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CN116590303A - 一种绿豆大籽粒基因及其检测鉴定方法与应用 - Google Patents

一种绿豆大籽粒基因及其检测鉴定方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一个绿豆大籽粒基因及其鉴定方法与应用，涉及分子生物学和遗传学领域；本发明公开一个与绿豆大籽粒基因bg的序列，所述基因序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列片段；以及bg基因的检测引物组，所述标记的序列为SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列片段，所述引物扩增产物在大籽粒绿豆个体和小籽粒绿豆个体间会产生片段大小的差异，从而准确的在苗期鉴定出携带功能性bg基因的大籽粒个体，节省育种时间，加快育种进程，降低育种成本，整个检测过程操作简单且准确性高，极大地降低了工作周期和成本。

Description

一种绿豆大籽粒基因及其检测鉴定方法与应用
技术领域
本发明属于分子生物学和遗传学领域，具体涉及一种绿豆大籽粒基因及其检测鉴定方法与应用。
背景技术
绿豆(Vigna radiata L.)是我国重要的豆科作物，具有悠久的栽培历史，深受消费者的喜爱。绿豆用途广泛，在我国常被用于制作绿豆汤、绿豆糕、豆芽以及粉丝等，其丰富的营养元素，如优质蛋白、抗性淀粉，以及其他微量营养元素，如异黄酮、牡荆素、花青素、维生素、铁锌等金属元素等含量很高，使得绿豆成为联合国粮食组织首推的食用豆作物。近年来，我国的绿豆需求越来越高，市场上绿豆价格持续走高，提高绿豆单产是绿豆育种的当务之急，现有育种方法中，传统杂交育种耗时长，育种结果不稳定。现有检测方法也存在灵敏度低，耗时过长等缺陷。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种绿豆大籽粒基因及其检测鉴定方法与应用。
本发明公开了一种绿豆大籽粒基因bg，其特征在于，所述基因序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明还提供了上述绿豆大籽粒基因bg在绿豆品种鉴定及高产品种培育方面的应用。
本发明公开了一种用于鉴定上述基因的引物组，所述引物组包含两条特异性引物，核苷酸序列如SEQ ID No：2和3所示。
本发明还提供了一种鉴定绿豆籽粒大小性状的方法，以待测绿豆样品的基因组DNA作为模板，利用权利要求3所述的引物组对模板进行扩增，对扩增产物进行丙烯酰胺电泳分析，如果片段大小在94bp，则该个体为大籽粒个体。
本发明提供了一种用于鉴定绿豆籽粒大小性状的试剂盒，包括上述引物。
本发明还公开了上述试剂盒在绿豆籽粒大小性状鉴定方面的应用。
本发明有以下有益效果：本发明针对来自绿豆大籽粒突变体bg的大籽粒基因在编码区上具有4bp的缺失，导致翻译蛋白的错乱和提前终止，本发明开发了鉴定该突变位点的引物组bg94-F和bg94-R，通过该引物扩增产物的片段大小比对，从而准确的在苗期鉴定出携带bg基因的个体，节省育种时间，加快育种进程，降低育种成本，整个检测过程操作简单且准确性高，极大地降低了工作周期和成本。
附图说明
图1为突变体bg、苏绿1号、突变体bg与苏绿1号杂交F2代植株DNA通过bg94-F和bg94-R的扩增结果，其中，泳道1为Marker；泳道2为突变体bg的扩增带型；泳道3为苏绿1号的扩增带型；第4-27泳道为突变体ml与苏绿1号杂交F2代的扩增条带；
图2为图1中4-27泳道对应个体的种子照片。
具体实施方式
实施例1基于绿豆bg基因的InDe l标记的开发
前期工作中，本发明的发明团队筛选到一个大籽粒的绿豆突变体PK，通过图位克隆的方法，将相关基因定位在第7染色体上，并获得了候选基因bg，编码一个转录抑制子蛋白。
来自突变体PK的bg基因全长序列如SEQ ID No：1所示。测序发现bg基因的第三外显子上有一处4bp的缺失，本发明根据该缺失，设计了一对特异引物bg94-F和bg94-R，核苷酸序列如SEQ ID No：2-3所示。该引物组在亲本PK以及其后代大籽粒绿豆个体中扩增产物片段长度为94bp，在其他绿豆个体中扩增产物大小为98bp，在丙烯酰胺凝胶电泳中可以观察到条带大小的差异，由此产生多态性。经过该标记筛选出携带bg基因的大籽粒个体。
实施例2bg94分子标记在大籽粒绿豆选育上的应用
(1)群体扩增检测及标记分析：常规绿豆品种苏绿1号和大籽粒绿豆突变体PK杂交得到F1代种子，种植后得到F1代单株，F1代单株自交结实收获得F2代种子。
采用CTAB法分别提取部分F2单株的基因组DNA：在苗期，选择重组自交系的新鲜叶片，液氮迅速冷冻后，碾磨，采用CTAB法提取样品总DNA。利用bg94引物(SEQ ID No：2-3)对样品总DNA进行PCR扩增，选用MIX master DNA聚合酶(北京擎科)进行扩增，保证PCR产物条带的单一。
PCR体系(10μL)：
PCR反应程序：94℃预变性3分钟；95℃变性10秒，55-58℃退火15秒，72℃延伸30秒，循环32-37次；72℃最后延伸1分钟，扩增产物4℃保存。
扩增产物用10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶配方如下(10ml)：
2.5毫升的19：1溶液；
1毫升的10×TBE溶液；
6.5毫升的ddH2O；
10微升的TEMED，
100微升的10％过硫酸铵溶液。
其中10×TBE是将108g的Tris碱和55g的硼酸先溶解于蒸馏水，加40mL 0.5mol/L的EDTA(PH 8.0)，再加ddH2O定容到1000mL；19:1(100mL)溶液是将38g丙烯酰胺和2g N',N'-亚甲双丙烯酰胺溶解于ddH2O，定容至100mL，过滤后4℃保存。
电泳采用恒压电泳，选用DYY-6E型电泳仪电源(北京六一)和JY-CX2B型电泳槽(北京君意)，注意灌胶过程中缓慢耐心，以免气泡的产生。待胶完全凝固后，用10μL量程的移液器(北京大龙兴创)加样，上样，上样量为2μL，电压为220V，电泳时长120分钟，电泳后取出凝胶进行银染及显色。
银染：凝胶用ddH2O反复洗净；加入足够没过凝胶的银染液(0.2％硝酸银水溶液)；摇床上轻摇20分钟左右，然后倒掉银染液，用蒸馏水漂洗2次。
显色：加入相同体积的显色液(1.5％氢氧化钠水溶液，0.4％饱和甲醛)，轻摇至条带清晰；取出胶板，用蒸馏水清洗，在灯箱上读取带型，分析条带。
(3)结果与分析：在PK和苏绿1号的F2群体基因型的部分检测结果如图2所示，泳道1为Marker，最低条带大小为50bp，倒数第二条带为100bp，倒数第三条为400bp。泳道2为PK的扩增带型，片段大小为94bp，泳道3为苏绿1号的扩增带型，片段大小为98bp；其后为部分F2个体的扩增条带，其中发现13个单株的扩增条带大小为94bp，8个单株的扩增条带在98bp左右，5个单株的扩增条带为杂合型，即同时包含98bp和94bp大小的两条条带。
将图1中接受检测的F2个体种子进行搜集比对可以发现(如图2所示)，扩增条带为94bp的个体(图2中下排13个资料)均表现出大籽粒的表型，这说明bg94引物组能够准确的鉴定大籽粒的材料。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (6)

1.一种绿豆大籽粒基因bg，其特征在于，所述基因序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种如权利要求1所述的绿豆大籽粒基因bg在绿豆品种鉴定及高产品种培育方面的应用。
3.一种用于鉴定权利要求1所述基因的引物组，其特征在于，所述引物组包含两条特异性引物，核苷酸序列如SEQ ID No：2和3所示。
4.一种鉴定绿豆籽粒大小性状的方法，其特征在于，以待测绿豆样品的基因组DNA作为模板，利用权利要求3所述的引物组对模板进行扩增，对扩增产物进行丙烯酰胺电泳分析，如果片段大小在94bp，则该个体为大籽粒个体。
5.一种用于鉴定绿豆籽粒大小性状的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求3所述的引物。
6.一种如权利要求5所述的试剂盒在绿豆品种鉴定方面的应用。
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