CN116554325A - 抗b7h3抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本申请提供了鼠源抗B7H3(CD276)抗体及其嵌合形式和人源化形式。本申请还提供了包含上述抗体的药物组合物、疫苗、编码上述抗体的核苷酸分子、包含所述核苷酸分子的表达载体、包含所述表达载体的宿主细胞以及利用上述抗体来治疗B7H3相关的疾病的用途。

Description

抗B7H3抗体及其应用

技术领域

本申请涉及抗体领域，更具体地，本申请涉及抗B7H3的抗体及其应用。

背景技术

在细胞免疫反应中，T细胞的增殖和活化不仅需要T细胞受体TCR识别APC或肿瘤细胞表面MHC提呈的第一信号，还需要共刺激分子提供的第二信号(Hodge J W，Greiner J W，Tsang K Y等人，2006)。B7-CD28超家族是目前发现的共刺激分子家族之一，属于免疫球蛋白超家族。B7家族分子可提供刺激信号来增强和维持T细胞免疫反应，也可产生抑制信号来限制和减弱T细胞免疫反应。因此该家族在肿瘤疾病、器官移植和自身免疫病中发挥重要作用。

B7H3属于B7家族中的一员。根据功能，B7家族可以分为3类(SeligerB，MarincolaFM，Ferrone S等人，2008)。第一类：B7-1(CD80)和B7-2(CD86)；第二类：B7-H1(PD-L1)和B7-DC(PD-L2)；第三类：B7H3(CD276)和B7-H4(B7x)。第三类成员的受体尚未被确定，但被认为参与了共刺激和共抑制途径。

针对B7-H1(也即PD-L1)的免疫检查点PD1抗体O药(Opdivo)和K药(Kyytrudo)分别于2014年12月和4月上市，得益于此，针对B7H1的抗体的研发于今年得到了快速的发展。罗氏的Tecentriq也在两年后的10月份准许上市，使得B7家族在肿瘤免疫治疗领域获得了更多的关注和研发的热情。

另外作为B7家族第一类成员B7-1和B7-2受体的CTLA-4，一直是众多药企的研究重点。最早面世的伊匹单抗在治疗晚期黑色素瘤方面具有很好的疗效，但由于其严重的副作用又使之增加了众多不确定性，因此需要更多的机制研究及更有效低毒的疗法。

对于B7家族的前两类，目前对其进行的开发和研究相对较多，而作为第三类的B7H3却有些发展缓慢。这主要是由于其配体依然未知，以及其作用机制尚不明确，导致其在抗肿瘤方面的选择依然面临着众多困难。

B7H3，也称CD276，属于I型跨膜蛋白，胞外区包含一对或两对相同的免疫球蛋白可变区和恒定区，胞内区很短，没有明确的信号基序，从而形成两种主要的分子形式2IgB7H3和4IgB7H3，以及游离形态。人的4IgB7H3，位于15号染色体，小鼠B7H3基因则位于第9号染色体。B7H3是进化最保守的B7家族成员之一，因为它在从硬骨鱼类到哺乳动物的各种物种中普遍表达。另外在多种非人灵长类动物体内，都表达这两种形式的B7H3，但在小鼠等动物体内只包括2IgB7H3这一种形式。

B7H3的转录本广泛表达于心脏、肝脏、胎盘、前列腺、睾丸、子宫、胰腺、小肠和结肠等组织。而B7H3蛋白的表达更多地局限于细胞表面，例如活化的树突状细胞、单核细胞、T细胞、B细胞和NK细胞(Wang L，Kang F B，Shan B E.2014)。

许多研究揭示B7H3异常高表达于多种癌细胞或组织中，包括胃癌、肺癌、前列腺癌、肾癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌、肝癌、结肠直肠癌、口腔癌、膀胱癌、骨肉瘤及血液系统恶性疾病，其表达水平与患者预后不良和临床转归差密切相关，推测其参与了肿瘤的免疫逃避。B7H3在免疫系统中可能发挥双重作用。一方面，B7H3作为一种共刺激分子，对CD4+和CD8+细胞具有共刺激作用，诱导细胞免疫，并在T细胞受体信号传导下选择性增强干扰素-γ(IFNG)的产生。

另一方面，在人类和小鼠中的实验证明，B7H3也具有共抑制作用(Veenstra R G，Flynn R，Kreymborg K等人，2015)，它可以抑制Treg细胞，从而使肿瘤逃逸免疫反应(HofmeyerKA，RayA，ZangX.2008)。这可能与NFAT、NF-κB和AP-1因子相关。虽然其分子机制还不明确，可能是由于分子存在不同形式引起不同的功能，但作为一种可能的免疫检查点分子，是一个有前景的肿瘤免疫治疗靶标。

已有文献证明B7H3通过对T细胞的抑制作用，在肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用，此外，它在非免疫系统中也起了重要作用。研究表明B7H3参与了癌细胞转移潜能的调节，还可能影响肿瘤的增殖、侵袭等生物学特征。

B7H3在膀腺癌、前列腺癌、黑色素瘤等肿瘤细胞系中的高表达被证明可促进肿瘤细胞的侵袭和转移。在黑素瘤细胞中，沉默B7H3可降低细胞的基质凝胶侵袭能力。这可能是因为B7H3沉默可降低与转移相关的蛋白的表达，例如基质金属蛋白酶(MMP)-2，信号转导和转录激活因子3(STAT3)以及分泌的白介素8(IL-8)的水平。

另外，在众多的中外文献中发现B7H3在肿瘤微环境中的血管内皮上高表达，或许也提示B7H3在抑制或促进血管生成有一定作用，对于抑制肿瘤和治疗老年黄斑变性(AMD)等疾病有一定潜力。

对于B7H3分子，目前市场上研究进展最快的是MacroGenics公司的Enoblituzumab(MGA271)，其抗肿瘤作用是通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)进行的。该抗体已经进入到II期临床试验，并显示令人鼓舞的初步结果。抗体-药物偶联物(ADC)可起到生物导弹的作用，放射标记靶向B7H3的单抗8H9成功用于转移性神经细胞瘤的临床治疗，而放射标记的人源化8H9抗体已用于开展腹膜癌、神经胶质瘤以及中枢神经肿瘤等多种肿瘤的临床试验。双特异抗体、嵌合抗体、受体T细胞(CAR-T)、小分子抑制剂的开发丰富了肿瘤免疫治疗的策略，联合应用促进协同效应，进一步对其受体和机制的研究为设计更有效的治疗药物奠定基础。

发明内容

为解决上述技术问题，本申请提供了一种抗B7H3抗体及其应用。具体而言，本申请提供了以下技术方案。

在第一方面，本申请提供了特异性结合B7H3的抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列中的任意一项或多项，其中所述HCDR1序列为GDSITSNY(SEQ ID NO：1)；所述HCDR2序列为ISNSGST(SEQ ID NO：2)；和所述HCDR3序列为ARGEGRYGFGAY(SEQ ID NO：3)。

在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分还包含轻链可变区，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3序列中的任意一项或多项，其中所述LCDR1序列包含氨基酸序列KSLLHGNGNTY(SEQ ID NO：4)；所述LCDR2序列包含氨基酸序列RMS(SEQ ID NO：5)；和所述LCDR3序列包含氨基酸序列MQHLEYPFT(SEQ ID NO：6)。

在一些实施方案中，所述抗体为鼠源抗体。优选地，所述鼠源抗体的重链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO：7，和/或所述鼠源抗体的轻链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO：8。

在一些实施方案中，所述抗体为嵌合抗体。优选地，所述嵌合抗体包含重链和/或轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO：9，和/或所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO：10。

在一些实施方案中，所述抗体为人源化抗体。优选地，所述人源化抗体的重链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或者SEQ ID NO：13，和/或所述人源化抗体的轻链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO：14或者SEQ ID NO：15。

在第二方面，本申请提供了药物组合物，其包含第一方面所述的特异性结合B7H3的抗体或其抗原结合部分以及药学上可接受的载体。

在一些实施方案中，所述药物组合物还包含一种或多种其他活性成分。在一些实施方案中，所述活性成分为化疗剂、PD-1结合拮抗剂、4-1BB结合激动剂等。

在第三方面，本申请提供了疫苗，其包含第一方面所述的抗体或其抗原结合部分，以及任选的免疫佐剂。

在第四方面，本申请提供了核苷酸分子，其编码第一方面所述的特异性结合B7H3的抗体或其抗原结合部分。

在第五方面，本申请提供了表达载体，其包含第四方面所述的核苷酸分子。

在第六方面，本申请提供了宿主细胞，其包含第四方面所述的核苷酸分子或第五方面所述的表达载体。

在第七方面，本申请提供了第一方面所述的特异性结合B7H3的抗体或其抗原结合部分、第二方面所述的药物组合物、第三方面所述的疫苗、第四方面所述的核苷酸分子、第五方面所述的表达载体或第六方面所述的宿主细胞在制备用于抑制或促进血管生成、抑制Treg功能、促进T细胞增殖、引发T细胞介导的反应、提高效应T细胞的功能、提高记忆T细胞的功能、抑制或促进血管生成、治疗老年黄斑变性(AMD)、和/或有效抑制肿瘤生长的药物中的用途。

在第八方面，本申请提供了本申请提供了第一方面所述的特异性结合B7H3的抗体或其抗原结合部分、第二方面所述的药物组合物、第三方面所述的疫苗、第四方面所述的核苷酸分子、第五方面所述的表达载体或第六方面所述的宿主细胞在制备用于预防和/或治疗B7H3相关的疾病的药物中的用途。

在第九方面，本申请提供了检测试剂或者试剂盒，其包含第一方面所述的特异性结合B7H3的抗体或其抗原结合部分。

在第十方面，本申请提供了预防和/或治疗B7H3相关的疾病的方法，其包括向有需要的个体施用第一方面所述的特异性结合B7H3的抗体或其抗原结合部分、第二方面所述的药物组合物、第三方面所述的疫苗、第四方面所述的核苷酸分子、第五方面所述的表达载体或第六方面所述的宿主细胞。

在一些实施方案中，所述方法还包括联合施用其他的治疗剂，例如化疗剂、PD-1结合拮抗剂、4-1BB结合激动剂等。

本申请的特异性结合B7H3的抗体或其抗原结合部分能够与B7H3特异性结合，并且具有以下的一种或多种效应：具有B7H3抑制剂功能，刺激T细胞的增殖活化，诱导B7H3介导的抗肿瘤免疫应答，抑制或促进血管生成，治疗老年黄斑变性(AMD)等眼部疾病，和/或抑制肿瘤生长等。

附图的简要说明

图1显示了细胞融合实验后，ELISA检测杂交瘤上清与人4IgB7H3-his结合的实验结果，其中1C和7A的孔为阴性对照，4H和5H的孔为阳性对照，加粗字体为筛选出的阳性孔。

图2-1显示了ELISA检测杂交瘤上清与鼠mB7H3-his结合的实验结果，其中12A、12B、12C和12D的孔为阴性对照，3F、3H、7C、7G、8F、12G和12H的孔为阳性对照，加下划线的孔为筛选出的阳性孔。

图2-2显示了图2-1的ELISA检测结果对应的克隆编号，其中标注的8个孔即为图2-1筛选出的阳性孔对应的克隆编号。

图3显示了流式细胞术检测三株ELISA筛选出的2#、48#、248#三株阳性杂交瘤抗体与293T细胞的结合实验。

图4显示了流式细胞术检测384#克隆的A4、A5、B8、D2、D4、G7、G9等7株亚克隆抗体与293T细胞的结合实验。

图5显示了通过流式细胞术检测不同浓度的B7H3嵌合抗体B7H3-Chi与HCC827细胞的结合实验。

图6显示了通过流式细胞术检测B7H3人源化抗体(B7H3-1、B7H3-2、B7H3-3)及嵌合抗体B7H3-Chi与CT26-B7H3细胞的结合实验。

图7显示了通过激光共聚焦显微镜观察的方法(放大40X)检测B7H3-1与HCC827细胞的结合情况。

发明的详细描述

提供以下定义和方法以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，本申请的术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。

定义

为容易地理解本申请，首先定义本文中使用的某些术语。

如本文所用的，术语“抗体”指包含四条多肽链，即通过双硫键互连的两条重链(H)及两条轻链(L)的免疫球蛋白分子，以及其多聚体(例如IgM)。各重链包含重链可变区(缩写为VH)及重链恒定区(缩写为CH)。重链恒定区包含三个域，即CH1、CH2及CH3。各轻链包含轻链可变区(缩写为VL)及轻链恒定区(缩写为CL)。轻链恒定区包含一个域(CL1)。VH及VL区可进一步细分成称为互补决定区(CDR)的高变区，其中穿插有称为构架区(FR)的保守区。在一些实施方案中，从N-末端至C-末端，轻链与重链可变结构域均包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3与FR4。

如本文所用的，术语抗体的“抗原结合部分”是指负责结合抗原的完整抗体分子的一部分或区段。抗原结合域可以包含重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)或上述两者。抗体的抗原结合片段可使用任何适合的标准技术从完整抗体分子制备，所述标准技术包括蛋白水解消化或重组遗传工程化技术等。抗原结合部分的非限制性实例包括：Fab片段、F(ab′)₂片段、Fd片段、Fv片段、单链Fv(scFv)分子、单域抗体、dAb片段及由模拟抗体高变区的氨基酸残基组成的最小识别单元(例如分离的CDR)。术语“抗原结合部分”也包括其它工程化的分子，如双抗体、三抗体、四抗体及微型抗体等。例如，本文中所述Fd片段指由VH与CH1结构域组成的抗体片段；Fv片段由抗体的单臂中VL与VH结构域组成；dAb片段(Ward等人，Nature1989；341：544-546)由VH结构域组成。

本领域技术人员公知，互补决定区(CDR，通常有CDR1、CDR2及CDR3)是可变区中对抗体的亲和力和特异性影响最大的区域。VH或VL的CDR序列有两种常见的定义方式，即Kabat定义和Chothia定义，例如参见Kabat等人，“Sequences of Proteins ofImmunological Interest”，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991)；Al-Lazikani等人，J Mol Biol273：927-948(1997)；以及Martin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：9268-9272(1989)。对于给定抗体的可变区序列，可以根据Kabat定义或者Chothia定义来确定VH和VL序列中CDR区序列。在本申请的实施方案中，利用Kabat定义CDR序列。在本文中，重链可变区的CDR1、CDR2及CDR3分别简称为HCDR1、HCDR2及HCDR3；轻链可变区的CDR1、CDR2及CDR3分别简称为LCDR1、LCDR2及LCDR3。

对于给定抗体的可变区序列，可以通过多种方式分析可变区序列中CDR区序列，例如可以利用在线软件Abysis确定(http：//www.abysis.org/)。

如本文所用的，术语“特异性结合”，是指两个分子之间的非随机结合反应，例如抗体至抗原表位的结合，例如抗体以比其对非特异性抗原的亲和性大至少两倍的亲和性结合于特异性抗原的能力。然而应了解，抗体能够特异性结合于两种或更多种与其序列相关的抗原。例如，本申请的抗体可特异性结合于人与非人(例如小鼠或非人灵长动物)的B7H3。

如本文所用的，术语“单克隆抗体”指由基本同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能在少量个体中存在自然发生的突变以外，组成群体的各个抗体是相同的。本文所述单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与来源于具体物种或属于具体抗体类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而重链和/或轻链的余下部分与来源于另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，并且还包括这样的抗体的片段，只要它们能表现出所期望的生物学活性(参见，美国专利号4,816,567；和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984))。

如本文所用的，术语“鼠源抗体”是指其中所有恒定结构域序列均为小鼠序列的任何抗体。此类抗体可通过杂交瘤产生。

如本文所用的，术语“嵌合抗体”是指包含来自两种或多种不同抗体的区段的抗体。在一些实施方案中，一个或多个CDR衍生自小鼠抗B7H3抗体。在另一些实施方案中，所有CDR均衍生自小鼠抗B7H3抗体。在一些实施方案中，在嵌合抗体中组合来自一种以上小鼠抗B7H3抗体的CDR。例如，嵌合抗体可包含来自第一种小鼠抗B7H3抗体中轻链的CDR1、来自第二种小鼠抗B7H3抗体中轻链的CDR2、与来自第三种小鼠抗B7H3抗体中轻链的CDR3，以及来自重链的CDR可衍生自一种或多种其它抗B7H3抗体。此外，框架区可来自相同抗B7H3抗体或来自一个或多个不同的个体。本申请的嵌合抗体可包含鼠源抗体的可变区(包括重链可变区VH和/或轻链可变区VL)和人抗体的恒定区。

如本文所用的，术语“人源化抗体”是指CDR移植抗体，具体是指将小鼠的CDR区序列移植到人的抗体可变区框架中产生的抗体。目的是克服嵌合抗体由于携带大量其他物种例如小鼠的蛋白成分从而在人体中诱导强烈的免疫副反应。

如本文所用的，术语“核苷酸分子”可以指DNA分子及RNA分子，其可以是单链或双链的。核苷酸分子分子也可以为cDNA。

如本文所用的，术语“B7H3相关的疾病”包括与B7H3信号通路相关的疾病和/或病症。示例性的B7H3相关的疾病或病症包括癌症，例如结肠癌、黑色素瘤、间皮质瘤、肾细胞癌、淋巴瘤、晚期实体瘤以及上述的转移瘤，及AMD等眼部病变。

如本文所用的，术语“EC50”是指半数最大效应浓度(concentration for 50％ofmaximal effect，EC50)，指能引起50％最大效应的浓度。

如本文所用的，术语“免疫反应”指脊椎动物内针对外来作用剂的生物反应，该反应保护生物体抵抗此类作用剂及由其引起的疾病。免疫反应系由免疫系统的细胞(例如，T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、树突细胞或嗜中性粒细胞)及由此类细胞中的任一者或由肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子及补体)的作用介导，其导致选择性靶向、结合、损害、破坏和/或自脊椎动物身体消除侵入病原体、经病原体感染的细胞或组织、癌性或其他异常细胞或在自体免疫或病理炎症的情形下正常人类细胞或组织。免疫反应包括T细胞(例如效应T细胞)或Th细胞(例如CD4⁺或CD8⁺T细胞)的活化或抑制或Treg细胞的抑制。

如本文所用的，术语“癌症”指以体内异常细胞不受控生长为特点的一大类疾病。失调的细胞分裂可形成侵袭相邻组织且可经由淋巴系统或血流转移至身体的远处部分的恶性肿瘤或细胞。

如本文所用的，术语“治疗”指对受试者实施的任何类型的介入或方法或向其施用活性剂，其中目的是逆转、缓和、改善、抑制或缓解或预防症状、并发症、病况或与疾病相关的进展、发展、严重程度或复发。

如本文所用的，术语“预防”指对未患疾病的受试者施用，以防止疾病发生或使其影响(若存在)最小化。

如本文所用的，术语“血管生成”指受试者正常身体组织或肿瘤微环境中的新生血管生成及血管成熟过程。

如本文所用的，术语“眼部疾病”指老年黄斑变性(AMD)、老年黄斑变性湿性期/湿性黄斑变性(wAMD)、糖尿病性黄斑水肿(DME)、脉络膜新生血管(CNV)、视网膜静脉阻塞(RVO)、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、视网膜分支静脉阻塞(BRVO)、病理性近视(PM)等一种或多种疾病。

具体实施方式

本申请提供了特异性结合B7H3的新型抗B7H3抗体或其抗原结合部分。本申请的抗体或其抗原结合部分可结合靶细胞表面的B7H3分子，并可以结合2IgB7H3和4IgB7H3两种分子结构。

本发明人筛选得到了一些杂交瘤细胞，其上清中的抗体能够与小鼠B7H3，以及人或猴的2IgB7H3、4IgB7H3两种分子结构结合。

本发明人还通过基因工程手段从鼠源抗B7H3抗体制备了嵌合抗体和人源化抗体形式，这些抗体同样能够与人或猴的B7H3结合，且可阻断配体与B7H3的结合，从而有效地诱导B7H3介导的免疫反应，并起到预防或治疗B7H3相关的疾病的作用。

本申请还提供了编码该抗体或其抗原结合片段的核苷酸分子、包含所述核苷酸分子的表达载体、包含所述核苷酸分子或表达载体的宿主细胞、制备和纯化该抗体的方法以及所述抗体或其抗原结合片段的医学和生物学应用，例如预防或治疗B7H3相关的疾病或病症。本申请还涵盖使用所述抗体或其抗原结合片段来检测B7H3及调节B7H3活性的方法以及相关检测试剂或试剂盒。

可额外用于抗体方法中的合适的技术包括基于B7H3的亲和纯化、非变性凝胶纯化、HPLC或RP-HPLC、在蛋白A柱上纯化、或这些技术的任何组合。可使用ELISA测定法测定B7H3抗体同种型，例如可使用鼠Ig吸附的抗人Ig鉴定人Ig。

可通过本领域已知的多种标准的蛋白纯化或重组表达技术中的任何一种来产生适于产生抗体的B7H3。适于产生免疫反应的B7H3的形式包括B7H3子序列(例如免疫原性片段)。另外的B7H3的形式包括B7H3表达细胞、含有B7H3的制品或细胞提取物或级分、部分纯化的B7H3。

第一方面，本申请提供了特异性结合B7H3的抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列中的任意一项或多项，其中所述HCDR1序列包含GDSITSNY(SEQ ID NO：1)；所述HCDR2序列包含ISNSGST(SEQ ID NO：2)；和所述HCDR3序列包含ARGEGRYGFGAY(SEQ ID NO：3)。

在优选的实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合部分的重链可变区包含SEQID NO：1所示的HCDR1、SEQ ID NO：2所示的HCDR2和SEQ ID NO：3所示的HCDR3序列。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合部分还包含轻链可变区，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3序列中的任意一项或多项，其中所述LCDR1序列包含KSLLHGNGNTY(SEQ ID NO：4)；所述LCDR2序列包含RMS(SEQ ID NO：5)；和所述LCDR3序列包含MQHLEYPFT(SEQ ID NO：6)。

在优选的实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合部分的轻链可变区包含SEQID NO：4所示的LCDR1、SEQ ID NO：5所示的LCDR2以及SEQ ID NO：6所示的LCDR3序列。

在优选的实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO：1所示的HCDR1、SEQ ID NO：2所示的HCDR2和SEQ ID NO：3所示的HCDR3序列，并且所述轻链可变区包含SEQ ID NO：4所示的LCDR1、SEQID NO：5所示的LCDR2、SEQ ID NO：6所示的LCDR3序列。

在一些更具体的实施方案中，本文公开的抗体可以为抗人B7H3单克隆抗体。抗B7H3抗体类型与亚型可由本领域已知的任何方式确定。通常，抗体类型与亚型可使用特异于特定抗体类型与亚型的抗体确定。可使用ELISA测定法测定抗B7H3抗体同种型，例如可使用鼠Ig吸附的抗人Ig鉴定人Ig。

在一些实施方案中，本文所述的抗体为鼠源抗体，优选地，所述鼠源抗体的重链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO：7，和/或所述鼠源抗体的轻链可变区包含氨基酸序列如SEQ ID NO：8。

在优选的实施方案中，本文所述的鼠源抗体包含SEQ ID NO：7所示的重链可变区和SEQ ID NO：8所示的轻链可变区。

在一些实施方案中，本文所述的抗体为嵌合抗体。本文所述的嵌合抗体包含鼠源抗体的可变区(包括重链可变区VH和/或轻链可变区VL)和人抗体的恒定区。

在优选的实施方案中，本文所述的嵌合抗体包含鼠源抗体的可变区(包括重链可变区和轻链可变区)和人抗体的恒定区。

优选地，所述嵌合抗体包含SEQ ID NO：9所示的重链，和/或SEQ ID NO：10所示的轻链。

在优选的实施方案中，本文所述的嵌合抗体包含SEQ ID NO：9所示的重链和SEQID NO：10所示的轻链。

在一些实施方案中，本文所述的抗体为人源化抗体。本文所述的人源化抗体包含鼠源抗体的CDR区(包括HCDR1、HCDR2和HCDR3中的任意一项或多项和/或LCDR1、LCDR2和LCDR3中的任意一项或多项)、人抗体可变区的框架区(包括FR1、FR2、FR3和FR4中的任意一项或多项)，以及任选地人抗体的恒定区。

在优选的实施方案中，本文所述的人源化抗体包含鼠源抗体的CDR区(包括HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3)、人抗体可变区的框架区(包括FR1、FR2、FR3和FR4)，以及任选地人抗体的恒定区。

优选地，所述人源化抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：12或者SEQ ID NO：13所示，和/或人源化抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：14或者SEQ ID NO：15。

在优选的实施方案中，本文所述的人源化抗体包含SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或者SEQ ID NO：13所示的重链可变区以及SEQ ID NO：14或者SEQ ID NO：15所示的轻链可变区。

本文所述的抗体还可以包含鼠或人抗体恒定区。鼠抗体恒定区包括鼠IgG1、IgG2a、IgG2b或IgG3的重链恒定区以及κ或λ型轻链恒定区等。人抗体恒定区包括人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区以及κ或λ型轻链恒定区等。

在一些实施方案中，本文所述的B7H3为啮齿类B7H3。优选地，本文所述的啮齿类B7H3选自小鼠或者大鼠B7H3。

在一些实施方案中，本文所述的B7H3为灵长类B7H3。优选地，本文所述的灵长类B7H3选自人B7H3或猴B7H3。

在一些实施方案中，本文所述的抗原结合部分选自：Fab片段、Fab’片段、F(ab’)₂片段、Fv片段、scFv片段、Fd片段或单域抗体。

本文所用的术语“Fab片段”包含轻链以及重链的CH1和可变区。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。

本文所用的术语“Fab’片段”含有轻链以及重链的部分或片段，所述部分或片段含有VH结构域和CH1结构域以及在CH1和CH2结构域之间的区域，使得在2个Fab’片段的两条重链之间可以形成链间二硫键，以形成F(ab’)₂分子。

本文所用的术语“F(ab’)₂片段”含有两条轻链和两条重链，所述重链含有在CH1和CH2结构域之间的恒定区的一部分，使得在两条重链之间形成链间二硫键。F(ab’)₂片段因而由两个Fab’片段组成，而两个Fab’片段通过两条重链之间的二硫键连接在一起。

本文所用的术语“Fv片段”包含来自重链和轻链的可变区，但是缺少恒定区。

本文所用的术语“单链Fv”或“scFv”，是指包含抗体的VH结构域和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域以单一多肽链形式存在。通常，Fv多肽还包含VH结构域和VL结构域之间的多肽接头，所述接头使scFv能够形成期望的结构以进行抗原结合。

本文所用的术语“单域抗体”指包含一个重链可变区(VHH)和两个常规的CH2与CH3区的抗原结合部分。最初是在羊驼外周血液中发现的一种天然缺失轻链的抗体，该抗体虽然只包含一个重链可变区(VHH)和两个常规的CH2与CH3区，但却不像人工改造的单链抗体片段(scFv)那样容易相互沾粘，甚至聚集成块。更重要的是单独克隆并表达出来的VHH结构具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性，是已知的可结合目标抗原的最小单位。VHH晶体分子量只有15KDa，因此也被称作纳米抗体(Nanobody，Nb)。

在第二方面，本申请提供了药物组合物，其包含第一方面所述的抗体或其抗原结合部分以及药学上可接受的载体。

药学上可接受的载体和稀释剂包括盐水、水性缓冲溶液、溶剂和/或分散介质。这种载体和稀释剂的使用是本领域熟知的。可用作药学上可接受的载体的材料的一些非限制性实例包括：(1)糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素和乙酸纤维素；(4)粉末状黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)润滑剂，例如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠和滑石；(8)赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；(9)油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇，例如丙二醇；(11)多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇(PEG)；(12)酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙基酒精；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；(22)填充剂，例如多肽和氨基酸；(23)血清组分，例如血清白蛋白、HDL和LDL；(22)C₂-C₁₂醇类，例如乙醇；以及(23)药物制剂中所用的其他无毒的相容物质。湿润剂、着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、调味剂、芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可以存在于药物制剂中。

在一些实施方案中，本文所述的药物组合物还包含一种或多种其他活性成分，例如用于治疗B7H3相关的疾病如肿瘤的药剂。

在第三方面，本申请提供了疫苗，其包含第一方面所述的抗体或其抗原结合部分，以及任选的免疫佐剂。

一般来说，该疫苗被制备成可注射的，例如制备成液态的溶液或者悬浮液，或者适于在注射前再悬浮于液体中的固体形式。该制备物也可以是乳化的。活性的免疫原性组分通常与药学上可接受的并且与所述活性成分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂为如水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等或者其组合。除此之外，疫苗也可以按照需要含有少量的辅料，如润湿剂或者乳化剂，pH缓冲剂或者提高所述疫苗的效果的佐剂。

将疫苗以与其剂型相容的方式给予，并且施用量是治疗上有效的和能产生免疫性的。所施用的量取决于所治疗的受试者，包括例如个体的免疫系统产生免疫应答的能力、给药途径等，具体的量由医师判断。对于初次给予和加强注射而言，适用的治疗方案也是可以变化的。在一些实施方案中，疫苗经静脉内递送，或者直接地递送到肿瘤或者感染的位点，或者其他的疫苗给药的传统方法。

在第四方面，本申请提供了核苷酸分子，其编码第一方面所述的抗体或其抗原结合部分。

在优选的实施方案中，本文所述的核苷酸分子可以是适合在宿主细胞中表达的密码子优化的核苷酸分子。例如根据密码子的简并性，其仍然编码同样的蛋白质。根据所用宿主细胞进行密码子优化的方法是本领域技术人员公知的。

在第五方面，本申请提供了表达载体，其包含第三方面所述的核苷酸分子。

可以使用任何合适的表达载体。例如，原核克隆载体包括来自大肠杆菌的质粒，如colEl、pCRl、pBR322、pMB9、pUC、pKSM和RP4。原核载体还包括噬菌体DNA如M13和其它丝状单链DNA噬菌体的衍生物。可用于酵母的载体的实例是2μ质粒。用于在哺乳动物细胞中表达的合适载体包括以下众所周知的衍生物：SV-40、腺病毒、逆转录病毒衍生的DNA序列以及衍生自功能性哺乳动物载体(如上述那些)和功能性质粒和噬菌体DNA的组合的穿梭载体。

另外的真核表达载体为本领域已知的(例如，P J.Southern&P.Berg，J.Mol.Appl.Genet，1：327-341(1982)；Subramani等人，Mol.Cell.Biol，1：854-864(1981)；Kaufinann&Sharp，″Amplification And Expression of Sequences Cotransfected witha Modular Dihydrofolate Reductase Complementary DNA Gene，″J.Mol.Biol，159：601-621(1982)；Kaufhiann&Sharp，Mol.Cell.Biol，159：601-664(1982)；Scahill等人，″Expression And Characterization Of The Product Of A Human Immune InterferonDNA Gene In Chinese Hamster Ovary Cells，″Proc.Nat′l Acad.Sci USA，80：4654-4659(1983)；Urlaub&Chasin，Proc.Nat′l Acad.Sci USA，77：4216-4220，(1980)，将其全部通过引用并入本文)。

可用于本申请的表达载体含有至少一个表达控制序列，其与待表达的DNA序列或片段可操作连接。将控制序列插入载体中以控制和调节克隆的DNA序列的表达。有用的表达控制序列的实例是lac系统，trp系统，tac系统，trc系统，噬菌体λ的主要操纵子和启动子区，fd外壳蛋白的控制区，酵母的糖酵解启动子，例如3-磷酸甘油酸激酶的启动子，酵母酸性磷酸酶的启动子，例如Pho5，酵母α-交配因子的启动子，以及来源于多瘤病毒、腺病毒、逆转录病毒和猿猴病毒的启动子，例如SV40的早期和晚期启动子和已知控制原核或真核细胞及其病毒或其组合的基因表达的其它序列。

在第六方面，本申请提供了宿主细胞，其包含四方面所述的核苷酸分子或第五方面所述的表达载体。

在一些实施方案中，本文所述的宿主细胞为哺乳动物细胞。哺乳动物细胞可以包括但不限于CHO细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞和PER.C6细胞。本领域技术人员能够根据需要选择适合的宿主细胞。

本文公开的抗B7H3单克隆抗体的制备方法可包括：在表达条件下培养宿主细胞，从而表达抗B7H3单克隆抗体；分离和纯化表达的抗B7H3单克隆抗体。利用上述方法，可以获得粗抗B7H3单克隆抗体。然后通过纯化方法，包括基于B7H3的亲和纯化、非变性凝胶纯化、HPLC或RP-HPLC、分子排阻、在蛋白A柱上纯化、或这些技术的任何组合，将抗B7H3单克隆抗体纯化为基本均一的物质，例如在SDS-PAGE电泳上为单一条带。

在第七方面，本申请提供了第一方面所述的特异性结合B7H3的抗体或其抗原结合部分、第二方面所述的药物组合物、第三方面所述的疫苗、第四方面所述的核苷酸分子、第五方面所述的表达载体或第六方面所述的宿主细胞在制备用于抑制或促进血管生成、抑制Treg功能、促进T细胞增殖、引发T细胞介导的反应、提高效应T细胞的功能、提高记忆T细胞的功能、抑制或促进血管生成、治疗老年黄斑变性(AMD)、和/或有效抑制肿瘤生长的药物中的用途。

在第八方面，本申请提供了本申请提供了第一方面所述的特异性结合B7H3的抗体或其抗原结合部分、第二方面所述的药物组合物、第三方面所述的疫苗、第四方面所述的核苷酸分子、第五方面所述的表达载体或第六方面所述的宿主细胞在制备用于预防和/或治疗B7H3相关的疾病的药物中的用途。

在第九方面，本申请提供了检测试剂或者试剂盒，其包含第一方面所述的特异性结合B7H3的抗体或其抗原结合部分。

本文所述的抗体或其抗原结合部分可与可检测部分结合。示例性的可检测部分包括但不限于放射性同位素例如碘125、碘-131、铯-137、铱192和钴60、辣根过氧化物酶、异硫氰酸荧光素、生物素、碱性磷酸酶、化学发光剂如鲁米诺类等。本领域技术人员可以根据需要选择适合的可检测部分与本申请的抗体或其抗原结合部分结合，从而实现不同的检测目的。

在第十方面，本申请提供了预防和/或治疗B7H3相关的疾病的方法，其包括向有需要的个体施用第一方面所述的特异性结合B7H3的抗体或其抗原结合部分、第二方面所述的药物组合物、第三方面所述的疫苗、第四方面所述的核苷酸分子、第五方面所述的表达载体或第六方面所述的宿主细胞。

在一些实施方案中，所述方法还包括施用预防和/或治疗B7H3相关疾病如肿瘤的第二药剂。

本文使用的术语“个体”是指哺乳动物，包括但不限于灵长类动物、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫以及诸如大鼠和小鼠的啮齿类动物。优选地，哺乳动物为非人类的灵长类或者人类。特别优选的哺乳动物是人。本文使用的“个体”和“受试者”可以互换使用。

“治疗”既指治疗性处理，也指预防性或防止性的措施，其目的就是预防或减缓(减轻)目标病理状态或病症。需要治疗的个体包括那些已经存在所述病症的个体，还包括那些将发展为该病症的或欲对其病症进行预防的个体。因此，本文中欲被治疗的个体已经被诊断为患有该病症或倾向于或易患该病症。

本文中所用的“治疗有效量”可以根据具体情况而定，本领域普通技术人员根据实际所需药量可以很容易地掌握，如可根据患者体重、年龄和病症情况来确定。

在第八和第十方面的任一实施方案中，所述B7H3相关的疾病为肿瘤。

在第八和第十方面的任一实施方案中，所述B7H3相关的疾病为眼部疾病。

在一些实施方案中，本文所述的肿瘤为原发性癌症或转移性癌症。在具体的实施方案中，肿瘤选自肺癌例如非小细胞肺癌、结直肠癌、膀胱癌、造血系统癌症例如白血病、乳腺癌、胃癌、食管癌、B淋巴细胞型非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、间变大细胞淋巴瘤、头颈癌例如头颈部鳞状细胞癌、恶性胶质瘤、肾癌、黑色素瘤、前列腺癌、骨癌、骨巨细胞瘤、胰腺癌、卵巢癌、肉瘤、肝癌、皮肤鳞癌、甲状腺癌、宫颈癌、鼻咽癌、子宫内膜癌，或上述肿瘤的转移癌。

在一些实施方案中，本文所述的血管生成指受试者正常身体组织或肿瘤微环境中的新生血管生成及血管成熟过程。

在一些实施方案中，本文所述的眼部疾病指老年黄斑变性(AMD)、老年黄斑变性湿性期/湿性黄斑变性(wAMD)、糖尿病性黄斑水肿(DME)、脉络膜新生血管(CNV)、视网膜静脉阻塞(RVO)、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、视网膜分支静脉阻塞(BRVO)、病理性近视(PM)等一种或多种疾病。

在任一方面的实施方案中，本文所述的方法、用途和药物组合物还可包括向个体施用第二药剂和/或治疗，例如作为联合疗法的一部分。第二药剂和/或治疗的非限制性实例可包括放射疗法、手术、吉西他滨、西司他丁、紫杉醇、卡铂、硼替佐米、AMG479、伏立诺他、利妥昔单抗、替莫唑胺、雷帕霉素、苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine)；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，诸如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱；长春地辛；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺肖林(novantrone)；替尼泊苷；依达曲沙(edatrexate)；正定霉素(daunomycin)；氨基蝶呤；希罗达(xeloda)；降低细胞增殖的PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR(例如，埃罗替尼)和VEGF-A的抑制剂以及上述任何的药学上可接受的盐、酸或衍生物。

本说明书和权利要求书中，词语“包括”、“包含”和“含有”意指“包括但不限于”，且并非意图排除其他部分、添加物、组分、或步骤。

应该理解，在本申请的特定方面、实施方案或实施例中描述的特征、特性、组分或步骤，可适用于本文所描述的任何其他的方面、实施方案或实施例，除非与之矛盾。

本发明公开了特异性结合哺乳动物(人、灵长类动物等)B7H3的抗体，本发明提供此类蛋白质在治疗、筛选和检测等方面的应用，如在癌症治疗中的用途。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明的范围内。本领域技术人员能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明。为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例

以下实施例用于说明本申请，但不用来限制本申请的范围。在不背离本申请精神和实质的情况下，对本申请方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本申请的范围。

若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基因插入到载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法。这样的方法对于本领域技术人员来说是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，例如参见Sambrook，J.，Fritsch，EF.和Maniais，T.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold spring Harbor Laboratory Press。

实施例1.抗B7H3抗体的杂交瘤的制备

制备方法如下：

1.取6-8周大的Balb/c小鼠，经背部皮下免疫4IgB7H3-his(北京百普赛斯生物科技股份有限公司，Cat：B73 H52E7)蛋白(100μg/剂/只)。2周免疫一次，共免疫3次。进行融合前为小鼠连续3天注射4IgB7H3-his蛋白。

2.进行融合前2天，取普通昆明鼠(KM)腹腔内巨噬细胞作为饲养层，接种于20块96孔细胞培养板中，然后置于37℃5％CO₂细胞培养箱中培养。

3.取来自经免疫接种的小鼠的脾与淋巴结的淋巴细胞与非分泌性骨髓瘤SP2/0细胞系融合，将细胞加入到提前铺有滋养层的96孔板中，对融合的细胞进行HAT选择(Galfreand Milstein，Methods Enzymol 1981；73：3-46)。

4.回收一组均分泌抗4IgB7H3特异性抗体的杂交瘤细胞。初次筛选是利用酶联免疫分析法(ELISA)确定杂交瘤分泌的抗4IgB7H3抗体的滴度。

实施例2.人4IgB7H3高表达细胞株的构建

人4IgB7H3高表达细胞株的构建

构建的人4IgB7H3高表达细胞株为稳转CT26-B7H3细胞株(购自康源博创生物科技(北京)有限公司，产品名称：CT26 CD276(B7H3)(KC-1364)，Lot No：20190822)。人4IgB7H3的氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示。

SEQ ID NO：16：NP_001019907.1CD276抗原同种型a前体[智人]

实施例3.杂交瘤的抗体的筛选

首先在杂交瘤细胞培养7-10天时，在显微镜下观察96孔细胞培养板中杂交瘤克隆的生长情况，在板子上标示出空白孔，及长克隆的孔中对应的克隆个数。随后通过以下方法筛选出抗4IgB7H3的鼠源抗体。

方法一：ELISA方法筛选产亲和型抗体的杂交瘤克隆配制浓度为1μg/ml的4IgB7H3-his蛋白，以100μl/孔包被96孔ELISA板，检测杂交瘤的抗体滴度。

取杂交瘤上清50μl，加50μl PBS，ELISA检测上清中抗体滴度，阳性对照为1∶1k稀释的融合前小鼠采血的血清。如图1显示其中一块96孔板杂交瘤细胞分泌抗体的ELISA结果，其中1C和7A的孔为阴性对照，4H和5H的孔为阳性对照，加粗字体为筛选出的阳性孔。

选择OD450大于或接近阳性对照OD值的孔为阳性克隆，依此规则筛选出阳性克隆，并对其进行进一步的ELISA筛选。

方法二：ELISA方法筛选鼠交叉阳性克隆

配制浓度为1μg/ml的mB7H3-his蛋白(义翘神州科技股份有限公司，Cat：50973-M08H)，以100μl/孔包被96孔ELISA板，检测方法一筛选出的杂交瘤细胞上清。

取杂交瘤上清50μl，加50μl PBS，ELISA检测上清中抗体滴度，阳性对照为1∶1k稀释的融合前小鼠采血的血清。如图2-1显示其中一块筛选与鼠B7H3蛋白有交叉反应的ELISA结果，其中12A、12B、12C和12D的孔为阴性对照，3F、3H、7C、7G、8F、12G和12H的孔为阳性对照，字体加下划线的孔为筛选出的阳性孔。图2-2为图2-1对应的克隆编号，其中标注的8个孔即为图2-1筛选出的阳性孔对应的克隆编号。

选择OD450大于或接近阳性对照OD值的孔为阳性克隆，依此规则筛选出阳性克隆，并以此去做流式筛选。

方法三：流式细胞术方法筛选产亲和型抗体的杂交瘤克隆

所用B7H3阳性检测抗体为抗B7H3-Ab-APC(CD276 Ab APC Mouse mAb，义翘神州科技股份有限公司，Cat：11188-MM06-A)；所用二抗为抗小鼠IgG APC(Biolegend，Cat：405308)。

收集一个T75细胞培养瓶的293T细胞，FACS缓冲液洗涤一次，用FACS缓冲液重悬计数，调整细胞浓度为2×10⁶/ml。以50μL/管的量将293T细胞加入到流式管中，然后每孔加入50μL经ELISA筛选出的阳性克隆的杂交瘤上清，并以抗B7H3-Ab-APC作为阳性对照，之后孵育0.5小时。

每孔加入3mlFACS缓冲液洗涤两次，杂交瘤上清样品加入APC羊抗小鼠IgG Fc二抗，孵育1小时后上流式细胞仪检测。

筛选规则为样品的流式指标Geom.平均值显著高于二抗阴性对照的Geom.平均值。

最终经过方法一、二、三的筛选，共获得17株阳性克隆的杂交瘤细胞，并对照原孔，统计如下表：

表1.杂交瘤筛选获得的阳性克隆统计表

实施例4.亚克隆筛选抗B7H3抗体

实施例3中获得的17株阳性克隆孔里面几乎都不是单一的克隆，因此无论选择哪个克隆作为备选，都需要进行亚克隆继续筛选。

为了优化缩小亚克隆所选阳性杂交瘤的范围，通过在6孔细胞培养板培养17株杂交瘤，至上清变黄细胞基本死亡，收取上清后离心取上清，经Protein A填料纯化获得鼠源杂交瘤抗体。然后检测杂交瘤抗体与293T细胞的结合，方法见实施例3的方法三，并计算EC50。任意挑选出的3株阳性鼠抗体的结合实验EC50检测结果如表2和图3所示。

表2.阳性杂交瘤抗体与293T细胞结合的EC50

随后选择对348#克隆进行亚克隆筛选。按0.8个细胞/孔，共铺5块96孔板，培养基为10％FBS+1640，待孔内细胞克隆长到大于1/4时，进行流式细胞术筛选，方法如实施例3中的方法三。检测结果如表3和图4所示。

表3. 384#亚克隆抗体结合实验EC50结果

随后通过Fortebio检测7个亚克隆上清与4IgB7H3-his的亲和力，结果如表4所示。

实施例5.制备抗B7H3嵌合抗体及结合活性验证

由实施例4可以发现384#克隆的所有亚克隆抗体具有与4IgB7H3-his接近的亲和力，随后对7株亚克隆细胞进行RNA提取，并反转录获得抗体的cDNA。之后用本实验室设计的抗体引物通过PCR扩增测序，最终获得鼠源抗B7H3抗体编码抗体可变区VH和VL的氨基酸序列(SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列)。然后将VH和VL分别构建到质粒pQKX1(hIgG1 CH)和pQKX2(hIgG1 CL)载体上以获得重链表达载体pQK B7H3-CH(重链序列如SEQID NO：9所示)和轻链表达载体pQK B7H3-CL(轻链序列如SEQ ID NO：10所示)。

将293Fv细胞(中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)稀释到1.5×10⁶个细胞/mL，终体积为200ml，37℃摇床培养24h。用转染体积10％的新鲜培养基稀释质粒pQKB7H3-CH和pQKB7H3-CL，按转染细胞体积计算，至浓度为1μg/mL。向稀释后质粒中按细胞体积的1/1000加入3mg/mL的PEI 200μl，立即涡旋震荡10秒，室温放置15分钟，将质粒/PEI混合物滴加到细胞培养基中，边滴加边轻轻摇动培养瓶，放入摇床培养，7天后收集培养上清，0.4μm的滤膜过滤后，使用Mab sure Lx 5ml纯化柱从培养上清中捕获抗体，流速设定为3ml/min，用5个柱体积的20mM PB+150mM Nacl，PH7.4平衡液平衡纯化柱，柱平衡稳定后上样，上样结束选择20mMPB+150mM Nacl，PH7.4淋洗，淋洗结束使用50mM柠檬酸PH3.0洗脱液进行洗脱，收集用1M Tris-Hcl，PH9.0中和洗脱的抗体(其重链和轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示)，命名为B7H3-Chi。

结合活性检测：

方法一：Fortebio检测B7H3-Chi与4IgB7H3-his和mB7H3-his的亲和力，结果如表5所示。B7H3-Chi与4IgB7H3-his和mB7H3-his均具有较好的亲和力。

方法二：流式细胞术方法检测

收集一个T75细胞培养瓶的HCC827细胞(购自中国医学科学院基础医学研究所)，FACS缓冲液洗涤一次，用FACS缓冲液重悬计数，调整细胞浓度为2×10⁶个细胞/ml；抗体梯度稀释。取10μL稀释后的各浓度抗体分别加入上述调整浓度后的细胞样品100μL，混匀，室温孵育1小时。

每孔加入2ml FACS缓冲液洗涤两次，加入APC抗人IgG Fc二抗(Biolegend，Cat409306)，孵育1小时，上流式细胞仪检测，结果见表6和图5。表6结果表明嵌合抗体B7H3-Chi与HCC827细胞特异性结合。

表6.B7H3-Chi与HCC827结合实验EC50结果

实施例6.抗B7H3人源化抗体的制备及结合实验检测

1、抗B7H3人源化抗体的制备

抗B7H3人源化抗体的VH的氨基酸序列如SEQ ID NO：11、12或13所示。抗B7H3人源化抗体的VL的氨基酸序列如SEQ ID NO：14、或15所示。

其中抗B7H3人源化抗体的VH、VL编码核酸序列通过全合成的方式构建成载体质粒pQKX1和pQKX2，以获得重链表达载体pQK B7H3-H1、pQKB7H3-H2、pQKB7H3-H3和轻链表达载体pQKB7H3-L1、pQK B7H3-L2。

将293Fv细胞稀释到1.5×10⁶个细胞/mL，终体积为200ml，37℃摇床培养24h。用转染体积10％的新鲜培养基稀释上述8个质粒，按转染细胞体积计算，至浓度为1μg/mL。向稀释后质粒中按细胞体积的1/1000加入3mg/mL的PEI 200μl，立即涡旋震荡10秒，室温放置15分钟，将质粒/PEI混合物滴加到细胞培养基中，边滴加边轻轻摇动培养瓶，放入摇床培养，7天后收集培养上清，0.4μm的滤膜过滤后，使用Mab sure Lx 5ml纯化柱从培养上清中捕获抗体，流速设定为3ml/min，用5个柱体积的20mM PB+150mM Nacl，PH7.4平衡液平衡纯化柱，柱平衡稳定后上样，上样结束选择20mM PB+150mM Nacl，PH7.4淋洗，淋洗结束使用50mM柠檬酸PH3.0洗脱液进行洗脱，收集用1M Tris-Hcl，PH9.0中和洗脱的抗体，分别命名为B7H3-1、B7H3-2、B7H3-3，如表7所示。

表7.抗B7H3人源化抗体的重链可变区和轻链可变区

2、抗B7H3人源化抗体的结合实验

方法一：Fortebio检测抗B7H3人源化抗体与2IgB7H3-his(北京百普赛斯生物科技股份有限公司，Cat：B73 H52E2)和mB7H3-his的结合。

检测结果如表8所示，人源化抗体B7H3-1、B7H3-2、B7H3-3与人和鼠B7H3都有结合。

方法二：流式细胞术检测B7H3人源化抗体及嵌合抗体B7H3-Chi与CT26-B7H3细胞的结合实验

方法参见实施例5的方法二，结果如图6所示。

实施例7.激光共聚焦显微镜检测B7H3人源化抗体与肿瘤细胞的结合

取HCC827细胞，胰酶消化后按照2e4个细胞/mL进行稀释。另将圆形玻片铺于24孔板中，按照每孔1mL将细胞悬液缓慢加入到24孔板中，将培养板置于37℃/5％CO₂培养箱培养过夜，待细胞充分贴壁。

第二天，取培养板中细胞爬片的玻片，PBS中洗三次后按照每玻片150μL体积加入PKH67(Sigma，MKCN7808)进行细胞的细胞膜染色：先在37℃培养箱孵育5min，后置于4℃冰箱孵育15min。染色结束后，用带有血清的培养基终止染色，并在PBS中洗三次。在片子上滴加PE(Sigma，GR3392101-1)直标的B7H3人源化抗体(B7H3-1，浓度为50μg/mL)后，先置于4℃结合30min，然后37℃孵育2h。

抗体孵育时间点结束后，将玻片在PBS中洗三次。将玻片置于4％多聚甲醛中固定20min。在PBS中洗三次后DAPI染色3-5min；PBS洗三遍后取封片剂置于玻片上进行封片。

室温待封片剂晾干，最后进行激光共聚焦荧光拍摄，观察抗体在细胞中定位。结果如图7所示。

可以理解，尽管本申请以上述具体形式描述了所涉及的发明，但这些发明并不局限于这些具体形式描述的特定内容。对本领域的技术人员显而易见的是，在不偏离本申请所描述的发明精神的前提下，还可对其中所涉及的发明包含的技术特征进行各种等同变化，这些变化都应该属于所述发明的范围之内。

序列表

<110> 北京免疫方舟医药科技有限公司

<120> 抗B7H3抗体及其应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Asp Ser Ile Thr Ser Asn Tyr

1 5

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ile Ser Asn Ser Gly Ser Thr

1 5

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ala Arg Gly Glu Gly Arg Tyr Gly Phe Gly Ala Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Lys Ser Leu Leu His Gly Asn Gly Asn Thr Tyr

1 5 10

<210> 5

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Arg Met Ser

1

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Phe Thr

1 5

<210> 7

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Ile Thr Ser Asn

20 25 30

Tyr Trp Asn Trp Leu Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Ser Asn Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Leu Ile Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Glu Gly Arg Tyr Gly Phe Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 8

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Ile Pro Val Ala Pro Gly

1 5 10 15

Ala Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Gly

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Leu Arg Pro Ser Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His

85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 9

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Ile Thr Ser Asn

20 25 30

Tyr Trp Asn Trp Leu Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Ser Asn Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Leu Ile Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Glu Gly Arg Tyr Gly Phe Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 10

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Ile Pro Val Ala Pro Gly

1 5 10 15

Ala Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Gly

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Leu Arg Pro Ser Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His

85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 11

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Ile Thr Ser Asn

20 25 30

Tyr Trp Asn Trp Leu Arg Gln Pro Pro Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Ser Asn Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Glu Gly Arg Tyr Gly Phe Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 12

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Ile Thr Ser Asn

20 25 30

Tyr Trp Asn Trp Leu Arg Gln Pro Pro Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Ser Asn Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Glu Gly Arg Tyr Gly Phe Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 13

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Ile Thr Ser Asn

20 25 30

Tyr Trp Asn Trp Leu Arg Gln Pro Pro Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Ser Asn Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Glu Gly Arg Tyr Gly Phe Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 14

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Thr Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Gly

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His

85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 15

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Thr Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Gly

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His

85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 16

<211> 534

<212> PRT

<213> 智人(homo sapiens)

<400> 16

Met Leu Arg Arg Arg Gly Ser Pro Gly Met Gly Val His Val Gly Ala

1 5 10 15

Ala Leu Gly Ala Leu Trp Phe Cys Leu Thr Gly Ala Leu Glu Val Gln

20 25 30

Val Pro Glu Asp Pro Val Val Ala Leu Val Gly Thr Asp Ala Thr Leu

35 40 45

Cys Cys Ser Phe Ser Pro Glu Pro Gly Phe Ser Leu Ala Gln Leu Asn

50 55 60

Leu Ile Trp Gln Leu Thr Asp Thr Lys Gln Leu Val His Ser Phe Ala

65 70 75 80

Glu Gly Gln Asp Gln Gly Ser Ala Tyr Ala Asn Arg Thr Ala Leu Phe

85 90 95

Pro Asp Leu Leu Ala Gln Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Gln Arg Val

100 105 110

Arg Val Ala Asp Glu Gly Ser Phe Thr Cys Phe Val Ser Ile Arg Asp

115 120 125

Phe Gly Ser Ala Ala Val Ser Leu Gln Val Ala Ala Pro Tyr Ser Lys

130 135 140

Pro Ser Met Thr Leu Glu Pro Asn Lys Asp Leu Arg Pro Gly Asp Thr

145 150 155 160

Val Thr Ile Thr Cys Ser Ser Tyr Gln Gly Tyr Pro Glu Ala Glu Val

165 170 175

Phe Trp Gln Asp Gly Gln Gly Val Pro Leu Thr Gly Asn Val Thr Thr

180 185 190

Ser Gln Met Ala Asn Glu Gln Gly Leu Phe Asp Val His Ser Ile Leu

195 200 205

Arg Val Val Leu Gly Ala Asn Gly Thr Tyr Ser Cys Leu Val Arg Asn

210 215 220

Pro Val Leu Gln Gln Asp Ala His Ser Ser Val Thr Ile Thr Pro Gln

225 230 235 240

Arg Ser Pro Thr Gly Ala Val Glu Val Gln Val Pro Glu Asp Pro Val

245 250 255

Val Ala Leu Val Gly Thr Asp Ala Thr Leu Arg Cys Ser Phe Ser Pro

260 265 270

Glu Pro Gly Phe Ser Leu Ala Gln Leu Asn Leu Ile Trp Gln Leu Thr

275 280 285

Asp Thr Lys Gln Leu Val His Ser Phe Thr Glu Gly Arg Asp Gln Gly

290 295 300

Ser Ala Tyr Ala Asn Arg Thr Ala Leu Phe Pro Asp Leu Leu Ala Gln

305 310 315 320

Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Gln Arg Val Arg Val Ala Asp Glu Gly

325 330 335

Ser Phe Thr Cys Phe Val Ser Ile Arg Asp Phe Gly Ser Ala Ala Val

340 345 350

Ser Leu Gln Val Ala Ala Pro Tyr Ser Lys Pro Ser Met Thr Leu Glu

355 360 365

Pro Asn Lys Asp Leu Arg Pro Gly Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys Ser

370 375 380

Ser Tyr Arg Gly Tyr Pro Glu Ala Glu Val Phe Trp Gln Asp Gly Gln

385 390 395 400

Gly Val Pro Leu Thr Gly Asn Val Thr Thr Ser Gln Met Ala Asn Glu

405 410 415

Gln Gly Leu Phe Asp Val His Ser Val Leu Arg Val Val Leu Gly Ala

420 425 430

Asn Gly Thr Tyr Ser Cys Leu Val Arg Asn Pro Val Leu Gln Gln Asp

435 440 445

Ala His Gly Ser Val Thr Ile Thr Gly Gln Pro Met Thr Phe Pro Pro

450 455 460

Glu Ala Leu Trp Val Thr Val Gly Leu Ser Val Cys Leu Ile Ala Leu

465 470 475 480

Leu Val Ala Leu Ala Phe Val Cys Trp Arg Lys Ile Lys Gln Ser Cys

485 490 495

Glu Glu Glu Asn Ala Gly Ala Glu Asp Gln Asp Gly Glu Gly Glu Gly

500 505 510

Ser Lys Thr Ala Leu Gln Pro Leu Lys His Ser Asp Ser Lys Glu Asp

515 520 525

Asp Gly Gln Glu Ile Ala

530

Claims (15)

1.特异性结合B7H3的抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列中的任意一项或多项，其中所述HCDR1序列包含氨基酸序列GDSITSNY(SEQ ID NO:1)；所述HCDR2序列包含氨基酸序列ISNSGST(SEQ ID NO:2)；和所述HCDR3序列包含氨基酸序列ARGEGRYGFGAY(SEQ ID NO:3)，任选地，所述抗原结合部分选自：Fab片段、Fab’片段、F(ab’)₂片段、Fv片段、scFv片段、Fd片段或单域抗体。

2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其还包含轻链可变区，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3序列中的任意一项或多项，其中所述LCDR1序列包含氨基酸序列KSLLHGNGNTY(SEQ ID NO:4)；所述LCDR2序列包含氨基酸序列RMS(SEQ ID NO:5)；和所述LCDR3序列包含氨基酸序列MQHLEYPFT(SEQ ID NO:6)。

3.如权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体为鼠源抗体，任选地，所述重链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:7，和/或所述轻链可变区包含氨基酸序列SEQID NO:8，任选地，其中所述抗体为嵌合抗体，任选地，所述嵌合抗体包含重链和/或轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:9，和所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:10，任选地，其中所述抗体为人源化抗体，任选地，所述重链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:11、SEQID NO:12或者SEQ ID NO:13，和/或所述轻链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:15。

4.如权利要求1至3中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分特异性结合灵长类和啮齿类B7H3；优选地，所述灵长类和啮齿类B7H3选自小鼠B7H3、人2IgB7H3、人4IgB7H3、猴2IgB7H3和猴4IgB7H3。

5.如前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分以1×10^-10至1×10^-9M的KD特异性结合小鼠mB7H3、人2IgB7H3、人4IgB7H3、猴2IgB7H3和/或猴4IgB7H3。

6.药物组合物，其包含权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合部分以及药学上可接受的载体；

任选地，所述药物组合物还包含一种或多种其他活性成分，如化疗剂、PD-1结合拮抗剂、4-1BB结合激动剂等。

7.疫苗，其包含权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，以及任选的免疫佐剂。

8.核苷酸分子，其编码权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合部分。

9.表达载体，其包含权利要求8所述的核苷酸分子。

10.宿主细胞，其包含权利要求8所述的核苷酸分子或权利要求9所述的表达载体。

11.权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、权利要求6所述的药物组合物、权利要求7所述的疫苗、权利要求8所述的核苷酸分子、权利要求9所述的表达载体或权利要求10所述的宿主细胞在制备用于阻断/激活配体与B7H3结合、促进/抑制T细胞活化、引发T细胞介导的反应、提高、抑制效应T细胞的功能、抑制或促进血管生成、治疗老年黄斑变性(AMD)、和/或抑制肿瘤生长的药物中的用途。

12.权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、权利要求6所述的药物组合物、权利要求7所述的疫苗、权利要求8所述的核苷酸分子、权利要求9所述的表达载体或权利要求10所述的宿主细胞在制备用于预防和/或治疗B7H3相关的疾病的药物中的用途。

13.如权利要求12所述的用途，其中所述B7H3相关的疾病为肿瘤；

任选地，所述肿瘤选自以下中的一种或多种：结肠癌、黑色素瘤、间皮质瘤、肾细胞癌、淋巴瘤、晚期实体瘤以及上述的转移瘤。

14.如权利要求12所述的用途，其中所述B7H3相关的疾病为眼部疾病；

任选地，所述眼部疾病选自以下中的一种或多种：老年黄斑变性(AMD)、老年黄斑变性湿性期/湿性黄斑变性(wAMD)、糖尿病性黄斑水肿(DME)、脉络膜新生血管(CNV)、视网膜静脉阻塞(RVO)、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、视网膜分支静脉阻塞(BRVO)、病理性近视(PM)。

15.检测试剂或试剂盒，其包含权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合部分。