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CN116492456A - 非洲猪瘟病毒d129l基因及其在制备复制缺陷型非洲猪瘟疫苗中的应用 - Google Patents

非洲猪瘟病毒d129l基因及其在制备复制缺陷型非洲猪瘟疫苗中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了非洲猪瘟病毒D129L基因及其在制备复制缺陷型非洲猪瘟疫苗中的应用，属于生物医药技术领域。本发明所要解决的技术问题是如何预防非洲猪瘟。为了解决该技术问题，本发明提供了氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白在制备复制缺陷型非洲猪瘟疫苗中的应用。本发明发现了一种控制ASFV复制的关键必需基因D129L，将该D129L基因缺失复制缺陷型病毒免疫猪后，用ASFV强毒攻击，免疫猪可获得100％攻毒保护。因此，该基因缺失病毒可作为复制缺陷型非洲猪瘟疫苗，用于非洲猪瘟的预防。

Description

非洲猪瘟病毒D129L基因及其在制备复制缺陷型非洲猪瘟疫 苗中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及非洲猪瘟病毒D129L基因及其在制备复制缺陷型非洲猪瘟疫苗中的应用。
背景技术
非洲猪瘟(African Swine Fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African Swine FeverVirus，ASFV)感染引起的家猪和欧亚野猪的一种热性出血性传染病，发病率和病死率可高达100％，是全球养猪业的头号疫病或首要威胁，可造成重大经济损失。目前全球尚无安全有效的非洲猪瘟疫苗，尽管一些企业或研究机构力推基因缺失活疫苗，但经过临床试用和大面积安全性评价，证明非洲猪瘟病毒基因缺失活疫苗存在重大生物安全问题。因此，安全有效的非洲猪瘟疫苗仍是非洲猪瘟防控面临的重要课题。
非洲猪瘟病毒是一种大的复杂的虫媒DNA病毒，是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属中的唯一成员。根据其主要衣壳蛋白p72基因3’端核苷酸序列的差异，迄今可将其分为24个基因型。非洲猪瘟病毒的结构由外向内可分为外部囊膜、衣壳、内部囊膜、核心壳和核这5层，病毒基因组长170～193kb，编码蛋白150种以上，其中结构蛋白68种以上。目前尚不清楚非洲猪瘟病毒的保护性抗原为哪种或哪几种，病毒基因组中大部分基因的功能尚不清楚，这种结构和功能上的复杂性和未知性给非洲猪瘟疫苗的研制带来了很大困难。除了上面提到的基因缺失活疫苗存在的生物安全问题以外，目前正在研究的非洲猪瘟疫苗还包括灭活疫苗、亚单位疫苗和重组载体疫苗等，这些疫苗候选株的安全性应该没有太大的问题，但是其效力均尚不如意，迄今没有一种安全有效的疫苗上市。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何预防非洲猪瘟。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质的应用，所述应用可为下述任一种：
A1)在制备复制缺陷型非洲猪瘟疫苗中的应用；
A2)在制备复制缺陷型非洲猪瘟病毒中的应用；
A3)在制备抑制非洲猪瘟病毒复制的产品中的应用；
A4)在制备用于复制缺陷型非洲猪瘟病毒的增殖或培养的产品中的应用；
所述蛋白质可为下述任一种：
B1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；
B2)将SEQ ID No.2的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性(同源性)且具有相同功能的蛋白质；
B3)在B1)或B2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
所述蛋白质可为病毒蛋白，名称为pD129L。
所述蛋白pD129L可来源于非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus，ASFV)。
进一步地，所述蛋白pD129L可来源于非洲猪瘟病毒SY18株，也可来源于其他非洲猪瘟病毒自然分离株和人工致弱株。
所述蛋白pD129L是非洲猪瘟病毒复制必需的蛋白，缺失该蛋白后病毒不能复制组装成完整的病毒颗粒。所述蛋白pD129L在细胞内具有复制的开关功能。
为了使B1)中的蛋白质便于纯化或检测，可在由序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接标签蛋白。
所述标签蛋白包括但不限于：GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、His6标签蛋白(His-tag)、MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、Flag标签蛋白、SUMO标签蛋白、HA标签蛋白、Myc标签蛋白、eGFP(增强型绿色荧光蛋白)、eCFP(增强型青色荧光蛋白)、eYFP(增强型黄绿色荧光蛋白)、mCherry(单体红色荧光蛋白)或AviTag标签蛋白。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质pD129L的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质pD129L的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质pD129L且具有蛋白质pD129L功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
本发明还提供了与所述蛋白质pD129L相关的生物材料的应用，所述应用可为下述任一种：
C1)在制备复制缺陷型非洲猪瘟疫苗中的应用；
C2)在制备复制缺陷型非洲猪瘟病毒中的应用；
C3)在制备抑制非洲猪瘟病毒复制的产品中的应用；
C4)在制备用于复制缺陷型非洲猪瘟病毒的增殖或培养的产品中的应用；
所述生物材料可为下述D1)至D6)中的任一种：
D1)编码所述蛋白质pD129L的核酸分子；
D2)抑制或降低所述蛋白质pD129L的编码基因功能的核酸分子；
D3)含有D1)和/或D2)所述核酸分子的表达盒；
D4)含有D1)和/或D2)所述核酸分子的重组载体、或含有D3)所述表达盒的重组载体；
D5)含有D1)和/或D2)所述核酸分子的重组微生物、或含有D3)所述表达盒的重组微生物、或含有D4)所述重组载体的重组微生物；
D6)含有D1)和/或D2)所述核酸分子的重组细胞、或含有D3)所述表达盒的重组细胞、或含有D4)所述重组载体的重组细胞。
进一步地，所述D2)可为抑制或降低所述蛋白质pD129L的编码基因表达的核酸分子。
上述应用中，D1)所述核酸分子可为下述任一种：
E1)核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子；
E2)编码序列是SEQ ID No.1的DNA分子；
E3)编码序列是SEQ ID No.1的任何遗传密码子简并序列的DNA分子。
SEQ ID No.1所示的DNA分子(D129L基因)编码氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白pD129L。
SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列为蛋白pD129L编码基因(CDS)的核苷酸序列。
缺失D129L基因全部及部分序列或破坏D129L基因开放阅读框(ORF)即D129L基因功能缺失的非洲猪瘟病毒不能复制，该病毒可在提供D129L基因表达蛋白的细胞中复制，D129L基因在非洲猪瘟病毒的复制中具有关键作用。
稳定表达D129L基因的ASFV敏感细胞系(辅助细胞系)或能在胞内提供pD129L蛋白的ASFV敏感细胞能够支持任一种D129L基因缺失复制缺陷型ASFV在该细胞上复制。
携带D129L基因且表达pD129L蛋白的ASFV敏感细胞系或能在胞内提供pD129L蛋白的ASFV敏感细胞能够支持缺失D129L基因功能的非洲猪瘟病毒的复制。
在所述辅助细胞系中增殖的D129L基因功能缺失复制缺陷型的非洲猪瘟病毒可作为预防非洲猪瘟病毒感染的疫苗，为免疫猪提供有效的攻毒保护。
D1)所述核酸分子还可包括在SEQ ID No.1所示核苷酸序列基础上经密码子偏好性改造得到的核酸分子。
本发明所述的蛋白pD129L的编码基因(D129L基因)可以为任意能够编码蛋白pD129L的核苷酸序列。考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。
D2)所述核酸分子可为敲除所述蛋白pD129L的编码基因的分子。所述敲除可通过同源重组实现。
进一步地，D2)所述核酸分子可为核苷酸序列是SEQ ID No.7和/或SEQ ID No.8的DNA分子(用于通过同源重组的方法敲除所述D129L基因)。
本文所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如gRNA、mRNA、siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。
D6)所述重组细胞可为下述任一种：
F1)稳定表达所述蛋白pD129L的重组细胞；
F2)稳定表达所述蛋白pD129L的重组野猪肺细胞(WSL)；
F3)稳定表达所述蛋白pD129L的重组猪肺泡巨噬细胞(PAM)。
本文所述载体是指能够把外源DNA或目的基因运载进入宿主细胞进行扩增和表达的载体，所述载体可以是克隆载体也可以是表达载体，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、病毒载体(如杆状病毒载体、逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒或疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)等)。在本发明的一个或多个实施方案中，所述载体为pMD18-T载体、pMD18-T-eGFP、pacAd5 CMVK-NpA(人5型腺病毒表达载体)、pacAd5 9.2-100和/或pcDNA3.1载体。
本文所述微生物可为酵母、细菌、藻、真菌或病毒。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia)，欧文氏菌(Erwinia)，根癌农杆菌属(Agrobacterium)，黄杆菌属(Flavobacterium)，产碱菌属(Alcaligenes)，假单胞菌属(Pseudomonas)，芽胞杆菌属(Bacillus)等。在本发明的一个或多个实施方案中，所述微生物为大肠杆菌DH5α。
本文所述细胞(宿主细胞)是指可用于导入载体的细胞，其包括但不限于：真核细胞(如酵母细胞、曲霉菌)、动物细胞(如哺乳动物细胞、昆虫细胞)、植物细胞或原核细胞。在本发明的一个或多个实施方案中，所述细胞为PAM细胞、HEK293AD细胞、野猪肺细胞(WSL)和/或永生化猪肺泡巨噬细胞(iPAM)。
本文所述重组载体是指将外源目的基因与载体在体外连接构建而成的重组体DNA分子，可以任何合适的方式构建，只要构建的重组载体可携带外源目的基因进入受体细胞、并为外源目的基因提供在受体细胞的复制、整合、扩增和/或表达能力即可。在本发明的一个或多个实施方案中，所述重组载体为pΔD129L-EGFP、pAdCMV-D129L和/或pcDNA3.1-D129L。
所述重组载体pΔD129L-EGFP含有D129L基因左侧同源臂D129L-Larm(SEQ IDNo.7)和右侧同源臂D129L-Rarm(SEQ ID No.8)，其构建方法为：以pMD18-T-eGFP(简写为T-eGFP)为基础载体，采用无缝连接技术，将D129L基因左侧同源臂D129L-Larm(SEQ ID No.7)和右侧同源臂D129L-Rarm(SEQ ID No.8)克隆至T-eGFP载体中得到的重组表达载体。
所述基础载体pMD18-T-eGFP可为将p72启动子(SEQ ID No.24)和eGFP-SV40polyA(SEQ ID No.23)克隆到pMD18-T载体得到的重组载体。
所述重组载体pAdCMV-D129L是使用同源重组的方法，将带有同源臂的D129L基因连接在pacAd5 CMVK-NpA载体上得到的重组载体，具体为将ASFV D129L目标基因通过基因的同源重组基因片段插入pacAd5 CMVK-NpA质粒的EcoRI酶切位点中得到的载体，重组质粒pAdCMV-D129L含有SEQ ID No.1所示的DNA分子(D129L基因)，表达D129L目标基因。
所述重组载体pcDNA3.1-D129L是通过无缝连接技术，将带有同源臂的D129L基因连接在pcDNA3.1载体上得到的重组载体，重组载体pcDNA3.1-D129L含有SEQ ID No.1所示的DNA分子(D129L基因)，表达氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质pD129L。
本文所述重组微生物是指对目的微生物的基因进行操作和修饰，从而得到功能发生变化的微生物，或直接对目的微生物的内源基因进行基因编辑后得到的重组微生物。如将外源目的基因或重组载体导入目的微生物后得到的重组微生物。在本发明的一个或多个实施方案中，所述重组微生物为ΔrAdv5-D129L。
所述重组微生物ΔrAdv5-D129L为表达D129L基因的重组腺病毒。所述重组腺病毒ΔrAdv5-D129L是将所述重组载体pAdCMV-D129L和骨架质粒pacAd5 9.2-100分别采用PacI酶进行线性化后共转染HEK293AD细胞，进行重组腺病毒的拯救而得。所述重组腺病毒ΔrAdv5-D129L可用于复制缺陷型非洲猪瘟病毒的制备和扩大培养。
本文所述重组细胞是指对宿主细胞的基因进行操作和修饰，从而得到功能发生变化的细胞。如将外源目的基因或重组载体导入宿主细胞后得到的重组细胞。在本发明的一个或多个实施方案中，所述重组细胞为WSL-D129L和/或iPAM-D129L。
所述重组细胞WSL-D129L是将所述重组载体pcDNA3.1-D129L导入野猪肺细胞(WSL)，经筛选得到的稳定表达所述蛋白pD129L的重组细胞。
所述重组细胞iPAM-D129L是将所述重组载体pcDNA3.1-D129L导入永生化猪肺泡巨噬细胞(iPAM)，经筛选得到的稳定表达所述蛋白pD129L的重组细胞。
所述重组细胞WSL-D129L和iPAM-D129L可作为辅助细胞用于制备(增殖或培养)D129L基因缺失的复制缺陷型非洲猪瘟病毒。
本发明还提供了复制缺陷型非洲猪瘟病毒，所述复制缺陷型非洲猪瘟病毒基因组缺失了所述蛋白质pD129L的编码基因，或所述复制缺陷型非洲猪瘟病毒基因组中所述蛋白质pD129L的编码基因功能失活。
所述复制缺陷型非洲猪瘟病毒不能复制，丧失了在原代单核-巨噬细胞和在猪体内的复制功能。
所述复制缺陷型非洲猪瘟病毒可为复制缺陷型非洲猪瘟病毒ΔSY18ΔD129L株。
本发明还提供了制备复制缺陷型非洲猪瘟病毒(如ΔSY18ΔD129L株)的方法，所述方法可包括使非洲猪瘟病毒基因组中所述蛋白质pD129L的编码基因缺失或功能失活，得到复制缺陷型非洲猪瘟病毒。
所述使非洲猪瘟病毒基因组中所述蛋白质pD129L的编码基因缺失或功能失活可通过基因突变、基因敲除、基因编辑或基因敲减技术实现。
进一步地，所述使非洲猪瘟病毒基因组中所述蛋白质pD129L的编码基因缺失或功能失活可利用同源重组技术进行D129L基因的敲除。
上述方法中，所述方法可包括如下步骤：
G1)构建含有所述蛋白质pD129L编码基因左右同源臂的重组载体；
G2)将G1)中所述重组载体与非洲猪瘟病毒共转染/感染(转染和/或感染)宿主细胞；
G3)培养所述宿主细胞，筛选得到复制缺陷型非洲猪瘟病毒。
进一步地，所述蛋白质pD129L编码基因左同源臂名称为D129L-Larm，所述D129L-Larm的核苷酸序列可为SEQ ID No.7。所述蛋白质pD129L编码基因右同源臂名称为D129L-Rarm，所述D129L-Rarm的核苷酸序列可为SEQ ID No.8。
G1)中所述重组载体可为所述重组载体pΔD129L-EGFP。
G2)中所述非洲猪瘟病毒可为非洲猪瘟病毒SY18株(ASFV SY18株)。
G2)中所述宿主细胞可为PAM细胞。
G3)中所述培养条件可为37℃5％ CO2条件下培养72～96小时。
虽然本发明提供的实施例利用同源重组技术进行D129L基因的敲除，但本发明不限于该特定方法。本领域技术人员可采用本领域已知的其它基因敲除、基因编辑、基因突变或基因敲减方法使非洲猪瘟病毒基因组中D129L基因缺失或失活。这些方法也可用于本发明。这些替代方法未脱离本发明的范围，本发明应包括这些替代方法。
本发明还提供了由所述制备复制缺陷型非洲猪瘟病毒的方法制备得到的复制缺陷型非洲猪瘟病毒。
本发明还提供了本文任一所述复制缺陷型非洲猪瘟病毒的增殖方法，所述方法可包括将本文任一所述复制缺陷型非洲猪瘟病毒在辅助细胞中培养，所述辅助细胞可为稳定表达所述蛋白质pD129L的重组细胞和/或含有所述蛋白质pD129L的细胞。
所述辅助细胞(稳定表达所述蛋白质pD129L的重组细胞和/或含有所述蛋白质pD129L的细胞)或所述辅助细胞在制备所述复制缺陷型非洲猪瘟病毒中的应用也在本发明的保护范围内。
所述复制缺陷型非洲猪瘟病毒基因组缺失了所述蛋白质pD129L的编码基因，或所述复制缺陷型非洲猪瘟病毒基因组中所述蛋白质pD129L的编码基因功能失活。
所述辅助细胞可通过在如下任一种受体细胞中稳定表达所述蛋白质pD129L得到，或所述辅助细胞可为含有所述蛋白质pD129L的下述任一种细胞：
H1)适于非洲猪瘟病毒增殖的原代单核-巨噬细胞；
H2)适于非洲猪瘟病毒增殖的传代单核-巨噬细胞系；
H3)适于非洲猪瘟病毒增殖的其他传代细胞系如野猪肺细胞、Vero细胞、HeLa细胞或HEK293细胞系等。
进一步地，所述辅助细胞(基因稳定表达转基因细胞)可为所述重组细胞WSL-D129L和/或iPAM-D129L。
在本发明的一个实施方案中，所述复制缺陷型非洲猪瘟病毒的增殖方法包括如下步骤：
将所述复制缺陷型非洲猪瘟病毒按照1％比例接种重组细胞iPAM-D129L，在37℃5％CO2条件下培养72～96小时，待90％以上细胞呈现荧光后，收获培养细胞，冻融混合后-15℃以下保存。
本发明还提供了复制缺陷型非洲猪瘟疫苗，所述复制缺陷型非洲猪瘟疫苗可包括本文任一所述的复制缺陷型非洲猪瘟病毒。
所述复制缺陷型非洲猪瘟疫苗中的活性成分为本文任一所述的复制缺陷型非洲猪瘟病毒。
进一步地，所述复制缺陷型非洲猪瘟疫苗还可包括佐剂(adjuvant)和/或疫苗递送系统(vaccine delivery system)。
进一步地，所述复制缺陷型非洲猪瘟疫苗还可包括一种或者是多种药学上可接受的载体。
所述佐剂是一种可以刺激机体产生针对与其一同接种的抗原更强烈体液和/或细胞免疫应答的物质。本文所述佐剂是本领域技术人员公知的，包括但不限于：植物佐剂(如烷基胺、酚类成分、奎宁、皂角素、倍半萜、蛋白质、多肽、多糖、糖脂、植物血凝素等)、细菌佐剂(如霍乱毒素、大肠埃希菌不耐热毒素、细菌脂多糖等)、铝佐剂及其他无机成分佐剂(如钙佐剂)、细胞因子和核酸佐剂(如单核细胞克隆刺激因子、白细胞因子IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IFN-γ、CpG基序、核酸载体等)、乳剂佐剂(如弗氏佐剂)。
所述疫苗递送系统是一类能够将抗原物质携带至机体的免疫系统，并在其中较长时间存储和发挥其抗原作用的物质。本文所述疫苗递送系统可为铝盐凝胶佐剂疫苗递送系统、乳剂佐剂疫苗递送系统、脂质体佐剂疫苗递送系统或纳米佐剂疫苗递送系统。
所述药学上可接受的载体可为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂。
本文所述复制缺陷型非洲猪瘟病毒可为D129L基因缺失复制缺陷型非洲猪瘟病毒，所述复制缺陷型非洲猪瘟疫苗可为D129L基因缺失复制缺陷型非洲猪瘟疫苗。
本发明所述复制缺陷型非洲猪瘟疫苗是采用基因工程方法，将非洲猪瘟病毒复制过程中的一些必需基因进行缺失或正常的编码序列破坏，使其只有在提供复制必需基因的辅助细胞系中才能进行有效复制，在感染动物后不能进行有效复制，故该疫苗毒株最大程度保留了病毒的原始状态，保持了完整病毒颗粒所具有的免疫原性且在感染动物中不会产生排毒等免疫副作用。
本发明的目的之一是提供一种非洲猪瘟病毒蛋白—pD129L蛋白的功能鉴定及其在制备复制缺陷型非洲猪瘟疫苗中的应用。
本发明试验证明，非洲猪瘟病毒D129L基因所编码的蛋白是病毒复制必需的蛋白，缺失该蛋白后病毒不能复制组装成完整的病毒颗粒，但在不缺失该蛋白的病毒共存时可以组装成完整的病毒颗粒；缺失该基因的非洲猪瘟病毒在稳定表达该蛋白的ASFV敏感细胞(辅助细胞)系或瞬时表达pD129L蛋白的ASFV敏感细胞内也可以复制且组装成病毒颗粒，并可在稳定表达该蛋白的细胞系中连续增殖，但不能在不表达D129L基因的细胞内增殖；利用在稳定表达或瞬时表达pD129L蛋白的ASFV敏感细胞中增殖的D129L基因缺失复制缺陷型ASFV免疫猪以后，后者可以提供针对ASFV强毒攻击的坚强的免疫保护效果。以上表明，D129L基因是非洲猪瘟病毒复制组装的关键必需基因之一，揭示了D129L基因表达蛋白对非洲猪瘟病毒在细胞内复制的开关功能。据此，本发明进一步证实，该D129L基因缺失复制缺陷型ASFV免疫猪可使免疫动物产生坚强的针对非洲猪瘟病毒感染的免疫功能，是一种有效的非洲猪瘟疫苗。
通过本发明试验证明，采用同源重组技术将非洲猪瘟病毒D129L基因缺失以后，重组基因组不能复制成为感染性病毒颗粒，在利用D129L基因建立的表达pD129L蛋白的iPAM和/或WSL辅助细胞系上进行筛选和培养，则可获得携带荧光蛋白且只能在辅助细胞中增殖的D129L基因缺失的重组病毒，该D129L基因缺失病毒在原代PAM细胞或非转化(不表达D129L基因)的iPAM和WSL细胞中不能复制，属于复制缺陷型病毒；将该复制缺陷型D129L基因缺失病毒免疫猪两次后，用ASFV SY18株强毒攻击，免疫猪可获得100％攻毒保护。综上，本发明发现了一种控制ASFV复制的关键必需基因D129L，该基因缺失病毒可作为一种复制缺陷型非洲猪瘟疫苗，用于非洲猪瘟的预防。
附图说明
图1为实施例1中D129L基因两侧同源重组片段扩增引物。
图2为实施例1中同源重组臂扩增产物电泳结果。其中，1：Marker；2：左侧同源臂扩增结果；3：右侧同源臂扩增结果。
图3为实施例1中线性化T-eGFP扩增结果。其中，1：Marker；2、3：线性化T-eGFP。
图4为实施例1中pΔD129L-Larm重组质粒鉴定。其中，1：Marker；2～9：阳性重组子。
图5为实施例1中pΔD129L-Larm重组质粒线性化扩增结果。其中，1：线性化pΔD129L-Larm重组质粒；2：Marker。
图6为实施例1中pΔD129L-EGFP重组质粒鉴定结果。其中，1：Marker；2：阴性克隆菌；3～10：阳性克隆菌。
图7为实施例1中同源重组质粒pΔD129L-EGFP示意图。
图8为实施例1中同源重组质粒pΔD129L-EGFP转染/SY18感染的PAM细胞，同源重组结果(绿色荧光细胞的出现)。
图9为实施例1中ASFV SY18野毒和SY18ΔD129L混合感染的PAM细胞形成的荧光簇。
图10为实施例1中针对16个细胞孔的培养物上清培养液PCR鉴定结果。其中，M泳道：Marker；泳道1～16：分别对应16个单荧光灶细胞孔的PCR鉴定结果；泳道17：为野毒对照；泳道18：为阴性模板对照。
图11为实施例1中进一步针对克隆的单荧光灶细胞孔培养上清培养液PCR鉴定结果。其中，泳道1：Marker；泳道2～17：分别对应16个单荧光灶细胞孔的PCR鉴定结果；泳道18：为野毒对照；泳道19：为阴性模板对照。
图12为实施例2中表达D129L基因的重组人5型腺病毒构建图谱。图中ASFV gene和X代指D129L基因。
图13为实施例2中D129L基因扩增引物及预期产物大小。
图14为实施例2中混合毒荧光观察结果。其中，+：为含荧光；-：为无荧光。
图15为实施例3中重组D129L真核表达载体构建引物及预期产物大小。
图16为实施例3中不同转化细胞系中基因整合的部分检测结果。其中，M泳道：Marker；泳道1：为WSL-D129L-1；泳道2：为iPAM-D129L-1；泳道3：以pcDNA3.1-D129L质粒为模板的阳性对照；泳道4：未添加模板的阴性对照。
图17为实施例3中细胞克隆中目的蛋白pD129L表达量分析。
图18为实施例3中iPAM-D129L细胞中的单荧光灶细胞孔。
图19为实施例3中单荧光灶细胞孔收集的感染细胞冻融后接种iPAM-D129L细胞系后培养的结果。左图为D129L基因缺失复制缺陷病毒接种的iPAM-D129L稳定表达细胞系荧光镜下结果；右图为原代猪PAM细胞荧光镜下结果。
图20为实施例3中复制缺陷型D129L基因缺失毒含量测定结果。其中，+：为含荧光；-：为无荧光。
图21为实施例4中D129L基因缺失复制缺陷型非洲猪瘟病毒ΔSY18ΔD129L免疫猪攻毒结果。注：发热或发病猪实时qPCR检测结果均为阳性。
图22为实施例4中观察结束时ΔSY18ΔD129L免疫猪口、鼻、肛拭子ASFV核酸检测结果。判定标准：小于等于35判为阳性；CT值大于35、小于40判为可疑(均给出CT值)；无数值判为阴性。
图23为实施例4中ΔSY18ΔD129L免疫猪攻毒后28日剖检组织中ASFV核酸检测结果。“-”为无数值。判定标准：小于等于35判为阳性；CT值大于35、小于40判为可疑(均给出CT值)；无数值判为阴性。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的非洲猪瘟病毒SY18株(ASFV SY18株，ASFV-SY18)记载在如下文献中：Zhou X,Li N,Luo Y,Liu Y,Miao F,Chen T,Zhang S,Cao P,Li X,Tian K,Qiu HJ,HuR(2018)Emergence of African Swine Fever in China,2018.Transboundary andemerging diseases 65(6):1482-1484.doi:10.1111/tbed.12989)，由军事兽医研究所流行病学研究室于2018年分离。该病毒的基因组序列的GenBank号：MH766894.2(27-JAN-2021)。
下述实施例中的表达质粒载体pacAd5 CMVK-NpA和骨架质粒pacAd5 9.2-100均购自美国Invitrogen公司。
下述实施例中的pcDNA3.1载体为Invitrogen公司产品。
下述实施例中的HEK293AD细胞购自美国Invitrogen公司。
下述实施例中的野猪肺细胞(WSL)购自上海莼试生物技术有限公司。
下述实施例中的iPAM细胞为传代猪肺泡巨噬细胞系，购自北纳创联科技有限公司。
下述实施例中的PAM细胞为原代猪肺泡巨噬细胞，来源于无特定病原体感染的猪只，通过用无菌的PBS(0.012mol/L,pH 7.2)冲洗肺脏，裂解红细胞，离心获得。
ASFV复制相关基因及表达的蛋白较多，如p72、p30等蛋白都是ASFV病毒复制过程中必不可少的成分，类组蛋白pA104R、p10(pK78R)、pG1340L、pD1133L、B962L、Q706L等也和病毒的复制、转录起始等过程相关，但是影响ASFV复制的关键蛋白成分尚不清楚。本发明在非洲猪瘟病毒基因缺失病毒构建过程中，发现了一种可以限制病毒复制的基因(即D129L基因)，缺失该基因的非洲猪瘟病毒基因组不能完成病毒的复制过程组装成病毒颗粒，和野生病毒共存的该基因缺失病毒则可组装成病毒颗粒，并表达其携带的绿色荧光蛋白基因。构建表达该D129L基因的辅助细胞系，以该细胞系拯救的复制缺陷型非洲猪瘟病毒免疫猪以后，可以为免疫猪提供针对ASFV强毒攻击的坚强保护作用。说明D129L基因、表达该基因的非洲猪瘟病毒敏感细胞系以及缺失该基因的复制缺陷型非洲猪瘟病毒可用于开发和制备复制缺陷型非洲猪瘟疫苗。
D129L基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1，其编码的蛋白质名称为pD129L，蛋白pD129L的氨基酸序列为SEQ ID No.2。蛋白pD129L是非洲猪瘟病毒复制必需的蛋白，缺失该蛋白后病毒不能复制组装成完整的病毒颗粒。所述蛋白质pD129L在细胞内对非洲猪瘟病毒的复制具有开关功能。
实施例1、D129L基因缺失复制缺陷型ASFV的拯救
1、D129L基因缺失同源重组臂核酸片段的克隆
在D129L基因左右两侧(上、下游)各约1200bp区域，分别设计两对引物，引物序列(SEQ ID No.3-SEQ ID No.6)如图1所示，利用普通PCR分别扩增两个同源重组片段：D129L基因左侧同源臂(名称为D129L-Larm，核苷酸序列为SEQ ID No.7)和D129L基因右侧同源臂(名称为D129L-Rarm，核苷酸序列为SEQ ID No.8)。扩增产物经回收后在10％琼脂糖凝胶上电泳结果如图2。
2、D129L基因缺失同源重组臂质粒的构建
2.1、pMD18-T-eGFP质粒的构建
pMD18-T-eGFP质粒是将p72启动子(SEQ ID No.24)和eGFP-SV40polyA(SEQ IDNo.23)克隆到pMD18-T载体(Takara公司产品，货号6011)得到。
2.1.1、eGFP-SV40polyA序列的获得：从peGFP-C3质粒(HonorGene公司产品，货号HG-VPH0002)中扩增获得，设计引物(eGFP F：5’-GCCTGCAGGTCGACGATTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3’(SEQ ID No.25)；polyA R：5’-CGGGGATCCTCTAGAGATACCACAACTAGAATGCAGTG-3’(SEQ ID No.26))扩增出含有eGFP-SV40polyA(SEQ ID No.23)的DNA片段1(1036bp)，eGFP-SV40polyA的核苷酸序列如SEQ ID No.23所示。
2.1.2、pMD18T-eGFP-SV40polyA质粒的构建：DNA片段1经PCR扩增、纯化回收后，与pMD18-T载体在In-HD Cloning Plus(Takara Bio公司产品，货号638911，按照试剂操作说明进行)作用下连接形成pMD18T-eGFP-SV40polyA重组质粒，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，培养16～18h后，挑取若干菌落于200μL含有氨苄抗性的液体LB培养基中，在37℃摇床中培养6h后，以1μL菌液为模板，进行菌液鉴定，将鉴定正确的菌落扩大培养后，使用Axygen质粒小提试剂盒提取质粒，经序列测定正确的质粒命名为pMD18T-eGFP-SV40polyA。
2.1.3、p72启动子序列的获得：p72启动子序列从ASFV SY18株基因组中扩增获得，设计引物(p72 F：5’-GCCTGCAGGTCGACGATTAAGGGTCGCCGGAGGAAA-3’(SEQ IDNo.27)；p72 R：5’-TCCTCGCCCTTGCTCACCATATATAATGTTATAAAAATAAT-3’(SEQ IDNo.28))扩增出含有p72启动子(SEQ ID No.24)的DNA片段2(237bp)，p72启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.24所示。
2.1.4、pMD18-T-eGFP质粒的构建：设计引物(F：5’-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3’(SEQ ID No.29)；R：5’-AATCGTCGACCTGCAGGC-3’(SEQ ID No.30))扩增pMD18T-eGFP-SV40polyA重组质粒，将该质粒线性化，获得3778bp片段，纯化回收后，使用In-HDCloning Plus试剂盒(依照操作说明使用)，与p72启动子片段(DNA片段2)连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，培养16～18h后，挑取若干菌落于200μL含有氨苄抗性的液体LB培养基中，在37℃摇床中培养6h后，以1μL菌液为模板，进行菌液鉴定，获得pMD18T-p72启动子-eGFP-SV40polyA重组质粒，简写pMD18-T-eGFP或T-eGFP。
2.2、同源重组臂质粒构建
利用含有ASFV p72蛋白基因启动子序列以及SV40 polyA序列的pMD18-T-eGFP质粒(T-eGFP)作为载体，采用无缝连接技术构建含有D129L基因两侧序列核苷酸片段(即D129L-Larm和D129L-Rarm)的重组质粒，具体操作如下：
2.2.1、左侧同源臂连接及鉴定：使用引物p72 promoter-F及T-R，以T-eGFP为模板进行扩增，在p72启动子前方对载体线性化，得到左侧位点线性化的载体，长度为3890bp，扩增结果见图3。而后使用In-HD Cloning Plus(Takara Bio公司产品，货号638911)，按照操作说明将回收后的D129L基因左侧同源臂D129L-Larm与左侧位点线性化的载体进行连接，随后将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，培养16～18h后，挑取若干菌落于200μl含有氨苄抗性的液体LB培养基中，于37℃摇床中培养6h后，以1μL菌液为模板，进行菌液鉴定(图4)，将鉴定正确的菌落扩大培养后，使用Axygen质粒小提试剂盒提取质粒，经序列测定正确的质粒命名为pΔD129L-Larm，即为插入左侧同源臂的重组质粒。
引物p72 promoter-F：5’-AAGGGTCGCCGGAGGA-3’(SEQ ID No.9)，
引物T-R：5’-AATCGTCGACCTGCAGGCATG-3’(SEQ ID No.10)。
2.2.2、右侧同源臂的连接：使用线性化引物T-F及poly-R将步骤2.2.1中得到的重组质粒pΔD129L-Larm从右侧位点线性化，得到右侧位点线性化的载体，并通过胶回收得到纯化的线性化重组质粒，获得5059bp产物，鉴定结果见图5。按照步骤2.2.1中同样的方法，使用In-fusion Kit将D129L基因右侧同源臂D129L-Rarm与右侧位点线性化的载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞后，挑取菌落进行鉴定，获得3555bp产物，鉴定结果见图6，将鉴定结果为阳性的菌落扩大培养，提取质粒，送吉林省库美生物科技有限公司进行测序。将测序正确的质粒命名为pΔD129L-EGFP，即为含有D129L基因左侧同源臂D129L-Larm(SEQ ID No.7)和右侧同源臂D129L-Rarm(SEQ ID No.8)的同源重组质粒，并保存菌种与质粒。重组质粒示意图如图7所示。
引物T-F：5’-ATCTCTAGAGGATCCCCG-3’(SEQ ID No.11)，
引物poly-R：5’-ACCACAACTAGAATGCAG-3’(SEQ ID No.12)。
3、D129L基因缺失非洲猪瘟重组病毒的拯救
用104.0TCID50的ASFV SY18株接种PAM细胞得到接种ASFV SY18株的PAM细胞，同时用Jet-Macrophage转染剂将5μg同源重组质粒pΔD129L-EGFP转染到接种ASFV SY18株的PAM细胞中，37℃5％ CO2条件下培养72～96小时。当出现绿色荧光细胞时(如图8所示)，通过灭菌移液器挑出荧光细胞，在PBS(0.012mol/L，pH 7.2)中漂洗3遍，转移至0.5mlEppendorf管中，冻融2次，进行系列稀释，再接种PAM细胞。
如此挑选荧光细胞并漂洗3～6次，待绿色荧光细胞达到较多时(如图9所示)。通过对病毒的系列稀释和接种PAM细胞，测定冻融液中呈现荧光的病毒(绿色荧光病毒)滴度。结果，测定的绿色荧光病毒滴度为103.2TCID50。
根据测定结果，将绿色荧光病毒进行103.2倍稀释，再进行连续2次2倍稀释，每个稀释度接种1块96孔PAM细胞培养板。37℃5％ CO2条件下培养72～96小时。结果在96孔板中共出现16个含单一荧光灶的细胞孔。
针对16个细胞孔的培养物上清液(简称病毒培养物)，采用引物D129L-I-F：5’-GCACACGCACAAGAATAC-3’(SEQ ID No.13)和引物D129L-I-R：5’-AACGCCACTGAATTACCTAT-3’(SEQ ID No.14)进行PCR检测，其中15孔(图10中标号为2-16的孔)出现2条核酸扩增条带，分别为野毒(ASFV SY18株)的扩增条带(大小为1090bp)和重组毒的扩增条带(大小为1922bp)，另一孔(图10中标号为17的孔)为野毒条带。结果如图10所示。
为了进一步确认病毒的拯救效果，将PCR鉴定为阳性(PCR检测结果为得到上述野毒的扩增条带和上述重组毒的扩增条带)的一个细胞孔的病毒培养物进行TCID50测定，稀释后接种96孔PAM细胞培养板，观察单荧光灶细胞孔。针对单荧光灶细胞孔培养上清采用引物D129L-I-F(SEQ ID No.13)和引物D129L-I-R(SEQ ID No.14)进行PCR检测扩增，结果仍出现2条扩增带，分别为基因缺失复制缺陷重组毒的扩增条带(大小为1922bp)和野毒的扩增条带(大小为1090bp)。如图11所示。
以上结果表明，D129L基因缺失重组毒不能单独复制，需要野毒辅助才能进行复制，因此，通过本实验获得了既包含野毒也包含D129L基因缺失重组毒的混合物—混合毒。将上述用引物D129L-I-F和引物D129L-I-R进行PCR检测得到的具有上述基因缺失重组毒的扩增条带(大小为1922bp)和野毒的扩增条带(大小为1090bp)的培养物上清液命名为混合毒Mix-V，混合毒Mix-V含有野毒(ASFV SY18株)和D129L基因缺失重组毒。说明D129L基因缺失的非洲猪瘟重组病毒具有不可拯救性，属于复制缺陷型非洲猪瘟病毒。
实施例2、表达D129L基因的重组人5型腺病毒的构建和D129L基因缺失复制缺陷型非洲猪瘟病毒的获得
1、表达D129L基因的重组人5型腺病毒的构建
重组病毒构建示意图如图12所示。
1.1、同源重组质粒的构建
采用常规方法提取非洲猪瘟病毒SY18株基因组，设计带有表达质粒载体pacAd5CMV K-NpA(人5型腺病毒表达载体)同源臂的ASFV D129L目标基因的引物分别为D129L-F：5’-GCTTGATATCGAATTGCCACCATGGATATAAATCCCTTACTGTATTTGCAAGCA-3’(SEQ ID No.15)；D129L-R：5’-TCCCCCGGGCTGCAGGTTAATCTTCATCATCTGT-3’(SEQ IDNo.16)。以SY18株基因组为模板利用引物D129L-F和D129L-R采用PCR方法进行扩增，获得D129L基因的同源重组基因片段(片段大小为427bp，引物中斜体标注部分为同源臂序列，片段大小为目的基因加同源臂后大小))。下述重组质粒为将目的基因片段插入质粒pa cAd5 CMVK-NpA的EcoRI位点间得到的质粒。
将D129L基因的同源重组基因片段与EcoRI酶切后得到的线性化pacAd5 CMVK-NpA质粒连接，再转化大肠杆菌感受态细胞，进行同源重组，获得重组质粒：pAdCMV-D129L。
重组质粒pAdCMV-D129L(也称为重组载体pAdCMV-D129L)是使用同源重组的方法，将带有同源臂的D129L基因连接在pacAd5 CMVK-NpA载体上得到的重组载体，具体为将ASFVD129L目标基因通过基因的同源重组基因片段插入pacAd5 CMVK-NpA质粒的EcoRI酶切位点中得到的载体，重组质粒pAdCMV-D129L含有SEQ ID No.1所示的DNA分子(D129L基因)，表达D129L目标基因。
1.2、重组病毒的拯救和鉴定
将重组质粒pAdCMV-D129L和骨架质粒pacAd5 9.2-100分别采用PacI酶进行线性化，得到酶切后的重组质粒和酶切后的骨架质粒pacAd5 9.2-100。
将上述酶切后的重组质粒以一定比例(2微克)和酶切骨架质粒pacAd5 9.2-100(4微克)混合，再与12微升转染试剂(2000)混合后，加入2ml细胞培养液，均匀加入到细胞单层上，转染25cm2的长成单层的HEK293AD细胞，3天后，对转染的细胞进行传代，长至单层后，按照上述步骤进行第二次转染。
按以上步骤转染3次，观察到细胞有大量变圆等病变时，冻融细胞，收集并保存冻融液，分别记为P0代重组腺病毒；提取P0代重组腺病毒的核酸，使用鉴定引物(上游引物：5’-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3’(SEQ ID No.17)，下游引物：5’-CACTGCATTCTAGTTGTGGTTT-3’(SEQ ID No.18))进行重组腺病毒鉴定，预期鉴定产物大小如图13中所示，扩增出目标大小片段则为目标重组腺病毒。
经PCR鉴定正确后，将表达D129L基因的重组腺病毒命名为ΔrAdv5-D129L。将P0代重组腺病毒ΔrAdv5-D129L按照1％(V/V)在HEK293AD细胞中传代3次并收集冻融液保存，得到P1、P2、P3代重组腺病毒ΔrAdv5-D129L。
1.3、病毒滴度测定和鉴定
将上述步骤1.2获得的P3代重组腺病毒ΔrAdv5-D129L进行滴度测定，测定方法为：将病毒培养液作10倍系列稀释，共作12次稀释，每个稀释度接种8个重复孔，接种到96孔板的HEK293AD细胞上，接种量0.1ml/孔，接种后37℃培养5～6日时，在光镜下观察细胞病变，按照Reed-Muench法计算重组腺病毒的TCID50，结果为108.4TCID50/ml。
2、混合毒Mix-V TCID50测定
将收获的混合毒Mix-V进行10倍系列稀释，取101.0～106.0共6个稀释度接种PAM细胞96孔板，每个稀释度接种8个细胞孔，每孔100μl，补充完全培养基RPMI 1640(美国Gibco公司产品，货号C11875500BT)，37℃5％ CO2条件下培养72小时后，在倒置荧光显微镜下观察细胞中荧光，粗略计算混合毒(表达荧光蛋白的重组病毒)的含量。野毒和重组毒混合毒的观察结果如图14所示。据此计算的混合毒Mix-V的粗略含量为103.84TCID50/ml。
3、D129L基因-重组人5型腺病毒和稀释的混合毒Mix-V的共感染及纯化毒挑选
根据测定的混合毒Mix-V的病毒滴度，按照MOI＝1的D129L基因-重组人5型腺病毒(即重组腺病毒ΔrAdv5-D129L)接种野猪肺细胞(WSL)得到重组腺病毒感染的WSL细胞，并同时在每个孔内加入稀释的每毫升含10TCID50的混合毒Mix-V 100μL以感染重组腺病毒感染的WSL细胞。在37℃5％ CO2条件下培养3-5天，细胞中出现单个荧光灶并在荧光细胞数量达到80％以上时，冻融收集单孔荧光灶。其中，部分用于扩大培养和病毒的制备；另一部分接种原代猪肺泡巨噬细胞(PAM细胞)。结果显示，稀释的Mix-V接种重组腺病毒感染的WSL细胞后，共出现13个单荧光灶细胞孔，分别记为Mix-V-1～13。收集其中的细胞冻融液并转接至原代猪肺泡巨噬细胞培养孔后，只有Mix-V-6冻融液接种后没有出现荧光。将Mix-V-6剩余的病毒保存作为0代D129L基因缺失复制缺陷型非洲猪瘟病毒(ΔSY18ΔD129L株)。
4、D129L基因缺失复制缺陷型非洲猪瘟病毒(ΔSY18ΔD129L株)的制备及病毒滴度测定
4.1、制备
将纯化的D129L基因缺失复制缺陷型非洲猪瘟病毒(ΔSY18ΔD129L株)克隆细胞培养物与D129L基因-重组人5型腺病毒(即重组腺病毒ΔrAdv5-D129L)均按照MOI＝1的剂量同时共感染野猪肺细胞系(WSL)单层，在37℃5％ CO2条件下培养，待荧光达60％以上(3-5天)时，冻融细胞，收集病毒感染细胞裂解液。
4.2、滴度测定
将收集的病毒培养液进行10倍系列稀释，每个稀释度取0.1ml分别与MOI＝1的D129L基因-重组人5型腺病毒(即重组腺病毒ΔrAdv5-D129L)按照剂量同时接种野猪肺细胞系(WSL)单层，每个稀释度接种8个细胞孔，在37℃5％ CO2条件下培养4天，观察每个稀释度细胞孔中的荧光。根据Spearman Karber法计算TCID50。结果表明，制备的纯化的D129L基因缺失复制缺陷型非洲猪瘟病毒(ΔSY18ΔD129L株)滴度为105.64TCID50。
实施例3、非洲猪瘟病毒D129L基因稳定表达细胞系的构建和复制缺陷型D129L基因缺失非洲猪瘟病毒的拯救
1、非洲猪瘟病毒D129L基因片段的获得及其表达质粒的构建
本发明以提取的非洲猪瘟病毒ASFV SY18基因组为模板，以D129L-Fin(SEQ IDNo.19)和D129L-Rin(SEQ ID No.20)为引物，引物序列见图15。扩增回收获得带有左右同源臂的D129L基因片段D129L-in，并通过无缝连接技术将D129L基因片段D129L-in构建到pcDNA3.1载体的EcoRV位点，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞后挑取菌落进行扩大培养，经PCR鉴定和序列测定无误的质粒，命名为pcDNA3.1-D129L，用于进行后续细胞系的构建试验。
质粒pcDNA3.1-D129L(重组载体pcDNA3.1-D129L)是通过无缝连接技术，将带有同源臂的D129L基因连接在pcDNA3.1载体上得到的重组载体，重组载体pcDNA3.1-D129L含有SEQ ID No.1所示的DNA分子(D129L基因)，表达氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质pD129L。
2、细胞系的转染
2.1、细胞对G418敏感性的筛选
2.1.1、野猪肺细胞(WSL)购自上海莼试生物技术有限公司，永生化猪肺泡巨噬细胞(iPAM)即猪肺泡巨噬细胞系，购自北纳创联科技有限公司(也可采用其他ASFV敏感细胞系)。上述细胞传代至24孔板的24个孔中，105个细胞/孔。孔中的培养基为1640培养基(美国Gibco公司产品，货号C11875500BT)。
2.1.2、待细胞贴壁后，孔中的培养基更换为含特定浓度G418的培养基(由G418和1640培养基制成)。浓度梯度为：0、100、200、400、600、800、1000、1200μg/mL。每个浓度设置4个重复。
2.1.3、隔日更换含相应浓度G418的新鲜培养基，每日观察记录每孔中细胞生长状况。高浓度G418的细胞最先开始出现生长缓慢现象并逐渐死亡。观察至第14天，判定WSL或iPAM细胞全部死亡的细胞孔的G418浓度，并在此基础上提高一个梯度，作为之后对细胞系加压筛选的G418使用浓度。
结果显示，培养至14天时，浓度为200和400μg/ml及以上浓度的G418培养基培养的WSL或iPAM细胞均全部死亡，100和200μg/ml时，可见有部分存活细胞。因此，WSL和iPAM细胞的后续加压筛选的浓度分别为400μg/ml和600μg/ml。
2.2、细胞转染和稳定细胞系的获得
2.2.1、提前约12h，将WSL细胞(受体细胞)或iPAM细胞(受体细胞)传代至6孔板中，106个细胞/孔。正常培养至细胞生长至单层后，准备进行转染：100μL的OPTI-MEM培养基中加入2μg的质粒pcDNA3.1-D129L；100μL的OPTI-MEM培养基中加入-LT1Reagent约4μL，各静置5min后混合在一起，室温静置15～20min；待转染细胞更换新鲜的OPTI-MEM培养基后，加入转染体系，混匀；于37℃，5％ CO2细胞培养箱中孵育4～6h；弃去细胞孔中的转染混合物，更换新的培养液，置于37℃，5％ CO2细胞培养箱中继续培养；培养24h后，以1:500传代至96孔细胞培养板，同时补充少量的正常的细胞；传代用1640培养基中加入终浓度400μg/mL(WSL)或600μg/mL(iPAM)的G418，以加压筛选出具有G418抗性的细胞系。
2.2.2、细胞加药筛选期间，每天观察各孔中细胞存活情况。7天左右，部分孔中细胞开始出现死亡；14天左右，大部分细胞孔中细胞全部死亡，部分细胞孔中，出现1个或多个成簇的细胞克隆。
2.2.3、选取单个的细胞克隆的孔，将其中的细胞消化后，传代至新的24孔板中，继续加压培养；每天观察孔中细胞生长情况；细胞长至单层后，消化，部分传代至6孔板中继续扩大培养，小部分传代至24孔板中，准备进行鉴定。
2.3、稳定细胞系中D129L基因表达鉴定
2.3.1、基因整合检测：挑取多个单细胞克隆，分别记为WSL-D129L-1～WSL-D129L-6(由WSL作为受体细胞得到的单细胞克隆)和iPAM-D129L-1～iPAM-D129L-5(由iPAM作为受体细胞得到的单细胞克隆)，针对这些细胞克隆提取染色体基因组，采用D129L基因引物(D129L-F1：5’-TTAATCTTCATCATCTGTTT-3’(SEQ ID No.21)，D129L-R1：5’-ATGGATATAAATCCCTTACT-3’(SEQ ID No.22))进行PCR扩增。如图16为两种细胞克隆的部分细胞的核酸整合检测结果。
2.3.2、细胞克隆中目的蛋白pD129L表达量检测：收集以上单细胞克隆培养上清包被酶联板，按照间接ELISA操作程序，分别与抗ASFV阳性血清在37℃湿盒内反应1小时，经过PBS-Tween淋洗3次(3min/次)后，再分别与工作浓度的HRP标记的兔抗猪二抗在37℃湿盒内反应1小时，PBS-Tween淋洗3次，每次3min。同时设空白PBS、空白细胞培养上清(Control1)、培养基DMEM(美国Gibco产品，货号C11995500BT)对照(Control2)。反应后进行显色。结果显示，全部对照均成立。11个细胞克隆上清与抗ASFV阳性血清均发生了特异性免疫反应，结果如图17所示。保留pD129L蛋白表达量最高的细胞克隆WSL-D129L-4和iPAM-D129L-1为目标细胞系，分别记为WSL-D129L(由WSL作为受体细胞得到的表达pD129L蛋白的重组细胞)和iPAM-D129L(由iPAM作为受体细胞得到的表达pD129L蛋白的重组细胞)。
2.4、D129L基因稳定表达细胞系WSL(或iPAM)-D129L的制备和保存
针对上述鉴定的D129L蛋白稳定表达单细胞克隆WSL-D129L和iPAM-D129L传代扩大培养，并于液氮内保存。
3、利用D129L蛋白稳定表达单细胞克隆WSL-D129L和iPAM-D129L细胞系制备D129L基因缺失复制缺陷型非洲猪瘟病毒
3.1、D129L基因缺失复制缺陷型非洲猪瘟病毒的挑选
3.1.1、混合毒Mix-V TCID50测定：同实施例2中“混合毒Mix-V TCID50测定”，混合毒的粗略含量为103.84TCID50/ml。
3.1.2、D129L基因缺失毒的纯化、鉴定及种毒制备
将混合毒Mix-V进行103.84稀释，使每100μl中含有1个TCID50的混合毒，得到稀释的混合毒悬液。分别取100μl稀释的混合毒悬液，接种到96孔板培养的D129L基因稳定表达细胞系(WSL-D129L或iPAM-D129L)中，在37℃5％ CO2条件下培养72～96小时后，在倒置荧光显微镜下观察并标记只有单一荧光细胞或单一荧光灶细胞的感染细胞孔。将含有单个荧光细胞克隆的细胞孔冻融，将冻融液分别接种D129L基因稳定表达细胞系和原代猪PAM细胞，在倒置荧光显微镜下观察细胞中荧光。其中混合毒Mix-V感染iPAM-D129L得到的单一荧光灶细胞的感染细胞孔的荧光显微镜检测结果如图18所示。图19为混合毒Mix-V感染iPAM-D129L得到的单一荧光灶细胞的感染细胞冻融后接种iPAM-D129L细胞系后培养的结果，iPAM-D129L细胞孔中具有明显的荧光，猪PAM细胞中没有荧光。说明获得的单一荧光细胞或单一荧光细胞灶孔中的病毒为纯化的D129L基因缺失毒，该病毒为复制缺陷型。将混合毒Mix-V感染iPAM-D129L得到的单一荧光灶细胞的感染细胞孔中的细胞冻融，收集冻融液，该冻融液只含有复制缺陷型D129L基因缺失毒这一种病毒，命名为ΔSY18ΔD129L。
3.2、复制缺陷型D129L基因缺失毒制备
收获3.1的含有D129L基因缺失复制缺陷型非洲猪瘟病毒ΔSY18ΔD129L的冻融液，按照1％比例接种iPAM-D129L基因稳定表达转基因细胞系，用1640培养基(美国Gibco公司产品，货号C11875500BT)在37℃5％ CO2条件下培养72～96小时，待90％以上细胞呈现荧光后，收获培养细胞，冻融混合后得到含有ΔSY18ΔD129L的冻融液，-15℃以下保存，标记为ΔSY18ΔD129L-202201。
3.3、复制缺陷型D129L基因缺失毒的含量滴定
收获3.2的含有D129L基因缺失复制缺陷型非洲猪瘟病毒ΔSY18ΔD129L的冻融液，进行10倍系列稀释，取104.0～108.0共5个稀释度接种D129L基因稳定表达转基因细胞系(iPAM-D129L)96孔板，每个稀释度接种8个细胞孔，每孔100μl，补充含5％小牛血清的1640培养基(美国Gibco公司产品，货号C11875500BT)，在37℃5％ CO2条件下培养72小时。在倒置显荧光微镜下观察荧光细胞孔，计算D129L基因缺失复制缺陷型非洲猪瘟病毒滴度。D129L基因缺失复制缺陷型非洲猪瘟病毒含量测定结果如图20所示，测定的病毒滴度结果为107.64TCID50/mL。
实施例4、D129L基因缺失复制缺陷型非洲猪瘟病毒免疫试验
1、病毒
1.1、实施例3步骤3.1.2中制备的D129L基因缺失复制缺陷型非洲猪瘟病毒(ΔSY18ΔD129L株)
1.2、ASFV SY18ΔMGF/CD2v株为双基因片段缺失非洲猪瘟活病毒，记载在如下文献中：张艳艳，陈腾，张静远，齐宇，缪发明，薄宗义，王立冬，郭晓宇，周鑫韬，杨金梅，王晓虎，高玉龙，汪春雨，鲍晨沂，米立娟，孙雪霏，冯娜，杨金金，王承宇，万忠海，李记平，孟轲音，田多，李楠，王述超，王颖，张菲，张锦霞，蒋依倩，刘晔，张守峰，张中洋，钱莺娟，朱鸿飞，高玉伟，陈鸿军，李金祥，扈荣良.非洲猪瘟病毒基因缺失疫苗株的构建和免疫保护特性.中国兽医学报,2019；39(8):1421-1427.，由军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所构建、鉴定、保存和供应。
1.3、非洲猪瘟病毒强毒SY18株(ASFV SY18株，ASFV-SY18)。
2、动物
1月龄健康仔猪(为杜长大三元杂交仔猪，体重6.0-7.5kg)若干。购买前采集血清用于检测非洲猪瘟病毒核酸和抗体，ASFV核酸和抗体均为阴性的临床健康猪用于本试验。
3、病毒制备
ASFV SY18ΔD129L株的iPAM-D129L辅助细胞培养物的制备和测定：同实施例3、中的3.2和3.3。
ASFV SY18ΔMGF/CD2v株的PAM细胞培养物的制备：同文献(张艳艳，陈腾，张静远，齐宇，缪发明，薄宗义，王立冬，郭晓宇，周鑫韬，杨金梅，王晓虎，高玉龙，汪春雨，鲍晨沂，米立娟，孙雪霏，冯娜，杨金金，王承宇，万忠海，李记平，孟轲音，田多，李楠，王述超，王颖，张菲，张锦霞，蒋依倩，刘晔，张守峰，张中洋，钱莺娟，朱鸿飞，高玉伟，陈鸿军，李金祥，扈荣良.非洲猪瘟病毒基因缺失疫苗株的构建和免疫保护特性.中国兽医学报,2019；39(8):1421-1427)中的制备方法。
4、免疫及感染试验
4.1、免疫
15头上述健康仔猪，随机分为3组，每组5头，第1组免疫ASFV SY18ΔD129L株的iPAM-D129L辅助细胞培养物1ml(107.0TCID50/ml)，免疫2次，间隔14日；第2组免疫ASFV SY18ΔMGF/CD2v株的PAM细胞培养物1ml(107.0TCID50/ml)，免疫2次，间隔14日；第3组不免疫(不进行安全性评价故不注射任何液体)作为空白攻毒对照。免疫后各组隔离饲养。
4.2、攻毒感染
所有3组猪在免疫组第2次免疫后14日时，对所有猪进行ASFV SY18攻毒，每头猪肌内注射攻毒剂量为25TCID50。攻毒后正常饲养。观察28日。针对发热和发病猪按照世界动物卫生组织(OIE)推荐方法进行ASFV实时PCR检测。根据以下标准判断发病或保护：
(1)发病标准
1)死亡；
2)高热，体温≥41℃，且超过3天；
3)精神沉郁、食欲减退或废绝超过3日，后期出现腹泻、呼吸困难、皮肤出血点等非洲猪瘟典型临床症状；
4)发热或发病期或死亡猪口、鼻、肛拭子中ASFV病毒检测阳性。
符合1)+4)或2)+3)+4)，即可判为发病。
(2)攻毒保护判定标准
1)体温连续升高≥41℃不超过3日；
2)不出现明显临床症状(精神沉郁、食欲减退或废绝、腹泻、呼吸困难、皮肤出血点等非洲猪瘟典型临床症状)；
3)观察结束时，采集口、鼻、肛拭子，病毒检测应为阴性。
4、结果
4.1、免疫攻毒保护结果：观察结果显示，攻毒后8～13日，第3组5头空白攻毒对照全部死亡，发病期间表现精神沉郁，厌食，卧地，发热持续2-6日，最终全部死亡(100％死亡率)。第2组猪攻毒后5-8所有个体均出现了较为明显的发热，1只死亡，4只耐过保护。第1组攻毒后均未出现异常临床表现，全部健活，保护率100％(5/5)。结果见图21。
上述结果说明，D129L基因缺失复制缺陷型非洲猪瘟病毒ΔSY18ΔD129L免疫猪2次能够产生完全的攻毒保护，双基因片段缺失毒SY18ΔMGF/CD2v株两次免疫后攻毒时，免疫猪出现明显的发热且1头猪死亡。
4.2、免疫攻毒组观察期结束时，D129L基因缺失复制缺陷型非洲猪瘟病毒免疫猪拭子及剖检组织中ASFV核酸检测结果：具体结果见图22(判定标准：小于等于35判为阳性；CT值大于35、小于40判为可疑(均给出CT值)；无数值判为阴性。)和图23(“-”为无数值。判定标准：小于等于35判为阳性；CT值大于35、小于40判为可疑(均给出CT值)；无数值判为阴性)。
针对核酸检测结果呈现阳性的拭子，经过滤除菌后接种BMDM细胞进行病毒分离，并盲传一代，用FITC-p30荧光抗体染色和实时PCR检测，结果均呈阴性。
针对核酸检测结果呈现阳性的组织悬液接种BMDM细胞进行病毒分离，并盲传2代，用FITC-p30荧光抗体染色和实时PCR检测，结果均呈阴性。
通过以上攻毒结果可以看出，D129L基因缺失复制缺陷型非洲猪瘟病毒免疫猪两次以后，可以产生完全的免疫攻毒保护，且不发生排毒现象。说明D129L基因缺失复制缺陷型非洲猪瘟病毒具有良好的免疫保护效果，是一种理想的复制缺陷型疫苗。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.蛋白质的应用，其特征在于，所述应用为下述任一种：
A1)在制备复制缺陷型非洲猪瘟疫苗中的应用；
A2)在制备复制缺陷型非洲猪瘟病毒中的应用；
A3)在制备抑制非洲猪瘟病毒复制的产品中的应用；
A4)在制备用于复制缺陷型非洲猪瘟病毒的增殖或培养的产品中的应用；
所述蛋白质为下述任一种：
B1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；
B2)将SEQ ID No.2的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
B3)在B1)或B2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
2.与权利要求1中所述蛋白质相关的生物材料的应用，其特征在于，所述应用为下述任一种：
C1)在制备复制缺陷型非洲猪瘟疫苗中的应用；
C2)在制备复制缺陷型非洲猪瘟病毒中的应用；
C3)在制备抑制非洲猪瘟病毒复制的产品中的应用；
C4)在制备用于复制缺陷型非洲猪瘟病毒的增殖或培养的产品中的应用；
所述生物材料为下述D1)至D6)中的任一种：
D1)编码权利要求1中所述蛋白质的核酸分子；
D2)抑制或降低权利要求1中所述蛋白质的编码基因功能的核酸分子；
D3)含有D1)和/或D2)所述核酸分子的表达盒；
D4)含有D1)和/或D2)所述核酸分子的重组载体、或含有D3)所述表达盒的重组载体；
D5)含有D1)和/或D2)所述核酸分子的重组微生物、或含有D3)所述表达盒的重组微生物、或含有D4)所述重组载体的重组微生物；
D6)含有D1)和/或D2)所述核酸分子的重组细胞、或含有D3)所述表达盒的重组细胞、或含有D4)所述重组载体的重组细胞。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，D1)所述核酸分子为下述任一种：
E1)核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子；
E2)编码序列是SEQ ID No.1的DNA分子；
E3)编码序列是SEQ ID No.1的任何遗传密码子简并序列的DNA分子。
4.复制缺陷型非洲猪瘟病毒，其特征在于，所述复制缺陷型非洲猪瘟病毒基因组缺失了权利要求1中所述蛋白质的编码基因，或所述复制缺陷型非洲猪瘟病毒基因组中权利要求1中所述蛋白质的编码基因功能失活。
5.制备复制缺陷型非洲猪瘟病毒的方法，其特征在于，所述方法包括使非洲猪瘟病毒基因组中权利要求1中所述蛋白质的编码基因缺失或功能失活，得到复制缺陷型非洲猪瘟病毒。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
G1)构建含有权利要求1中所述蛋白质编码基因左右同源臂的重组载体；
G2)将G1)中所述重组载体与非洲猪瘟病毒共转染/感染宿主细胞；
G3)培养所述宿主细胞，筛选得到复制缺陷型非洲猪瘟病毒。
7.由权利要求5或6所述的方法制备得到的复制缺陷型非洲猪瘟病毒。
8.权利要求4或7所述复制缺陷型非洲猪瘟病毒的增殖方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求4或7所述复制缺陷型非洲猪瘟病毒在辅助细胞中培养，所述辅助细胞为稳定表达权利要求1中所述蛋白质的重组细胞和/或含有权利要求1中所述蛋白质的细胞。
9.权利要求8中所述的辅助细胞，或权利要求8中所述的辅助细胞在制备权利要求4所述复制缺陷型非洲猪瘟病毒中的应用。
10.复制缺陷型非洲猪瘟疫苗，其特征在于，所述复制缺陷型非洲猪瘟疫苗包括权利要求4或7所述的复制缺陷型非洲猪瘟病毒。
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