得到愈伤组织后，本发明优选将愈伤组织转移至MSBK培养基上进行胚状体培养。本发明所述胚状体培养的时间优选为10~14d。本发明胚状体培养优选培养至出现绿色胚状体；所述胚状体培养的光照强度优选为150µmol/m2/s，所述胚状体培养的温度优选为20℃~24℃，所述胚状体培养的光暗比优选为16h:8h。胚状体培养完成后，得到出现绿色胚状体的愈伤组织。得到绿色胚状体愈伤组织后，本发明优选将绿色胚状体愈伤组织进行芽分化培养。本发明所述芽分化培养优选在SH9培养基中进行。本发明所述芽分化培养的光照强度优选为150µmol/m2/s，所述芽分化培养的温度优选为20℃~24℃，所述芽分化培养的光暗比优选为16h:8h；所述芽分化培养过程中优选每3~4周继代一次；所述芽分化培养的时间优选为6~8周。芽分化培养完成时，得到长出2~3片完全展开的三片叶植株，简称为三片叶植株。得到三片叶植株后，本发明优选将三片叶植株进行生根培养，得到生根幼苗。本发明所述生根培养优选在MSO培养基中进行。本发明所述生根培养的光照强度优选为150µmol/m2/s，所述生根培养的温度优选为20℃~24℃，所述生根培养的光暗比优选为16h:8h，所述生根培养的时间优选为1个月。若生长健壮的苗一个月难以生根，本发明优选在MSO培养基中添加IAA促进生根。在本发明中，所述IAA的添加量优选为1mg/L。
得到生根幼苗后，本发明优选将生根幼苗进行炼苗。本发明所述炼苗优选在蛭石和珍珠岩体积比为1:1的土壤基质中进行。本发明所述炼苗的光照强度优选为150µmol/m2/s；所述炼苗的温度优选为20℃~24℃；所述炼苗的光暗比优选为16h:8h；所述炼苗的时间优选为1~2周。炼苗完成后，本发明优选将幼苗移栽至营养土和蛭石体积比为1:1的基质中进行培养，得到MfERF026基因抑制表达转基因紫花苜蓿。
本发明构建得到的转基因紫花苜蓿中通过将抑制MfERF026基因表达载体整合到紫花苜蓿基因组中，初步定向改变紫花苜蓿发育情况和抗旱性以及抗冷性。MfERF026基因抑制表达使紫花苜蓿株高增加，分蘖数和分节数增加，三叶数增加，耐旱性和抗冷性增强，为培育高抗、高产、高蛋白的豆科牧草新品种提供新的理论基础和候选基因。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明使用的培养基如下：
所述基本培养基组分如下：MgSO4·7H2O 185mg/L、KNO3 2830 mg/L、(NH4)2SO4 463mg/L、CaCl2·2H2O 166mg/L、KH2PO4 400 mg/L、MnSO4·H2O 10mg/L、H3BO35.0 mg/L、ZnSO4·7H2O 1.0mg/L、KI 1.0mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.1mg/L、CuSO4·5H2O 0.2mg/L、CoCl2·6H2O 0.1mg/L、EDTA-FeNa 140mg/L、盐酸硫胺素5.0mg/L、盐酸比哆醇5.0mg/L、烟酸5.0mg/L和肌醇100mg/L；所述基本培养基的pH 5.8～6.0。
所述共培养的培养基除基本培养基外，还仅含有：蔗糖30g/L、乙酰丁香酮100µmol/L、2,4-D 4mg/L、6-BA 0.5mg/L和植物凝胶3g/L。
所述愈伤组织培养的培养基（继代培养用培养基）除基本培养基外，还仅含有：蔗糖30g/L、2,4-D 4mg/L、6-BA 0.5mg/L、特美汀 200mg/L、潮霉素B10mg/L和植物凝胶3g/L。
所述胚状体诱导的培养基（MSBK培养基）以MS培养基为基本培养基，还仅含有：蔗糖30g/L、激动素1mg/L、6-BA0.5mg/L、特美汀 150mg/L、潮霉素B 5mg/L和植物凝胶3g/L，pH5.8～6.0。
所述胚状体分化的培养基（SH9培养基）除基本培养基外，还仅含有：蔗糖20g/L、Timetin 150mg/L、潮霉素B 5mg/L和植物凝胶3g/L，pH 5.8～6.0。
所述生根培养的培养基以MS培养基为基本培养基，还仅含有：蔗糖10g/L和植物凝胶3g/L，pH 5.8～6.0。
SH3α培养基组分如下：N6大量元素100mL；SH微量盐1mL；SH维生素1mL；肌醇100mg；蔗糖 30g；10mg/mL 2,4-D 0.4mL；1mg/mL 6-BA 0.5mL；100mM AS乙酰丁香酮 1mL；400mg/mL TMT 0.5mL；50mg/mL Hyg（潮霉素） 200µL；植物凝胶3g，水定容至1L；该培养基的pH为5.8。
N6大量元素：MgSO4·7H2O 1.85g/L、KNO3 28.3g/L、(NH4)2SO4 4.63g/L、CaCl2·2H2O 2.475g/L、KH2PO4 4g/L。
SH微量盐：MnSO4·H2O 1g/L、H3BO3 0.5 g、ZnSO4·7H2O 0.1g、KI 0.1g、Na2MoO4·2H2O 0.01g和H2O 100mL。
SH维生素：烟酸0.5g、盐酸硫胺素B1 0.5g、盐酸吡哆醇B6 0.5g和H2O 100mL。
实施例1
黄花苜蓿MfERF026转录因子的获取。
总RNA的提取材料为250mmol/L NaCl盐胁迫处理24h后的黄花苜蓿野生型植株茎组织。
总RNA的提取方法：采用液氮研磨法，使用Takara生物公司的Trizol RNA提取试剂提取。
cDNA合成：按照Takara生物公司的反转录试剂盒（6210A）说明书反转录合成cDNA。
以MfERF026-F和MfERF026-R为引物按照PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase试剂盒（TAKARA，Code No. R050A）说明书进行RT-qPCR操作，引物信息具体如表1所示。
表1扩增MfERF026基因用引物信息
PCR反应条件为：预变性95℃，5min；变性98℃，10s；退火51℃，30s；延伸68℃，1min，变性至延伸30个循环；后延伸68℃，10min；4℃保存。
PCR反应结束后，使用生工生物工程股份有限公司的SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收目的片段（产物约700bp），按照试剂盒说明书的方法进行操作。
将回收得到的目的片段进行测序，将测序结果经过序列比对得到黄花苜蓿MfERF026基因CDS序列。MfERF026基因CDS的核苷酸如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQID NO.2所示。
实施例2
黄花苜蓿MfERF026基因的表达模式分析
植物材料选择正常生长30d的野生型黄花苜蓿。
4℃低温胁迫处理方法为：将黄花苜蓿置于4℃植物低温培养箱中胁迫处理0h、2h、4h、8h、24h、48h。
盐胁迫处理方法为：将黄花苜蓿以250mM NaCl溶液中胁迫处理0h、2h、4h、8h、24h、48h。
干旱胁迫处理方法：将黄花苜蓿以100mM甘露醇溶液中胁迫处理0h、2h、4h、8h、24h、48h。
ABA胁迫处理方法为：将黄花苜蓿以100µM ABA溶液胁迫处理0h、2h、4h、8h、24h、48h。
在不同胁迫时间点将黄花苜蓿根茎叶组织分离后用锡箔纸包好，标记后（胁迫条件、胁迫时间、组织类型）液氮速冻，于-80℃保存。
将上述胁迫处理条件下的黄花苜蓿分别提取RNA，经逆转录获得cDNA，以此cDNA为模板，以MfERF026 DL-F和MfERF026 DL-R为引物，按照TAKARA生物公司荧光定量试剂盒（RR047Q）说明书进行RT-qPCR操作。同时，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）基因（GenBank登录号GQ398120）作为Q-PCR内参基因。MfERF026 DL-F和MfERF026 DL-R引物序列以及内参基因的引物序列如表2所示。
表2引物信息
通过RT-qPCR结果计算MfERF026相对表达量，MfERF026相对表达量使用2-△△Ct公式方法进行计算。
通过RT-qPCR得到MfERF026在低温胁迫条件下的相对表达情况如图1所示。通过RT-qPCR得到MfERF026在盐胁迫条件下的相对表达情况如图2所示。通过RT-qPCR得到MfERF026在干旱胁迫条件下的相对表达情况如图3所示。通过RT-qPCR得到MfERF026在ABA胁迫条件下的相对表达情况如图4所示。
由图1~图4得，MfERF026基因在低温、盐、干旱和ABA处理下都有明显的表达，在干旱胁迫中表达量最高，对渗透胁迫响应较显著，其在植物根、茎、叶中的表达量有差别，其表达量随着时间的变化均有或升高或降低的明显变化，说明MfERF026基因响应低温、盐、干旱和ABA处理。
实施例3
黄花苜蓿MfERF026基因的亚细胞定位分析
1.构建重组质粒pBE-GFP-MfERF026
采用实施例1中的方法获取黄花苜蓿的cDNA。
按照全式金生物公司pEASY®-Blunt试剂盒（CB101-01）说明书，将MfERF026基因cDNA连接到pEASY®-Blunt载体。
使用MfERF026 PBE-F和MfERF026 PBE-R引物对进行PCR，获得带有BamH I和Sal I酶切位点的MfERF026全长cDNA。MfERF026 PBE-F和MfERF026 PBE-R引物对序列如表3所示。
表3MfERF026 PBE-F和MfERF026 PBE-R引物信息
PCR反应体系如表4所示。
表4PCR反应体系
PCR条件为：预变性98℃,5min；变性98℃,10s；退火60℃,30s；延伸68℃,1min，变性至延伸30个循环；后延伸68℃,10min；4℃保存。
PCR反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，通过条带的大小判断得到目的片段。
PCR反应结束后，使用生工生物工程股份有限公司的SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒按照试剂盒说明书的方法回收MfERF026目的片段（产物约470bp）。
将pBE空载质粒用BamH I和Sal I进行双酶切，酶切体系如表5所示。
表5酶切体系
按酶切体系混匀后37℃酶切1h。酶切反应结束后，使用生工生物工程股份有限公司的SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒按照试剂盒说明书的方法回收线性化质粒载体。
使用TaKaRa公司的In-Fusion® HD Cloning Kit试剂盒进行目的片段和pBE载体的同源重组连接。将连接产物转化大肠杆菌DH5α，经菌落PCR检测后送测序，对测序验证的阳性克隆扩大培养，提取质粒备用。
2.重组质粒pBE-GFP-MfERF026转化农杆菌GV3101
吸取5µL浓度为100ng/µL的重组质粒pBE-GFP-MfERF026和空载pBE-GFP，加入到50µL农杆菌GV3101感受态细胞中。轻轻混匀后冰上静置5min，液氮5min，转移到37℃水浴热激5min，冰水浴5min，在超净工作台中加入平衡至室温的LB液体培养基700µL，于28℃、200rpm条件下培养2h。
培养完成后，6000rpm离心1min，弃上清500µL，使用移液器吹打剩余液体，以达到重悬浮菌体的目的，方便下一步涂布。吸取80µL剩余液体涂布于含有50mg/L Kan（卡那霉素）、50mg/L genta（庆大霉素）、25mg/L Rif（利福平抗生素）的LB固体培养基上，28℃倒置培养36~48h，直至长出单菌落。
3.注射侵染本式烟草叶片下表皮
挑取阳性农杆菌GV3101单菌落于含Kan、Gent和Rif的YEB液体培养基，28℃振荡培养24h。
培养完成后，取500µL菌液加至含500µL 1M MES（2-（N-吗啡林）乙磺酸）和5µL200mM AS（乙酰丁香酮，利于农杆菌侵染烟草叶片）的40 mL YEB三抗（Kan、Gent和Rif）液体培养基中，28℃振荡培养至OD600值在1.2~1.5之间。
培养完成后，采用离心的方法收集菌体（4℃，8000rpm，离心10min），收集的菌体中加入侵染液（每100mL ddH2O中含1mL 1M MES、1mL 1M MgCl2和100µL 200mM AS）重悬，使OD600值为1.0，黑暗静置4h后注射4周龄烟草叶片下表皮，置于植物组培室培养36h。
4.激光共聚焦显微镜观察叶片荧光
剪取侵染部位的烟草叶片，置于培养皿中，将DAPI滴于叶片上，染色20min后用PBS缓冲液清洗两次，每次20min。将染色后的叶片正面朝上置于载玻片上，用激光共聚焦显微镜观察。
亚细胞定位实验中激光共聚焦显微镜观察结果图如图5所示。
由图5可得，与MfERF026融合的GFP的荧光信号与DAPI共定位，表明MfERF026基因定位于细胞核中。
实施例4
黄花苜蓿MfERF026基因的转录激活实验分析
采用实施例1中的方法获取黄花苜蓿的cDNA。
按照全式金生物公司pEASY®-Blunt试剂盒（CB101-01）说明书，将MfERF026基因cDNA连接到pEASY®-Blunt载体。
使用不同的引物分别获得MfERF026全长（a）、N端＋ERF结构域（b）、ERF结构域（c）、ERF结构域＋C端（d）、C端（e）5个片段，具有使用的引物信息如表6所示。
表6编码MfERF026全长、N端＋ERF结构域、ERF结构域、ERF结构域＋C端、C端5个片段的引物信息
使用表6所示引物分别进行PCR，分别获得编码MfERF026全长（a）、N端＋ERF结构域（b）、ERF结构域（c）、ERF结构域＋C端（d）、C端（e）5个片段。5个片段具体如图6中的A所示。
PCR反应体系如表7所示。
表7PCR反应体系
PCR反应程序为：预变性98℃，5min；变性98℃，30s；退火60℃，30s；延伸68℃，1min30s，变性至延伸30个循环；后延伸68℃，10min；16℃，10min。
将MfERF026全长（a）、N端＋ERF结构域（b）、ERF结构域（c）、ERF结构域＋C端（d）、C端（e）5个片段分别插入pGBKT7载体，构建融合表达载体。
构建融合表达载体
（1）PCR反应结束后，使用生工生物工程股份有限公司的SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收目的片段，按照试剂盒说明书的方法进行操作。
（2）将pBE空载质粒用BamH I和Not I进行双酶切，酶切体系如表8所示。
表8酶切体系
按酶切体系混匀后37℃酶切1h。酶切反应结束后，使用生工生物工程股份有限公司的SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收线性化质粒载体，按照试剂盒说明书的方法进行操作。
（3）按照目的片段与载体的摩尔比为（3~10）:1的比例，将上述目的片段基因片段连接至pGBKT7线性化载体上，然后转化至大肠杆菌感受态细胞DH5ɑ，涂板后挑取阳性克隆进行PCR检测。对测序验证的阳性克隆扩大培养，提取质粒备用。
将5个融合表达载体分别转入AH109酵母，5种融合表达载体的酵母转化子分别培养于SD/-Trp培养基（酵母缺陷型培养基，SD培养基中缺少色氨酸）和添加X-α-gal的SD/-Trp/-His/-Ade（SD培养基中缺少色氨酸、组氨酸、腺嘌呤）培养基中。
5种融合表达载体的酵母转化子在不同培养基上的培养结果如图6中的B所示。
由图6可得，5种融合表达载体的酵母转化子在SD/-Trp培养基上生长良好，而在添加X-α-gal的SD/-Trp/-His/-Ade培养基上仅有a和e观察到蓝色的酵母菌落，表明β-半乳糖苷酶报告基因已被转录激活，表现良好的活性。结果证明MfERF026蛋白具有转录激活活性，转录激活域位于C端。
实施例5
抑制表达MfERF026转基因紫花苜蓿的获取
1.抑制表达载体pCAM1307-RNAi-MfERF026的构建
采用实施例1中的方法获取黄花苜蓿的cDNA。
使用MfERF026 RNAi-F和MfERF026 RNAi-R进行PCR（引物扩增片段如图7中的A所示），获得带有BamH I和Xba I酶切位点的RNAi-MfERF026全长cDNA，PCR反应体系和PCR条件同实施例3。MfERF026 RNAi-F和MfERF026 RNAi-R引物对信息如表9所示，扩增得到的目的片段如SEQ ID NO.17所示。
表9MfERF026 RNAi-F和MfERF026 RNAi-R引物序列信息
PCR反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，通过条带的大小判断目的片段。
PCR反应结束后，使用生工生物工程股份有限公司的SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收目的片段（产物约330bp），按照试剂盒说明书的方法进行操作。
用BamH I和Xba I双酶切空载质粒pCAM1307（以下简称p1307），酶切体系如表10所示。
表10质粒酶切体系
按酶切体系混匀后37℃酶切1h。酶切反应结束后，使用生工生物工程股份有限公司的SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收线性化质粒载体，按照试剂盒说明书的方法进行操作。
按照目的片段与载体的摩尔比为（3~10）:1的比例，将上述目的片段基因片段连接至p1307线性化载体上，然后转化至大肠杆菌感受态细胞DH5ɑ，涂板后挑取阳性克隆进行PCR检测。对测序验证的阳性克隆扩大培养，提取质粒备用。
2.抑制表达载体pCAM1307-RNAi-MfERF026转化农杆菌EHA105
吸取5µL浓度为100ng/µL的抑制表达载体pCAM1307-RNAi-MfERF026加入到50µLEHA105感受态中。液氮速冻2min，42℃热激30s，加入600µL YEB液体培养基，28℃，190rpm培养4h。
培养完成后，取80µL菌液涂布于含卡那霉素（50mg/L）和利福平（75mg/L）的YEB固体培养基上，28℃，倒置培养2d。
培养完成后筛选阳性菌落。选择阳性单菌落扩大培养至OD600值为0.6~0.8，室温下2400rpm离心农杆菌菌液15min，弃上清，悬浮菌体，使OD600值达到0.2~0.3，制成侵染液备用。
3.农杆菌EHA105介导的叶盘法转化紫花苜蓿
植物材料选择紫花苜蓿中苜一号，侵染材料选择培育四至六周生长状态良好的紫花苜蓿叶片。
通过EHA105介导的叶盘法转化紫花苜蓿：
将侵染材料使用超纯水清洗后，加入适量的次氯酸漂洗液和Tween-20混合溶液（混合溶液中，Tween-20和次氯酸漂洗液的体积比为1:3000，次氯酸漂洗液中次氯酸的质量百分含量为7%，次氯酸漂洗液购自于淘宝网，杀菌99.99%进口高乐氏1L*2瓶消毒液家用室内衣物次氯酸消毒漂白水），使混合溶液没过叶片，除菌10~13min。
将步骤2中制备好的侵染液与除菌后的三叶混合，0.08~0.09Mpa真空渗透叶片10min，室温超声（40kHz）处理4~5min，再次0.08~0.09Mpa真空渗透叶片10min。
真空渗透完成后，弃置农杆菌悬液，在灭菌滤纸上吸除叶片表面的农杆菌，将经上述处理的三叶铺于共培养基上，暗培养24~30h。将外植体移入选择培养基上进行愈伤组织的诱导培养，每2周继代一次，愈伤组织培育需5~6周。
将生长状态良好的愈伤组织转移到MSBK培养基上培养10~14d，直到出现绿色胚状体。
将有绿色胚状体的愈伤组织移入SH9培养基中进行芽分化。每3~4周继代一次，直到芽长大，通常在此培养基上芽长大需6~8周。当芽长出2~3个完全展开的三片叶时，移入MSO培养基中进行生根培养，得到生根的植株（若生长健壮的苗一个月内难以生根，则添加1mg/L IAA）。
将生根的植株移栽到蛭石和珍珠岩体积比为1:1的基质中进行炼苗。存活的植株转移到营养土和蛭石体积比为1:1的基质中进行培养。
4.转基因紫花苜蓿的检测
采用PCR法和Q-PCR法对转基因株系进行验证。
该步骤中采用野生型紫花苜蓿植株作对照，对照实验材料为正常生长30d野生型“中苜一号”紫花苜蓿的叶片组织，处理及检测方法同转基因植株。
采用CTAB法获取成活30d的转基因植株叶片和野生植株叶片的DNA进行PCR鉴定。
使用MfERF026 RNAi-F和3×Flag-R引物进行PCR（引物扩增片段如图7中的A所示）。MfERF026 RNAi-F和3×Flag-R引物信息如表11所示。
表11引物信息
PCR反应体系如表12所示
表12PCR反应体系
PCR反应条件为：预变性98℃，5min；变性98℃，10s；退火57℃，30s；延伸68℃，1min，变性至延伸30个循环；后延伸68℃，10min；4℃保存。
PCR反应完成，得到PCR产物后，采用琼脂糖凝胶电泳通过检测是否有目的条带产生和目的条带大小，判断阳性株系。
PCR产物凝胶电泳图如图7中的B所示。
选取初步检测为阳性株系的叶片提取RNA并反转录为cDNA，然后采用荧光定量RT-qPCR计算各株系MfERF026的相对表达量。同时，提取同一生长时期的野生型紫花苜蓿RNA并反转录为cDNA，进行荧光定量RT-qPCR，计算MfERF026的相对表达量作为对照组。
以MfERF026 DL-F和MfERF026 DL-R为引物进行RT-qPCR，按照TAKARA生物公司荧光定量试剂盒（RR047Q）说明书操作。MfERF026 DL-F和MfERF026 DL-R引物信息详见表2。
通过RT-qPCR结果计算MfERF026相对表达量，计算方法和内参基因同实施例2。
转基因紫花苜蓿和野生型紫花苜蓿中MfERF026基因的RT-qPCR检测结果如表13和图7中的C所示。
表13转基因紫花苜蓿和野生型紫花苜蓿中MfERF026基因的RT-qPCR检测结果
注：WT为野生型。
由表13和图7中的C得，根据定量结果，与野生型(WT)相比，抑制表达转MfERF026基因株系表达量均显著降低。结果证明MfERF026基因转入紫花苜蓿基因组中并得到抑制表达的结果。转基因株系#16、#17、#26、#29的抑制效果最好，后续实验选择株系#16、#17、#26、#29进行。
6.抑制表达转基因株系的发育表型、耐旱性实验和耐冷性实验
（1）转基因紫花苜蓿的扦插
在实验5的基础上，选取株系#16、#17、#26和#29且生长状态良好的转基因植株茎叶，斜口剪下长约7cm的枝条，底部切口浸入生根粉（Solarbio，货号R8240）溶液（1g/L）中10min，插入浇透的蛭石中，仅留叶节处在地表。2周左右长出白而状的根，移栽于蛭石与营养土比值为3：2（v/v）的基质中，野生型紫花苜蓿做同批扦插，作为对照组试验。每组试验样本数为≥30。
（2）抑制表达转基因株系的发育表型
选择在蛭石与营养土比值为3：2（v/v）基质中生长30d的野生型植株和转基因植株进行发育表型的测量、统计和分析。
转基因株系#26和#29以及野生型紫花苜蓿的生长情况如图8所示。
野生型植株和转基因植株发育表型统计结果如表14~表15和图9~图11所示。其中野生型植株和转基因植株的株高、分蘖数、三叶数和分节数如表14和图9所示。野生型植株和转基因植株单叶重量、单叶面积和单叶比叶重（即单叶重量与单叶面积比值）统计结果如表15和图10所示。野生型植株和转基因植株单叶长度、单叶宽度和单叶长宽比如表15和图11所示。
表14野生型植株和转基因植株的株高、分蘖数、三叶数和分节数
表15野生型植株和转基因植株单叶情况统计结果
由表14和表15和图8~图11可得，相对于对照（WT）植株，抑制表达植株株高升高，分蘖数增加，分节数和三叶数增加。相对于对照（WT）植株，抑制表达植株顶叶叶重降低，单叶长度降低但宽度增加，叶面积无显著差别，单叶比叶重升高，长宽比降低。
（3）抑制表达转基因株系的耐旱性实验
将在蛭石与营养土体积比为3：2的土壤基质中生长30d的野生型植株和转基因株系#16、#17、#26、#29浇透，开始进行耐旱性实验，停止浇水3周，复水1周。复水完成后计算实验组和对照组紫花苜蓿存活率，检测比较实验前后实验组和对照组紫花苜蓿电导率变化和生理生化指标变化。其中#16试验株数为20株；#17、#26、#29试验株数分别为21株；WT野生型的试验株数为26株。
电导率的测定方法为：i.将待测叶片置于含有25mL超纯水的50mL离心管中；ii.将离心管放入真空泵，抽真空（<0.09Mpa）15min，取出离心管，放于摇床中，室温230rpm振荡平衡1h；iii.用电导率测定仪测定离心管中液体的电导率，记下初始数值S1；iv.将含有样品的离心管置于沸水浴中煮15min后，取出离心管，放于摇床中，室温230rpm振荡平衡1h，待管内液体温度降至室温；v.测定离心管中液体的电导率，记录数值为S2；vi.并同时测定超纯水的电导率，记录数值为S0；vii.根据每个样品的S1、S2和超纯水的电导率S0计算所测样品叶片的相对电导率，电导率的计算公式为：相对电导率=（S1-S0）/（S2-S0）。
野生型植物和转基因株系的耐旱性试验结果如表16和表17和图12~图16所示。其中图12为耐旱试验前野生型植株和转基因植株的生长状态；图13为干旱胁迫3周时野生型植株和转基因植株的生长状态；图14为复水一周时野生型植株和转基因植株的生长状态。其中图12~图14从左至右依次为野生型植株，转基因植株#16，转基因植株#17，转基因植株#26和转基因植株#29。干旱胁迫后的存活率统计结果如表16和图15所示；干旱胁迫前和干旱胁迫后的电导率统计结果如表17和图16所示。
表16野生型植物和转基因株系的耐旱性存活率统计结果
表17野生型植物和转基因株系的耐旱性电导率统计结果
由表16和表17和图12~图16可得，与野生型WT相比，抑制表达MfERF026转基因株系存活率更高，细胞膜通透性更好，受损伤更低，明显耐旱性更强。
实验前后，试验组和对照组紫花苜蓿生理生化指标检测使用苏州科铭生物技术有限公司试剂盒进行生理生化指标检测。
野生型紫花苜蓿和转基因紫花苜蓿干旱胁迫下生理生化指标测定结果如表18和图17所示。
表18野生型紫花苜蓿和转基因紫花苜蓿干旱胁迫生理生化指标测定结果
注：表格中的前表示胁迫前；后表示胁迫后。
由表18和图17可得，干扰MfERF026基因后增强了转基因紫花苜蓿抗氧化酶系统抗氧化的能力，包括提高SOD和POD的活性，提升了CAT的含量，使得H2O2含量在胁迫前和胁迫后都显著低于野生型。
（4）抑制表达转基因株系的耐冷性实验
将在蛭石与营养土体积比为3：2的土壤基质中生长30d的野生型植株和转基因株系#26、#29放置在低温培养箱中，程序设为：0℃ 1h、-1℃ 1h、-2℃ 1h、-3℃ 1h、-4℃ 1h、-5℃ 1h、-6℃ 1h、-7℃ 1h、-8℃ 1h、-9℃ 1h. 4℃过夜。从-4℃处理1h后开始取出部分植株立即置于4℃植物培养箱过夜培养，每降低一度取出部分植物材料立即置于4℃植物培养箱过夜培养，第二天将所有植物材料放至室温条件下恢复3d，恢复3d后计算实验组和对照组紫花苜蓿存活率，检测比较实验前后实验组和对照组紫花苜蓿电导率变化。CK对照组在相同试验条件下于常温条件进行培养。电导率计算方法同（3）。
野生型和转基因株系的耐冷性试验过程中植株的生长情况如图18所示。野生型和转基因株系的耐冷性试验存活率结果如表19和图19所示。野生型和转基因株系的耐冷性试验电导率检测结果如表20和图20所示。
表19野生型和转基因株系的耐冷性试验存活率结果
表20野生型和转基因株系的耐冷性试验电导率检测结果
如表19、表20和图18、图19，与野生型WT相比，抑制表达MfERF026转基因株系在-5℃~-8℃冷冻胁迫处理下存活率更高；如表20和图20，抑制表达MfERF026转基因株系在-7℃和-8℃冷冻胁迫处理下电导率更低，细胞膜通透性更完整，受损伤程度更低，结果表明抑制表达MfERF026基因后转基因植株耐冷性更强。
综上，本发明提供的黄花苜蓿ERF转录因子MfERF026基因在紫花苜蓿中抑制表达可使紫花苜蓿耐旱性和耐冷性增加，同时，还能促进紫花苜蓿生长发育，使紫花苜蓿生长速率加快和/或叶片增多。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.黄花苜蓿ERF转录因子MfERF026基因调控制剂在促进紫花苜蓿生长发育、提高紫花苜蓿耐旱性和提高紫花苜蓿耐冷性中的任一种或者两种以上中的应用，所述MfERF026基因编码氨基酸序列为SEQ ID NO.2的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述MfERF026基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述调控制剂包括沉默或降低所述MfERF026基因表达的制剂。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，降低MfERF026基因表达制剂包括MfERF026基因表达的干扰RNA。
5.一种tasiRNA，其特征在于，所述tasiRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。
6.一种基于权利要求5所述tasiRNA得到的降低MfERF026基因表达的碱基片段，其特征在于，所述碱基片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。
7.一种用于扩增权利要求6所述碱基片段的引物对，其特征在于，所述引物对包括上游引物MfERF026 RNAi-F和下游引物MfERF026 RNAi-R；所述上游引物MfERF026 RNAi-F的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.14所示；所述下游引物MfERF026 RNAi-R的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.15所示。
8.一种降低MfERF026基因表达的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括权利要求6所述的碱基片段。
9.一种基于权利要求8所述的表达载体构建得到的工程菌。
10.一种转基因紫花苜蓿的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
将权利要求9所述的工程菌侵染紫花苜蓿叶片，得到转化后的紫花苜蓿叶片；
将转化后的紫花苜蓿叶片进行组织培养，得到MfERF026基因抑制表达的转基因紫花苜蓿。
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