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CN1165547C - 与阿卡加定相关的新型羊毛硫抗生素及其制备方法和用途 - Google Patents

与阿卡加定相关的新型羊毛硫抗生素及其制备方法和用途 Download PDF

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CN1165547C CNB981241085A CN98124108A CN1165547C CN 1165547 C CN1165547 C CN 1165547C CN B981241085 A CNB981241085 A CN B981241085A CN 98124108 A CN98124108 A CN 98124108A CN 1165547 C CN1165547 C CN 1165547C
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Abstract

本发明涉及一种具有通式NH2-R-阿卡加定的新型羊毛硫抗生素及其化学衍生物，其中NH2-R是氨基酸丙氨酸的基团，该新型羊毛硫抗生素是在微生物利古里亚游动放线菌，DSM11797或加尔巴丁游动放线菌，DSM11796的发酵培养过程中形成的，本发明还涉及羊毛硫抗生素的制备方法及其作为药物的用途。

Description

与阿卡加定相关的新型羊 毛硫抗生素及其制备方法和用途
本发明涉及一种与阿卡加定(actagardine)相关的新型羊毛硫抗生素，特别是涉及一种称为Ala0-阿卡加定的羊毛硫抗生素，其制备方法、从该羊毛硫抗生素产生的化学衍生物和该羊毛硫抗生素作为药物的用途。
已有多种羊毛硫抗生素被记载过。羊毛硫抗生素是多环肽抗生素，其特征在于含有羊毛硫氨酸或甲基羊毛硫氨酸。它们是通过微生物获得的天然物质，用于作治疗人类疾病的抗菌活性化合物、防腐剂或酶抑制剂(G.Jung，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，1991，30，1051-1068)。
多种抗生素被用于治疗细菌感染疾病。然而，病原体对这些所用药物的抗性越来越大，目前面临的最大威胁是所谓的多抗性微生物，这种微生物不但对个别的抗生素组如β-内酰胺抗生素或糖肽或大环内酯变得具有抗性，而且同时具有几种抗性。甚至存在这样的病原体，其对所有从商业上得到的抗生素变得具有抗性。由这些微生物引起的传染病无法得到治疗。因此亟需能够用以治疗抗性微生物的新型药物。尽管文献记载了数千种抗生素，然而，大多数抗生素由于毒性太大而不能用作药物。
阿卡加定是S.Somma等人于1977年首次在《抗微生物试剂及化疗》11，396-401上描述的羊毛硫抗生素，其结构只是在最近才被正确地阐明(N.Zimmermann等，欧州生化杂志1995，228，786-797)。
令人惊奇的是发现了利古里亚游动放线菌和加尔巴丁游动放线菌两个菌株都能产生至少一种新型抗生素，例如Ala0-阿卡加定，该新型抗生素不但有很高的抗菌活性，而且具有很高的耐药剂量。根据布达佩斯条约有关条款的规定，一株利古里亚游动放线菌的分离菌株于1997年9月24日在Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH(德国微生物和细胞培养物保藏中心GmbH)，MASCHERODER WEG 1B，38124 BRAUNSCHWEIG，Germany(下文简称为‘DMS’)进行了保藏，保藏号为DSM11797。根据布达佩斯条约有关条款的规定，一株加尔巴丁游动放线菌的分离菌株于1997年9月24日在DMS进行了保藏，保藏号为DSM11796。
相应地，本发明提供了如式1所示的化合物及其生理耐受盐，
其中R是氨基酸基团。R可以是取代的或未取代的氨基酸基团，其中氨基是α-至ω-位的且以D型或L型存在。特别优选的是D型或L型的取代或未取代的α-氨基酸。
优选的是，R是选自下面一组氨基酸中的一种天然氨基酸基团，该组氨基酸由Ala，Gly，Glu，Phe，Pro，Thr，Cys，Met，Trp，Tyr，Asn，Gln，Asp，His，Ile，Leu，Lys，Arg，Ser和Val组成。特别优选的氨基酸是Ala，Ile，Lys，Phe，Val，Glu，Asp，His，Leu，Arg或Ser，最优选的氨基酸是Ala0。
R也可以是取代的或未取代的二氨基链烷酸基团，例如2，4-二氨基丁酸(Dab)。
另外，本发明还涉及一种实验式为C84H129N21O25S4(Ala0-阿卡加定)的化合物及其药理耐受盐，该化合物是通过以下方法获得的，将利古里亚游动放线菌，DSM11797或加尔巴丁游动放线菌，DSM11796或它们的变异体和/或突变体之一于培养基中进行发酵培养，直至培养液中富集了化合物Ala0-阿卡加定，然后分离得到该化合物。
本发明进一步涉及由实验式为C84H129N21O25S4(Ala0-阿卡加定)的化合物产生的化学衍生物及其药理耐受盐，该化学衍生物是通过以下方法获得的，将利古里亚游动放线菌，DSM11797或加尔巴丁游动放线菌，DSM11796或它们的一种变异体和/或突变体于培养基中进行发酵培养，直至培养液中富集了化合物Ala0-阿卡加定，然后分离得到该化合物，再将该化合物转化成它的化学衍生物。
优选的化学衍生物是：Ile0-，Lys0-，Phe0-，Val0-，Glu0-，Asp0-，His0-，Leu0-，Arg0-和Ser0-阿卡加定。可以采用本领域的技术人员已知的方法将Ala0-阿卡加定转化为所述的化学衍生物。
抗生素Ala0-阿卡加定不同于文献中以结构式表示的已知物质。除了阿卡加定，文献还记载了一些阿卡加定的第二种成分(1976年5月10日的美国专利4,022,884，和A.Malabarba等，抗生素杂志，1985，38，1506-1511)，然而第二种成分和阿卡加定的极性、氨基酸组成、抗微生物活性或物理性质都不同于本发明的化合物。
利古里亚游动放线菌，DSM11797菌株在含有葡萄糖、淀粉或甘油的培养液中可生成阿卡加定和文献中记载的副产物。令人惊奇的是，同样的菌株在含不易消化的甘露醇培养基中以极高的产率生产根据本发明的抗生素NH2-R-阿卡加定，其中R是天然氨基酸的基团，尤其是丙氨酸，但是并不产生所述的已知化合物，所产生的阿卡加定也是极其微量的。
本发明进一步涉及制备式1所示化合物的方法，该方法包括微生物利古里亚游动放线菌，DSM11797或加尔巴丁游动放线菌，DSM11796或它们的一种变异体或突变体于液体培养基中的培养，式1所示化合物的分离和纯化，也可适当地将该化合物转化成它的药理耐受盐。
所述方法包括在含碳源和氮源，无机盐和微量元素的培养基中，在有氧的条件下培养利古里亚游动放线菌，DSM11797或加尔巴丁游动放线菌，DSM11796，它的突变体和/或变异体。
优选的是，培养在温度为20～35℃之间，pH为4～10之间的条件下进行。
另外，本发明还涉及制备式1所示化合物的方法，该方法包括化合物阿卡加定与氨基酸的反应。
例如，活化了的氨基酸酯可以与阿卡加定的末端氨基反应。优选的是，将一个保护基团如叔-丁氧羰基(Boc-)连接到氨基酸的氨基氮上，以便防止活化了的氨基酸酯自身发生反应。活化了的酯是例如每一氨基酸的N-羟基琥珀酸酯。去除保护基团并纯化反应混合物。
游动放线菌具有桔黄色的基内菌丝体，而没有气生菌丝体。它形成游动放线菌所特有的孢子囊。细胞壁含有作为特征氨基酸的介二氨基庚二酸和甘氨酸，并且还含有作为糖的木糖和阿拉伯糖；这些都是游动放线菌属的特征。
根据本发明，如果菌株DSM11797或菌株DSM11796的突变体和变异体能够合成本发明的化合物，可以用来代替菌株DSM11797或菌株DSM11796。这样的突变体可以采用已知的物理方法进行制备，例如可以采用辐射如紫外线辐射，X-射线辐射或化学诱变剂如甲基磺酸乙酯(EMS)；2-羟基-4-甲氧基二苯酮(MOB)或N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基-胍(MNNG)。
可以通过测定培养液中积累的活性化合物的生物活性，例如通过测定其抗菌活性来筛选能够生产本发明抗生素的突变体和变异体。
适于有氧发酵的优选碳源应是可同化的，但却是不易消化的碳水化合物和糖醇如甘露糖醇，肌醇和含碳水化合物的天然产物如大豆粉。合适的氮源是：氨基酸，肽和蛋白质及其降解产物如胨或胰化胨，进一步的是肉浸出物，磨碎的种子如玉米，小麦，豆类，燕麦，大豆或棉花植物，从乙醇生产中得到的蒸馏残余物，肉粉或酵母浸出物，铵盐和硝酸盐。培养基中的无机盐可以是例如碱金属或碱土金属，铁，锌，钴和锰的氯化物，碳酸盐，硫酸盐或磷酸盐。
采用含有大约0.5～5％，优选的为1～3％的甘露糖醇、0.5～5％，优选的为1～3％的大豆粉和浓度为0.1～0.5％，优选的为0.2～0.3％的微量元素溶液的培养液生产Ala(0)-阿卡加定效果特别好。微量元素溶液中含有CaCl2，柠檬酸铁(III)，MnSO4，ZnCl2，CuSO4，四硼酸钠，CoCl2和钼酸钠。
培养是在有氧的条件下进行的，即例如通过摇动或搅拌摇瓶或发酵罐浸没培养，如果合适，可通入空气或氧气。发酵可在各种体积的广口瓶或圆底摇瓶或玻璃发酵罐或V2A不锈钢罐中进行。发酵的温度范围约为20～35℃，优选的约为25～30℃。pH值的范围为4～10，优选的为5.5～8.5。在这些条件下，微生物的培养周期一般为20～300小时，优选的为24～140小时。培养分为几个阶段进行是有利的，即在液体培养基中首先进行一次或多次的预培养，然后再例如以1∶10的体积比转入生产用培养基即主要培养基中。预培养是这样进行的，例如，将菌丝体转入培养液中培养大约20～120小时，优选的是培养24～72小时。菌丝体是通过以下方法获得的，例如，将菌株于固体或液体培养基如酵母-麦芽琼脂或燕麦粉琼脂中培养1～40天，优选的是培养3～10天。
根据本发明，发酵和抗生素形成的过程可以通过本领域的技术人员已知的方法进行监测，例如通过生物分析测定生物活性或通过色谱方法如薄层色谱(TLC)或高效液相色谱(HPLC)。
菌丝体和培养滤液中都含有抗生素Ala(0)-阿卡加定，通常主要含量是在培养滤液中。因此通过过滤或离心可以方便地分离发酵液。以吸附树脂作为固相进行滤液的提取。采用甲醇或丙酮可以方便地进行菌丝体的提取，然而也可以采用其它溶剂进行提取。
可在较大的pH范围内进行提取，然而，有利的是在中性或弱酸性培养基中进行，优选在pH3和pH7之间。提取物可浓缩和干燥，例如，真空中进行。
本发明的抗生素的一种分离方法是用本身已知的方法对溶液进行分离。
另外一种纯化方法是在吸附树脂上进行的色谱纯化，吸附树脂是，例如DiaionHP-20(Mitsubishi Casei Corp.，Tokyo)，AmberliteXAD7(Rohm and Haas，USA)，AmberchromCG，(Toso Hass，Philadelphia，USA)或类似的树脂。许多反相载体是非常合适的，例如RP8和RP18，一般已在如涉及高效液相色谱(HPLC)的情况中公开了。
本发明的抗生素的纯化还可进一步包括所谓正相色谱载体的使用，例如以本身已知的方式使用硅胶或Al2O3或其它载体。
一种选择的分离方法是采用分子筛方法，例如以本身已知的方式采用FractogelTSK HW-40，SephadexG-25等。通过结晶的方法从富含Ala(0)-阿卡加定的物质中得到Ala(0)-阿卡加定也是很有可能的。例如，有机溶剂及其混合物，无水的或加水的，适合于本目的。另外一种分离和纯化本发明抗生素的方法包括阴离子交换剂的使用，优选的pH值范围为4～10，还有阳离子交换剂的使用，优选的pH值范围为2～5。加了有机溶剂的缓冲溶液尤其适合于此目的。
Ala(0)-阿卡加定、其已提到过的化学衍生物和其各种化学等效物可以通过本领域的技术人员已知的方法转化为其相应的药理耐受盐。
本发明化合物的各种化学等效物是具有轻微化学差别的化合物，即这些化学等效物与本发明化合物具有相同的活性或在温和的条件下就可以转化为本发明的化合物。所提到的等效物包括，例如本发明化合物的酯、氨基衍生物、同本发明化合物的复合物或加成化合物。
本发明的药理耐受盐理解为有机盐或无机盐，诸如Remington’sPharmaceutical Sciences(17th Edition，page 1418(1985))中所述的盐。可能的盐尤其是指碱金属盐、铵盐、碱土金属盐、生理耐受胺的盐和有机酸或无机酸例如HCl、HBr、H2SO4、马来酸、延胡索酸的盐。
本发明抗生素的物理化学和光谱学性质可概述如下：
Ala(0)-阿卡加定：
外观：
溶于甲醇和水的无色物质。于中性和弱碱性介质中稳定，但于强酸性和强碱性溶液中不稳定。
实验式：        C84H129N21O25S4
分子量：        1961.21
1H-和13C-NMR：见表1和2
紫外最大吸收值(logε)：280nm(3.71)，288nm(肩峰)
         表1：Ala0-阿卡加定的1H-NMR光谱学数据
氨基酸    HN        Hα             Hβ                      Hγ                       其它
Ala0     8.010    2.891    1.383
Ala1     8.564    4.727    3.397         -
                            2.603
Ser2     8.264    4.350    3.651                      OH：5.102
Gly3     8.595    3.968    -             -
                   3.263
Trp4     8.147    4.475    3.311                      H5：7.144；H6：
                                                       7.554；H7：6.983；
                                                       H8：7.061；H9：
                                                       7.333；吲哚：
                                                       10.740
                            2.978
Val5     7.454    4.558    2.048         0.909
                                          0.856
Ala6     8.487    4.704    2.578
                            2.960
Abu7     8.324    4.557    3.596         1.176
Leu8     7.636    4.626    1.418         1.482        δ0.841
                            1.482         Y-Me：0.860
Abu9     7.604    4.747    3.570         1.207
Ile10    8.378    3.763    1.605         1.063        δ-Me：0.860
                            β-Me：0.879  1.642
Glu11    8.262    3.690    2.178         2.319
Ala12    7.325    4.553    2.559         -
                            2.866
Gly13    8.140    3.538    -             -
                   4.167
Abu14    7.860    4.381    3.336         1.059
Val15    7.778    4.104    2.042         0.875
                                          0.873
Ile16    7.589    3.867    1.875         1.513        δ-Me：0.833
                            β-Me：0.889  1.115
Ala17    7.577    4.488    2.594
                            2.878
Ala18    8.181    4.036    1.232
Ala19    8.342    4.447    2.934
                            3.069
              表2：Ala0-阿卡加定的13C-NMR光谱学数据
氨基酸      CO        Cα             Cβ                Cγ                       其它
Ala0      169.51    48.35    17.35
Ala1      169.27    50.80    34.21      -
Ser2      170.48    55.04    61.23
Gly3      168.90    43.44               -
Trp4                54.28    27.62                    110.41，123.28，
                                                       127.08，111.28，
                                                       120.83，136.00，
                                                       118.10，118.22
Val5      171.20    56.73    31.50      17.76
                                         19.02
Ala6      170.14    53.73    32.79
Abu7                57.83    43.95      19.96
Leu8      171.45    51.01    41.66      24.03         22.38
                                                       22.62
Abu9      171.59    55.77    46.38      20.10
Ile10     170.96    60.00    35.71      24.75         11.59
                              β-Me：14.70
Glu11               55.86    24.49      30.98         173.75
Ala12     170.78    55.47    35.26
Gly13     170.03    44.18
Abu14     168.33    55.00    55.64      6.94
Val15     170.63    60.03    30.02      19.15
                                         18.564
Ile16     170.66    59.64    35.69      24.55         10.62
                             β-Me：15.53
Ala17     169.79    53.13    35.70
Ala18     171.52    48.89    15.34
Ala19               47.16    51.53
未指定的   169.01
           169.83
           170.33
           171.01
氨基酸分析结果，阿卡加定的氨基酸多了一个Ala(1Ser，2Gly，1Trp，2Val，1Leu，2Ile，1Glu，1Ala，1羊毛硫氨酸(Ala-S-Ala)和3β-甲基羊毛硫氨酸(Abu-S-Ala))。
进一步发现本发明的化合物具有很强的抗菌活性；表3通过实施例的方式总结了Ala(0)-阿卡加定的最小抑制浓度(MIC)。
表3：系列稀释试验中Ala(0)-阿卡加定抗格兰氏阳性和厌氧菌的体外活性
微生物     Ala(0)-阿卡加定MIC值(μg/ml)
金黄色葡萄球菌SG511金黄色葡萄球菌285金黄色葡萄球菌503金黄色葡萄球菌FH1982金黄色葡萄球菌701E金黄色葡萄球菌707E金黄色葡萄球菌9Tub金黄色葡萄球菌8236表皮葡萄球菌ZH2c表皮葡萄球菌6098W表皮葡萄球菌763表皮葡萄球菌5747IIW表皮葡萄球菌291表皮葡萄球菌799尿肠球菌Md8B尿肠球菌VR1尿肠球菌VR2化脓葡萄球菌VR3化脓葡萄球菌308A化脓葡萄球菌77A疮疱丙酸杆菌6919疮疱丙酸杆菌6922破伤风梭状芽孢杆菌9406产气荚膜梭状芽孢杆菌194     6.256.253.1312.512.512.56.256.256.2512.56.256.2512.56.256.255050256.250.1951.01.08.00.5
特别值得注意的是，本发明的化合物不但具有比阿卡加定高约两倍的抗格兰氏阳性微生物的活性，而且同时与传统的抗生素如β-内酰胺(青霉素，头孢菌素)，氨基糖苷(链霉素)，大环内酯(红霉素)，喹诺酮(环丙沙星)，磺胺或糖肽(万古霉素)及其它抗生素根本不具有交叉抗性。更需要强调的是，该化合物对引起顽疾，实际上是威胁生命的传染病的厌氧菌具有很强的抑制作用。
Ala(0)-阿卡加定特别适合于此类疾病的治疗。
在活性浓度和以上提到的浓度下，Ala(0)-阿卡加定的耐受性很好，并且没有发现其细胞毒性或其它的毒性。
因此本发明也涉及到本发明化合物作为药物的用途，并且涉及到所述化合物用以制备治疗和/或预防细菌感染的药物的用途。
另外，本发明还涉及到含有本发明化合物的药物。
所述药物是通过将至少一种式1所示化合物与一种生理辅剂和/或赋形剂进行混合，制成合适的剂型而得到的。
本发明的药物可以经肠用药(口服)、不经肠用药(肌肉或静脉注射)、直肠用药或局部用药。其剂型可以是溶液、粉剂(片剂、包括微胶囊的胶囊)、膏剂(乳膏或凝胶)或栓剂。用于制备剂型的可能辅剂是一般的药用常规液体或固体的填充剂和补充剂、溶剂、乳化剂、润滑剂、调味剂、着色剂和/或缓冲剂物质。可用剂量是0.1～1000毫克/每千克人体重量，优选的是0.2～100毫克/每千克人体重量。每天有效用药剂量单位含有本发明化合物的量至少为例如30～3000毫克，优选的为50～1000毫克。
以下通过操作实施例和权利要求的内容对本发明进行更详细的说明。
实施例1：生产用菌株的菌丝体悬浮液的制备
将100ml培养液(1升水中含10g淀粉、10g甘油、10g葡萄糖、2.5g玉米浆、5g胨和2g酵母提取物，消毒前的pH为6.0)装入容量为500ml的锥形瓶中，接种菌株后于28℃条件下在摇床上培养72小时，摇床的转速为140rpm。将120ml培养液均匀地分散在500ml无菌锥形瓶中的培养基中，其中培养基含有浓度为2.0g/l的燕麦粉浸液，另外还加入了15g/l的琼脂进行固化，并进行了倾析。培养于28℃条件下进行10到14天。然后从锥形瓶中挑出菌丝体，立刻重复使用或于-22℃下保存在50％的甘油中或于-140℃下保存在10％的二甲亚砜中。
实施例2：于锥形瓶中进行生产用菌株培养物或预培养物的制备
将试管斜面上生长的培养物或一块琼脂培养物接种到实施例1所述的500ml无菌锥形瓶中的100ml培养液中，在黑暗中进行摇床培养，培养温度为28℃，摇床转速为140rpm。培养72小时后，式1所示化合物的产量达到最高值。来自相同培养液的培养了72小时的浸没培养物(接种量大约5％)足够接种10升和100升的发酵罐。
实施例3：Ala(0)-阿卡加定的制备
一个10升发酵罐的发酵条件如下：
培养基：        2％的大豆粉、2％的甘露醇
培养时间：      24或28小时
培养温度：      28℃
搅拌速度：      200rpm
通气量：        5升的空气/分钟
通过反复滴加数滴多元醇的乙醇溶液抑制泡沫形成。48小时后产量达到最大值。
实施例4：抗生素Ala(0)-阿卡加定的分离
将实施例3所得到的27升培养液进行离心，将清澈的培养滤液加样上柱，该柱的容量为3升，柱填料为吸附树脂MIC GelCHP20P。柱尺寸：宽×高：11.3cm×30cm。采用5％到50％的异丙醇水溶液的溶剂梯度洗脱柱子。柱洗脱液按每馏分2升进行收集。对经HPLC分析检查过的含有Ala(0)-阿卡加定的馏分进行收集、真空浓缩和冻干(4g)。
实施例5：Ala(0)-阿卡加定的高压液相色谱(HPLC)分析
柱子：      Nucleosil100-5C18AB，250/4
流动相：    乙腈浓度为32％的10mM磷酸盐缓冲液，
                  pH值为7
流速：            1ml/分钟
在210nm下进行紫外吸收检测。
发现Ala(0)-阿卡加定的保留时间是16分钟50秒，阿卡加定本身的保留时间是11分钟20秒。
实施例6：Ala(0)-阿卡加定的浓缩
将3g依照实施例4获得的产品加样上柱，该柱的容量为3升，柱填料为FractogelTSK HW-40s(宽×高＝10cm×50cm)。50％的甲醇水溶液依靠泵以50ml/分钟的流速流经柱子，柱洗脱液进行馏分(65ml)收集。发现140mg的抗生素Ala(0)-阿卡加定主要是从馏分24～28中得到的。
实施例7：Ala(0)-阿卡加定的最终纯化
将按照实施例6所得到的浓缩抗生素Ala(0)-阿卡加定(280mg)加样上柱，该柱为Nucleosil12C18AB-HPLC柱(宽×高＝3.2cm×25cm)，梯度方法采用5％到30％的乙腈和0.05％的三氟乙酸。经HPLC分析过的馏分(见实施例5)相应地混合后，进行真空浓缩和冻干，得到185mg、纯度为98％的Ala(0)-阿卡加定。
通过ESI+质谱法测得的Ala(0)-阿卡加定分子量：M+H+＝1962.6。
实施例8：Lys(0)-阿卡加定的获得
将94.5mg(0.05mmol)的阿卡加定溶解在10ml的无水二甲亚砜(DMF)和22mg(0.05mmol)的二-Boc-赖氨酸-O-N-羟基琥珀酰亚胺中，其中还加有100μl的三乙胺(TEA)，使混合物在室温下静置。整个反应过程通过HPLC分析进行监测(见实施例5)。反应进行96小时后，通过在高度真空下去除DMF和TEA来终止反应。反应产物通过制备性HPLC进行纯化，纯化过程中的梯度方法采用了乙腈浓度为25％到50％的0.05％强度的三氟乙酸溶液(TFA)。柱的尺寸为：高×宽25mm×250mm；载体：Select B。含有反应产物的馏分冻干后，获得了33mg(0.015mmol)的二-Boc-Lys(0)-阿卡加定。
用60％强度TFA可完全去除Boc保护基团。为了做到这点，将25mg(0.011mmol)的被保护的衍生物于室温下溶解在5ml的60％强度TFA中。90分钟后，去除反应完成。如上所述，在制备性HPLC柱(10mm×250mm，LiChrospher)上，采用同样的梯度纯化自由的赖氨酰-阿卡加定。纯化的物质经冻干后，可得到14mg(0.007mmol)的Lys(0)-阿卡加定。
通过质谱法检查最终产品的分子量。分子量是(M+H)+：2019，对应于实验式C87H136O25N22S4。
实施例9：Ile(0)-阿卡加定的制备
将189mg(0.1mmol)的阿卡加定与33mg(0.1mmol)的Boc-Ile-O-N-羟基琥珀酰亚胺酯按照实施例8描述的方法进行反应。得到210mg的Boc-Ile(0)-阿卡加定。
去除Boc的保护基团并进行最终纯化，可得到84mg(0.042mmol)的Ile(0)-阿卡加定。通过质谱法测定的分子量是(M+H)+：2004，对应于实验式C87H135O25N21S4。
实施例10：N-α-氨基丁酰-阿卡加定[Abu(0)-阿卡加定]的制备
将94.5mg(0.05mmol)的阿卡加定与16.3mg(0.05mmol)的N-Boc-α-氨基丁酸对硝基苯酯按照实施例8描述的方法进行反应，9天后，得到54mg的N-Boc-Abu(0)-阿卡加定，去除保护基团后，可得到19mg(0.01mmol)的N-α-氨基丁酰-阿卡加定。
分子峰值(M+H)+：1976，对应于实验式C85H131O25N21S4。
实施例11：Gln(0)-阿卡加定的制备
将94.5mg(0.05mmol)的阿卡加定与16.4mg(0.05mmol)的Boc-谷氨酰胺对硝基苯酯按照实施例8描述的方法进行反应，去除保护基团后，可得到38mg(0.019mmol)的Gln(0)-阿卡加定。
分子峰值(M+H)+：2019，对应于实验式C86H132O26N22S4。
实施例12：Phe(0)-阿卡加定的制备
将94.5mg(0.05mmol)的阿卡加定与15.6mg(0.05mmol)的Boc-Phe-O-N-羟基琥珀酰亚胺酯按照实施例8描述的方法进行反应。去除保护基团后，可得到26mg(0.013mmol)的Phe(0)-阿卡加定。
分子峰值(M+H)+：2038，对应于实验式C90H133O25N21S4。
实施例13：Phe-Ala(0)-阿卡加定的制备
将94.5mg(0.05mmol)的阿卡加定与21.7mg(0.05mmol)的Boc-Phe-Ala-O-N-羟基琥珀酰亚胺酯按照实施例8描述的方法反应3小时。去除保护基团后，可得到37mg(0.018mmol)的Phe-Ala(0)-阿卡加定。
分子峰值(M+H)+：2019，对应于实验式C93H138O26N22S4。
实施例14：D-Ala(0)-阿卡加定的制备
将94.5mg(0.05mmol)的阿卡加定与14.5mg(0.05mmol)的Boc-D-Ala-O-N-羟基琥珀酰亚胺酯按照实施例8描述的方法反应24小时，去除保护基团后，可得到47mg(0.024mmol)的D-Ala(0)-阿卡加定。
分子峰值(M+H)+：1961，对应于实验式C84H129O25N21S4。
表4～6列出了阿卡加定(Acta)及其本发明化合物的体外抗菌活性(MIC值[μg/ml])。
表4
培养时间24h  Acta  Ala-Acta  Ile-Acta  Gln-Acta  Phe-Acta  Phe-Ala-Acta  Lys-Acta  Abu-Acta
金黄色葡萄球菌SG511  20  5  1.2  20  0.6  5  1.2  1.2
金黄色葡萄球菌SG511+10％血清  40  20  2.5  40  5  10  2.5  10
金黄色葡萄球菌Exp 54146  ＞40  40  2.5  ＞40  5  20  10  20
化脓葡萄球菌A561  ＞40  ＜＝0.04  ＜＝0.04  5  ＞40  ＞40  ＜＝0.04  ＞40
屎肠球菌M78L  10  5  5  10  ＞40  10  5  ＞40
大肠杆菌  ＞40  ＞40  ＞40  ＞40  ＞40  ＞40  ＞40  ＞40
表5
接种时间24h  Acta  Boc-Ala-Acta  Boc-Ile-Acta  Boc-Gln-Acta  Boc-Phe-Acta  Boc-Phe-Ala-Acta  Boc-Lys-Acta Boc-Abu-Acta
金黄色葡萄球菌SG511 20  10  20  40  1.2  5  2.5 5
金黄色葡萄球菌SG511+10％血清 40  40  40  ＞40  10  10  10 10
金黄色葡萄球菌Exp 54146 ＞40  40  ＞40  ＞40  5  10  10 ＞40
化脓葡萄球菌A561 ＞40  0.150  ＞40  0.3  ＜＝0.04  ＞40  ＜＝0.04 ＞40
屎肠球菌M78L ＞40  20  ＞40  40  5  ＞40  10 ＞40
大肠杆菌 ＞40  ＞40  ＞40  ＞40  ＞40  ＞40  ＞40 ＞40
表6
培养时间18h AIa-Acra Ile-Acta Boc-Phe-Acta Lys-Acta Boc-Lys-Acra
阿卡加定011HT3 20 2.5 5 10 10
阿卡加定011HT3+50％ 血清 20 2.5 10 10 20
阿卡加定011HT3+50％ 血清 40 5 40 10 40
阿卡加定011HT18 ＞40 ＞40 ＞40 ＞40 ＞40
表皮葡萄球菌012GO20 ＞40 ＞40 ＞40 ＞40 ＞40
金黄色葡萄球菌011HT1 1.1 1.2 10 0.6 10
金黄色葡萄球菌011DU5 40 10 40 10 40
金黄色葡萄球菌011CB20 ＞40 40 ＞40 ＞40
金黄色葡萄球菌0121O64 ＞40 ＞40 ＞40 ＞40 ＞40
表皮葡萄球菌012GO42 ＞40 ＞40 ＞40 ＞40 ＞40
Staph.coag.negative012HT5 ＞40 ＞40 ＞40 ＞40 ＞40
化脓葡萄球菌02A1SJl ＜＝0.04 ＜＝0.04 0.08 ＜＝0.04 0.08
化脓葡萄球菌02A1UC1 ＜＝0.04 ＜＝0.04 ＜＝0.04 ＜＝0.04 ＜＝0.04
化脓葡萄球茵02A1F16 ＜＝0.04 ＜＝0.04 ＜＝0.04 ＜＝0.04 ＜＝0.04
Strepto gr G02GOCB2 20 10 2.5 5 2.5
S.pnenmoniae 030BI2 2.5 1.2 1.2 2.5 1.2
S.milleri02milGR12 40 ＞40 40 40 5
S.miris 02mitGRl6 20 10 20 10 5
粪肠球菌 02D2HM9 ＞40 40 40 ＞40 ＞40
粪肠球菌02D2uC5 20 40 40 40 40
粪肠球菌02D2DU18 5 5 10 5 10
粪肠球菌02D2HT10 ＞40 ＞40 ＞40 ＞40 ＞40

Claims (20)

1.一种式1所示的化合物或其生理耐受盐，
其中R是氨基酸基团。
2.如权利要求1所述的式1所示的化合物，其中R是天然氨基酸基团。
3如权利要求2所述的式1所示的化合物，其中氨基酸是丙氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸或缬氨酸。
4.如权利要求3所述的式1所示的化合物，其中氨基酸是丙氨酸。
5.如权利要求1所述的式I所示的化合物，其中R是Phe-Ala-。
6.如权利要求1至5中的一个权利要求所述的式1所示的化合物，其中氨基酸的氨基氮带有一个可去除的保护基团。
7.一种Ala0-阿卡加定的化合物，其通过以下方法获得：将利古里亚游动放线菌、DSM11797或加尔巴丁游动放线菌或DSM11796于培养基中进行发酵培养，直至培养液中富集了化合物Ala0-阿卡加定，然后分离得到该化合物。
8.如权利要求7中所获的化合物的药理耐受盐。
9.一种从Ala0-阿卡加定的化合物产生的氨基衍生物，所述氨基衍生物是通过以下方法获得的，将利古里亚游动放线菌、DSM11797或加尔巴丁游动放线菌或DSM11796于培养基中进行发酵培养，直至培养液中富集了化合物Ala0-阿卡加定，然后分离得到该化合物，再将该化合物转化成它的氨基衍生物或其药理耐受盐。
10.如权利要求1至6中的一个权利要求所述的化合物的制备方法，该方法包括将阿卡加定与氨基酸或Phe-Ala-进行反应。
11.如权利要求10中的制备方法，该方法进一步还可将所述化合物转化成它的药理耐受盐。
12.如权利要求1至6中的一个或多个权利要求所述的化合物的制备方法，该方法包括将利古里亚游动放线菌、DSM11797或加尔巴丁游动放线菌或DSM11796于培养基中进行发酵培养，分离得到式1所示的化合物。
13.如权利要求12中的制备方法，该方法进一步将化合物转化成它的药理耐受盐。
14.如权利要求12所述的制备方法，其中将利古里亚游动放线菌、DSM11797或加尔巴丁游动放线菌或DSM11796在含碳源、氮源、普通无机盐和微量元素的培养基中，于有氧的条件下进行发酵培养。
15.如权利要求12-14之一所述的制备方法，其中发酵培养是在以0.5～5％的甘露醇和0.5～5％的大豆粉作为碳源的培养基中进行。
16.如权利要求12至14中的一个权利要求所述的制备方法，其中发酵培养是在温度为20～35℃之间，pH为4～10之间的有氧条件下进行。
17.如权利要求15中的制备方法，其中发酵培养是在温度为20～35℃之间，pH为4～10之间的有氧条件下进行。
18.如权利要求1至8中的一个或多个权利要求所述的化合物用于制备药物的应用。
19.如权利要求1至8中的一个或多个权利要求所述的化合物用于生产治疗和预防细菌感染疾病的药物的用途。
20.一种药物，其特征在于该药物含有至少一种如权利要求1至8中的一个权利要求所述的化合物和一种或多种生理上可接受的赋形剂。
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PB01 Publication
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Applicant after: Awentis Medicines Deutschland GmbH

Applicant before: Hoechst Marion Roussel Deutschland GmbH

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C56 Change in the name or address of the patentee

Owner name: SANOFI- AVENTIS GERMAN CO., LTD.

Free format text: FORMER NAME OR ADDRESS: AVENTIS PHARMACY (GERMANY)INTERNATIONAL CO., LTD.

CP03 Change of name, title or address

Address after: Frankfurt, Germany

Patentee after: Hoechst Marion Roussel de GmbH

Address before: Frankfurt, Federal Republic of Germany

Patentee before: Awentis Medicines Deutschland GmbH

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Granted publication date: 20040908

Termination date: 20171015

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