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CN116463344A - 一种降低tomm22表达抑制肿瘤的方法 - Google Patents

一种降低tomm22表达抑制肿瘤的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于癌症治疗领域，提供了具体涉及一种降低TOMM22表达抑制肿瘤的方法。本发明提供的shRNA包括shHTOMM22#1或shHTOMM22#2，shRNA抑制载体包括上述的shRNA和基础载体。shRNA抑制载体的制备方法包括以下步骤：将shRNA的正向引物和反向引物混合，退火，得到双链寡核苷酸；酶切基础载体得到敲低载体；将所述双链寡核苷酸和所述敲低载体进行连接，得到所述shRNA抑制载体。本发明通过在肝癌细胞中敲低TOMM22的表达，显著抑制癌细胞增殖；通过裸鼠成瘤实验，确定TOMM22的敲低对肿瘤生长具有显著抑制效果。

Description

一种降低TOMM22表达抑制肿瘤的方法
技术领域
本发明属于癌症治疗技术领域，具体涉及一种降低TOMM22表达抑制肿瘤的方法。
背景技术
肝癌是导致病人死亡的恶性肿瘤之一，其恶性程度高，在我国肝癌死亡率仅次于胃癌，居我国恶性肿瘤死亡率第二位。据统计，我国每年新增肝癌人数30万人，而每年肝癌死亡人数达11万。
因此，寻找有效且副作用和缓的抗癌物质就显得更为迫切。
目前，已经公开的针对Hep3b的治疗方法包括：使用棕榈酸作为人肝癌细胞株Hep3B，LM3的生长抑制剂；使用吡咯并嘧啶酯Ⅰ、吡咯并嘧啶酯Ⅱ和吡咯并嘧啶酯Ⅲ抑制肝癌Hep3b细胞中LncRNA CCAT1的表达；使用异戊烯基黄酮类化合物对Hep3B细胞具有细胞毒作用和促凋亡作用，从而抑制其表达；使用千金藤素抑制HepG2、Hep3B和Huh7的增殖以及使用辛伐他汀和博舒替尼作为肝癌细胞抑制剂的方法。
通过WB、RT-qPCR和免疫组化对临床肝癌样本分析中发现，在肝癌中TOMM22表达量显著高于正常组织，并且TOMM22的表达量同生存率呈负相关，因此，猜想，TOMM22的异常高表达会促进肝癌的进程。通过siRNA敲低TOMM22可能会抑制肝癌细胞的生长，进而有望成为治疗肝癌的药物。
但是现有技术中，并未发现有针对TOMM22表达的研究，如其可以适用于肿瘤生长的抑制，则对于本领域具有积极的意义。
发明内容
本发明的一个目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供的一种降低TOMM22表达抑制肿瘤的方法。
为了实现上述目的，本发明首先提供了一种降低TOMM22表达抑制肿瘤的方法，使用抑制TOMM22表达的shRNA抑制肿瘤，所述shRNA为shHTOMM22#1或shHTOMM22#2；
所述shHTOMM22#1的正向引物如SEQ ID NO.1所示,所述shHTOMM22#1的反向引物如SEQ ID NO.2所示；
所述shHTOMM22#2的正向引物如SEQ ID NO.3所示,所述shHTOMM22#2的反向引物如SEQ ID NO.4所示；
SEQ ID NO.1
CCGGGCAGATACTTCTAGGACCTAACTCGAGTTAGGTCCTAGAAGTATCTGCTTTTTG；
SEQ ID NO.2
AATTCAAAAAGCAGATACTTCTAGGACCTAACTCGAGTTAGGTCCTAGAAGTATCTGC；
SEQ ID NO.3
CCGGCGTTGTCTTTGAGACGGAGAACTCGAGTTCTCCGTCTCAAAGACAACGTTTTTG；
SEQ ID NO.4
AATTCAAAAACGTTGTCTTTGAGACGGAGAACTCGAGTTCTCCGTCTCAAAGACAACG。
所述shHTOMM22#1的靶点为TOMM22序列的第373-393位；所述shHTOMM22#2的靶点为TOMM22序列的第316-336位。
进一步的，本发明还提供了一种抑制TOMM22表达的shRNA，所述shRNA为shHTOMM22#1或shHTOMM22#2；
所述shHTOMM22#1的正向引物如SEQ ID NO.1所示,所述shHTOMM22#1的反向引物如SEQ ID NO.2所示；
所述shHTOMM22#2的正向引物如SEQ ID NO.3所示,所述shHTOMM22#2的反向引物如SEQ ID NO.4所示；
SEQ ID NO.1
CCGGGCAGATACTTCTAGGACCTAACTCGAGTTAGGTCCTAGAAGTATCTGCTTTTTG；
SEQ ID NO.2
AATTCAAAAAGCAGATACTTCTAGGACCTAACTCGAGTTAGGTCCTAGAAGTATCTGC；
SEQ ID NO.3
CCGGCGTTGTCTTTGAGACGGAGAACTCGAGTTCTCCGTCTCAAAGACAACGTTTTTG；
SEQ ID NO.4
AATTCAAAAACGTTGTCTTTGAGACGGAGAACTCGAGTTCTCCGTCTCAAAGACAACG。
所述shHTOMM22#1的靶点为TOMM22序列的第373-393位；所述shHTOMM22#2的靶点为TOMM22序列的第316-336位。
进一步的，本发明还提供了一种抑制TOMM22表达的shRNA抑制载体，包括所述的shRNA和基础载体。
优选的，所述基础载体为pLKO.1质粒。
进一步的，本发明还提供了一种抑制载体的制备方法，包括：
将所述的shRNA的正向引物和反向引物混合，退火，得到双链寡核苷酸；酶切基础载体得到敲低载体；将所述双链寡核苷酸和所述敲低载体进行连接，得到所述shRNA抑制载体。
优选的，所述酶切所用的酶包括EcoRI和AgeI。
优选的，所述EcoRI和AgeI为限制性内切酶，切割DNA产生粘性末端。
优选的，所述连接所用的酶为T4 DNA连接酶。
优选的，所述T4 DNA连接酶可以将所述限制性内切酶切割后的，具有互补的粘性末端进行连接，产生重组DNA。
进一步的，本发明还提供了抑制TOMM22表达的试剂在制备治疗肝癌的药物中的应用。
优选的，所述抑制TOMM22表达的试剂包括所述的shRNA。
优选的，所述抑制TOMM22表达的试剂包括所述的抑制载体。
本发明具有如下的有益效果：
本发明通过在肝癌细胞中敲低TOMM22的表达，显著抑制癌细胞增殖；通过裸鼠成瘤实验，确定TOMM22的敲低对肿瘤生长具有显著抑制效果，且本发明的研发成本较低，体内稳定性好，特异性强，不对正常的人体组织产生干扰，比靶向治疗中的单克隆抗体的生产成本低，具有较好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为转染肝癌细胞中TOMM22的敲低效果图；
图2为对7-21天小鼠活体成像检测图；
图3为28天小鼠体内肿瘤组织对比图；
图4为小鼠体内瘤重图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
TCGA数据显示，在肝癌患者的癌组织中，TOMM22的表达显著高于癌旁组织，因此拟通过在肝癌细胞中敲低TOMM22的表达，通过裸鼠皮下成瘤实验，检测TOMM22的敲低对肝癌细胞的生长是否有抑制效果。为了实时动态地观测肿瘤组织的生长，在肿瘤细胞中稳定表达荧光素酶，在荧光素为底物的情况下，通过小动物活体成像Lumina3检测小鼠在不同时期肿瘤的生长情况，最后解剖出肿瘤，称量肿瘤的重量，确定TOMM22的敲低对肝癌细胞的生长是否有抑制效果。
实例1：shRNA的构建
一种抑制TOMM22表达的shRNA，
所述shRNA为shHTOMM22#1或shHTOMM22#2；
所述shHTOMM22#1的正向引物如SEQ ID NO.1所示,所述shHTOMM22#1的反向引物如SEQ ID NO.2所示；
所述shHTOMM22#2的正向引物如SEQ ID NO.3所示,所述shHTOMM22#2的反向引物如SEQ ID NO.4所示；
SEQ ID NO.1
CCGGGCAGATACTTCTAGGACCTAACTCGAGTTAGGTCCTAGAAGTATCTGCTTTTTG；
SEQ ID NO.2
AATTCAAAAAGCAGATACTTCTAGGACCTAACTCGAGTTAGGTCCTAGAAGTATCTGC；
SEQ ID NO.3
CCGGCGTTGTCTTTGAGACGGAGAACTCGAGTTCTCCGTCTCAAAGACAACGTTTTTG；
SEQ ID NO.4
AATTCAAAAACGTTGTCTTTGAGACGGAGAACTCGAGTTCTCCGTCTCAAAGACAACG。
此外，设计了对照组引物shScramble，所述shScramble的正向引物如SEQ ID NO.5所示,所述shScramble的反向引物如SEQ ID NO.6所示；
SEQ ID NO.5
CCGGCCTAAGGTTAAGTCGCCCTCGCTCGAGCGAGGGCGACTTAACCTTAGGTTTTTG；
SEQ ID NO.6
AATTCAAAAACCTAAGGTTAAGTCGCCCTCGCTCGAGCGAGGGCGACTTAACCTTAGG。
实例2
将上述的每对正向引物和反向引物退火，形成两端含有AgeI和EcoRI的粘性末端，将退火后的片段用T4 DNA连接酶同用AgeI和EcoRI酶切后的pLKO.1质粒进行连接，通过菌落PCR和测序确定阳性克隆，从而获得载体质粒。
实例3
(1)将萤光素酶-杀稻瘟菌素和psPAX2、pMD2G质粒共转染293T细胞(淋巴细胞)，48h后收取病毒上清，利用超速离心机浓缩病毒。本步骤内病毒滴度为将1×108TU/mL病毒，以200倍稀释使用。
(2)将浓缩后的病毒加入Hep3b肝癌细胞中，同时加入聚凝胺。感染24h后，加入10μg/mL杀稻瘟菌素进行筛选，直到无细胞死亡，剩下的细胞即为表达荧光素酶的阳性细胞。
(3)将稳转荧光素酶的细胞悬浮液中加入终浓度为0.5mM的D-荧光素钠，用GloMax20/20Luminometer发光检测仪检测或将加入有D-荧光素的细胞培养皿直接在小动物活体成像仪lumina3上检测。同空白细胞相比，通过检测所构建的细胞是否有明显的发光。
实例4：构建稳定表达shRNA的肝癌细胞系
(1)将pHAGE-shHTOMM22#1、pHAGE-shHTOMM22#2和pHAGE-shScramble分别和psPAX2、pMD2G质粒共转293T细胞，48后收取病毒上清，利用超速离心机浓缩病毒。
(2)将浓缩后的病毒加入表达荧光素酶的Hep3b肝癌细胞中，同时加入聚凝胺。感染24h后，加入2μg/mL嘌呤霉素进行筛选，直到无细胞死亡，剩下的细胞即为稳定整合shRNA的阳性细胞。
(3)通过荧光定量PCR和WB鉴定稳定转染的细胞中TOMM22的敲低效果。
如图1，shTOMM22#1以及shTOMM22#2中的TOMM22的表达受到了抑制，而β-ACTIN和HSP60不受影响，这表明本发明的shRNA特异性较好。
本步骤包装病毒时的具体条件为：30cm培养皿，psPAX 15μg,pMD2G10μg,pLKO.125μg.PEI转染按DNA:PEI＝1:4(m/m)比例混合去内毒素DNA和1mg/ml PEI溶液。
实例5：小鼠皮下成瘤验证实验
(1)用15cm培养皿培养筛选出的稳定转染荧光素酶和shRNA的细胞。
(2)将细胞用磷酸缓冲盐溶液洗3遍，用磷酸缓冲盐溶液重悬细胞，使得每毫升磷酸缓冲盐溶液中有3×107细胞。
(3)将5周的18只雄性BALB/c裸鼠分成三组，分别为shScramble组，shHTOMM#1组和shHTOMM#2组。在每只小鼠上肢腋下注射3×106个细胞。
(4)饲养1个月，前三周在小鼠腹腔中注射200μL 15mg/mL的D-荧光素钠，用小动物活体成像仪lumina3进行检测，第四周处死小鼠，摘取肿瘤组织，进行称重，称重结果如下表。
实验结果可知：
在饲养第一、二、三和四周，shScramble组的肿瘤大小明显大于shHTOMM#1组和shHTOMM#2组。而且，shHTOMM#2组的序号为6的小鼠没有肿瘤组织，这表明敲低TOMM22能够抑制人肝癌细胞生长。
本发明通过调控TOMM22的表达，肝癌细胞中敲低TOMM22的表达，通过裸鼠皮下成瘤实验，确定了TOMM22的敲低对肝癌细胞的生长具备抑制效果，从而为肝癌治疗提供了一种新的路径。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质范围。

Claims (10)

1.一种降低TOMM22表达抑制肿瘤的方法，其特征在于，使用抑制TOMM22表达的shRNA抑制肿瘤，所述shRNA为shHTOMM22#1或shHTOMM22#2；
所述shHTOMM22#1的正向引物如SEQ ID NO.1所示,所述shHTOMM22#1的反向引物如SEQID NO.2所示；
所述shHTOMM22#2的正向引物如SEQ ID NO.3所示,所述shHTOMM22#2的反向引物如SEQID NO.4所示；
SEQ ID NO.1
CCGGGCAGATACTTCTAGGACCTAACTCGAGTTAGGTCCTAGAAGTATCTGCTTTTTG；
SEQ ID NO.2
AATTCAAAAAGCAGATACTTCTAGGACCTAACTCGAGTTAGGTCCTAGAAGTATCTGC；
SEQ ID NO.3
CCGGCGTTGTCTTTGAGACGGAGAACTCGAGTTCTCCGTCTCAAAGACAACGTTTTTG；
SEQ ID NO.4
AATTCAAAAACGTTGTCTTTGAGACGGAGAACTCGAGTTCTCCGTCTCAAAGACAACG。
2.一种抑制TOMM22表达的shRNA，其特征在于,所述shRNA为shHTOMM22#1或shHTOMM22#2；
所述shHTOMM22#1的正向引物如SEQ ID NO.1所示,所述shHTOMM22#1的反向引物如SEQID NO.2所示；
所述shHTOMM22#2的正向引物如SEQ ID NO.3所示,所述shHTOMM22#2的反向引物如SEQID NO.4所示；
SEQ ID NO.1
CCGGGCAGATACTTCTAGGACCTAACTCGAGTTAGGTCCTAGAAGTATCTGCTTTTTG；
SEQ ID NO.2
AATTCAAAAAGCAGATACTTCTAGGACCTAACTCGAGTTAGGTCCTAGAAGTATCTGC；
SEQ ID NO.3
CCGGCGTTGTCTTTGAGACGGAGAACTCGAGTTCTCCGTCTCAAAGACAACGTTTTTG；
SEQ ID NO.4
AATTCAAAAACGTTGTCTTTGAGACGGAGAACTCGAGTTCTCCGTCTCAAAGACAACG。
3.一种抑制TOMM22表达的shRNA抑制载体，其特征在于，包括权利要求1所述的shRNA和基础载体。
4.如权利要求3所述的抑制TOMM22表达的shRNA抑制载体，其特征在于，所述基础载体为pLKO.1质粒。
5.权利要求3或4所述抑制载体的制备方法，其特征在于，包括：
权利要求1或2所述的shRNA的正向引物和反向引物混合，退火，得到双链寡核苷酸；酶切基础载体得到敲低载体；将所述双链寡核苷酸和所述敲低载体进行连接，得到所述shRNA抑制载体。
6.如权利要求5所述的抑制载体的制备方法，其特征在于，所述酶切所用的酶包括EcoRI和AgeI。
7.如权利要求5所述的抑制载体的制备方法，其特征在于，所述连接所用的酶为T4 DNA连接酶。
8.抑制TOMM22表达的试剂在制备治疗肝癌的药物中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，
所述抑制TOMM22表达的试剂包括如权利要求1所述的shRNA。
10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，
所述抑制TOMM22表达的试剂包括如权利要求3-4任一项所述的shRNA抑制载体。
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