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CN116438456A - 用于疾病检测/诊断、分期、监测和治疗的离体蛋白酶活性检测 - Google Patents

用于疾病检测/诊断、分期、监测和治疗的离体蛋白酶活性检测 Download PDF

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CN116438456A
CN116438456A CN202180076229.1A CN202180076229A CN116438456A CN 116438456 A CN116438456 A CN 116438456A CN 202180076229 A CN202180076229 A CN 202180076229A CN 116438456 A CN116438456 A CN 116438456A
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protease
reporter
protein
cathepsin
carboxypeptidase
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法伊察尔·陶蒂
温迪·温克勒·阿达莫维奇
索菲·卡扎纳夫
梅赫尔·奇马
罗伯特·S·兰格
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Grimpus Biological Co ltd
Original Assignee
Grimpus Biological Co ltd
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Abstract

本申请提供了用于确定对象中的疾病或病症的组合物和方法。该方法包含将体液与含有其报告物的分子接触，所报告物被体液中的作用物切割。还描述了可通过该方法确定的疾病和病症。

Description

用于疾病检测/诊断、分期、监测和治疗的离体蛋白酶活性 检测
交叉引用
本申请要求于2020年9月11日提交的美国临时申请号63/077,525的权益，其全部内容通过引用并入本文。
发明内容
本文提供了一种方法，其包括使来自对象的血浆样本与分子离体接触并检测所述释放的报告物的形成速率或量。本文进一步提供了一种方法。本文进一步提供了一种方法，其中所述分子包含可切割接头和报告物，并且其中所述可切割接头被来自所述血浆的作用物(agent)切割，释放来自所述分子的所述报告物。
本文进一步提供了一种方法，其进一步包含向所述血浆样本中引入抗凝剂。本文进一步提供了一种方法，其中所述抗凝剂是EDTA、柠檬酸盐、肝素、草酸盐，其任何盐、溶剂化物、对映异构体、互变异构体和几何异构体，或其任何混合物。
本文进一步提供了一种方法，其包括使来自患有疾病或病症的对象的体液样本与分子离体接触。本文进一步提供了一种方法，其中所述分子包含可切割接头和报告物，并且其中所述可切割接头被来自所述体液的作用物切割，释放来自所述分子的所述报告物。本文进一步提供了一种方法，其中所述释放的报告物的所述形成速率或所述量与健康对象显著不同。
本文提供了一种方法，其包括使来自对象的体液样本与第一分子离体接触，其中所述第一分子包含第一可切割接头和第一报告物，并且其中所述第一可切割接头被来自所述体液的第一作用物切割，从所述第一分子释放所述第一报告物。本文进一步提供了一种方法，其检测所述释放的第一报告物的形成速率或量。本文进一步提供了一种方法，其使来自所述对象的所述体液样本与第二分子离体接触，其中所述第二分子包含第二可切割接头和第二报告物，并且其中所述第二可切割接头被来自所述体液的第二作用物切割，从所述第二分子释放所述第二报告物。本文进一步提供了一种方法，其检测所述释放的第二报告物的形成速率或量，并且基于对所述释放的第一报告物的所述检测和对所述释放的第二报告物的所述检测确定所述对象的疾病或病症。
本文进一步提供了一种方法，其中所述确定包含监督机器学习分类算法、逻辑回归、朴素贝叶斯、支持向量机、随机森林、梯度提升(gradient boosting)、神经网络、连续回归方法、岭回归、核岭回归、支持向量回归或其任何组合。
本文提供了一种方法，其包括使来自对象的体液样本与分子离体接触，其中所述分子包含可切割接头和报告物，并且其中所述可切割接头被来自所述体液的作用物切割，释放来自所述分子的所述报告物。本文进一步提供了一种方法，其包括检测所述释放的报告物的形成速率或量，并且基于所述检测确定所述对象的疾病或病症，其中所述疾病或病症是非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的某一纤维化阶段或某一非酒精性脂肪性肝病活动度评分(NAS)。
本文提供了一种方法，其包括使来自对象的体液样本与分子离体接触，其中所述分子包含可切割接头和报告物，并且其中所述可切割接头被来自所述体液的作用物切割，释放来自所述分子的所述报告物。本文进一步提供了一种方法，其检测所述释放的报告物的形成速率或量，并且基于所述检测确定所述对象的疾病或病症，其中所述疾病或病症选自肝病、癌症、器官移植排斥、感染性疾病、变应性疾病、自身免疫、阿尔茨海默氏病和慢性炎症；其中所述癌症不是胰腺导管腺癌或非小细胞肺癌。
本文进一步提供了一种方法，其中所述肝病包含非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、毒素介导的肝损伤、病毒性肝炎、暴发性肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎、肝硬化、肝细胞癌(HCC)、原发性胆汁性胆管炎(PBC)、胆管癌、原发性硬化性胆管炎、移植肝的急性或慢性排斥、遗传性肝病或其组合。
本文进一步提供了一种方法，其中所述体液样本选自血液、血浆、骨髓液、淋巴液、胆汁、羊水、粘膜液、唾液、尿、脑脊液、脊髓液、滑液、精液、导管吸出物、粪便、粪质、阴道流出物、泪液、组织裂解物和患者来源的细胞系上清液。
本文进一步提供了一种方法，其中所述体液样本包含洗液、调理介质(conditioning media)或缓冲液、拭子病毒运输介质、盐水、培养基或细胞培养物上清液。
本文进一步提供了一种方法，其中所述洗液选自漱口洗液、细支气管肺泡洗液、灌洗液、洗发洗液、鼻喷雾流出物、应用于盐水或任何介质的任何体表、孔口、器官结构或实体瘤活检的拭子或其任何衍生物。
本文进一步提供了一种方法，其中所述作用物选自氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶、连接酶、蛋白酶(肽酶)、水解酶、酯酶、β-糖苷酶、磷脂酶和磷酸二酯酶、过氧化物酶、脂肪酶、淀粉酶、亲核试剂、还原试剂、亲电/酸性试剂、有机金属/金属催化剂、氧化试剂、羟基离子、硫醇类亲核物质、氮亲核物质、连二亚硫酸钠和高碘酸钠。
本文进一步提供了一种方法，其中所述作用物是蛋白酶。本文进一步提供了一种方法，其中所述蛋白酶是内肽酶或外肽酶。本文进一步提供了一种方法，其中所述蛋白酶选自A20(TNFa诱导的蛋白质3)、α/β水解酶结构域4(abhydrolase domain containing 4)、α/β水解酶结构域12、α/β水解酶结构域12B、α/β水解酶结构域13、顶体酶、酰氨基酰肽酶、解聚素金属蛋白酶(ADAM)、ADAM1a、ADAM2(受精素-b(Fertilin-b))、ADAM3B、ADAM4、ADAM4B、ADAM5、ADAM6、ADAM7、ADAM8、ADAM9、ADAM10、ADAM11、ADAM12金属蛋白酶、ADAM15、ADAM17、ADAM18、ADAM19、ADAM20、ADAM21、ADAM22、ADAM23、ADAM28、ADAM29、ADAM30、ADAM32、ADAM33、具有血小板反应蛋白基序的解聚素金属蛋白酶(ADAMTS)、ADAMTS1、ADAMTS2、ADAMTS3、ADAMTS4、ADAMTS5/11、ADAMTS6、ADAMTS7、ADAMTS8、ADAMTS9、ADAMTS10、ADAMTS12、ADAMTS13、ADAMTS14、ADAMTS15、ADAMTS16、ADAMTS17、ADAMTS18、ADAMTS19、ADAMTS20、脂肪细胞增强结合蛋白1、Afg3样蛋白1、Afg3样蛋白2、气道胰蛋白酶样蛋白酶、氨酰基转移酶、氨肽酶A、氨肽酶B、氨肽酶B样1、氨肽酶MAMS/L-RAP、氨肽酶N、氨肽酶O、氨肽酶P同系物、氨肽酶P1、氨肽酶PILS、氨肽酶Q、氨肽酶样1、AMSH/STAMBP、AMSH-LP/STAMBPL1、血管紧张素转换酶1(ACE1)、血管紧张素转换酶2(ACE2)、血管紧张素转换酶3(ACE3)、阴离子胰蛋白酶(II)、载脂蛋白(a)、阿奇霉素-1、阿奇霉素-2、天冬氨酸酰基转移酶、天冬氨酸酰基转移酶-3、天冬氨酰氨肽酶、共济失调蛋白-3、共济失调蛋白-3样、ATP/GTP结合蛋白1、ATP/GTP结合蛋白样2、ATP/GTP结合蛋白样3、ATP/GTP结合蛋白样4、ATP/GTP结合蛋白样5、ATP23肽酶、自噬蛋白-1、自噬蛋白-2、自噬蛋白-3、自噬蛋白-4、天青蛋白(azurocidin)、β内酰胺酶、β-分泌酶1、β-分泌酶2、博来霉素水解酶、脑丝氨酸蛋白酶2、BRCC36(含BRCA2的复合物亚基3)、钙蛋白酶、钙蛋白酶1、钙蛋白酶2、钙蛋白酶3、钙蛋白酶4、钙蛋白酶5、钙蛋白酶6、钙蛋白酶7、钙蛋白酶7样、钙蛋白酶8、钙蛋白酶9、钙蛋白酶10、钙蛋白酶11、钙蛋白酶12、钙蛋白酶13、钙蛋白酶14、钙蛋白酶15(Solh蛋白)、半胱氨酸蛋白酶、羧肽酶A1、羧肽酶A2、羧肽酶A3、羧肽酶A4、羧肽酶A5、羧肽酶A6、羧肽酶B、羧肽酶D、羧肽酶E、羧肽酶M、羧肽酶N、羧肽酶O、羧肽酶U、羧肽酶X1、羧肽酶X2、羧肽酶Z、肌肽二肽酶1、肌肽二肽酶2、半胱天冬酶募集结构域家族成员8、半胱天冬酶、半胱天冬酶-1、半胱天冬酶-2、半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-4/11、半胱天冬酶-5、半胱天冬酶-6、半胱天冬酶-7、半胱天冬酶-8、半胱天冬酶-9、半胱天冬酶10、半胱天冬酶-12、半胱天冬酶-14、半胱天冬酶-14样、casper/FLIP、组织蛋白酶、组织蛋白酶A(CTSA)、组织蛋白酶B(CTSB)、组织蛋白酶C(CTSC)、组织蛋白酶D(CTSD)、组织蛋白酶E(CTSE)、组织蛋白酶F、组织蛋白酶G、组织蛋白酶H(CTSH)、组织蛋白酶K(CTSK)、组织蛋白酶L(CTSL)、组织蛋白酶L2、组织蛋白酶O、组织蛋白酶S(CTSS)、组织蛋白酶V(CTSV)、组织蛋白酶W、组织蛋白酶Z(CTSZ)、阳离子胰蛋白酶、cezanne/OTU结构域7B、cezanne-2、CGI-58、类糜蛋白酶(chymase)、类胰凝乳蛋白酶(chymopasin)、凝乳酶(chymosin)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)B、胰凝乳蛋白酶C、凝血因子IXa、凝血因子VIIa、凝血因子Xa、凝血因子XIa、凝血因子XIIa、胶原酶1、胶原酶2、胶原酶3、补体蛋白酶C1r丝氨酸蛋白酶、补体蛋白酶C1s丝氨酸蛋白酶、补体C1r同系物、补体成分2、补体成分C1ra、补体成分C1sa、补体因子B、补体因子D、补体因子D样、补体因子I、COPS6、corin、CSN5(JAB1)、圆柱瘤蛋白、胞质溶胶丙氨酰氨肽酶样1、胞质溶胶丙氨酰氨肽酶、DDI相关蛋白酶、DECYSIN、Der1样结构域家族成员1、Der1样结构域家族成员2、Der1样结构域家族成员3、DESC1蛋白酶、沙漠刺猬蛋白、去SUMO异肽酶(desumoylating isopeptidase)1、去SUMO异肽酶2、二氢乳清酸酶、二氢嘧啶酶、二氢嘧啶酶相关蛋白1、二氢嘧啶酶相关蛋白2、二氢嘧啶酶相关蛋白3、二氢嘧啶酶相关蛋白4、二氢嘧啶酶相关蛋白5、DINE肽酶、二肽基肽酶(DPP)、二肽基肽酶(DPP1)、二肽基肽酶4(DPP4)、二肽基肽酶6(DPP6)、二肽基肽酶8(DPP8)、二肽基肽酶9(DPP9)、二肽基肽酶II、二肽基肽酶III、二肽基肽酶10(DPP10)、DJ-1、DNA损伤诱导蛋白、DNA损伤诱导蛋白2、DUB-1、DUB-2、DUB2a、DUB2a样、DUB2a样2、DUB6或其组合。本文进一步提供了一种方法，其中所述蛋白酶选自T细胞蛋白酶、补体蛋白酶、纤维化蛋白酶和炎症相关蛋白酶。
本文进一步提供了一种方法，其中所述可切割接头是肽、碳水化合物、核酸、脂质、酯、糖苷、磷脂、磷酸二酯、亲核物质/碱敏感接头、还原敏感接头、亲电物质/酸敏感接头、金属可切割接头、氧化敏感接头或其组合。本文进一步提供了一种方法，其中所述可切割接头是肽。本文进一步提供了一种方法，其中所述肽包含选自SEQ ID No:1-SEQ ID No:677的氨基酸序列。
本文进一步提供了一种方法，其中所述可切割接头通过共价键直接连接至所述报告物。本文进一步提供了一种方法，其中所述报告物包含荧光标记、质量标签、发色团、电化学活性分子、生物层干涉测量或表面等离子体共振可检测分子、沉淀物质、质谱和液相色谱底物、磁活性分子、凝胶形成和/或粘度改变分子、免疫测定可检测分子、基于细胞的扩增可检测物或核酸条形码或其任何组合。本文进一步提供了一种方法，其中所述报告物包含荧光标记。本文进一步提供了一种方法，其中所述荧光标记选自5-羧基荧光素(5-FAM)、7-氨基-4-氨基甲酰基甲基香豆素(ACC)、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)、2-氨基苯甲酰基(Abz)、Cy7、Cy5、Cy3和(5-((2-氨基乙基)氨基)萘-1-磺酸)(EDANS)。
本文进一步提供了一种方法，其中所述分子进一步包含荧光猝灭剂。本文进一步提供了一种方法，其中所述荧光猝灭剂选自BHQ0、BHQ1、BHQ2、BHQ3、BBQ650、ATTO 540Q、ATTO 580Q、ATTO 612Q、CPQ2、QSY-21、QSY-35、QSY-7、QSY-9、DABCYL(4-([4'-二甲基氨基)苯基]偶氮)苯甲酰基)、Dnp(2,4-二硝基苯基)和Eclipse。本文进一步提供了一种方法，其中所述荧光猝灭剂通过共价键直接连接至所述可切割接头。
本文进一步提供了一种方法，其中所述分子进一步包含载体。本文进一步提供了一种方法，其中所述载体包含天然的、标记的或合成的蛋白质、准确已知化学组成或具有围绕平均分子量分布的合成化学聚合物、寡核苷酸、磷酰二胺吗啉代低聚物(PMO)、折叠体、脂质、脂质胶束、纳米颗粒、由聚苯乙烯、聚丙烯或任何其他类型的塑料制成的固体载体、或其任何组合。
本文进一步提供了一种方法，其中所述对象是哺乳动物。本文进一步提供了一种方法，其中所述哺乳动物是人。
本文进一步提供了一种方法，其中所述报告物通过自消除(self-immolative)间隔物与所述可切割接头连接。本文进一步提供了一种方法，其中所述自消除间隔物选自二硫化物、异胺二官能团(hetheroaminebifuncional)二硫化物、基于硫醇的哒嗪二酮、对氨基苄氧羰基、二肽、Gly-Pro、L-Phe-Sar、反式环辛烯四嗪、邻羟基保护的芳基硫酸盐、基于氨基磷酸酯的间隔物、羟基苄基、氨基甲酸三甲酯、基于醌甲基化物(quinone methide)的间隔物。
本文进一步提供了一种方法，其中所述检测包含荧光检测、光谱检测、质谱、免疫学检测或成像检测。本文进一步提供了一种方法，其中所述检测包含荧光检测。本文进一步提供了一种方法，其中所述荧光检测是荧光共振能量转移(FRET)。
本文进一步提供了一种方法，其中所述切割的报告物包含沉淀荧光团。本文进一步提供了一种方法，其中所述沉淀荧光团包含HPQ、Cl-HPQ、HTPQ、HBPQ或HQPQ。
本文提供了一种方法，其包括：测量来自对象的体液样本中两种或更多种作用物的活性，并且基于所述活性确定所述对象的疾病或病症，其中所述疾病或病症选自肝病、器官移植排斥、感染性疾病、变应性疾病、自身免疫、阿尔茨海默氏病和慢性炎症。
本文进一步提供了一种方法，其中所述肝病包含非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、毒素介导的肝损伤、病毒性肝炎、暴发性肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎、肝硬化、肝细胞癌(HCC)、原发性胆汁性胆管炎(PBC)、胆管癌、原发性硬化性胆管炎、移植肝的急性或慢性排斥、遗传性肝病或其组合。
本文提供了一种方法，方法包含测量来自对象的体液样本中的两种或更多种作用物的活性并基于所述活性确定所述对象的疾病或病症，其中所述疾病或病症是非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的某一纤维化阶段或某一非酒精性脂肪性肝病活动度评分(NAS)。
本文进一步提供了一种方法，其进一步包含使来自所述对象的所述体液与分子离体接触，其中所述分子包含可切割接头和报告物，并且其中所述可切割接头被来自所述血浆的所述蛋白酶切割，释放来自所述分子的所述报告物，检测所述释放的报告物的形成速率或量。
本文进一步提供了一种方法，其中所述作用物选自氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶、连接酶、蛋白酶(肽酶)、水解酶、酯酶、β-糖苷酶、磷脂酶和磷酸二酯酶、过氧化物酶、脂肪酶、淀粉酶、亲核试剂、还原试剂、亲电/酸性试剂、有机金属/金属催化剂、氧化试剂、羟基离子、硫醇类亲核物质、氮亲核物质、连二亚硫酸钠和高碘酸钠。本文进一步提供了一种方法，其中所述作用物是蛋白酶。本文进一步提供了一种方法，其中所述蛋白酶是内肽酶或外肽酶。本文进一步提供了一种方法，其中所述蛋白酶选自A20(TNFa诱导的蛋白质3)、α/β水解酶结构域4、α/β水解酶结构域12、α/β水解酶结构域12B、α/β水解酶结构域13、顶体酶、酰氨基酰肽酶、解聚素金属蛋白酶(ADAM)、ADAM1a、ADAM2(受精素-b)、ADAM3B、ADAM4、ADAM4B、ADAM5、ADAM6、ADAM7、ADAM8、ADAM9、ADAM10、ADAM11、ADAM12金属蛋白酶、ADAM15、ADAM17、ADAM18、ADAM19、ADAM20、ADAM21、ADAM22、ADAM23、ADAM28、ADAM29、ADAM30、ADAM32、ADAM33、具有血小板反应蛋白基序的解聚素金属蛋白酶(ADAMTS)、ADAMTS1、ADAMTS2、ADAMTS3、ADAMTS4、ADAMTS5/11、ADAMTS6、ADAMTS7、ADAMTS8、ADAMTS9、ADAMTS10、ADAMTS12、ADAMTS13、ADAMTS14、ADAMTS15、ADAMTS16、ADAMTS17、ADAMTS18、ADAMTS19、ADAMTS20、脂肪细胞增强结合蛋白1、Afg3样蛋白1、Afg3样蛋白2、气道胰蛋白酶样蛋白酶、氨酰基转移酶、氨肽酶A、氨肽酶B、氨肽酶B样1、氨肽酶MAMS/L-RAP、氨肽酶N、氨肽酶O、氨肽酶P同系物、氨肽酶P1、氨肽酶PILS、氨肽酶Q、氨肽酶样1、AMSH/STAMBP、AMSH-LP/STAMBPL1、血管紧张素转换酶1(ACE1)、血管紧张素转换酶2(ACE2)、血管紧张素转换酶3(ACE3)、阴离子胰蛋白酶(II)、载脂蛋白(a)、阿奇霉素-1、阿奇霉素-2、天冬氨酸酰基转移酶、天冬氨酸酰基转移酶-3、天冬氨酰氨肽酶、共济失调蛋白-3、共济失调蛋白-3样、ATP/GTP结合蛋白1、ATP/GTP结合蛋白样2、ATP/GTP结合蛋白样3、ATP/GTP结合蛋白样4、ATP/GTP结合蛋白样5、ATP23肽酶、自噬蛋白-1、自噬蛋白-2、自噬蛋白-3、自噬蛋白-4、天青蛋白、β内酰胺酶、β-分泌酶1、β-分泌酶2、博来霉素水解酶、脑丝氨酸蛋白酶2、BRCC36(含BRCA2的复合物亚基3)、钙蛋白酶、钙蛋白酶1、钙蛋白酶2、钙蛋白酶3、钙蛋白酶4、钙蛋白酶5、钙蛋白酶6、钙蛋白酶7、钙蛋白酶7样、钙蛋白酶8、钙蛋白酶9、钙蛋白酶10、钙蛋白酶11、钙蛋白酶12、钙蛋白酶13、钙蛋白酶14、钙蛋白酶15(Solh蛋白)、半胱氨酸蛋白酶、羧肽酶A1、羧肽酶A2、羧肽酶A3、羧肽酶A4、羧肽酶A5、羧肽酶A6、羧肽酶B、羧肽酶D、羧肽酶E、羧肽酶M、羧肽酶N、羧肽酶O、羧肽酶U、羧肽酶X1、羧肽酶X2、羧肽酶Z、肌肽二肽酶1、肌肽二肽酶2、半胱天冬酶募集结构域家族成员8、半胱天冬酶、半胱天冬酶-1、半胱天冬酶-2、半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-4/11、半胱天冬酶-5、半胱天冬酶-6、半胱天冬酶-7、半胱天冬酶-8、半胱天冬酶-9、半胱天冬酶-10、半胱天冬酶-12、半胱天冬酶-14、半胱天冬酶-14样、casper/FLIP、组织蛋白酶、组织蛋白酶A(CTSA)、组织蛋白酶B(CTSB)、组织蛋白酶C(CTSC)、组织蛋白酶D(CTSD)、组织蛋白酶E(CTSE)、组织蛋白酶F、组织蛋白酶G、组织蛋白酶H(CTSH)、组织蛋白酶K(CTSK)、组织蛋白酶L(CTSL)、组织蛋白酶L2、组织蛋白酶O、组织蛋白酶S(CTSS)、组织蛋白酶V(CTSV)、组织蛋白酶W、组织蛋白酶Z(CTSZ)、阳离子胰蛋白酶、cezanne/OTU结构域7B、cezanne-2、CGI-58、类糜蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶、凝乳酶、胰凝乳蛋白酶B、胰凝乳蛋白酶C、凝血因子IXa、凝血因子VIIa、凝血因子Xa、凝血因子XIa、凝血因子XIIa、胶原酶1、胶原酶2、胶原酶3、补体蛋白酶C1r丝氨酸蛋白酶、补体蛋白酶C1s丝氨酸蛋白酶、补体C1r同系物、补体成分2、补体成分C1ra、补体成分C1sa、补体因子B、补体因子D、补体因子D样、补体因子I、COPS6、corin、CSN5(JAB1)、圆柱瘤蛋白、胞质溶胶丙氨酰氨肽酶样1、胞质溶胶丙氨酰氨肽酶、DDI相关蛋白酶、DECYSIN、Der1样结构域家族成员1、Der1样结构域家族成员2、Der1样结构域家族成员3、DESC1蛋白酶、沙漠刺猬蛋白、去SUMO异肽酶1、去SUMO异肽酶2、二氢乳清酸酶、二氢嘧啶酶、二氢嘧啶酶相关蛋白1、二氢嘧啶酶相关蛋白2、二氢嘧啶酶相关蛋白3、二氢嘧啶酶相关蛋白4、二氢嘧啶酶相关蛋白5、DINE肽酶、二肽基肽酶(DPP)、二肽基肽酶(DPP1)、二肽基肽酶4(DPP4)、二肽基肽酶6(DPP6)、二肽基肽酶8(DPP8)、二肽基肽酶9(DPP9)、二肽基肽酶II、二肽基肽酶III、二肽基肽酶10(DPP10)、DJ-1、DNA损伤诱导蛋白、DNA损伤诱导蛋白2、DUB-1、DUB-2、DUB2a、DUB2a样、DUB2a样2、DUB6或其组合。
本文进一步提供了一种方法，其中所述蛋白酶选自T细胞蛋白酶、补体蛋白酶、纤维化蛋白酶和炎症相关蛋白酶。本文进一步提供了一种方法，其中所述可切割接头是肽、碳水化合物、核酸、脂质、酯、糖苷、磷脂、磷酸二酯、亲核物质/碱敏感接头、还原敏感接头、亲电物质/酸敏感接头、金属可切割接头、氧化敏感接头或其组合。本文进一步提供了一种方法，其中所述可切割接头是肽。本文进一步提供了一种方法，其中所述肽包含选自SEQ IDNo:1-SEQ ID No:677的氨基酸序列。本文进一步提供了一种方法，其中所述可切割接头通过共价键直接连接至所述报告物。
本文进一步提供了一种方法，其中所述报告物包含荧光标记、质量标签、发色团、电化学活性分子、生物层干涉测量或表面等离子体共振可检测分子、沉淀物质、质谱和液相色谱底物、磁活性分子、凝胶形成和/或粘度改变分子、免疫测定可检测分子、基于细胞的扩增可检测物或核酸条形码或其任何组合。本文进一步提供了一种方法，其中所述报告物包含荧光标记。本文进一步提供了一种方法，其中所述荧光标记选自5-羧基荧光素(5-FAM)、7-氨基-4-氨基甲酰基甲基香豆素(ACC)、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)、2-氨基苯甲酰基(Abz)、Cy7、Cy5、Cy3和(5-((2-氨基乙基)氨基)萘-1-磺酸)(EDANS)。
本文进一步提供了一种方法，其中所述分子进一步包含荧光猝灭剂。本文进一步提供了一种方法，其中所述荧光猝灭剂选自BHQ0、BHQ1、BHQ2、BHQ3、BBQ650、ATTO 540Q、ATTO 580Q、ATTO 612Q、CPQ2、QSY-21、QSY-35、QSY-7、QSY-9、DABCYL(4-([4'-二甲基氨基)苯基]偶氮)苯甲酰基)、Dnp(2,4-二硝基苯基)和Eclipse。本文进一步提供了一种方法，其中所述荧光猝灭剂通过共价键直接连接至所述可切割接头。
本文进一步提供了一种方法，其中所述分子进一步包含载体。本文进一步提供了一种方法，其中所述载体包含天然的、标记的或合成的蛋白质、准确已知化学组成或具有围绕平均分子量分布的合成化学聚合物、寡核苷酸、磷酰二胺吗啉代低聚物(PMO)、折叠体、脂质、脂质胶束、纳米颗粒、由聚苯乙烯、聚丙烯或任何其他类型的塑料制成的固体载体、或其任何组合。
本文进一步提供了一种方法，其中所述对象是哺乳动物。本文进一步提供了一种方法，其中所述哺乳动物是人。
本文进一步提供了一种方法，其中所述报告物通过自消除间隔物与所述可切割接头连接。本文进一步提供了一种方法，其中所述自消除间隔物选自二硫化物、异胺二官能团二硫化物、基于硫醇的哒嗪二酮、对氨基苄氧羰基、二肽、Gly-Pro、L-Phe-Sar、反式环辛烯四嗪、邻羟基保护的芳基硫酸盐、基于氨基磷酸酯的间隔物、羟基苄基、氨基甲酸三甲酯、基于醌甲基化物的间隔物。
本文进一步提供了一种方法，其中所述检测包含荧光检测、光谱检测、质谱、免疫学检测或成像检测。本文进一步提供了一种方法，其中所述检测包含荧光检测。本文进一步提供了一种方法，其中所述荧光检测是荧光共振能量转移(FRET)。
本文进一步提供了一种方法，其中所述切割的报告物包含沉淀荧光团。本文进一步提供了一种方法，其中所述沉淀荧光团包含HPQ、Cl-HPQ、HTPQ、HBPQ或HQPQ。
本文进一步提供了一种方法，其中所述体液样本选自血液、血浆、骨髓液、淋巴液、胆汁、羊水、粘膜液、唾液、尿、脑脊液、脊髓液、滑液、精液、导管吸出物、粪便、粪质、阴道流出物、泪液、组织裂解物和患者来源的细胞系上清液。本文进一步提供了一种方法，其中所述体液样本包含洗液、调理介质或缓冲液、拭子病毒运输介质、盐水、培养基或细胞培养物上清液。本文进一步提供了一种方法，其中所述洗液选自漱口洗液、细支气管肺泡洗液、灌洗液、洗发洗液、鼻喷雾流出物、应用于盐水或任何介质的任何体表、孔口、器官结构或实体瘤活检的拭子或其任何衍生物。
援引并入
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，其程度与每个单独的出版物、专利或专利申请被明确和单独地指示通过引用并入本文的程度相同。
附图说明
本发明的新颖特征在所附权利要求中具体阐述。通过参考以下详细说明和附图(本文中也称作“图(FIGURE)”或“图(FIGURES)”)，将更好地理解本发明的特征和优点，所述详细说明阐述了利用本发明原理的说明性实施方案，附图中：
图1显示了根据当前申请的多个探针。每个探针101包括报告物103，如图1中的星号所示。报告物103与可切割接头105连接，可切割接头105是作用物107的可切割底物。
图2显示了报告物在多个探针中的切割。如图所示，可切割接头105被作用物107切割，导致报告物103从探针101上切割下来。一旦切割，可以检测切割的报告物203和/或将其与未切割的报告物103区分开。切割的报告物203的存在和检测指示作用物107在样本中存在并有活性。此外，作用物活性的缺乏可用于与活性降低相关的检测。可基于例如切割反应发生的速率或样本中切割的报告物的量，或通过其他方式，如速率与适当对照的比率或切割的报告物与适当对照的比率，来定量作用物的活性。
图3说明了使用探针101评估对象中的生物状况的方法301。
图4显示了在组合物中使用的探针的选择，以分析作用物的活性，从而分析一种或多种特定的生物学病症或疾病状态。一种或多种作用物的活性可与生物学病症或疾病状态相关。这可包括特定病症或状态随时间的进展。因此，为了评价对象的生物学病症或疾病状态，从库中选择可被感兴趣的作用物切割的探针，以包括在病症特异性组403中。病症特异性组的所选探针405被差异标记，使得可以测量305预定蛋白酶的活性。不同的探针101，包括库401中所包括的探针，可以包括赋予片段以确保作用物活性的准确、多重检测的特性的特征。这样的性质包括例如改进的切割、检测、溶解性、稳定性、再现性、稳健性和/或与不同类型的报告物的扩展的相容性。
图5显示了探针501的示意图，其包括间隔物507、可溶性标签509、猝灭剂和共价或非共价附着位点511。这些成分各自的位置原则上可以相互转换。
图6A-图6C显示了探针的切割。图6A显示了探针601包括荧光报告物603和猝灭剂605。探针601还可以包括间隔物507、可溶性标签509和/或共价或非共价附着位点511。图6B显示了两成分探针的切割过程。图6C显示了三成分探针的切割过程。
图7A-图7C显示了HPQ荧光团的反应过程。图7A显示了具有自消除间隔物705和沉淀荧光报告物703的探针701。间隔物705将沉淀荧光团报告物连接到外肽酶底物707上，为了清楚起见，外肽酶底物被矩形包围。特异性的预定外肽酶切割外肽酶底物707。结果，自消除间隔物705与沉淀的荧光团报告物703解离。这允许在报告物703中建立特定的氢键709，使得它进入固态，从流体样本中沉淀，并提供强荧光信号。图7B显示了详细过程。图7C显示了内肽酶和外肽酶的反应过程。
图8显示了使用探针801的方法，探针具有自消除间隔物807、沉淀或非沉淀荧光报告物805和酶/蛋白酶底物809，酶/蛋白酶底物被预定的酶/内切蛋白酶803切割。探针包括被两种预定的酶/蛋白酶切割的酶/蛋白酶底物809。这些酶/蛋白酶中的第一种是样本中感兴趣的酶/内切蛋白酶803。流体样本中的酶/内切蛋白酶803裂解酶/蛋白酶底物809。然而，因为803不能将蛋白酶底物中的末端或倒数第二位氨基酸与间隔物807完全切割。因此，将预定的外肽酶/酶811引入样本。外肽酶/酶可以在与内切蛋白酶/酶803孵育之前、之后或期间掺入流体样本中。对酶/蛋白酶底物805进行工程化，使得酶/内切蛋白酶803的切割产生可被预定的酶/外肽酶811切割的第二酶/蛋白酶底物813。通过811的切割导致间隔物807与沉淀/非沉淀荧光团报告物805解离，这样报告物805提供强荧光信号。
图9显示了NASH的进展。
图10显示了用于检测蛋白酶活性的体内探针。
图11显示了使用体内探针测量的蛋白酶活性。
图12概述了本申请的实验。
图13概述了本申请的实验。
图14显示当在小鼠K2EDTA血浆中遇到NASH相关蛋白酶时，探针可以准确地检测和区分来自经肝活检诊断为NASH的患者的样本和健康患者样本。
图15A-图15B提供了实验结果，显示了本申请的特异性肽接头可以区分健康小鼠和来自K2EDTA小鼠血浆的NASH+样本中的NASH相关蛋白酶活性。图15A显示了健康样本的结果。图15B显示了NASH+样本的结果。
图16提供了比较离体探针和它们区分NASH(CDHFD)样本(右数据点)和健康(CD)样本(左数据点)的能力的实验结果。
图17提供了原始实验结果，显示了探针#492的荧光增加的测量速率可归因于K2EDTA小鼠血浆中的蛋白酶活性和NASH疾病。在疾病和健康条件下，n＝10个样本中的荧光增加的平均速率与合并血浆(n＝10)的荧光增加相匹配。
图18提供了实验结果，显示了探针#102的荧光增加的测量速率可归因于K2EDTA小鼠血浆中的蛋白酶活性和NASH疾病。在疾病和健康条件下，n＝10个样本中荧光增加的平均速率与合并血浆(n＝10)的荧光增加相匹配。
图19A-图19B提供了实验结果，显示了活性(非丰度)负责确定K2EDTA小鼠血浆样本中基于疾病的蛋白酶活性差异。图19A显示了测试蛋白酶丰度水平的结果，图19B显示了测试蛋白酶活性水平的结果。
图20概述了本申请的实验设计。
图21A-图21F提供了实验结果，显示了几种探针可以区分健康K2EDTA血浆样本(左)、消退样本(中)和NASH样本(右)。图21A显示了探针#428的结果，图21B显示了探针#520的结果，图21C显示了探针#96的结果，图21D显示了探针#102的结果，图21E显示了探针#492的结果，以及图21F显示了探针#647的结果。
图22提供实验结果，显示了探针可离体区分健康和暴发性肝炎样本的JO2小鼠模型。Jo2抗体通过诱导细胞凋亡显示了针对表达小鼠Fas的细胞系的细胞溶解活性。
图23提供实验结果，显示了探针可以在小鼠模型中体内区分健康和暴发性肝炎样本。+/++组表示轻度肝炎症状，+++/++++组表示基于小鼠病理生理学检查的暴发性肝炎。Jo2抗体通过诱导细胞凋亡显示了针对表达小鼠Fas的细胞系的细胞溶解活性。
图24显示了肽片段由于其不同的生物学机制可以区分两种不同的肝病临床前模型。
图25概述了本申请的实验设计。
图26提供了实验结果，显示了探针可以区分健康、肥胖和NASH人类样本。
图27提供了实验结果，显示了具有各种收集日期、收集方案、运输等的独立样本队列之间的再现性。
图28提供了实验结果，显示了肽片段可以在特定测定条件下区分NASH疾病进展的不同阶段。
图29提供了实验结果，显示了能够区分NASH和健康人K2EDTA血浆的肽片段的多样性。
图30A-图30F提供实验结果，证明了特定蛋白酶在检测小鼠K2EDTA血浆中NASH样本的疾病特异性活性差异中的相关性。图30A显示了用泛蛋白酶抑制剂测试时的结果。图30B显示了用半胱氨酸蛋白酶家族抑制剂测试时的结果。图30C显示了用组织蛋白酶家族抑制剂测试时的结果。图30D显示了用CTSB特异性抑制剂测试时的结果。图30E显示了用CTSK特异性抑制剂测试时的结果。图30F显示了用CTSL特异性抑制剂测试时的结果。这些结果显示了该底物被CTSL切割。
图31A-图31B提供了实验结果，显示了血浆中丰富的两种常见混杂蛋白酶不负责确定K2EDTA小鼠血浆中NASH样本中基于疾病的蛋白酶活性差异。图31A显示了用胰蛋白酶特异性抑制剂测试的结果，图31B显示了用凝血酶特异性抑制剂测试的结果。
图32A-图32B提供了实验结果，其显示了活性，而不是丰度，负责确定人样本中基于疾病的蛋白酶活性差异。
图32A显示了当比较蛋白酶活性时测试健康和NASH血浆的合并样本的结果。图32B显示了健康样本和NASH样本之间蛋白酶活性的定量比率。
图33A-图33B显示，尽管组织蛋白酶-L在健康和NASH人样本中的丰度相同，但其活性水平的差异允许健康和NASH样本之间的差异。图33A显示了CTSL丰度水平的测试结果，图33B显示了CTSL活性水平的测试优于CTSL丰度的测试。
图34A-图34B提供了实验证据，其证明了探针可以在两种不同的血浆收集下检测宿主应答和血浆中COVID病毒的存在。图34A显示了K2EDTA血浆队列的结果，而图34B显示了肝素锂(LiHeparin)血浆队列的结果。探针#18是嗜中性粒细胞弹性蛋白酶底物。探针#409是SARS-COV2 3C蛋白酶。探针#462是MMP8底物。探针#84是弗林蛋白酶(Furin)底物。探针#26是组织蛋白酶K/B、胰蛋白酶、凝血酶、类胰蛋白酶底物。
图35提供了探针可以区分健康拭子样本和COVID拭子样本的实验数据。
图36A-图36B提供了实验数据，显示了当掺入唾液或拭子样本中时，可以检测到来自SARS-COV2的3Cl蛋白酶。图36A显示了来自唾液样本的结果，而图36B显示来自在VTM(含有高达10％FBS的病毒转移培养基)中调理的拭子样本的结果。
图37显示了几种能够区分健康和COVID样本的探针。
图38A提供了探针#647可检测COVID相关蛋白酶的活性以区分在盐水中调理的健康和COVID合并拭子样本的实验证据。图38B显示了COVID+(n＝18)和COVID-(n＝19)样本之间存在显著差异(p＝0.029)。图38C显示了COVID+(7个样本有活性)和CO VID-(1个样本有活性)样本跨时间点调整后的RFU。
图39A-图39B提供了实验证据，证明了与其他自身免疫病相关的蛋白酶粒酶B是允许探针#647区分健康和COVID样本的蛋白酶。图39A显示了涉及粒酶B的抑制实验的结果，而图39B显示了涉及半胱天冬酶的抑制实验的结果。在拭子中检测到的疾病信号中，差异蛋白酶活性对GzmB特异性抑制剂比半胱天冬酶抑制剂更敏感，这表明GzmB是T细胞活性的标志。
图40显示了能够监测粒酶B活性的纸条试验。
图41A-图41B提供了实验证据，显示了肽片段可以区分健康和胰腺导管腺癌(PDAC)样本。图41A显示了第一组实验的结果，而图41B显示了第二组实验的结果。
图42提供了实验证据，显示了肽片段可以区分健康样本、PDAC样本和胰腺炎样本。
图43显示了使用
Figure BDA0004223379250000171
髓过氧化物酶活性测定试剂盒检测MPO的氯化和过氧化活性的示意图。AH代表无荧光
Figure BDA0004223379250000172
UltraRed底物，A代表其荧光产物。过氧化氢将MPO转化为MPO-I，并且MPO在不存在过氧化氢的情况下是无活性的。然后用MPO-I氧化
Figure BDA0004223379250000181
UltraRed并产生荧光氧化产物A，其可以在Ex/Em＝530/590下读取。
图44A-图44C显示了检测过氧化物酶的结果。图44A显示了健康小鼠和NASH小鼠之间的MPO活性不同。图44B显示了用标准饲料饮食(CD)喂养的小鼠与用缺乏胆碱、L-氨基酸限定的高脂肪饮食(CDAHFD)喂养的小鼠之间MPO活性不同。图44C显示了健康人对象和类风湿性关节炎对象之间的MPO活性不同。
图45A-图45B显示了使用试卤灵油酸酯作为底物的人血浆中掺加的重组蛋白酶的合并结果。图46A显示了3种重组酶—羧酸酯酶1、磷脂酶A2和脂蛋白脂肪酶的结果。图46B显示了不同浓度脂蛋白脂肪酶的结果。
图46A-图46C显示了FRET底物的示例性可切割接头的一般设计。图46A显示了内肽酶、氨肽酶和羧肽酶底物的一般设计。图46B显示了报告物和猝灭剂可以反转的示例。图46C显示了氨肽酶和羧肽酶的通用底物设计。
具体实施方式
本文提供了一种方法，其包括使来自对象的体液样本与分子离体接触。在一些实施方案中，分子包含可切割接头和报告物，并且可切割接头被来自体液的作用物切割，从分子释放报告物。在一些实施方案中，方法进一步包含检测释放的报告物的形成速率或量。在一些实施方案中，释放的报告物的形成速率或量与健康对象显著不同。在一些实施方案中，体液可以是血浆。在一些实施方案中，方法进一步包含基于检测确定对象的疾病或病症。
在一个方面，体液样本与具有第二可切割接头和第二报告物的第二分子接触。在一些实施方案中，第二可切割接头被来自体液的第二作用物切割，从第二分子释放第二报告物。在一些实施方案中，方法进一步包含检测释放的第二报告物的形成速率或量。在一些实施方案中，方法进一步包含基于对释放的第一报告物的检测和对释放的第二报告物的检测来确定对象的疾病或病症。在一些实施方案中，本文所述的方法可以以多重形式使用，使得单个体液样本可用于确定多种选择作用物的活性。这允许针对特定病理和病症创建诊断组，其利用多种作用物的活性来提供对某些病症的更完整和准确的评估。这些组可用于将多种作用物的活性与特定病症或疾病状态相关联。这些签名可保存在例如数据库中，并用于评估由特定蛋白酶活性组评估的后续个体的病症或疾病状态。在一些实施方案中，在分析中使用分类工具来区分健康和患病患者，或区分疾病的离散阶段。分类工具可以是监督机器学习分类算法，包括但不限于逻辑回归、朴素贝叶斯、支持向量机、随机森林、梯度提升或神经网络。此外，如果建模的变量在性质上是连续的(例如肿瘤体积)，则可以使用连续回归方法，例如岭回归、核岭回归或支持向量回归。这些算法将在由多个探针的测量值(或诸如探针比率的那些测量值的数学函数)定义的多维特征空间上操作，以便学习探针测量值和疾病状态之间的关系。最后，可以将探针测量与诸如年龄、性别或患者共病状态的临床变量相结合。在这种情况下，可以将临床特征直接并入到分类器中，或者可选地，学习将仅探针预测与临床特征相结合的二阶分类器，以产生针对这些变量而校准的结果。
在一些实施方案中，疾病或病症可以是非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的某一纤维化阶段或某一非酒精性脂肪性肝病活动度评分(NAS)。在一些实施方案中，疾病或病症可以是肝病、癌症、器官移植排斥、感染性疾病、变应性疾病、自身免疫和慢性炎症。
在另一方面，本文所述的方包含离体、多重检测酶活性以诊断和监测对象的病理和治疗。该酶活性可用于诊断和监测对象内脏中的疾病和病症。
检测探针/分子
疾病或病症的确定基于样本中检测到的释放的报告物的形成速率或量。将探针/分子引入体液样本。探针/分子包含可切割接头和报告物，并且来自体液的作用物切割可切割接头，释放切割的报告物。探针/分子可以具有可以实现该功能的任何结构。在一些实施方案中，报告物可以与可切割的接头共价连接。在一些实施方案中，报告物可以是荧光标记、质量标签、发色团、电化学活性分子、生物层干涉测量或表面等离子体共振可检测分子、沉淀物质、质谱和液相色谱底物(包括尺寸排阻、反相、等电点等)、磁活性分子、凝胶形成和/或粘度改变分子、免疫测定可检测分子、基于细胞的扩增可检测分子、核酸条形码或其任何组合。
在一些实施方案中，报告物可以是荧光标记并且分子还包含猝灭剂。在一些实施方式中，猝灭剂与可切割接头共价连接。在一些实施方案中，内部猝灭的荧光团连接至可切割接头。在一些实施方案中，分子进一步包含自消除间隔物。在一些其他实施方案中，分子进一步包含载体。
可切割接头
在一些方面，本文所述的探针/分子包含可切割接头。本文所述的可切割接头可以是能够被作用物切割的任何结构。在一些实施方案中，可切割接头可以是肽、碳水化合物、核酸、脂质、酯、糖苷、磷脂、磷酸二酯、亲核物质/碱敏感性接头、还原敏感性接头、亲电物质/酸敏感性接头、金属可切割接头、氧化敏感性接头、可自消除接头(三成分探针＝酶底物+接头+报告物)或其组合。在一些实施方案中，报告物可以是无活性形式并且在疾病活性下变得可检测。Geoffray Leriche,Louise Chisholm,Alain Wagner,Cleavable linkers inchemical biology,Bioorganic&Medicinal Chemistry,第20卷,第2期,2012,第571-582页,ISSN 0968-0896,https://doi.Org/10.1016/j.bmc.2011.07.048。
交联作用物旨在在一个或两个聚合物链内的两个空间上相邻的残基之间形成共价键。为了鉴定蛋白结合配偶体，交联作用物需要能够检测和稳定瞬时相互作用。交联作用物通常在蛋白质中的赖氨酸或半胱氨酸残基之间形成共价连接。或者，交联作用物可以是光反应性的。交联可切割接头可用于区分受体的蛋白间和蛋白内相互作用、信号级联和多蛋白复合物的结构。
在一些实施方案中，可切割接头可以是肽。肽接头的核心结构有时包含被溶酶体酶识别和切割的二肽或四肽。蛋白酶(也称为肽酶)通过水解催化肽键的断裂，并限于可被蛋白酶识别的特定氨基酸序列。常用的蛋白酶包含胃蛋白酶、胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶。由于蛋白酶在许多疾病中具有关键作用，肽接头广泛用于药物释放系统或诊断工具中。在一些实施方案中，肽接头包含短肽序列。在一些实施方案中，肽接头可包括至少一个非天然存在的氨基酸。
在一些实施方案中，肽接头的长度可以小于约20个氨基酸。在一些实施方案中，肽接头的长度可以在介于10与100个氨基酸之间。在一些实施方案中，肽接头长度可以是1至5个、1至10个、1至20个、1至30个、1至50个、1至70个、1至90个、1至100个、5至10个、5至20个、5至30个、5至50个、5至70个、5至90个、5至100个、10至20个、10至30个、10至50个、10至70个、10至90个、10至100个、20至30个、20至50个、20至70个、20至90个、20至100个、30至50个、30至70个、30至90个、30至100个、50至70个、50至90个、50至100个、70至90个、70至100个或90至100个氨基酸。
表1.肽接头和相应的探针构建体设计的示例性序列
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本文所述的用于内切蛋白酶的肽接头可遵循以下设计：XmAYn或AXnB，其中分别地，A是单个氨基酸，并且A和B是由特定的内切蛋白酶识别的氨基酸对，X和Y是标记或未标记报告物的任何氨基酸，并且m、n是零或任何整数。该设计仅用于举例说明，不应解释为肽接头的唯一可能的设计。
本文所述的用于外切蛋白酶的肽接头可遵循以下设计：XmAYn，其中A是由特定外切蛋白酶识别的氨基酸对，X和Y是标记或未标记报告物的任何氨基酸，n是零或任何整数。该设计仅用于举例说明，不应解释为肽接头的唯一可能的设计。
表2.示例性肽接头设计
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在一些实施方案中，可切割接头可以是碳水化合物。Tung等人报道了β-半乳糖苷和7-羟基-9H-(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮)的缀合物，其在被β-半乳糖苷酶切割后具有远红荧光性质。Tung CH,Zeng Q,Shah K,Kim DE,Schellingerhout D,Weissleder R.Invivo imaging of beta-galactosidase activity using far red fluorescentswitch.Cancer Res.2004Mar 1；64(5):1579-83。Ho等人报道了将β-半乳糖苷酶底物与对苄氧基羰基组合作为自消除接头。β-半乳糖苷酶的底物，β-D-半乳吡喃糖苷，通过对位取代的苄氧羰基(用作第一自消除接头)和甘氨酸残基(用作猝灭剂和第二自消除接头)缀合至光学探针。β-D-半乳吡喃糖苷的酶促切割触发一系列自发反应，其导致光学活性探针的释放。Ho,N.-H.,Weissleder,R.和Tung,C.-H.(2007),A Self-Immolative Reporter Forβ-Galactosidase Sensing.ChemBioChem,8:560-566。一些碳水化合物接头是可商购的。
在一些实施方案中，可切割接头可以是核酸。DNA接头对其缀合物的行为的影响既通过降低游离药物在血流中过早解缀合的情况下呈阳性的细胞穿透而降低游离药物的毒性，又增加对低抗原表达细胞的脱靶毒性，推测是由于基于核酸的接头与细胞表面的非特异性相互作用。例如，在抗体-药物缀合物中，抗体和药物可以使用互补DNA接头非共价连接。Dovgan,I.,Ehkirch,A.,Lehot,V.等人.On the use of DNA as a linker inantibody-drug conjugates:synthesis,stability and in vitro potency.Sci Rep 10,7691(2020)。Dovgan等人公开了通过37聚体寡核苷酸与单甲基澳瑞他汀E(MMAE)连接的曲妥珠单抗。
在一些实施方案中，可切割接头可以是脂质。在一些实施方案中，可切割接头可以是磷脂。在两个荧光染料或染料/猝灭剂对之间插入磷脂基团允许检测磷脂酶切割活性。在一些实施方案中，可切割接头可以是磷酸二酯。在两个荧光染料或染料/猝灭剂对之间插入磷酸二酯基团允许检测磷酸二酯酶切割活性。在一些实施方案中，脂质直接附接到荧光团：一旦脂质和荧光团之间的共价键被切割，荧光活性的增加允许检测酶的存在。
在一些实施方案中，可切割接头可以是酯。酯基通常通过皂化切割。酯对切割的反应性可以通过使用吸电子基团来增强，或通过使用自消除间隔物来稳定以防止自发水解。在化学生物学中，基于酯的可切割化合物最初用于蛋白质纯化和结构生物学中。设计基于FRET的探针以成像酯酶活性。
在一些实施方案中，可切割接头可以是糖苷。例如，纤维素酶将纤维素解构为葡萄糖，并且通常由将糖苷水解酶(GH)连接至碳水化合物结合模块(CBM)的糖基化接头组成。
在一些实施方案中，可切割接头可以是亲核物质/碱敏感性接头。这些可包括但不限于卤素亲核物质、氧亲核物质、安全捕获接头、硫醇亲核物质、氮亲核物质和苯乙酮酯衍生物。
在一些实施方案中，可切割接头可以对来自所有酶家族的活性敏感，包括但不限于氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和连接酶。
可氟化的接头广泛用于有机化学中作为醇的硅基保护基。氟对硅的高热力学亲和力允许使用氟源在正交和温和条件下除去它们。在该反应中，氟离子作为亲核物质与硅反应，并且切割条件取决于硅烷基的空间位阻。由于氟离子的基本性质，氟离子也可以引发键断裂。
氧亲核物质包括砜和酯接头，而安全捕获接头允许对键断裂的时间有更大的控制，因为接头将保持稳定直到它被活化以通过化学修饰切割。
在仲胺合成或固相合成中，已知硝基苯磺酰胺用如b-巯基乙醇的硫醇亲核物质切割。半胱氨酸可被缺电子炔烃修饰以形成乙烯基硫键。
涉及作为亲核试物质的特定氮物质的置换反应可在温和可切割条件下发生。这些反应可分为两组；通过氨解或交换反应切割。对于氨解切割，示例包括通过吡咯烷或肼切割丙二醛(MDA)吲哚衍生物，和通过羟胺或肼切割酯接头。酰基腙44和腙45,156可以通过在弱酸性介质中的转亚胺基作用而用作可切割接头。胺催化剂(例如苯胺、对茴香胺或羟胺)加速水解并能够在稳定和动态状态之间进行有效的转变，这对于切割和交换是必需的。
在一些实施方案中，可切割接头可以是还原敏感性接头。还原敏感连接已经在化学生物学中使用了很长时间，并且它是一类常用的可切割接头。对还原条件敏感的可切割接头的示例包括：硝基还原酶、二硫桥和偶氮化合物。Karan等人报道了检测硝基还原酶的荧光探针。Sanu Karan,Mi Young Cho,Hyunseung Lee,Hwunjae Lee,Hye Sun Park,Mahesh Sundararajan,Jonathan L.Sessler,和Kwan Soo Hong.Near-InfraredFluorescent Probe Activated by Nitroreductase for In Vitro and In VivoHypoxic Tumor Detection.Journal of Medicinal Chemistry 2021 64(6),2971-2981。在天然存在的蛋白质中，二硫键通常在维持蛋白质结构中起作用。已知它们被如二硫苏糖醇(DTT)、b-巯基乙醇或三(2-羧乙基)膦(TCEP)的温和的还原剂有效且快速地切割。在化学生物学中，二硫键已经用于广泛的应用中，包括功能和结构蛋白质组学、药物递送、肿瘤成像、DNA和蛋白质-DNA复合物纯化。通常使用基于二硫化物的可切割接头，这是由于其直接合成和快速切割。偶氮接头对于化学生物学家是非常有吸引力的，因为它们能够在用连二亚硫酸钠(一种温和且潜在的生物正交还原剂)处理后经历切割。偶氮化合物通过电化学还原机理还原成两个苯胺部分，这允许使用许多生物方案中常用的还原剂，例如TCEP、DTT。在化学生物学中，偶氮化合物已经用于交联蛋白质十多年，并且最近用于蛋白质亲和纯化。
在一些实施方案中，可切割接头可以是亲电物质/酸敏感接头。酸敏感接头可以与其他类型的接头组合。例如，β-D-吡喃半乳糖苷的第一次β-半乳糖苷酶切割触发苄氧基羰基的自消除，导致光学活性探针的释放。Ho,N.-H.,Weissleder,R.和Tung,C.-H.(2007),ASelf-Immolative Reporter Forβ-Galactosidase Sensing.ChemBioChem,8:560-566。在化学生物学中使用亲电切割的两种不同方式：对质子源敏感的酸性敏感接头和对叠氮化合物敏感的2-(二苯基膦基)苯甲酸烷基酯衍生物。质子敏感性键是有机化学中最常用的可切割官能团之一；如保护胺的BOC基团或固相合成中使用的Merrifield树脂的发展所示。在有机化学中，可以容忍的切割条件对于酸试剂、溶剂、温度和pH是非常灵活的。相反，生物相容的酸可切割接头必须对pH的微小变化有应答。强酸性条件可导致蛋白质和DNA变性。选择生物相容的酸可切割接头是因为它们在生理pH附近不稳定，并且通常不同于用强酸切割的经典保护基。可在水中断裂或形成键的化学反应可用作可切割接头的基础，例如施陶丁格(Staudinger)连接。该反应通过2-(二苯基膦基)苯甲酸烷基酯衍生物在叠氮化物上的亲核攻击进行，以形成氮杂-叶立德(aza-ylide)中间体。然后，酯捕获氮杂-叶立德(aza-ylide)，这导致形成酰胺。在该过程中，酯充当可切割接头，叠氮化物充当生物正交化学作用物，其确保化学选择性和生物正交切割。
在一些实施方案中，可切割接头可以是金属可切割接头。有机金属化合物用于催化含有非天然氨基酸的蛋白质的修饰，但它们在化学生物学中作为切割试剂的用途仅报道了几次。烯丙基官能团是有机合成中常用的醇保护基，它也用作合成DNA测序中的可切割接头。金属可切割接头也用于肽核酸(PNA)的设计，其被开发用于酶非依赖性DNA/RNA杂交方法。
在一些实施方案中，可切割接头可以是氧化敏感接头。高碘酸钠无疑是最常用的生物相容性氧化剂，因为其能够切割邻位二醇以形成两种醛化合物。这种类型的可切割接头的一个示例由具有酒石酸间隔物和两个位于两端的官能团的邻二醇组成。基于硒的接头还含有对氧化剂敏感的可切割键，例如固定在聚苯乙烯珠(碘珠)上的高碘酸钠或N-氯苯磺酰胺。触发剂将不稳定键氧化成氧化硒，然后氧化硒通过分子内b-消除或重排直接切割。
报告物和检测方法
在一些方面，本文所述的探针/分子包含报告物。本文所述的报告物可以是能够通过任何方法检测的任何结构，方法包括但不限于荧光检测、光谱检测、免疫学检测或成像检测。在一些实施方案中，报告物可以是荧光标记、质量标签或核酸条形码。
在一些实施方案中，报告物可以是荧光标记。含有诸如荧光的小化合物的标记、标签和探针可用于标记蛋白质和核酸。也可以使用对其他分子(生物素、洋地黄毒苷)、酶(AP、HRP)或化学发光(酯或吖啶)的生物亲和性。遗传编码的标志物，如GFP家族的荧光蛋白，已经成为基因表达研究和蛋白定位的选择的报告物。与亚细胞标签结合，GFP可用于标记如突触的亚细胞结构，允许研究如突触形成的发育过程的新方法。其他荧光标记包括但不限于小的有机染料和亲脂性染料。荧光标记本身可用作活性底物而不添加接头。
一些报告物是“内部猝灭的”，因此不需要猝灭剂，其中连接内部猝灭的荧光团与底物接头的键的切割直接产生荧光分子。许多所述的蛋白酶、酯酶、过氧化物酶和其他的探针以这种方式起作用。
在一些实施方案中，报告物可以是质量标签。设计质量标签试剂使得能够使用质谱(MS)鉴定和定量不同样本中的蛋白质。一组内的质量标签试剂通常具有相同的标称质量(即，是等压的)和由胺反应性NHS酯基团、间隔物臂(质量归一化器)和质量报告物组成的化学结构。
在一些实施方案中，报告物可以是核酸条形码。例如，DNA条形码是一种用于物种鉴定的系统，其集中在以与超市扫描仪使用通用产品代码来区分商业产品类似的方式用作“条形码”的短的、标准化的遗传区域的使用。
在一些实施方案中，可以使用配体结合测定来检测报告物。配体结合测定通常包括检测步骤，如ELISA、包括荧光、比色、生物发光和化学发光ELISA、纸测试条或侧流测定或基于珠的荧光测定。在一些实施方案中，纸基ELISA试验可用于检测流体样本中的切割的报告物。基于纸的ELISA可以廉价地产生，例如通过回流从商业固体油墨打印机沉积的蜡以在单张纸上产生测试点阵列。当固体油墨被加热至液体或半液体状态时，印刷的蜡渗透纸，产生疏水屏障。然后可以将疏水性屏障之间的空间用作单独的反应孔。ELISA测定可以通过以下来进行：干燥各个反应孔上的检测抗体，在纸上构成测试点，然后进行封闭和洗涤步骤。然后可以将取自对象的样本的流体添加到测试点。然后，例如，可将链霉亲和素碱性磷酸盐(ALP)缀合物加入到测试点中作为检测抗体。然后可以将结合的ALP暴露于颜色反应剂，例如BCIP/NBT(5-溴-4-氯-3"-吲哚磷酸对甲苯胺盐/硝基蓝四唑氯化物)，其引起紫色沉淀，指示报告物的存在。
在一些实施方案中，报告物可以使用挥发性有机化合物检测。挥发性有机化合物可以通过分析平台来检测，如气相色谱仪、呼气测醉器、质谱仪或使用光学或声学传感器。气相色谱可以用于检测可以蒸发而不分解的化合物(例如，挥发性有机化合物)。气相色谱仪器包括流动相(或移动相)和固定相，流动相是载气，例如诸如氦气的惰性气体，或诸如氮气的无反应性气体，固定相是在称为柱的玻璃或金属管内的惰性固体载体上的液体或聚合物的微观层。用固定相涂覆柱，并且分析的气态化合物与柱壁相互作用，使得它们在不同时间洗脱(即，在柱中具有不同的保留时间)。化合物可以通过它们的保留时间来区分。
质谱和富集/色谱法可用于基于质量差异和/或标记的存在来分离和区分/检测从本发明中使用的完整报告物切割的报告物。例如，酶促反应可导致母体分子的片段化，导致起始底物的质量偏移，这可用于不同的色谱/富集方法，例如尺寸排阻色谱和亲和力富集。在质谱分析中，例如通过用电子轰击样本来电离样本。样本可以是固体、液体或气体。通过电离样本，一些样本分子断裂成带电荷的片段。然后可以根据它们的质荷比分离这些离子。这通常通过加速离子并使它们经受电场或磁场来执行，其中具有相同质荷比的离子将经历相同量的偏转。当偏转时，可以通过例如电子倍增器的能够检测带电粒子的机构来检测离子。检测结果可以显示为作为质荷比的函数的检测离子的相对丰度的谱。然后，可以通过将已知质量(例如整个分子的质量)与所标识的质量相关联或通过特征片段化模式来标识样本中的分子。
当报告物包括核酸时，可以通过本领域已知的各种测序方法检测报告物，例如传统的Sanger测序方法或下一代测序(NGS)。NGS通常指基于非Sanger的高通量核酸测序技术，其中许多(即数千、数百万或数十亿)核酸链可以并行测序。这样的NGS测序的示例包括由Illumina生产的平台(例如，HiSeq、MiSeq、NextSeq、MiniSeq和iSeq 100)、PacificBiosciences(例如，Sequel和RSII)，和由ThermoFisher生产的离子激流(例如，Ion S5、IonProton、Ion PGM和Ion Chef系统)。应理解，任何合适的NGS测序平台可用于NGS以检测如本文所述的可检测分析物的核酸。
可以直接对生物样本进行分析，或者可以首先将可检测的切割的报告物纯化至一定程度。例如，纯化步骤可包括将可检测分析物与生物样本中的其他成分分离。纯化可包括诸如亲和色谱的方法。分离或纯化的可检测分析物在分析前不需要是100％纯的或甚至基本上纯的。检测切割的报告物可以提供定性评估(例如，可检测的切割的报告物以及因此预定的蛋白酶是存在还是缺乏)或定量评估(例如，存在的可检测的切割的报告物的量)以指示预定的蛋白酶在流体样本中的比较活性水平。定量值可通过任何方式计算，例如通过测定样本中存在的各级分的相对百分比量。用于进行这些类型的计算的方法在本领域中是已知的。
切割的报告物可以通过任何适合于特定报告物的检测方法检测。在一些方面，检测方法包含荧光检测、光谱检测、质谱法、免疫学检测或成像检测。在一些方面，检测方法可以是荧光共振能量转移(FRET)。
在一些实施方案中，检测方法可以是光谱检测。光谱检测方法在离子色谱(IC)中非常普遍地使用，并且仅次于其使用频率的电导率检测。这些方法可以广泛地分为分子光谱技术和原子光谱技术。分子光谱学包括UV-可见光分光光度法、折射率测量和光致发光技术(荧光和磷光)。原子光谱法包括原子发射光谱法(使用各种激发源)和原子吸收光谱法。许多光谱检测方法可以以直接或间接模式操作。这些术语的定义与用于描述电化学检测模式的定义相同。即，当溶质离子具有比洗脱液离子更大的测量检测参数值时，直接光谱检测结果。当反向为真时，间接检测结果。
在一些实施方案中，检测方法可以是质谱法。质谱(MS)是用于测量离子的质荷比的分析技术。结果通常表示为质谱，作为质荷比的函数的强度图。
在一些实施方案中，检测方法可以是荧光共振能量转移(FRET)。FRET(荧光共振能量转移)是不发射光子的距离依赖性偶极相互作用，其导致能量从最初激发的供体分子转移到受体分子。它允许检测纳米范围内的分子相互作用。FRET肽用供体分子和受体(猝灭剂)分子标记。在大多数情况下，供体和受体对是两种不同的染料。如果受体是非荧光染料(猝灭剂)，则从荧光供体转移的能量转化为分子振动。当FRET终止时(通过分离供体和受体)，可以检测到供体荧光的增加。当供体和受体染料都是荧光的时，转移的能量作为较长波长的光发射，使得可以测量供体和受体荧光的强度比变化。为了发生有效的FRET猝灭，荧光团和猝灭剂分子必须彼此接近(约
Figure BDA0004223379250000661
))，并且猝灭剂的吸收光谱必须与荧光团的发射光谱重叠。
沉淀荧光团
在一些方面，切割的报告物可以是沉淀荧光团。在一些实施方案中，沉淀荧光团可以是HPQ、Cl-HPQ、HTPQ、HTPQA、HBPQ或HQPQ。
在一些实施方案中，沉淀荧光团可以是HPQ，也称为2-(2”-羟基苯基)-4(3H)-喹唑啉酮。HPQ是一种小分子有机染料，已知其通过激发态分子内质子转移(ESIPT)的经典发光机理，在固态显示出强发光，但在溶液中不发光。发现HPQ严格不溶于水，并表现出类似于四苯乙烯的强固态荧光。此外，通过禁止在亚胺氮和酚羟基之间建立内部氢键，可以抵消和逆转其不溶性和强固态荧光的基本性质。
在一些实施方案中，沉淀荧光团可以是Cl-HPQ。当水溶性和非荧光分子HPQF与弗林蛋白酶反应时，Cl-HPQ被释放。Cl-HPQ在酶活性位点附近开始沉淀，并且沉淀发射具有超过60倍荧光增强的明亮固态荧光。Li等人.In Situ Imaging of Furin Activity with aHighly Stable Probe by Releasing of PrecipitatingFluorochrome.Anal.Chem.2018,90,19,11680-11687。
在一些实施方案中，沉淀荧光团可以是HTPQ。发现HTPQ严格不溶于水，并在固态下显示强荧光，最大激发和发射波长分别为410nm和550nm。这使得它更适合于与共焦显微镜一起使用。HTPQ的大斯托克斯(Stokes)位移贡献了额外的和高度期望的优点：增加的灵敏度、最小化的背景荧光和增强的生物成像对比度。Liu等人.In Situ Localization ofEnzyme activity in Live Cells by a Molecular Probe Releasing a PrecipitatingFluorochrome.Angew Chem Int Ed Engl.2017 Sep 18；56(39):11788-11792。
在一些实施方案中，沉淀荧光团可以是HTPQA。HTPQA是衍生自HTPQ的另一种酶响应性荧光探针。当通过ALP转化时，探针释放游离的HTPQ，其在非常短的延迟后开始沉淀；沉淀物发射具有大于100倍荧光增强的明亮固态荧光。
在一些实施方案中，沉淀荧光团可以是HBPQ。HBPQ完全不溶于水且当用405nm激光激发时显示强黄色固体发射。Liu等人.Precipitated Fluorophore-Based MolecularProbe for In Situ Imaging of Aminopeptidase N in Living Cells andTumors.Anal.Chem.2021,93,16,6463-6471,出版日期：四月14日,2021。
在一些实施方案中，沉淀荧光团可以是HQPQ。HQPQ是一种不溶于水的新型固态荧光团。Li等人.Precipitated Fluorophore-Based Probe for Accurate Detection ofMitochondrial Analytes.Anal.Chem.2021,93,4,2235-2243。出版日期：一月5日,2021。
沉淀和非沉淀荧光团可以通过自消除底物与酶底物分离，以稳定初始探针并确保酶切割通过自消除间隔物转导至沉淀荧光团或非内部猝灭的可溶性荧光团的形成。
荧光猝灭剂
在一些方面，本文所述的探针/分子包含荧光猝灭剂。本文所述的荧光猝灭剂可以是能够降低给定物质的荧光强度的任何结构。在一些实施方案中，荧光猝灭剂可以是BHQ0、BHQ1、BHQ2、BHQ3、BBQ650、ATTO 540Q、ATTO 580Q、ATTO 612Q、CPQ2、QSY-21、QSY-35、QSY-7、QSY-9、DABCYL(4-([4'-二甲基氨基)苯基]偶氮)苯甲酰基)、Dnp(2,4-二硝基苯基)或
Figure BDA0004223379250000671
在一些实施方式中，荧光猝灭剂可以是BHQ猝灭剂，包括但不限于BHQ0、BHQ1、BHQ2、BHQ3或BBQ650。BHQ，或黑洞猝灭剂、染料，通过FRET和静态猝灭的组合起作用，以能够避免诸如TAMRA的发荧光猝灭剂所共有的残余背景信号，或实现低信噪比。不同类型的BHQ染料用于猝灭不同颜色的染料，BHQ1用于猝灭绿色和黄色染料，如FAM、TET或HEX，BHQ2用于猝灭橙色和红色染料。BHQ染料是真正的暗猝灭剂，由于其多芳族偶氮主链而没有天然发射。取代芳环上的给电子和吸电子基团产生具有跨越可见光谱的宽吸收曲线的完全系列的猝灭剂。
在一些实施方式中，荧光猝灭剂可以是ATTO猝灭剂，包括但不限于ATTO 540Q、ATTO 580Q或ATTO 612Q。ATTO猝灭剂具有强吸收(高消光系数)和高光稳定性的特征性质。ATTO猝灭剂通常用作FRET实验中胺标记的核苷酸上的荧光猝灭剂。
在一些实施方式中，荧光猝灭剂可以是CPQ2。猝灭剂CPQ2通常用作荧光供体5-羧基荧光素的对。
在一些实施方案中，荧光猝灭剂可以是QSY猝灭剂，包括但不限于QSY-21、QSY-35、QSY-7或QSY-9。QSY探针是暗猝灭剂，是吸收来自荧光团的激发能量并将能量作为热量消散的物质。
在一些实施方式中，荧光猝灭剂可以是DABCYL(4-([4'-二甲基氨基)苯基]偶氮)苯甲酰基)。DABCYL是用于开发基于FRET的核酸探针和蛋白酶底物的最流行的受体之一。DABCYL染料通常在基于FRET的荧光探针中与EDANS配对。DABCYL具有宽且强烈的可见光吸收，但无荧光。
在一些实施方式中，荧光猝灭剂可以是Dnp(2,4-二硝基苯基)。DNP是稳定的猝灭剂，其吸收光谱不随pH变化，这使得该基团成为溶液中底物定量的方便标志物。
在一些实施方案中，荧光猝灭剂可以是
Figure BDA0004223379250000684
是一种非荧光发色团和暗猝灭剂，常用于双标记探针。作为暗猝灭剂，
Figure BDA0004223379250000681
吸收能量而不发射萤光。
Figure BDA0004223379250000682
的吸收范围从390nm到625nm，能够在各种彩色FRET探针中发挥有效性能。
载体
在一些方面，本文所述的探针/分子包含载体。本文所述的荧光猝灭剂可以是任何结构。在一些实施方案中，载体可以是天然的、标记的或合成的蛋白质、准确已知化学组成或具有围绕平均分子量分布的合成化学聚合物(例如线性或支化PEG聚合物)、寡核苷酸、磷酰二胺吗啉代低聚物(PMO)、或折叠体、脂质、脂质胶束、纳米颗粒(例如氧化铁、金和非金属纳米颗粒)、由聚苯乙烯、聚丙烯或任何其他类型的塑料或聚合物制成的固体载体。在一些实施方案中，载体可以是比肽接头长的肽。载体可以共价地或非共价地附接至接头。
在一些实施方案中，载体可以是纳米颗粒。不溶性药物通过纳米颗粒的运输由于它们的小粒径而得到改善。纳米颗粒载体是一种亚微颗粒递送系统，属于纳米级显微镜。包封在亚颗粒中的药物可以调节药物释放速度，增加生物膜的渗透性，改变体内分布，提高生物利用度。纳米颗粒是在官能化体系中用作核的尺寸为10至100nm的固体胶体颗粒。
它们通常由天然或合成的大分子物质组成，可用作传导或运输药物的载体。可以形成纳米球和纳米胶囊。纳米材料的化学材料是壳聚糖、明胶、支化聚合物、碳基载体等。金纳米颗粒由金原子的核组成，其可以通过添加含有硫醇(SH)基团的部分的单层而官能化。
在一些实施方案中，载体可以是天然的、标记的或合成的蛋白质。蛋白质可用作递送化学品和诸如抗癌药和治疗性蛋白质的生物分子药物的载体。蛋白质纳米颗粒作为药物递送系统具有若干优点，例如生物可降解性、稳定性、颗粒的表面改性、易于粒度控制，并且它们具有较少的与诸如免疫原性的毒性问题相关的问题。蛋白质纳米颗粒可以使用蛋白质产生，如蚕丝蛋白、白蛋白、明胶、醇溶蛋白、豆球蛋白、30Kc19、脂蛋白和铁蛋白，并通过乳液、电喷雾和去溶剂化方法制备。Hong S,Choi DW,Kim HN,Park CG,Lee W,ParkHH.Protein-Based Nanoparticles as Drug Delivery Systems.Pharmaceutics.2020；12(7):604.出版于2020年六月29日。例如，白蛋白，一种分子量为66kDa的血浆蛋白，已被广泛研究作为药物载体。
在一些实施方案中，载体可以是合成化学聚合物。已经广泛研究了聚合物纳米颗粒作为药物纳米载体。通过(i)使用聚合物包埋含水药物相以形成纳米级结构如笼和胶囊或(ii)通过可在体内水解的简单酯或酰胺键将药物分子化学连接至聚合物骨架来实现药物负载。最广泛研究的合成聚合物包括聚丙交酯(PLA)、聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)和PEG。所有三种聚合物在体内水解并且是生物可降解的。Malam Y,Loizidou M,SeifalianAM.Liposomes and nanoparticles:nanosized vehicles for drug delivery incancer.Trends Pharmacol Sci.2009年十一月；30(l l):592-9.
在一些实施方案中，载体可以是聚乙二醇(PEG)。已经全面研究了PEG作为载体，因为它可溶于有机和亲水性溶剂。与许多其他合成聚合物不同，PEG是相对亲水的。与PEG的缀合增加了疏水性分子的溶解度并延长了在生物体中的循环时间。PEG还使诸如药物的分子的非特异性吸收最小化，提供对靶组织的特异性亲和力，并增加药物在恶性组织中的积累。PEG可以与其他聚合物缀合以使它们疏水性降低(即PEG化)。表面亲水性的变化阻止了蛋白质吸附，从而使得细胞能够在生物材料支架上粘附和增殖。PMO主链由具有磷二酰胺类键的吗啉代环组成，其保护它们免受核酸酶降解，同时仍保持互补碱基配对。针对细菌病原体的基于PMO的反义技术的潜在应用正在被探索，用于开发一类新的抗细菌药物。Panchai RG,Geller BL,Mellbye B,Lane D,Iversen PL,Bavari S.Peptide conjugatedphosphorodiamidate morpholino oligomers increase survival of mice challengedwith Ames Bacillus anthracis.Nucleic Acid Ther.2012；22(5):316-322。与荧光素特异性抗体组合的荧光素标签的吗啉可用作与miRNA原位杂交的探针。
在一些实施方案中，载体可以是寡核苷酸。已经报道了各种结构的生物稳定的高有效载荷DNA纳米组装体，包括笼状DNA纳米结构、DNA颗粒、DNA多聚体和DNA水凝胶。笼状DNA结构将药物分子牢固地保持在该结构内并在腔内留下大的空间。这些DNA纳米结构利用其独特的结构携带丰富的CpG，并且利用其生物相容性和尺寸优势进入免疫细胞以实现各种疾病的免疫治疗。DNA纳米结构的一部分还可以与诸如aPD1、RNA、TLR配体的其他功能成分结合实现更有效的治疗。已经报道了基于DNA的纳米颗粒，例如球形核酸、杂合的基于DNA的纳米颗粒、多足样DNA纳米结构、DNA水凝胶。Chi Q,Yang Z,Xu K,Wang C和Liang H(2020)DNA Nanostructure as an Efficient Drug Delivery Platform for Immunotherapy.Front.Pharmacol.10:1585。
在一些实施方案中，载体可以是磷二酰胺吗啉代低聚物(PMO)。反义磷二酰胺吗啉代低聚物(PMO)及其衍生物通过干扰核糖体与mRNA的结合从而抑制蛋白质翻译而以序列依赖性方式下调靶基因表达。
在一些实施方案中，载体可以是脂质或脂质胶束。脂质体双层可由合成或天然磷脂组成。脂质体的主要物理和化学性质基于组成磷脂的净性质，包括渗透性、电荷密度和空间位阻。由于水分子和磷脂的疏水磷酸基团之间的相互作用，脂质双层自闭合。脂质体形成的这个过程是自发的，因为两亲性磷脂自缔合成双层。将药物装载到脂质体中可以通过以下来实现：(i)在用可溶性药物饱和的水溶液中形成脂质体；(ii)使用有机溶剂和溶剂交换机制；(iii)使用亲脂性药物；和(iv)pH梯度方法。Malam Y,Loizidou M,SeifalianAM.Liposomes and nanoparticles:nanosized vehicles for drug delivery incancer.Trends Pharmacol Sci.2009Nov；30(l l):592-9。
在一些实施方案中，载体可以是由聚苯乙烯、聚丙烯或任何其他类型的塑料制成的固体载体。例如，Canal等报道了微孔聚苯乙烯固体泡沫的药物递送性质。这些材料通过在由相转变温度方法制备的高浓度乳液的连续相中聚合而获得。它们的孔隙率、比表面积和表面形貌与药物掺入和释放特性有关。Canal,Cristina&Aparicio,Rosa&Vilchez,Alejandro&Esquena,Jordi&Garcia-Celma,Maria.(2012).Drug Delivery Properties ofMacroporous Polystyrene Solid Foams.Journal of pharmacy&pharmaceuticalsciences:a publication of the Canadian Society for Pharmaceutical Sciences,Societe canadienne des sciences pharmaceutiques.15.197-207.
在一些实施方案中，载体可以是折叠体(foldamer)。折叠体是具有明确构象的折叠寡聚物或聚合物。折叠体的构象从它们的一级序列是高度可预测的，因此有可能在靶位置排列官能团并且有可能设计功能性折叠体，例如用于有效的细胞摄取。例如，细胞穿透肽(CPP)折叠体是具有细胞膜渗透性的基于肽的折叠体。肽折叠体含有非天然氨基酸、非蛋白原性氨基酸，其使得肽采用稳定的二级结构，尤其是螺旋结构，甚至在短序列中也是如此。该性质有助于设计具有稳定螺旋结构的两亲性CPP。此外，含有非天然氨基酸的肽通常表现出对蛋白酶水解的抗性，蛋白酶在身体和细胞中是丰富的。肽折叠体对酶降解的高稳定性可导致其在体内的功能延长。Makoto Oba,Cell-Penetrating Peptide Foldamers:DrugDelivery Tools.ChemBioChem 10.1002/cbic.201900204.
自消除间隔物
在一些方面，本文所述的探针/分子包含自消除间隔物。在一些实施方案中，自消除间隔物包含二硫化物、对氨基苄醇、a-醌-甲基化物间隔物、异胺二官能团二硫化物、基于硫醇的哒嗪二酮、对氨基苯氧羰基、二肽、Gly-Pro、L-Phe-Sar、反式环辛烯四嗪、邻羟基保护的芳基硫酸盐、基于氨基磷酸酯的间隔物、羟基苄基、三甲基氨基甲酸酯、基于醌-甲基化物的间隔物、环化间隔物、三甲基锁、2-氨基甲基哌啶或乙二胺衍生的环化间隔物。Gonzaga等人.Perspective about self-immolative drug delivery systems.Journal ofPharmaceutical Sciences 109(2020)3262-3281。
预定的蛋白酶或酶对可切割接头的切割使得自消除间隔物与沉淀的荧光或非荧光报告物解离，从而产生可检测的信号。多个探针/分子的可切割接头可被体液样本中的预定内切蛋白酶切割，导致自动损害和报告物释放或导致可被预定外肽酶切割的蛋白酶底物。在一些实施方案中，将预定的外肽酶加入体液样本中。在一些实施方案中，预定的外肽酶切割蛋白酶底物，从而导致自消除间隔物与沉淀的荧光报告物解离，从而产生可检测的信号。
体液样本
疾病或病症的确定基于体液样本中检测到的释放的报告物的形成速率或量。在一些实施方案中，体液样本可以是血液、血清、血浆、骨髓液、淋巴液、胆汁、羊水、粘膜液、唾液、尿、脑脊液、滑液、精液、导管吸出物、粪便、阴道流出物、囊液、组织匀浆、组织来源的流体、泪液和患者来源的细胞系上清液。在一些实施方案中，体液样本包含冲洗流体。在一些实施方案中，冲洗流体可以是漱口洗液、细支气管肺泡洗液、灌洗液、洗发洗液、鼻喷雾流出物、应用于盐水或任何介质的任何体表、孔口或器官结构的拭子或其任何衍生物。
在一些实施方案中，体液样本可以是血液。血液是不断循环的液体，为身体提供营养、氧气和废物清除。血液主要是液体，其中悬浮有许多细胞和蛋白质。血液由几种主要因素组成，包括血浆、红细胞、白细胞和血小板。
在一些实施方案中，体液样本可以是血浆。血浆是添加抗凝剂防止凝血时残留的液体。血清是本领域中从血浆中除去凝血因子时残留的流体的常规术语。抗凝剂是帮助防止血凝块的药物。抗凝剂的示例包括但不限于乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸盐、肝素、草酸盐，其任何盐、溶剂化物、对映异构体、互变异构体和几何异构体，或其任何混合物。
在一些实施方案中，抗凝血剂可以是EDTA。EDTA，其含有四个羧酸基团和两个具有孤对电子的胺基团的多元酸，主要性质是在1:1金属-EDTA络合物中螯合或络合金属离子的能力。由于其与作为酶辅因子的金属离子的强络合，EDTA广泛用作螯合剂以防止一些酶反应发生。当在适当的容器(血液管)中没有添加剂的情况下收集血液时，它相当快速地凝结。由于钙离子是这一过程所必需的，EDTA的羧基和钙之间的特定缔合是一种可靠的解决方案，可以防止凝血，使全血稳定在液体形式，如在一些实验室分析所要求的。此外，EDTA显示血细胞和颗粒的最佳延长稳定性。三种EDTA制剂可用作抗凝剂：Na2EDTA、K2EDTA和K3EDTA的选择主要取决于要进行的分析类型。
在一些实施方案中，抗凝剂可以是柠檬酸盐。柠檬酸盐(C6H7O7)是分子量为191道尔顿的带负电荷的小分子。柠檬酸盐可用作贮存血液制品的抗凝剂，通常为酸性柠檬酸葡萄糖(ACD)(3.22％柠檬酸盐，112.9mmol/l柠檬酸盐，123.6mmol/l葡萄糖，224.4mmol/l钠和114.2mmol/l氢离子)或柠檬酸三钠(TCA)Na3C3H5O(COO)3(4％TCA，136mmol/l柠檬酸盐，420mmol/l钠)。柠檬酸盐螯合钙，浓度为4-6mmol/l，离子化钙<0.2mmol/l，可防止凝血级联和血小板的活化。因此，柠檬酸盐是血液学家和输血服务机构用于贮存血液制品的标准抗凝剂，也是用于离心血小板和白细胞分离技术和血浆交换的体外抗凝剂。
在一些实施方案中，抗凝血剂可以是肝素。肝素抗凝作用的分子基础在于其结合并增强血浆蛋白抗凝血酶对凝血系统的几种丝氨酸蛋白酶(最重要的是因子IIa(凝血酶)、Xa和IXa)的抑制活性的能力。两种主要机制是肝素强化抗凝血酶的基础。由肝素结合诱导的构象变化引起反应性环的排出和抗凝血酶表面的外部位的暴露，所述抗凝血酶表面的外部位直接与酶靶标结合；并且存在一种模板机制，其中抑制剂和酶都与相同的肝素分子结合。这两种作用模式的相对重要性在酶之间不同。此外，肝素可通过其他丝氨酸蛋白酶抑制剂起作用，如肝素辅因子II、蛋白C抑制剂和组织因子纤溶酶原抑制剂。肝素在体内的抗血栓形成作用虽然受抗凝血机制支配，但更复杂，并且与其他血浆蛋白和细胞的相互作用在活血管系统中起重要作用。
在一些实施方案中，抗凝血剂可以是草酸盐。钠、钾、铵和锂草酸盐通过与钙形成不溶性络合物来抑制血液凝固。广泛使用浓度为1-2mg/ml血液的草酸钾。组合的草酸铵和/或草酸钾不会引起红细胞收缩。它由三重量份引起红细胞膨胀的草酸铵组成，由二重量份引起收缩的草酸钾平衡。NH4 +和K+草酸盐混合物的比例为3:2，且2mg/ml血液是所要求的量。
在一些实施方案中，体液样本可以是骨髓液。骨髓存在于大多数骨的中心并且具有许多血管。骨髓有两种类型：红色和黄色。红髓含有可以变成红细胞、白细胞或血小板的血液干细胞。黄髓主要由脂肪组成。
在一些实施方案中，体液样本可以是淋巴液。淋巴液，也称为淋巴，是从细胞和组织排出的额外流体的集合，其不被再吸收到毛细血管中。
在一些实施方案中，体液样本可以是胆汁。胆汁是由肝脏产生并储存在胆囊中的消化液。在胆汁反流期间，消化液向上回流到胃中，并且在一些情况下回流到食管中。
在一些实施方案中，体液样本可以是羊水。羊水是一种透明的、略带黄色的液体，在怀孕期间包围未出生的婴儿(胎儿)。它包含在羊膜囊中。
在一些实施方案中，体液样本可以是粘膜液。粘膜液，也称为粘液，是由粘膜分泌的厚保护液，用于阻止病原体和污物进入体内。粘液也用于防止身体组织脱水。
在一些实施方案中，体液样本可以是唾液。唾液是由口中唾液腺产生和分泌的细胞外液。
在一些实施方案中，体液样本可以是尿液。尿液是人和许多其他动物中代谢的液体副产物。尿液从肾脏通过输尿管流向膀胱。
在一些实施方案中，体液样本可以是脑脊液。脑脊液是一种包围脑和脊髓的透明液体。它缓冲脑和脊髓使其免受损伤，并且还用作脑的营养物递送和废物去除系统。
在一些实施方案中，体液样本可以是滑液。滑液，也称为关节液，是一种位于关节之间的粘稠液体。流体缓冲骨的端部并当关节移动时减小摩擦。
在一些实施方案中，体液样本可以是精液。精液是含有悬浮精子的雄性生殖液体。
在一些实施方案中，体液样本可以是导管抽吸物。导管抽吸物，也称为导管灌洗、导管流体或灌洗流体，是从诸如乳房的乳导管的导管收集的流体。
在一些实施方案中，体液样本可以是粪便。粪便，也称为排泄物或粪质，是在食物消化后从肠中排出的废物。
在一些实施方案中，体液样本可以是阴道流出物。阴道流出物，也称为阴道排出物，是从阴道出来的清澈或发白的流体。
在一些实施方案中，体液样本可以是泪液。泪液(lachrymal fluid)，也称为泪液(lacrimal fluid)，由泪腺分泌以润滑眼睛和对抗细菌。
在一些实施方案中，体液样本可以是组织匀浆。通过机械微破碎新鲜组织并机械透化细胞膜获得组织匀浆。
蛋白酶和其他作用物
本文所述的探针/分子可通过蛋白酶从体液切割。在一些实施方案中，蛋白酶包含内肽酶或外肽酶。
在一些实施方案中，蛋白酶包含内肽酶。内肽酶是断裂肽链中末端之外的肽键的酶。
在一些实施方案中，蛋白酶包含外肽酶。外肽酶是催化末端或倒数第二个肽键切割的酶；该过程从肽链释放单个氨基酸或二肽。
在一些实施方案中，蛋白酶包含A20(TNFa诱导的蛋白质3)、α/β水解酶结构域4、α/β水解酶结构域12、α/β水解酶结构域12B、α/β水解酶结构域13、顶体酶、酰氨基酰肽酶、解聚素金属蛋白酶(ADAM)、ADAM1a、ADAM2(受精素-b)、ADAM3B、ADAM4、ADAM4B、ADAM5、ADAM6、ADAM7、ADAM8、ADAM9、ADAM10、ADAM11、ADAM12金属蛋白酶、ADAM15、ADAM17、ADAM18、ADAM19、ADAM20、ADAM21、ADAM22、ADAM23、ADAM28、ADAM29、ADAM30、ADAM32、ADAM33、具有血小板反应蛋白基序的解聚素金属蛋白酶(ADAMTS)、ADAMTS1、ADAMTS2、ADAMTS3、ADAMTS4、ADAMTS5/11、ADAMTS6、ADAMTS7、ADAMTS8、ADAMTS9、ADAMTS10、ADAMTS12、ADAMTS13、ADAMTS14、ADAMTS15、ADAMTS16、ADAMTS17、ADAMTS18、ADAMTS19、ADAMTS20、脂肪细胞增强结合蛋白1、Afg3样蛋白1、Afg3样蛋白2、气道胰蛋白酶样蛋白酶、氨酰基转移酶、氨肽酶A、氨肽酶B、氨肽酶B样1、氨肽酶MAMS/L-RAP、氨肽酶N、氨肽酶O、氨肽酶P同系物、氨肽酶P1、氨肽酶PILS、氨肽酶Q、氨肽酶样1、AMSH/STAMBP、AMSH-LP/STAMBPL1、血管紧张素转换酶1(ACE1)、血管紧张素转换酶2(ACE2)、血管紧张素转换酶3(ACE3)、阴离子胰蛋白酶(II)、载脂蛋白(a)、阿奇霉素-1、阿奇霉素-2、天冬氨酸酰基转移酶、天冬氨酸酰基转移酶-3、天冬氨酰氨肽酶、共济失调蛋白-3、共济失调蛋白-3样、ATP/GTP结合蛋白1、ATP/GTP结合蛋白样2、ATP/GTP结合蛋白样3、ATP/GTP结合蛋白样4、ATP/GTP结合蛋白样5、ATP23肽酶、自噬蛋白-1、自噬蛋白-2、自噬蛋白-3、自噬蛋白-4、天青蛋白或其组合。
在一些实施方案中，蛋白酶包含β内酰胺酶、β-分泌酶1、β-分泌酶2、博来霉素水解酶、脑丝氨酸蛋白酶2、BRCC36(含BRCA2的复合物亚基3)、钙蛋白酶、钙蛋白酶1、钙蛋白酶2、钙蛋白酶3、钙蛋白酶4、钙蛋白酶5、钙蛋白酶6、钙蛋白酶7、钙蛋白酶7样、钙蛋白酶8、钙蛋白酶9、钙蛋白酶10、钙蛋白酶11、钙蛋白酶12、钙蛋白酶13、钙蛋白酶14、钙蛋白酶15(Solh蛋白)或其组合。
在一些实施方案中，蛋白酶包含半胱氨酸蛋白酶、羧肽酶A1、羧肽酶A2、羧肽酶A3、羧肽酶A4、羧肽酶A5、羧肽酶A6、羧肽酶B、羧肽酶D、羧肽酶E、羧肽酶M、羧肽酶N、羧肽酶O、羧肽酶U、羧肽酶X1、羧肽酶X2、羧肽酶Z、肌肽二肽酶1、肌肽二肽酶2、半胱天冬酶募集结构域家族成员8、半胱天冬酶、半胱天冬酶-1、半胱天冬酶-2、半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-4/11、半胱天冬酶-5、半胱天冬酶-6、半胱天冬酶-7、半胱天冬酶-8、半胱天冬酶-9、半胱天冬酶-10、半胱天冬酶-12、半胱天冬酶-14、半胱天冬酶-14样、casper/FLIP、组织蛋白酶、组织蛋白酶A(CTSA)、组织蛋白酶B(CTSB)、组织蛋白酶C(CTSC)、组织蛋白酶D(CTSD)、组织蛋白酶E(CTSE)、组织蛋白酶F、组织蛋白酶G、组织蛋白酶H(CTSH)、组织蛋白酶K(CTSK)、组织蛋白酶L(CTSL)、组织蛋白酶L2、组织蛋白酶O、组织蛋白酶S(CTSS)、组织蛋白酶V(CTSV)、组织蛋白酶W、组织蛋白酶Z(CTSZ)、阳离子胰蛋白酶、cezanne/OTU结构域7B、cezanne-2、CGI-58、类糜蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶、凝乳酶、胰凝乳蛋白酶B、胰凝乳蛋白酶C、凝血因子IXa、凝血因子VIIa、凝血因子Xa、凝血因子XIa、凝血因子XIIa、胶原酶1、胶原酶2、胶原酶3、补体蛋白酶C1r丝氨酸蛋白酶、补体蛋白酶C1s丝氨酸蛋白酶、补体C1r同系物、补体成分2、补体成分C1ra、补体成分C1sa、补体因子B、补体因子D、补体因子D样、补体因子I、COPS6、corin、CSN5(JAB1)、圆柱瘤蛋白、胞质溶胶丙氨酰氨肽酶样1、胞质溶胶丙氨酰氨肽酶或其组合。
在一些实施方案中，蛋白酶包含DDI相关蛋白酶、DECYSIN、Der1样结构域家族成员1、Der1样结构域家族成员2、Der1样结构域家族成员3、DESC1蛋白酶、沙漠刺猬蛋白、去SUMO异肽酶1、去SUMO异肽酶2、二氢乳清酸酶、二氢嘧啶酶、二氢嘧啶酶相关蛋白1、二氢嘧啶酶相关蛋白2、二氢嘧啶酶相关蛋白3、二氢嘧啶酶相关蛋白4、二氢嘧啶酶相关蛋白5、DINE肽酶、二肽基肽酶(DPP)、二肽基肽酶(DPP1)、二肽基肽酶4(DPP4)、二肽基肽酶6(DPP6)、二肽基肽酶8(DPP8)、二肽基肽酶9(DPP9)、二肽基肽酶II、二肽基肽酶III、二肽基肽酶10(DPP10)、DJ-1、DNA损伤诱导蛋白、DNA损伤诱导蛋白2、DUB-1、DUB-2、DUB2a、DUB2a样、DUB2a样2、DUB6或其组合。
在一些实施方案中，蛋白酶包含酶溶素、内肽酶Clp、内质网金属肽酶1、内皮素转化酶1、内皮素转化酶2、肠激酶、表皮特异性SP样、表皮溶素、上皮细胞转化序列2癌基因样、上皮溶素、环氧化物水解酶、环氧化物水解酶相关蛋白、真核细胞翻译起始F3SF、真核生物翻译起始F3SH或其组合。
在一些实施方案中，蛋白酶包含因子VII活化蛋白酶、FACE-1/ZMPSTE24、FACE-2/RCE1、具有序列相似性的家族108成员A1、具有序列相似性的家族108成员B1，具有序列相似性的家族108成员C1、具有序列相似性的家族111A、具有序列相似性的家族111B、弗林蛋白酶或其组合。
在一些实施方案中，蛋白酶包含γ-谷氨酰水解酶、γ-谷氨酰转移酶-1、γ-谷氨酰转移酶-2、γ-谷氨酰转移酶5、γ-谷氨酰转移酶-6、γ-谷氨酰转移酶m-3、γ-谷氨酰转移酶样3、GCDFP15、明胶酶A、明胶酶B、Gln-果糖-6-P转酰胺酶1、Gln-果糖-6-P转酰胺酶2、Gln-果糖-6-P转酰胺酶3、Gln-PRPP酰胺转移酶、谷氨酸羧肽酶II、谷氨酰胺酰环化酶、谷氨酰胺酰环化酶2、糖基天冬酰胺酶、糖基天冬酰胺酶-2、粒酶、粒酶A、粒酶B、粒酶H、粒酶K、粒酶M、触珠蛋白-1或其组合。
在一些实施方案中，蛋白酶包含组蛋白脱乙酰酶(HDAC)、触珠蛋白相关蛋白、HAT样2、HAT样3、HAT样4、HAT样5、HAT相关蛋白酶、HSP90AA1？(90kDa热休克蛋白1，α)、HSP90AB1？(90kDa热休克蛋白1，β)、热休克蛋白75、90kDa热休克蛋白β(Grp94)、成员1/肿瘤排斥抗原(gp96)、肝细胞生长因子、hepsin、HetF样、HGF激活剂、hGPI8、Hin-1/OTU结构域4、同系物ICEY、HP43.8KD、HTRA1丝氨酸蛋白酶、HTRA2、HTRA3、HTRA4、透明质酸结合血清蛋白酶、植入丝氨酸蛋白酶2、印度刺猬蛋白、胰岛素酶、肠丝氨酸蛋白酶1、josephin-1、josephin-2或其组合。
在一些实施方案中，蛋白酶包含激肽释放酶(KLK)、激肽释放酶hK1、激肽释放酶hK2、激肽释放酶hK3、激肽释放酶hK4、激肽释放酶hK5、激肽释放酶hK6、激肽释放酶hK7、激肽释放酶hK8、激肽释放酶hK9、激肽释放酶hK10、激肽释放酶hK11、激肽释放酶hK12、激肽释放酶hK13、激肽释放酶hK14、激肽释放酶hK15、Kell血型蛋白、含有KHNYN KH和NYN结构域、乳铁传递蛋白、豆荚蛋白、利什曼原虫-2、亮氨酰氨肽酶、亮氨酰-胱氨酰氨肽酶、白三烯A4水解酶、溶酶体羧肽酶A，溶酶体前-κC-肽酶或其组合。
在一些实施方案中，蛋白酶包含膜金属内肽酶(MME)、巨噬细胞弹性蛋白酶、巨噬细胞刺激蛋白、哺乳动物tolloid样1蛋白、哺乳动物tolloid样2蛋白、MAP1D甲硫氨酸氨肽酶1D、marapsin、marapsin2、MASP1/3(MBL相关丝氨酸蛋白酶3)、mBL相关丝氨酸蛋白酶2(MASP2)、mastin、溶基质蛋白素(matrilysin)、溶基质蛋白素-2、matriptase、matriptase-2、matriptase-3、膜二肽酶、膜二肽酶2、膜二肽酶3、膜型嵌合血清蛋白、meprinα亚基、meprinβ亚基、中胚层特异性转录物、中胰蛋白酶(mesotrypsin)、甲硫氨酰氨肽酶I、甲硫氨酰氨肽酶II、甲硫氨酰氨肽酶II样、线粒体内膜蛋白酶2、线粒体中间肽酶、线粒体加工肽酶b亚基、线粒体加工蛋白酶、线粒体信号肽酶、基质金属蛋白酶(MMP)、MMP19、MMP21、MMP23A、MMP23B、MMP27、MPND、MT1-MMP、MT2-MMP、MT3-MMP、MT4-MMP、MT5-MMP、MT6-MMP、MYSM1或其组合。
在一些实施方案中，蛋白酶包含NAALADASE II、NAALADASE样2、NAALADASE样1、napsin A、napsin B、nardilysin、鼻胚胎LHRH因子、NEDD4结合蛋白1、中性内肽酶(neprilysin)、中性内肽酶-2、神经溶素、神经胰蛋白酶、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(ELANE、ELA2)、NLRP1自切割蛋白、核受体相互作用蛋白2、核受体相互作用蛋白3、核孔蛋白98、NYN结构域和逆转录病毒整合酶、NY-REN-60、OMA1、O-唾液酸糖共蛋白内肽酶、O-唾液酸糖共蛋白内肽酶样1、成骨细胞丝氨酸蛋白酶、OTU结构域6B、OTU结构域-1、OTU结构域-3、OTU结构域-5、OTU结构域-6A、卵巢肿瘤蛋白(otubain)-1、卵巢肿瘤蛋白-2、OTUD2/YOD1、ovastacin、输卵管蛋白样/卵质酶(ovochymase)-2、卵质酶样或其组合。
在一些实施方案中，蛋白酶包含蛋白酶3(PRTN3)、木瓜蛋白酶、PACE4前蛋白转化酶、胰弹性蛋白酶、胰弹性蛋白酶II(IIA)、胰弹性蛋白酶II形式B、胰内肽酶E(A)、胰内肽酶E(B)、妊娠相关血浆蛋白A1(pappalysin-1)、妊娠相关血浆蛋白A2(pappalysin-2)、类胱天蛋白酶(paracaspase)、paraplegin、胃蛋白酶A、胃蛋白酶C、PHEX内肽酶、PIDD自身加工蛋白单元1、PIM1内肽酶、PIM2内肽酶、加溶金属蛋白酶1、血浆Glu-羧肽酶、血浆激肽释放酶、血浆激肽释放酶样2、血浆激肽释放酶样3、血浆激肽释放酶样4、纤溶酶(纤溶酶原)、PM20D2肽酶、POH1/PSMD14、聚合酶-2、聚合酶-3、聚合酶-I、Ppnx、早老素1、早老素2、早老素同系物1/SPPL3、早老素同系物2、早老素同系物3/SPP、早老素同系物4/SPPL2B、早老素同系物5、早老素相关菱形(rhomboid)样、前胶原C-蛋白酶、增殖相关蛋白1、脯氨酰寡肽酶、脯氨酰寡肽酶样、前蛋白转化酶1、前蛋白转化酶2、前蛋白转化酶4、前蛋白转化酶5、前蛋白转化酶7、前蛋白转化酶9(前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型，PCSK9)、前列腺蛋白、(丝氨酸蛋白酶56)、蛋白酶体α1亚基、蛋白酶体α2亚基、蛋白酶体α3亚基、蛋白酶体α3样亚基、蛋白酶体α4亚基、蛋白酶体α5亚基、蛋白酶体α6亚基、蛋白酶体α7亚基、蛋白酶体α8亚基、蛋白酶体b亚基LMP7样、蛋白酶体β1亚基、蛋白酶体β2亚基、蛋白酶体β3亚基、蛋白酶体β3样亚基、蛋白酶体β4亚基、蛋白酶体催化亚基1样、蛋白酶体催化亚基1、蛋白酶体催化亚基1i、蛋白酶体催化亚基2、蛋白酶体催化亚基2i、蛋白酶体催化亚基3、蛋白酶体催化亚基3i、蛋白C、蛋白C样、蛋白Z、蛋白酶3、PRPF8、PSMD7、焦谷氨酰-肽酶I、焦谷氨酰-肽酶II或其组合。
在一些实施方案中，蛋白酶包含颤蛋白(reelin)、肾素、视黄醇结合蛋白3、菱形5同系物1、菱形5同系物2、菱形结构域1、长菱形结构域2、菱形小静脉样2、菱形小静脉样3、菱形样蛋白1或其组合。
在一些实施方案中，蛋白酶包含丝氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶3(PRSS3)、S2P蛋白酶、SAD1、分泌素-1、分泌素-2、分泌素-3、sentrin(SUMO蛋白酶1)、sentrin(SUMO蛋白酶2)、sentrin(SUMO蛋白酶3)、sentrin(SUMO蛋白酶5)、sentrin(SUMO蛋白酶5样1)、sentrin(SUMO蛋白酶6)、sentrin(SUMO蛋白酶7)、sentrin(SUMO蛋白酶8)、sentrin(SUMO蛋白酶9)、sentrin(SUMO蛋白酶11)、sentrin(SUMO蛋白酶12)、sentrin(SUMO蛋白酶13)、sentrin(SUMO蛋白酶14)、sentrin(SUMO蛋白酶15)、sentrin(SUMO蛋白酶16)、sentrin(SUMO蛋白酶17)、sentrin(SUMO蛋白酶18)、sentrin(SUMO蛋白酶19)、分离酶、seprase、丝氨酸羧肽酶1、信号酶18kDa成分、信号酶21kDa成分、信号酶样1、拟南芥属Ser-prot.类似物、SPUVE类似物、位点1蛋白酶、音猬蛋白(sonic hedgehog protein)、脊突蛋白(spinesin)、SprT样N末端结构域、溶基质素1、溶基质素2、溶基质素3、Ty16同系物的抑制剂或其组合。
在一些实施方案中，蛋白酶包含taspase、TBP相关因子2、TESP2、TESP3、testase2、睾丸丝氨酸蛋白酶2、睾丸丝氨酸蛋白酶3、睾丸丝氨酸蛋白酶4、睾丸丝氨酸蛋白酶5、睾丸丝氨酸蛋白酶6、睾丸素、睾丸特异性蛋白tsp50、甲拌磷寡肽酶、凝血酶、胸腺特异性丝氨酸肽酶、TINAG相关蛋白、TMPRSS11A、t-纤溶酶原激活物、TRAF结合蛋白结构域、运铁蛋白受体2蛋白、运铁蛋白受体蛋白、跨膜Ser蛋白酶3、跨膜Ser蛋白酶4、转甲状腺素蛋白、TRH降解胞外酶、三肽基肽酶I、三肽基肽酶II、胰蛋白酶、胰蛋白酶10、胰蛋白酶15、胰蛋白酶C、胰蛋白酶X2、类胰蛋白酶、类胰蛋白酶α/β1、类胰蛋白酶β2、类胰蛋白酶δ1、类胰蛋白酶γ1、类胰蛋白酶同系物2/EOS、类胰蛋白酶同系物3、肾小管间质性肾炎抗原或其组合。
在一些实施方案中，蛋白酶包含泛素C末端水解酶BAP1、泛素C末端水解酶1、泛素C末端水解酶3、泛素C末端水解酶4、泛素C末端水解酶5、泛素特异性肽酶样1、UCR1、UCR2、UDP-N-乙酰葡糖胺基转移酶亚基、Ufm-1特异性蛋白酶1、Ufm-1特异性蛋白酶2、尿激酶(PLAU，uPA)、脐静脉蛋白酶、u-纤溶酶原激活物、USP1、USP2、USP3、USP4、USP5、USP6、USP7、USP8、USP9X、USP9Y、USP10、USPll、USP12、USP13、USP14、USP15、USP16、USP17、USP17样、USP18、USP19、USP20、USP21、USP22、USP24、USP25、USP26、USP27、USP28、USP29、USP30、USP31、USP34、USP35、USP36、USP37、USP40、USP41、USP42、USP43、USP44、USP45、USP46、USP47、USP48、USP49、USP50、USP51、USP52、USP53、USP54或其组合。
在一些实施方案中，蛋白酶包含VCP(p97)/p47-相互作用蛋白、VDU1、卵黄羧肽酶-L、X-Pro二肽酶、X-脯氨酰氨肽酶2、YME1样1、锌指CCCH-型12A、锌指CCCH-型12B、锌指CCCH-型12C、锌指CCCH-型12D、锌指含泛素肽酶1或其组合。
在一些实施方案中，蛋白酶包含A20(肿瘤坏死因子、α诱导的蛋白3、TNFa诱导的蛋白3)。A20是锌指蛋白和去泛素化酶。已显示A20抑制NF-κB活化以及TNF介导的细胞凋亡，限制炎症。
在一些实施方案中，蛋白酶包含血管紧张素转化酶2(ACE2)。ACE2是附着于位于肠、肾、睾丸、胆囊和心脏中的细胞膜的膜细胞的酶。ACE2通过减少血管抑制素II的量来对抗相关血管紧张素转化酶ACE的活性。
在一些实施方案中，蛋白酶包括组织蛋白酶。组织蛋白酶可以是但不限于组织蛋白酶A(CTSA)、组织蛋白酶B(CTSB)、组织蛋白酶C(CTSC)、组织蛋白酶D(CTSD)、组织蛋白酶E(CTSE)、组织蛋白酶H(CTSH)、组织蛋白酶K(CTSK)、组织蛋白酶L(CTSL)、组织蛋白酶S(CTSS)、组织蛋白酶V(CTSV)和组织蛋白酶Z(CTSZ)。组织蛋白酶是蛋白酶的子集，其中许多在低pH下被活化。组织蛋白酶包含丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和天冬氨酰蛋白酶等。组织蛋白酶涉及癌症、阿尔茨海默氏病、关节炎、埃博拉病、胰腺炎、青光眼、COPD和其他疾病。
在一些实施方案中，蛋白酶包含半胱天冬酶。半胱天冬酶可以是但不限于半胱天冬酶1、半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶4、半胱天冬酶5、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、半胱天冬酶10、半胱天冬酶11、半胱天冬酶12、半胱天冬酶13和半胱天冬酶14。
在一些实施方案中，蛋白酶包含钙蛋白酶。钙蛋白酶可以是但不限于钙蛋白酶1、钙蛋白酶2、钙蛋白酶3、钙蛋白酶4、钙蛋白酶5、钙蛋白酶6、钙蛋白酶7、钙蛋白酶8、钙蛋白酶9、钙蛋白酶10、钙蛋白酶11、钙蛋白酶12、钙蛋白酶13、钙蛋白酶14和钙蛋白酶15。半胱天冬酶是在程序性细胞死亡和细胞稳态中起重要作用的蛋白酶家族。
在一些实施方案中，蛋白酶包含半胱氨酸蛋白酶。半胱氨酸蛋白酶，也称为硫醇蛋白酶，是降解蛋白质的水解酶。这些蛋白酶共有共同的催化机制，其涉及催化三联体或二联体中的亲核半胱氨酸硫醇。半胱氨酸蛋白酶家族包含木瓜蛋白酶(木瓜)、菠萝蛋白酶(菠萝)、组织蛋白酶K(苔类)、钙蛋白酶(智人)、天冬氨酸蛋白酶-1(褐家鼠)、分离酶(酿酒酵母)、Adenain(人腺病毒2型)、焦谷氨酰-肽酶I(解淀粉芽孢杆菌)、分选酶A(金黄色葡萄球菌)、丙型肝炎病毒肽酶2(丙型肝炎病毒)、辛德比斯病毒型nsP2肽酶(辛德比斯病毒)、二肽基-肽酶VI(球形赖氨芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus))、DeSI-1肽酶(小家鼠)、TEV蛋白酶(烟草蚀刻病毒)、氨基磷酸核糖基转移酶前体(智人)、γ-谷氨酰水解酶(褐家鼠)、刺猬蛋白(黑腹果蝇)和DmpA氨基肽酶(人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi))等。
在一些实施方案中，蛋白酶包含补体C1r丝氨酸蛋白酶(补体成分1r)。在一些实施方案中，蛋白酶包含补体C1s丝氨酸蛋白酶(补体成分1s)。C1r与C1q和C1s一起形成C1络合物。C1r具有非常窄的胰蛋白酶样特异性，其负责C1络合物的活化。C1活化是两步过程，包括(1)C1r分子内自动活化和(2)C1s被活化的C1r切割。C1r在其C末端含有胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶结构域，并且在C1r和C1s中切割单个Arg-Ile键。Zvi Fishelson,在xPharm:TheComprehensive Pharmacology Reference,2007中。
在一些实施方案中，蛋白酶包含胰凝乳蛋白酶(胰凝乳蛋白酶A和B、α-chymarophth、avazyme、chymar、chymotest、enzeon、quimar、quimotrase、α-chymar、α-胰凝乳蛋白酶A、α-胰凝乳蛋白酶))。胰凝乳蛋白酶是作用于十二指肠的胰液的消化酶成分，在十二指肠中它进行蛋白水解、蛋白质和多肽的分解。胰凝乳蛋白酶优先切割肽酰胺键，其中易切割酰胺键的氨基酸N末端的侧链是大的疏水氨基酸(酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸)。
在一些实施方案中，蛋白酶包含类糜蛋白酶(肥大细胞蛋白酶1、骨骼肌蛋白酶、皮肤胰凝乳蛋白酶、肥大细胞丝氨酸蛋白酶、骨骼肌蛋白酶)。类糜蛋白酶是在肥大细胞、嗜碱性粒细胞中发现的丝氨酸蛋白酶家族。类糜蛋白酶显示广泛的肽溶解活性，并且涉及炎症反应、高血压和动脉粥样硬化。
在一些实施方案中，蛋白酶包含二肽基肽酶(DPP)。DPP包含组织蛋白酶C(DPP1)、DPP2、DPP3、DPP4、DPP6、DPP7、DPP8、DPP9、DPP10。
在一些实施方案中，蛋白酶包含DPP4(腺苷脱氨酶复合蛋白2，CD26)。DPP4在细胞表面表达并与免疫调节、信号转导和凋亡相关。DPP4是从多肽的N末端切割X-脯氨酸或X-丙氨酸二肽的丝氨酸外肽酶。已知DPP-4切割多种底物，包括生长因子、趋化因子、神经肽和血管活性肽。DPP4在葡萄糖代谢中起主要作用，负责诸如GLP-1的肠降血糖素的降解，并且似乎在一些肿瘤的发展中起抑制剂的作用。
在一些实施方案中，蛋白酶包含DPP1(组织蛋白酶C，CTSC)。DPP1是属于肽酶C1家族的溶酶体外半胱氨酸蛋白酶。组织蛋白酶C似乎是免疫/炎性细胞中许多丝氨酸蛋白酶活化的中心协调者。组织蛋白酶C催化从蛋白质和肽底物的N末端切除二肽。
在一些实施方案中，蛋白酶包含解聚素金属蛋白酶(ADAM)。ADAM是单程跨膜家族并分泌金属内肽酶类。并非所有人ADAM都具有功能性蛋白酶结构域。作为活性蛋白酶的那些ADAM被分类为脱落酶，因为它们切断或脱落跨膜蛋白的胞外部分。
在一些实施方案中，蛋白酶包含ADAM12金属蛋白酶。ADAM12结合胰岛素生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)，似乎是早期唐氏综合征标志物，并且已经涉及多种涉及细胞-细胞和细胞基质相互作用的生物过程，包括受精、肌肉发育和神经发生。
在一些实施方案中，蛋白酶包含具有血小板反应蛋白基序的解聚素与金属蛋白(ADAMTS)。ADAMTS是多结构域胞外蛋白酶家族，包含ADAMTS1、ADAMTS2、ADAMTS3、ADAMTS4、ADAMTS5(＝ADAMTS11)、ADAMTS6、ADAMTS7、ADAMTS8(或METH-2)、ADAMTS9、ADAMTS10、ADAMTS12、ADAMTS13、ADAMTS14、ADAMTS15、ADAMTS16、ADAMTS17、ADAMTS18、ADAMTS19和ADAMTS20。ADAMTS蛋白酶的已知功能包括前胶原和血管性血友病(on Willebrand)因子的加工以及聚集蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖、短蛋白聚糖和神经聚糖的切割，使它们成为细胞外基质的关键重塑酶。已经证明它们在结缔组织组织、凝血、炎症、关节炎、血管生成和细胞迁移中具有重要作用。
在一些实施方案中，蛋白酶包含ADAMTS1。ADAMTS1是AD AMTS蛋白家族的成员。ADAMTS1的表达可能与各种炎症过程、癌症恶病质的发展、正常生长、生育力以及器官形态和功能有关。
在一些实施方案中，蛋白酶包括因子VII活化蛋白酶(FSAP)。FSAP是与纤维蛋白溶解酶具有高度同源性的循环丝氨酸蛋白酶，并且可能与凝血和纤维蛋白溶解的调节有关。
在一些实施方案中，蛋白酶包含弗林蛋白酶。弗林蛋白酶属于枯草杆菌蛋白酶样前蛋白转化酶家族，并且是钙依赖性丝氨酸内切蛋白酶。弗林蛋白酶底物包括：甲状旁腺激素、转化生长因子β1前体、前白蛋白、前β-分泌酶、膜1型基质金属蛋白酶、前神经生长因子β亚基和血管性血友病因子。
在一些实施方案中，蛋白酶包含组蛋白脱乙酰酶(HDAC)。HDAC是一类酶，其从组蛋白上的ε-N-乙酰基赖氨酸氨基酸除去乙酰基(O＝C-CH3)，允许组蛋白更紧密地包裹DNA。
在一些实施方案中，蛋白酶包含HTRA1丝氨酸蛋白酶。HTRA1是一种分泌性酶，其被提议通过切割IGF结合蛋白来调节胰岛素样生长因子(IGF)的可用性。它也被认为是细胞生长的调节剂。
在一些实施方案中，蛋白酶包含粒酶。粒酶是由细胞毒性T细胞和天然杀伤(NK)细胞内的细胞质颗粒释放的丝氨酸蛋白酶。粒酶在靶细胞中诱导程序性细胞死亡。粒酶也杀死细菌并抑制病毒复制。
在一些实施方案中，蛋白酶包含激肽释放酶(KLK)。激肽释放酶是丝氨酸蛋白酶的亚组。激肽释放酶负责协调各种生理功能，包括血压、精液液化和皮肤脱屑。
在一些实施方案中，蛋白酶包含基质金属蛋白酶(MMP、基质金属肽酶、基质蛋白)。MPP是钙依赖性含锌内肽酶。MMP涉及细胞表面受体的切割、细胞凋亡配体的释放、趋化因子/细胞因子失活、细胞增殖和细胞迁移。
在一些实施方案中，蛋白酶包含膜金属内肽酶(MME)。MME是一种锌依赖性金属蛋白酶，其在疏水残基的氨基侧切割肽并使几种肽激素失活，肽激素包括胰高血糖素、脑啡肽、P物质、神经降压素、催产素和缓激肽。MME在多种组织中表达并且在肾脏中特别丰富。MME也是常见的急性淋巴细胞白血病抗原。
在一些实施方案中，蛋白酶包含甘露糖结合蛋白相关的丝氨酸蛋白酶2(MASP2、甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶2、MBL相关的丝氨酸蛋白酶2)。MASP2参与补体系统，将补体成分C4和C2切割成C4a、C4b、C2a和C2b。
在一些实施方案中，蛋白酶包含甘露糖结合蛋白相关的丝氨酸蛋白酶3(MBL相关的丝氨酸蛋白酶3，MASP3)。MASP3通过差异剪接来源于MASP1基因，它主要在与纤胶凝蛋白-3复合的高血清浓度中循环，并调节纤胶凝蛋白-3介导的补体激活。
在一些实施方案中，蛋白酶包含嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(ELANE，ELA2)。ELANE是一种在炎症过程中由嗜中性粒细胞和巨噬细胞分泌并破坏细菌和宿主组织的丝氨酸蛋白酶。
在一些实施方案中，蛋白酶包含蛋白酶3(PRTN3)。PRTN3是主要在中性粒细胞中表达的丝氨酸蛋白酶，并且有助于抗微生物肽的蛋白水解产生。
在一些实施方案中，蛋白酶包含纤溶酶(也称为纤溶酶原)。纤溶酶是来源于称为纤溶酶原的惰性血浆前体的蛋白水解酶。它存在于血液中，降解许多血浆蛋白，包括纤维蛋白凝块。在人类中，纤溶酶由PLG基因编码。
在一些实施方案中，蛋白酶包含胃蛋白酶。胃蛋白酶是将蛋白质切割成较小肽的内肽酶。它是天冬氨酸蛋白酶，在其活性位点使用催化性天冬氨酸。
在一些实施方案中，蛋白酶包含早老素-1(PS-1)。PS-1是早老蛋白，其是γ分泌酶络合物中的四种核心蛋白之一，其被认为在由淀粉样蛋白前体蛋白产生淀粉样蛋白β中起重要作用。
在一些实施方案中，蛋白酶包含前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)。PCSK9是肽酶S8家族的成员。
在一些实施方案中，蛋白酶包含丝氨酸蛋白酶。丝氨酸蛋白酶切割蛋白质中的肽键，其中丝氨酸充当酶活性位点处的亲核氨基酸。丝氨酸蛋白酶包括许多亚家族。
在一些实施方案中，蛋白酶包含类胰蛋白酶。类胰蛋白酶是肥大细胞中含有的最丰富的分泌颗粒衍生的丝氨酸蛋白酶，并已用作肥大细胞活化的标志物。当它们作为正常免疫应答的一部分以及在过敏反应中被激活时，它从掩膜细胞(mask cells)中释放出来。
在一些实施方案中，蛋白酶包含胰蛋白酶。胰蛋白酶是在消化系统中发现的来自PA家族超家族的丝氨酸蛋白酶。胰蛋白酶主要在氨基酸赖氨酸或精氨酸的羧基侧切断肽链。
在一些实施方案中，蛋白酶包含尿激酶(PLAU、uPA)。尿激酶是存在于人和其他动物中的丝氨酸蛋白酶。它存在于人尿、血液和许多组织的细胞外基质中。它参与细胞外基质的降解和可能的肿瘤细胞迁移和增殖。尿激酶是411-残基蛋白，由三个结构域组成：丝氨酸蛋白酶结构域、kringle结构域和EGF样结构域。尿激酶作为酶原形式(尿激酶原或单链尿激酶)合成，并通过Lys158和Ile159之间的蛋白水解切割而活化。所得的两条链通过二硫键保持在一起。
本文描述了待检测的作用物，包括但不限于氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶、连接酶、蛋白酶(肽酶)、水解酶、酯酶、β-糖苷酶、磷脂酶和磷酸二酯酶、过氧化物酶、脂肪酶、淀粉酶、亲核试剂、还原试剂、亲电/酸性试剂、有机金属/金属催化剂、氧化试剂、羟基离子、硫醇类亲核物质、氮亲核物质、连二亚硫酸钠和高碘酸钠。
如本文所述，一些作用物的活性检测不依赖于切割。例如，一些氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和连接酶导致底物接头修饰和可检测的报告物的释放或形成。作为说明，某些氧化过程可以修饰无活性的荧光团并使其荧光/可检测，而不需要底物接头或结合事件(对于非共价过程)可以改变某些报告物的磁性/荧光物理-化学性质并使它们可检测。
疾病和病症
本文所述的方法包括确定对象的疾病或病症。在一些方面，疾病或病症包含肝病、癌症、代谢疾病、纤维化疾病、器官移植排斥、感染性疾病、变应性疾病、自身免疫、阿尔茨海默氏病或慢性炎症。在一些实施方案中，肝病可以是非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、毒素介导的肝损伤(药物/试剂、酒精、环境)、病毒性肝炎(HAV、HBV、HCV、HDV、HEV、感染肝的其他病毒)、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性胆管炎、原发性硬化性胆管炎、暴发性肝炎、肝硬化、肝细胞癌(HCC)、胆管癌、移植肝的急性或慢性排斥、遗传性肝病(例如威尔逊病、血色素沉着病或α-1抗胰蛋白酶)或其组合。
在一些实施方案中，癌症包含腺样囊性癌、肾上腺肿瘤、淀粉样变性、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、共济失调-毛细血管扩张、贝克威斯-韦德曼(Beckwith-Wiedemann)综合征、胆道癌(胆管癌)、伯-霍-杜氏(Birt-Hogg-Dubé)综合征、膀胱癌、骨癌(骨肉瘤)、脑干神经胶质瘤、脑肿瘤、乳腺癌、卡尼(Carney)综合征、中枢神经系统肿瘤、宫颈癌、结直肠癌、考登(Cowden)综合征、颅咽管瘤、硬纤维癌、结缔组织增生性婴儿神经节神经胶质瘤、室管膜瘤、食道癌、尤因(Ewing)肉瘤、眼癌、眼睑癌、家族性腺瘤性息肉病、家族性GIST、家族性恶性黑素瘤、家族性胰腺癌、胆囊癌、胃肠道基质肿瘤(GIST)、生殖细胞肿瘤、妊娠滋养细胞疾病、头颈癌、乳腺癌和卵巢癌、弥漫性胃癌、平滑肌肉瘤和肾细胞癌、混合性息肉病综合征、乳头状肾癌、少年息肉病综合征、肾癌、泪腺肿瘤、喉和下咽癌、白血病、髓样白血病、成淋巴细胞性白血病、嗜酸性白血病、李-佛美尼(Li-Fraumeni)综合征、肝癌、肺癌、霍奇金肺癌、非霍奇金肺癌、林奇(Lynch)综合征、肥大细胞增多症、成神经管细胞瘤、黑素瘤、脑膜瘤、间皮瘤、多发性内分泌瘤形成、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、神经内分泌肿瘤、神经纤维瘤病、痣样基底细胞癌综合征、口腔和口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、输卵管癌、腹膜癌、胰腺癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、普-杰(Peutz-Jeghers)综合征、嗜铬细胞瘤、副神经节瘤、垂体腺瘤、胸膜肺母细胞瘤、前列腺癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、卡波西(Kaposi)肉瘤、软组织肉瘤、肉瘤、非黑素瘤皮肤癌、小肠癌、胃癌、睾丸癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、结节性硬化复合体、子宫癌、阴道癌、林岛(von Hippel-Lindau)综合征、外阴癌、瓦耳登斯特姆(Waldenstrom)巨球蛋白血症、沃纳(Werner)综合征、维尔姆斯氏(Wilms)肿瘤或着色性干皮病。
在一些实施方案中，疾病可以是NASH。非酒精性脂肪性肝炎，也称为NASH，是非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的更活跃的炎性形式。NAFLD由肝脏中的脂肪积聚引起。当这种积聚引起炎症和损伤时，称为NASH，其可导致肝脏的瘢痕形成。尽管最常见的症状是右上腹部疲劳或轻度疼痛，但通常没有与NASH相关的外在体征或症状。NASH可导致肝硬化，当病症进展时引起一种或多种以下症状：容易出血、容易瘀伤、皮肤发痒、黄疸、腹腔积液、食欲不振、恶心、腿部肿胀、意识模糊、嗜睡、言语不清或蜘蛛样血管。
NASH在超重或肥胖的患者中最常见；其他危险因素包括糖尿病、高胆固醇、高甘油三酯、饮食不良、代谢综合征、多囊卵巢综合征、睡眠呼吸暂停和甲状腺机能亢进。
NAFLD涵盖没有显著饮酒的个体的整个脂肪肝疾病谱，范围从脂肪肝到脂肪性肝炎到肝硬化。非酒精性脂肪肝是存在>5％的肝脂肪变性，没有肝细胞气球样变形式的肝细胞损伤证据或纤维化证据。认为进展为肝硬化和肝衰竭的风险最小。NASH是存在>5％的伴有炎症的肝脂肪变性和伴有或不伴有纤维化的肝细胞损伤(气球样变)。这可能进展为肝硬化、肝功能衰竭和罕见的肝癌。NASH肝硬化是存在具有脂肪变性或脂肪性肝炎的当前或先前组织学证据的肝硬化。
NAS是脂肪变性、小叶炎症和气球样变评分的未加权组合。NAS是在临床试验中测量NAFLD患者肝脏组织学变化的有用工具。纤维化被单独评分并且可以被分类为F1至F4；具体地，1期是区域3(脉络膜周)、窦周或门静脉周纤维化；2期是区域3和门静脉周纤维化；3期是具有结节性的桥接纤维化；4期为肝硬化。
表3：用于非酒精性脂肪性肝病的组织学评分系统：NAFLD活动评分(NAS)和纤维化分期的成分
Figure BDA0004223379250000911
Figure BDA0004223379250000921
在一些实施方案中，疾病可以是NAFLD。非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是影响饮酒很少或不饮酒的人的一系列肝脏病症的概括性术语。顾名思义，NAFLD的主要特征是肝细胞中储存的脂肪过多。尽管最常见的症状是右上腹部疲劳或轻度疼痛，但通常没有与NAFLD相关的外在体征或症状。
在一些实施方案中，疾病可以是暴发性肝炎。暴发性肝炎或暴发性肝衰竭定义为严重肝功能损害的临床综合征，其导致肝昏迷和肝合成能力降低。然后它们迅速发展成严重的，通常危及生命的肝衰竭。这可以在几小时、几天或有时几周内发生。严重肝衰竭的症状包括意识错乱、极度过敏、意识改变、凝血缺陷和腹腔积液和多器官系统衰竭。
在一些实施方案中，疾病可以是肝细胞癌(HCC)。HCC是最常见的原发性肝癌类型。HCC最经常发生在患有导致晚期纤维化或肝硬化的慢性肝病的人中。与HCC相关的最常见的肝病是病毒性乙型肝炎或丙型肝炎、酒精相关的肝病和NASH。
在一些实施方案中，疾病可以是原发性胆汁性胆管炎(PBC)。原发性胆汁性胆管炎，以前称为原发性胆汁性肝硬化，是一种慢性疾病，其中肝脏中的胆管被缓慢破坏。胆汁是肝脏中产生的液体。肝脏中的慢性炎症可导致胆管损伤，肝组织的不可逆瘢痕形成(肝硬化)和最终肝衰竭。PBC被认为是一种自身免疫性疾病，这意味着机体免疫系统错误地攻击健康细胞和组织。研究人员认为遗传和环境因素的组合引发了该疾病。它通常发展缓慢。此时，没有治愈原发性胆汁性胆管炎的方法，但药物治疗可减缓肝损伤，尤其是在治疗早期开始时。
在一些实施方案中，肝病可以是毒素介导的肝损伤(例如，来自药物/药剂、酒精、环境)。毒素介导的肝损伤是肝脏对某些物质反应中的炎症，如酒精、化学品、药物/药剂、环境因素或营养补充剂。肝脏通常从血流中除去和分解大多数药物和化学品，这产生可损害肝脏的副产物。尽管肝脏具有很大的再生能力，但持续暴露于有毒物质可引起严重的，有时不可逆的损害。
在一些实施方案中，肝脏疾病可以是病毒性肝炎(HAV、HBV、HCV、HDV、HEV、感染肝脏的其他病毒)。病毒性肝炎是由病毒感染引起的肝脏炎症。它可以作为相对快速发作的近期感染以急性形式存在，或以慢性形式存在。病毒性肝炎最常见的原因是五种不相关的嗜肝病毒肝炎甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎和戊型肝炎。其他病毒也可引起肝脏炎症，包括巨细胞病毒、爱泼斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒和黄热病。还记录了由单纯疱疹病毒引起的病毒性肝炎病例的评分。病毒性肝炎通过污染的食物或水(甲型肝炎、戊型肝炎)或通过血液和体液(乙型肝炎、丙型肝炎)传播。甲型肝炎和乙型肝炎可以通过接种预防。丙型肝炎的有效治疗是可获得的，但费用昂贵。
在一些实施方案中，肝病可以是自身免疫性肝炎。自身免疫性肝炎是当免疫系统攻击肝细胞时发生的肝脏炎症。自身免疫性肝炎的确切原因尚不清楚，但遗传和环境因素似乎在引发该疾病中随时间而相互作用。未治疗的自身免疫性肝炎可导致肝瘢痕形成(肝硬化)并最终导致肝衰竭。当早期诊断和治疗时，自身免疫性肝炎通常可以用抑制免疫系统的药物来控制。当自身免疫性肝炎对药物治疗没有反应时或在晚期肝病的情况下，肝移植可以是一种选择。自身免疫性肝炎有两种主要形式：(1)1型自身免疫性肝炎。1型自身免疫性肝炎是最常见的类型并且可以在任何年龄发生。约一半的患有1型自身免疫性肝炎的人具有其他自身免疫性疾病，例如乳糜泻、类风湿性关节炎或溃疡性结肠炎；(2)2型自身免疫性肝炎。尽管成人可能发展成2型自身免疫性肝炎，但在儿童和年轻人中最常见。其他自身免疫性疾病可伴随2型自身免疫性肝炎。
在一些实施方案中，肝病可以是原发性硬化性胆管炎。原发性硬化性胆管炎是一种胆管疾病。在原发性硬化性胆管炎中，炎症引起胆管内瘢痕。这些瘢痕使导管变得坚硬和狭窄，并逐渐引起严重的肝脏损伤。大多数患有原发性硬化性胆管炎的人还患有炎性肠病，例如溃疡性结肠炎或克罗恩病。在大多数原发性硬化性胆管炎的病例中，疾病进展缓慢。其可最终导致肝衰竭、反复感染和胆管或肝的肿瘤。
在一些实施方案中，肝病可以是肝硬化。肝硬化是由许多形式的肝脏疾病和病症(诸如肝炎和慢性酒精中毒)引起的肝脏瘢痕形成(纤维化)的晚期阶段。在肝脏自修复过程中，瘢痕组织形成。随着肝硬化的发展，越来越多的瘢痕组织形成，使得肝脏难以发挥功能(失代偿性肝硬化)。
在一些实施方案中，肝病可以是胆管癌。胆管癌(胆管癌)是在胆管中形成的一种类型的癌症。胆管癌的危险因素包括原发性硬化性胆管炎(胆管的炎性疾病)、溃疡性结肠炎、肝硬化、丙型肝炎、乙型肝炎、某些肝吸虫感染和一些先天性肝畸形。胆管癌可以基于在胆管中发生的癌症的位置来分类：肝内胆管癌、肝门部胆管癌、远端胆管癌。胆管癌时常在晚期才被诊断，使得难以实现成功的治疗。
在一些实施方案中，肝脏疾病可以是遗传性肝脏疾病(例如威尔逊(Wilson)病、血色素沉着病或α-1抗胰蛋白酶等)。遗传性肝病是可引起严重肝病和其他健康问题的遗传性失调。威尔逊病是一种罕见的遗传性失调，它会导致铜在肝脏、大脑和其他重要器官中积累。血色素沉着病是一种在肝脏和其他器官中聚集的铁沉积物的疾病。血色素沉着病的主要形式是美国最常见的遗传性疾病之一。α-1抗胰蛋白酶蛋白主要在肝脏中由肝细胞合成，分泌到血流中，并且在炎症期间充当主要在肺中释放的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的抑制剂。当血液中α-1抗胰蛋白酶蛋白缺乏或以低于正常水平存在时，引起α-1抗胰蛋白酶缺乏。
在一些实施方案中，疾病可以是器官移植排斥。当移植组织被配方免疫系统排斥时发生移植排斥，其破坏移植组织。移植排斥可以通过确定供体和受体之间的分子相似性和通过在移植后使用免疫抑制药物来减轻。
在一些实施方案中，疾病可以是感染性疾病。感染性疾病是由诸如细菌、病毒、真菌或寄生虫的生物体引起的病症。细菌是引起疾病如链球菌上呼吸道感染、尿路感染和结核病的单细胞生物体。病毒引起从普通感冒到AIDS的许多疾病。许多皮肤病，例如癣菌和脚癣，是由真菌引起的。其他类型的真菌可以感染肺或神经系统。疟疾是由蚊子叮咬传播的微小寄生虫引起的。其他寄生虫可从动物粪便传播给人。在一些实施方案中，感染性疾病是COVID-19。
在一些实施方案中，疾病可以是变应性疾病。变应性疾病是由变应原诱导的不利免疫应答引起的，免疫应答在不同器官中引发各种症状，其通常不能完全由现代医学控制。变应性疾病的免疫学基础在两个阶段中观察到：记忆T和B细胞反应的致敏和发展，以及IgE的产生和效应功能，这些与嗜酸性粒细胞、先天性淋巴细胞、树突状细胞亚群、上皮细胞和组织炎症/损伤、上皮屏障、组织重塑和慢性哮喘、特应性皮炎(AD)和过敏性鼻炎(AR)相关。不同的疾病表型和内型可能随着不同的显性分子机制、相关的生物标志物和对生物治疗的应答而变得明显。多种机制因子复杂地涉及过敏性炎症的发病机理。在一些实施方案中，疾病可以是自身免疫性疾病/自身免疫。自身免疫性疾病是免疫系统错误地攻击自身身体的病症。通常，免疫系统可以分辨外来细胞和自身细胞之间的差异。在自身免疫性疾病中，免疫系统将像关节或皮肤这样的身体的一部分误认为是外来的。它释放攻击健康细胞的称为自身抗体的蛋白质。一些自身免疫性疾病仅靶向一个器官。1型糖尿病损害胰腺。其他疾病，如系统性红斑狼疮(SLE)，影响许多不同的器官系统。在一些实施方案中，自身免疫性疾病可以是类风湿性关节炎、克罗恩病、多发性硬化(MS)或银屑病关节炎(PsA)。
在一些实施方案中，疾病可以是慢性炎症。慢性炎症也称为持续数月至数年的长期的缓慢、长期的炎症。通常，慢性炎症的程度和作用随损伤的原因和身体修复和克服损伤的能力而变化。急性炎症的大部分特征随着炎症变得慢性而持续，包括血管扩张(血管舒张)、血流增加、毛细血管通透性和嗜中性粒细胞通过毛细血管壁迁移到感染组织中(渗出)。然而，白细胞的组成很快改变，巨噬细胞和淋巴细胞开始替代短寿命的中性粒细胞。因此，慢性炎症的标志是诸如巨噬细胞、淋巴细胞和浆细胞的原发性炎性细胞在组织部位的浸润，产生炎性细胞因子、生长因子、酶，并因此有助于组织损伤的进展和包括纤维化和肉芽肿形成等的继发性修复。
在一些实施方案中，疾病可以是纤维化疾病。纤维化疾病定义为各种组织的过度生长、硬化和/或瘢痕形成，并且归因于细胞外基质组分(包括胶原)的过度沉积。纤维化是由多种刺激诱导的慢性炎症反应的最终结果，刺激包括持续感染、自身免疫反应、过敏反应、化学损伤、辐射和组织损伤。纤维化疾病包括但不限于系统性纤维化疾病，诸如系统性硬化症(SSc)、硬皮病移植物抗宿主病、特发性肺纤维化(IPF)、肾源性系统性纤维化和器官特异性疾病，包括辐射诱导的纤维化和心脏、肺、肝和肾纤维化。
在一些实施方案中，疾病可以是代谢疾病。当体内的异常化学反应破坏代谢时，发生代谢紊乱/疾病。当这种情况发生时，人们可能有过多的某些物质或过少的其他物质需要保持健康。有不同组的失调。一些影响氨基酸、碳水化合物或脂质的分解。另一组，线粒体疾病，影响产生能量的细胞部分，当诸如肝脏或胰腺的一些器官变得患病或不能正常发挥功能时，可以发展为代谢失调。糖尿病是一个例子。
在一些实施方案中，疾病可以是阿尔茨海默氏病。阿尔茨海默氏病是一类影响记忆、思维和行为的痴呆。症状最终严重到足以干扰日常工作。阿尔茨海默氏病的变化通常在影响学习的大脑部分开始。随着阿尔茨海默氏病通过大脑发展，其导致越来越严重的症状，包括定向障碍、情绪和行为改变；加深事件、时间、地点的混淆；对家庭、朋友和专业照顾者的无据可查的怀疑；更严重的记忆丧失和行为改变；难以说话、吞咽和行走。
实施例
提供这些实施例仅用于说明目的，而不是限制本文提供的权利要求的范围。应当理解，所示出的比例的变化和成分的元素的替换对于本领域技术人员而言是显而易见的，并且在本文所呈现的实施方案的范围内。
实施例1.使用探针在小鼠中诊断NASH
在该实验中，本申请的探针显示准确地检测液体样本中与非酒精性脂肪性肝炎(NASH)相关的蛋白酶的活性水平，以诊断对象中的NASH。
在两个小鼠群体中体内评估与NASH相关的蛋白酶活性水平，一个群体健康且一个群体患有NASH。体内使用的探针如图10所示。
在喂食标准饲料饮食(Chow Diet)(CD)的健康小鼠和喂食缺乏胆碱、L-氨基酸限定的高脂肪饮食(CDAHFD)的NASH小鼠中，通过蛋白酶对这些探针的蛋白水解切割获得的质量-条形码化报告物尿浓度水平示于图11。与健康小鼠相比，通过增加的NASH相关蛋白酶活性切割的NASH相关探针与来自NASH小鼠的尿中质量条形码化报告物的更高积累相关。
如图12所示，在其各自饮食12周后，从健康(CD)或具有NASH(CDAHFD)的小鼠收集血样于K2EDTA管中。根据动物护理指南使用所有动物。通过在4℃下以3,500RPM离心20min从这些血液样本获得血浆。将血浆储存在-80℃下直至其需要用于实验目的。
如图13所示，合并解冻的血浆样本，并在各种肽和血清浓度下与具有荧光猝灭剂和蛋白酶可切割的荧光报告物的探针接触。将样本与蛋白酶底物和猝灭剂/报告物在96孔板中混合。在Biotech Synergy H1上使用465,535激发/发射设置读取96孔板。
如图14所示，本申请的探针能够测量NASH相关蛋白酶的活性，在两种小鼠群体中以每分钟的相对荧光单位(RFU)表示。测量组织蛋白酶活性的探针在NASH小鼠中的蛋白酶切割动力学比健康小鼠高3倍。相反，检测半胱天冬酶活性的探针在健康小鼠和NASH小鼠之间没有显示可检测活性的变化。图15A和图15B显示了一种探针，探针#102，在检测NASH相关蛋白酶活性中的结果子集；此处，荧光报告物和猝灭剂的使用与图5中讨论的那些相似，显示出准确测量健康小鼠(图15A)和NASH小鼠(图15B)血浆中NASH相关蛋白酶的活性水平。
因此，本申请的探针可以使用体液样本离体准确地检测对象中与生物学病症或疾病状态相关的蛋白酶的活性水平。
实施例2：小鼠血浆中NASH蛋白酶活性的检测
如图14所示，本申请的探针能够以多重形式准确检测取自两个小鼠群体的血浆样本中NASH相关蛋白酶的蛋白酶活性，如实施例1和图13中所解释的。将单个血浆样本与每种预定蛋白酶的探针接触以提供样本中蛋白酶活性的多重评估。
在图16中，对于每组探针，健康小鼠中的蛋白酶活性显示在左边，而NASH小鼠中的蛋白酶活性显示在右边。如图所示，本申请的探针能够测量NASH相关蛋白酶活性的增加。
如图17和图18所示，以RFU/min测量的相同组动物的合并血浆样本中的蛋白酶活性与该组各动物的蛋白酶活性平均值相似。此外，在健康和NASH动物组中加入广谱蛋白酶抑制剂混合物(INH)完全消除了蛋白酶活性，提供了随时间测量的荧光信号依赖于蛋白水解活性的证据。
图19A和图19B显示，当研究小鼠血浆样本时，活性(非丰度)在区分健康样本和NASH样本中更重要。尽管在健康CD小鼠和NASH CDAHFD小鼠之间NASH相关蛋白酶(这里是组织蛋白酶L或CTSL)的丰度可以是相当的(图19A)，但是这些蛋白酶的活性水平是不同的(图19B)。在该实验中，使用来自LS Bio的ELISA试剂盒测量蛋白酶丰度，而使用实施例1中描述的探针#102(CTSL传感探针)荧光测定测量活性。
因此，本申请的探针可以使用诸如血浆的体液样本以多重形式离体准确地检测对象中与生物学病症或疾病状态相关的蛋白酶的活性水平。
实施例3：液体活检确定NASH的进展与消退
在该实验中，本申请的探针能够在健康小鼠、NASH小鼠和经历疾病消退的NASH小鼠之间进行区分。
图20显示了包括三组小鼠的实验设计：CDAHFD NASH小鼠持续20周(NASH进展)，健康CD小鼠持续20周，以及给小鼠喂食CDAH FD持续16周后转换到饲料饮食持续4周(NASH消退)。在20周时从所有动物收集血浆样本。
如图21A-图21F所示，如实施例1所述，使用几种探针接触解冻的血浆，这导致健康、消退和NASH样本之间的明显区分。显示出NASH最多区分的探针与组织蛋白酶和/或MMP蛋白酶活性有关。
该实验表明，不仅可以区分健康样本和患病样本，而且可以区分健康样本、疾病进展样本和疾病消退样本。
实施例4：针对小鼠暴发性肝炎的液体活检应用
在该实验中，研究了另一种小鼠肝脏疾病模型-暴发性肝炎模型-以确定本申请的更广泛用途。该实验用于开发使用血浆和FRET底物库中的现有传感器应用于肝炎模型的离体测定技术。
腹膜内注射单克隆抗体抗CD95(Jo2，BD biosciences，4ug/动物)后诱导暴发性肝炎，并在Jo2注射后3小时收集小鼠血浆样本。如图22所示，当探针使用先前在实施例1中描述的方法接触小鼠血浆样本时，探针能够离体区分健康和Jo2样本。图23显示了相同的体内结果，相同的小鼠接受可注射探针制剂用于与离体方法直接比较。
与小鼠中的NASH肝脏模型数据相比，Jo2肝炎模型证明了差异探针切割。以半胱天冬酶为中心的探针(探针#647、探针#8、探针#12)主要显示对Jo2模型特异和敏感的对比。与质谱数据的比较也与离体方法一致并证实了高一致性，这再次证明了生物学相关信号的存在。
图24表明，对于肝病的两种临床前模型，由于每种疾病的蛋白酶活性(即NASH中的组织蛋白酶活性和肝炎中的半胱天冬酶活性)的不同生物学机制，本申请可以清楚地鉴定每种疾病。
实施例5：检测人血浆中的NASH
本实验涉及人中NASH的检测。
如图25所示，从被诊断为健康/偏瘦、健康/肥胖或NASH的人类对象收集血液样本。用与实施例1相同的方法从这些血样中获得血浆。将血浆在-80℃下储存不超过2年，并且每个样本的冻/融循环计数≤1。
如图26所示，当探针使用实施例1中描述的方法接触人血浆样本时，与健康样本相比，在NASH样本中观察到随时间增加的荧光水平，允许区分健康样本和NASH样本的蛋白酶活性水平。
图27显示了当测试独立的样本队列时，本申请区分健康和NASH样本的能力的高水平再现性。
图28进一步表明，本申请不仅能够区分健康和NASH人样本，而且令人惊讶地，还能够区分早期(F0-F2)和晚期(F3+)NASH。整个F0-F4数据集含有100个NASH样本，并且使用实施例1的方法进行实验。
如图29所示，本申请的多个探针能够区分人的健康样本和NASH样本-当测试样本时，这种多样性提供了较低的假阳性率。
该实验表明，本申请非常适于在人对象中以非侵入性方式区分健康和NASH(以及NASH的不同纤维化阶段)。
实施例6：液体活检作用机制
在该实验中，确定由特异性探针切割的特异性蛋白酶以显示本申请关于其所检测的疾病差异的特异性。该实验还表明，蛋白酶活性而不是丰度是本申请确定样本中疾病标志物的驱动因素。
对于该实验，单独制备所有血浆样本并在PBS中稀释1/10e，将抑制剂直接加入样本中。制备15倍浓度的抑制剂至最终浓度。将底物在DI水中以18uM稀释，使得板上的最终浓度为6uM。制备所有样本，使得它们在板上的最后稀释不会影响期望的最终浓度。将10ul的每个单独样本吸移到它们相应的孔中，然后将板在离心机中以1500RPM旋转30秒以用样本涂覆每个孔的底部。将5ul的18uM底物溶液吸移到384孔板上使用的每个孔中，然后将板在离心机中以1500rpm旋转30秒。将板立即置于37℃的酶标仪中，以485/535延长的增益进行30分钟时长的荧光动力学读数。
为了评估探针#102的蛋白水解切割模式，使用丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、MMP和天冬氨酸蛋白酶家族成员的广泛抑制剂(广谱抑制剂)库测试样本以评估一般蛋白酶活性，使用丝氨酸蛋白酶的AEBSF，使用半胱氨酸蛋白酶的E64，使用组织蛋白酶L、S、K和B的广谱组织蛋白酶抑制的CTSi，或使用组织蛋白酶K(L00625)、组织蛋白酶L(SID)或组织蛋白酶B(CA074)的特异性抑制剂。
所有E64(广谱半胱氨酸)、SID(CTSL)和CTSi(CTSL、S、K、B)抑制剂显着地降低NASH信号，对于健康的信号降低极少，指示信号降低的性质是疾病特异性的。当使用广谱抑制剂或E64时，我们观察到NASH和健康样本之间的RFU信号对比降低大于6倍，指示半胱氨酸蛋白酶是造成疾病对比的原因。广谱组织蛋白酶抑制剂CTSi使NASH降低47％，而只使健康降低18％，证明组织蛋白酶是造成疾病对比的原因。CTSL的特异性组织蛋白酶抑制剂(SID)使NASH降低60％，而仅使健康降低33％。NASH和健康都随着丝氨酸抑制剂AEBSF的加入而降低。NASH被抑制65％，而健康被抑制60％。NASH和健康的RFU的类似降低表明探针#102感测的AEBSF信号不是疾病特异性信号和背景性质的重要贡献者。
组织蛋白酶K和B、L006235和CA074的特异性抑制剂分别不显著降低NASH或健康样本的信号。
图30A显示了探针#102与广谱蛋白酶抑制剂的组合，以显示探针#102特异性地接触蛋白酶确定健康样本和NASH样本之间的差异。图30B显示了探针#102接触半胱氨酸蛋白酶，图30C进一步将其限制为组织蛋白酶家族蛋白酶。图30D-图30F测试单个组织蛋白酶以显示探针#102特异地响应一种NASH相关蛋白酶-组织蛋白酶L(CTSL)的活性。因此，如本申请所认识到的，组织蛋白酶L活性是造成样本中蛋白酶活性的疾病相对健康差异的原因。
如图31A-图31B所示，本申请在健康组织和NASH组织之间的区别不是由胰蛋白酶或凝血酶引起的，它们都是经常存在于血液中的混杂蛋白酶。
如图32A-图32B所示，蛋白酶活性是疾病的真实量度，而不是蛋白酶数量。这证实了小鼠中先前确定的活性比先前在实施例2中看到的和先前在图19中显示的丰度更重要。
更具体地，图33证明，尽管CTSL在健康和NASH人样本中同样丰富，但CTSL活性在这两个样本群体之间是不同的。
本申请显示通过测量活性水平而不是特定疾病相关蛋白酶的丰度起作用，以给出样本中特定疾病的准确测定。
实施例7：针对COVID诊断的液体活检应用
在该示例中，本申请涉及诊断COVID。
使用COVID的初始实验使用K2EDTA和肝素锂收集血浆。将样本在-80℃储存的冰上解冻，然后在PBS中稀释至10％。制备样本后，将体积分成两半，并将广谱蛋白酶抑制剂加入到一个管中-最终稀释100倍，管中稀释67倍。将10uL各样本置于96孔板的孔中，并将板储存在冰上。使用在DMF中制备的1mM原液在ddH2O中以18uM制备底物。向各孔中加入5uL底物。将96孔板以1000RPM旋转<30秒。在Biotek Synergy H1酶标仪(Ex/Em＝485/535)上以4分钟30秒的循环时间使用动态读数(动态范围扩展1小时)读板。
如图34A-图34B所示，多个传感器证明了COVID和健康样本之间的差异切割。探针#462、探针#18和探针#84在两组中显示出对比，而探针#409、SARS CoV2冠状病毒底物，在K2EDTA样本中显示出适度的对比。
如图35所示，将COVID阳性和COVID阴性拭子(如在临床部位通过PCR测定的)与LBx传感器组合以确定是否可以使用拭子离体感测蛋白酶活性。
将样本在冰上解冻，然后在DPBS(中性pH7.4，Gibco)中稀释至10％。在需要时，根据条件合并样本，每种条件下每种样本的体积相等，然后在DPBS中稀释。制备样本后，将体积分成两半，并将广谱蛋白酶抑制剂加入到1个管中-最终稀释100倍，管中稀释67倍。将10uL各样本加入96孔板的相应孔中，将板储存在冰上。使用在DMF中制备的1mM原液在ddH2O中以18uM制备底物。将5uL底物加入96孔板中的每个样本中，并将板以1000x rpm离心<30秒。在Biotek Synergy H1酶标仪(Ex/Em＝485/535)上以4分钟30秒的循环时间使用动态读数(动态范围扩展2小时)读板。
图36A-图36B显示了用病毒转运介质(VTM)处理的拭子和唾液样本，病毒转运介质在与本申请的探针接触后在血清中含有一些蛋白酶。然而，当使用来自实验1的方法使用盐水培养基代替VTM测试拭子时，如图37中所示，在COVID-和COVID+样本之间可以看到明显的差异(如通过临床PCR测试所的)。与VTM拭子相比，盐水介质拭子给出了优异的蛋白酶活性信号，因为它们收集在不含添加剂的盐水介质中。这显示了本申请在生物流体上具有广泛的适用性。
特异性探针，探针#647，显示为COVID+和COVID-样本之间的关键差异物，如图38A-图38C所示。
如图39A-图39B所示，探针#647信号测量蛋白酶粒酶B的活性以区分健康样本和COVID样本。粒酶B是与其他自身免疫疾病和病毒感染相关的蛋白酶，显示了本申请可应用于广泛的疾病生物学。
生物素和探针#647通过在50/50DMF/PBS中以2mM溶解探针#647的储备粉末而缀合。生物素-马来酰亚胺以100mM从粉末重构，并在PBS中稀释至以下浓度-2mM、3mM和6mM。用以下摩尔当量产生三种反应混合物：1)1:1-10uL至10uL 2mM生物素+2mM探针#647，2)1:1.5-10至10uL 3mM生物素+2mM探针#647，和3)1:3-10至10uL 6mM生物素+2mM探针#647。一旦混合，将它们在Hula样本混合器上在室温下倒置2小时。一旦缀合反应完成，使用100nM重组粒酶B与来自上述3个反应的6uM探针#647-生物素缀合物测试重组蛋白酶和样本。然后将它们孵育多个时间点-0分钟、5分钟、30分钟、1小时和任选的O/N。然后将它们稀释至1:20，将纸条浸入混合物中，并目视读取纸条。一旦使用重组蛋白酶证实活性，在强COVID+盐水拭子样本和COVID-盐水拭子样本中证实结果(如通过临床PCR测试所测定)。将10uL稀释的盐水拭子样本与5uL探针#647-生物素缀合物组合并孵育多个时间点-0小时和2小时。反应后，将样本以1:20稀释并用纸条目视读取。
使用本申请的探针，使用纸条测试来监测粒酶B活性，如图40所示。用于检测生物素标签的5FAM传感器的蛋白酶切割的护理测试的这一点对于实时疾病监测和应答具有影响。
实施例8：针对胰腺导管腺癌的液体活检应用
在该实施例中，本申请涉及诊断胰腺导管腺癌(PDAC)。
如图41A-图41B所示，当使用实验1的方法将人血浆与本申请的探针接触时，可以区分健康和PDAC人血浆样本的蛋白酶活性。
此外，如图42所示，探针能够区分健康样本、PDAC样本和胰腺炎样本。
该实验继续显示，对于具有不同蛋白酶生物学的不同类型疾病的应用具有广泛的适用性。
实施例9：具有荧光报告物的探针将准确地测量小鼠中NASH相关的蛋白酶活性水 平。
在该预言性实验中，包括沉淀荧光报告物和可被内切蛋白酶切割的蛋白酶底物的本公开内容的探针，像图8中讨论的探针，将能够准确地测量健康小鼠和NASH小鼠中NASH相关蛋白酶的活性水平。
探针将被工程化，使得蛋白酶底物可被诸如内蛋白酶半胱天冬酶8的蛋白酶切割，从而产生通过自消除间隔物与沉淀荧光报告物连接的第二蛋白酶底物。或者，第二蛋白酶底物可被内切蛋白酶CTSD切割。
用过量CTSD加标血浆样本不会导致半胱天冬酶8活性的测量增加。因此，在没有半胱天冬酶8切割蛋白酶底物的情况下，第二底物将不能被CTSD切割，这将最终阻止荧光报告物的沉淀。
然而，在向液体样本中加入低浓度的半胱天冬酶8时，强信号将被沉淀的荧光团检测到。因此，半胱天冬酶8将能够切割蛋白酶底物，从而产生第二蛋白酶底物，其将被CTSD切割。这最终将导致间隔物与沉淀的荧光报告物解离，从而产生荧光信号。
在与半胱天冬酶8和CTSD孵育后，将含有具有可区分的沉淀荧光报告物的探针的血浆样本合并。单独地，从健康小鼠或患有NASH的小鼠采集血浆样本，以通过检测半胱天冬酶8来确定健康样本和NASH样本之间的差异。
实施例10：检测替代酶
在该实验中，研究了用于疾病检测的替代酶活性的测量。不同的酶种类包括过氧化物酶、脂肪酶、酯酶、磷脂酶、淀粉酶等。
图43显示了使用
Figure BDA0004223379250001061
髓过氧化物酶活性测定试剂盒检测MPO的氯化和过氧化活性的示意图。AH代表无荧光
Figure BDA0004223379250001062
UltraRed的底物，A代表其荧光产物。过氧化氢将MPO转化为MPO-I，并且MPO在不存在过氧化氢的情况下是无活性的。然后用MPO-I氧化
Figure BDA0004223379250001063
UltraRed并产生荧光氧化产物A，其可以在Ex/Em＝530/590下读取。
图44A-图44C显示了检测过氧化物酶的结果。图44A显示了健康小鼠和NASH小鼠之间的MPO活性不同。图44B显示了用标准饲料饮食(CD)喂养的小鼠与用缺乏胆碱、L-氨基酸限定的高脂肪饮食(CDAHFD)喂养的小鼠之间MPO活性不同。图44C显示了健康对象和类风湿性关节炎对象之间的MPO活性不同。该结果显示了我们能够检测血浆中NASH和滑液中人库中类风湿性关节炎的差异活性。
图45A-图45B显示了使用试卤灵油酸酯作为底物的人血浆中掺加的重组蛋白酶的合并结果。图46A显示了3种重组酶—羧酸酯酶1、磷脂酶A2和脂蛋白脂肪酶的结果。图46B显示了不同浓度脂蛋白脂肪酶的结果。该结果表明，试卤灵油酸酯和丁酸酯有希望用于检测宽范围的酶。
虽然在此已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，这些实施方案仅作为示例提供。本发明不受说明书中提供的具体实施例的限制。虽然已经参考前述说明书描述了本发明，但是本文中的实施方案的描述和说明并不意味着以限制的意义来解释。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替换。此外，应当理解，本发明的所有方面不限于本文所述的具体描述、配置或相对比例，其取决于各种条件和变量。应当理解，在实践本发明时可以采用本文所述的本发明的实施方案的各种替代方案。因此，预期本发明还将涵盖任何此类替代、修改、变化或等同物。希望以下权利要求书限定本发明的范围，且因此涵盖这些权利要求书的范围内的方法和结构及其等同物。

Claims (71)

1.一种方法，其包括：
使来自对象的血浆样本与分子离体接触，
其中所述分子包含可切割接头和报告物，并且
其中所述可切割接头被来自所述血浆的作用物切割，释放来自所述分子的所述报告物；
检测所述释放的报告物的形成速率或量。
2.如权利要求1所述的方法，进一步包含向所述血浆样本中引入抗凝血剂。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述抗凝剂是EDTA、柠檬酸盐、肝素、草酸盐，其任何盐、溶剂化物、对映异构体、互变异构体和几何异构体，或其任何混合物。
4.一种方法，其包括：
使来自患有疾病或病症的对象的体液样本与分子离体接触，
其中所述分子包含可切割接头和报告物，并且
其中所述可切割接头被来自所述体液的作用物切割，释放来自所述分子的所述报告物；
检测所述释放的报告物的形成速率或量，
其中所述释放的报告物的所述形成速率或所述量与健康对象显著不同。
5.一种方法，其包括：
使来自对象的体液样本与第一分子离体接触，
其中所述第一分子包含第一可切割接头和第一报告物，并且
其中所述第一可切割接头被来自所述体液的第一作用物切割，从所述第一分子释放所述第一报告物；
检测所述释放的第一报告物的形成速率或量；
使来自所述对象的所述体液样本与第二分子离体接触，
其中所述第二分子包含第二可切割接头和第二报告物，并且
其中所述第二可切割接头被来自所述体液的第二作用物切割，从所述第二分子释放所述第二报告物；
检测所述释放的第二报告物的形成速率或量；
基于对所述释放的第一报告物的所述检测和对所述释放的第二报告物的所述检测确定所述对象的疾病或病症。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述确定包含监督机器学习分类算法、逻辑回归、朴素贝叶斯、支持向量机、随机森林、梯度提升、神经网络、连续回归方法、岭回归、核岭回归、支持向量回归或其任何组合。
7.一种方法，其包括：
使来自对象的体液样本与分子离体接触，
其中所述分子包含可切割接头和报告物，并且
其中所述可切割接头被来自所述体液的作用物切割，释放来自所述分子的所述报告物；
检测所述释放的报告物的形成速率或量，
基于所述检测确定所述对象的疾病或病症，
其中所述疾病或病症是非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的某一纤维化阶段或某一非酒精性脂肪性肝病活动度评分(NAS)。
8.一种方法，其包括：
使来自对象的体液样本与分子离体接触，
其中所述分子包含可切割接头和报告物，并且
其中所述可切割接头被来自所述体液的作用物切割，释放来自所述分子的所述报告物；
检测所述释放的报告物的形成速率或量，
基于所述检测确定所述对象的疾病或病症，
其中所述疾病或病症选自肝病、癌症、器官移植排斥、感染性疾病、变应性疾病、自身免疫、阿尔茨海默氏病和慢性炎症；其中所述癌症不是胰腺导管腺癌或非小细胞肺癌。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述肝病包含非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、毒素介导的肝损伤、病毒性肝炎、暴发性肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎、肝硬化、肝细胞癌(HCC)、原发性胆汁性胆管炎(PBC)、胆管癌、原发性硬化性胆管炎、移植肝的急性或慢性排斥、遗传性肝病或其组合。
10.如权利要求4-9所述的方法，其中所述体液样本选自血液、血浆、骨髓液、淋巴液、胆汁、羊水、粘膜液、唾液、尿、脑脊液、脊髓液、滑液、精液、导管吸出物、粪便、粪质、阴道流出物、泪液、组织裂解物和患者来源的细胞系上清液。
11.如权利要求4-9所述的方法，其中所述体液样本包含洗液、调理介质或缓冲液、拭子病毒运输介质、盐水、培养基或细胞培养物上清液。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述洗液选自漱口洗液、细支气管肺泡洗液、灌洗液、洗发洗液、鼻喷雾流出物、应用于盐水或任何介质的任何体表、孔口、器官结构或实体瘤活检的拭子或其任何衍生物。
13.如权利要求1-12所述的方法，其中所述作用物选自氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶、连接酶、蛋白酶(肽酶)、水解酶、酯酶、β-糖苷酶、磷脂酶和磷酸二酯酶、过氧化物酶、脂肪酶、淀粉酶、亲核试剂、还原试剂、亲电/酸性试剂、有机金属/金属催化剂、氧化试剂、羟基离子、硫醇类亲核物质、氮亲核物质、连二亚硫酸钠和高碘酸钠。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述作用物是蛋白酶。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述蛋白酶是内肽酶或外肽酶。
16.如权利要求15的方法，其中所述蛋白酶选自A20(TNFa诱导的蛋白质3)、α/β水解酶结构域4、α/β水解酶结构域12、α/β水解酶结构域12B、α/β水解酶结构域13、顶体酶、酰氨基酰肽酶、解聚素金属蛋白酶(ADAM)、ADAM1a、ADAM2(受精素-b)、ADAM3B、ADAM4、ADAM4B、ADAM5、ADAM6、ADAM7、ADAM8、ADAM9、ADAM10、ADAM11、ADAM12金属蛋白酶、ADAM15、ADAM17、ADAM18、ADAM19、ADAM20、ADAM21、ADAM22、ADAM23、ADAM28、ADAM29、ADAM30、ADAM32、ADAM33、具有血小板反应蛋白基序的解聚素金属蛋白酶(ADAMTS)、ADAMTS1、ADAMTS2、ADAMTS3、ADAMTS4、ADAMTS5/11、ADAMTS6、ADAMTS7、ADAMTS8、ADAMTS9、ADAMTS10、ADAMTS12、ADAMTS13、ADAMTS14、ADAMTS15、ADAMTS16、ADAMTS17、ADAMTS18、ADAMTS19、ADAMTS20、脂肪细胞增强结合蛋白1、Afg3样蛋白1、Afg3样蛋白2、气道胰蛋白酶样蛋白酶、氨酰基转移酶、氨肽酶A、氨肽酶B、氨肽酶B样1、氨肽酶MAMS/L-RAP、氨肽酶N、氨肽酶O、氨肽酶P同系物、氨肽酶P1、氨肽酶PILS、氨肽酶Q、氨肽酶样1、AMSH/STAMBP、AMSH-LP/STAMBPL1、血管紧张素转换酶1(ACE1)、血管紧张素转换酶2(ACE2)、血管紧张素转换酶3(ACE3)、阴离子胰蛋白酶(II)、载脂蛋白(a)、阿奇霉素-1、阿奇霉素-2、天冬氨酸酰基转移酶、天冬氨酸酰基转移酶-3、天冬氨酰氨肽酶、共济失调蛋白-3、共济失调蛋白-3样、ATP/GTP结合蛋白1、ATP/GTP结合蛋白样2、ATP/GTP结合蛋白样3、ATP/GTP结合蛋白样4、ATP/GTP结合蛋白样5、ATP23肽酶、自噬蛋白-1、自噬蛋白-2、自噬蛋白-3、自噬蛋白-4、天青蛋白、β内酰胺酶、β-分泌酶1、β-分泌酶2、博来霉素水解酶、脑丝氨酸蛋白酶2、BRCC36(含BRCA2的复合物亚基3)、钙蛋白酶、钙蛋白酶1、钙蛋白酶2、钙蛋白酶3、钙蛋白酶4、钙蛋白酶5、钙蛋白酶6、钙蛋白酶7、钙蛋白酶7样、钙蛋白酶8、钙蛋白酶9、钙蛋白酶10、钙蛋白酶11、钙蛋白酶12、钙蛋白酶13、钙蛋白酶14、钙蛋白酶15(Solh蛋白)、半胱氨酸蛋白酶、羧肽酶A1、羧肽酶A2、羧肽酶A3、羧肽酶A4、羧肽酶A5、羧肽酶A6、羧肽酶B、羧肽酶D、羧肽酶E、羧肽酶M、羧肽酶N、羧肽酶O、羧肽酶U、羧肽酶X1、羧肽酶X2、羧肽酶Z、肌肽二肽酶1、肌肽二肽酶2、半胱天冬酶募集结构域家族成员8、半胱天冬酶、半胱天冬酶-1、半胱天冬酶-2、半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-4/11、半胱天冬酶-5、半胱天冬酶-6、半胱天冬酶-7、半胱天冬酶-8、半胱天冬酶-9、半胱天冬酶-10、半胱天冬酶-12、半胱天冬酶-14、半胱天冬酶-14样、casper/FLIP、组织蛋白酶、组织蛋白酶A(CTSA)、组织蛋白酶B(CTSB)、组织蛋白酶C(CTSC)、组织蛋白酶D(CTSD)、组织蛋白酶E(CTSE)、组织蛋白酶F、组织蛋白酶G、组织蛋白酶H(CTSH)、组织蛋白酶K(CTSK)、组织蛋白酶L(CTSL)、组织蛋白酶L2、组织蛋白酶O、组织蛋白酶S(CTSS)、组织蛋白酶V(CTSV)、组织蛋白酶W、组织蛋白酶Z(CTSZ)、阳离子胰蛋白酶、cezanne/OTU结构域7B、cezanne-2、CGI-58、类糜蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶、凝乳酶、胰凝乳蛋白酶B、胰凝乳蛋白酶C、凝血因子IXa、凝血因子VIIa、凝血因子Xa、凝血因子XIa、凝血因子XIIa、胶原酶1、胶原酶2、胶原酶3、补体蛋白酶C1r丝氨酸蛋白酶、补体蛋白酶C1s丝氨酸蛋白酶、补体C1r同系物、补体成分2、补体成分C1ra、补体成分C1sa、补体因子B、补体因子D、补体因子D样、补体因子I、COPS6、corin、CSN5(JAB1)、圆柱瘤蛋白、胞质溶胶丙氨酰氨肽酶样1、胞质溶胶丙氨酰氨肽酶、DDI相关蛋白酶、DECYSIN、Der1样结构域家族成员1、Der1样结构域家族成员2、Der1样结构域家族成员3、DESC1蛋白酶、沙漠刺猬蛋白、去SUMO异肽酶1、去SUMO异肽酶2、二氢乳清酸酶、二氢嘧啶酶、二氢嘧啶酶相关蛋白1、二氢嘧啶酶相关蛋白2、二氢嘧啶酶相关蛋白3、二氢嘧啶酶相关蛋白4、二氢嘧啶酶相关蛋白5、DINE肽酶、二肽基肽酶(DPP)、二肽基肽酶(DPP1)、二肽基肽酶4(DPP4)、二肽基肽酶6(DPP6)、二肽基肽酶8(DPP8)、二肽基肽酶9(DPP9)、二肽基肽酶II、二肽基肽酶III、二肽基肽酶10(DPP10)、DJ-1、DNA损伤诱导蛋白、DNA损伤诱导蛋白2、DUB-1、DUB-2、DUB2a、DUB2a样、DUB2a样2、DUB6或其组合。
17.如权利要求14所述的方法，其中所述蛋白酶选自T细胞蛋白酶、补体蛋白酶、纤维化蛋白酶和炎症相关蛋白酶。
18.如权利要求1-17所述的方法，其中所述可切割接头是肽、碳水化合物、核酸、脂质、酯、糖苷、磷脂、磷酸二酯、亲核物质/碱敏感接头、还原敏感接头、亲电物质/酸敏感接头、金属可切割接头、氧化敏感接头或其组合。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述可切割接头是肽。
20.如权利要求18所述的方法，其中所述肽包含选自SEQ ID No:1-SEQ ID No:677的氨基酸序列。
21.如权利要求1-20所述的方法，其中所述可切割接头通过共价键直接连接至所述报告物。
22.如权利要求1-21所述的方法，其中所述报告物包含荧光标记、质量标签、发色团、电化学活性分子、生物层干涉测量或表面等离子体共振可检测分子、沉淀物质、质谱和液相色谱底物、磁活性分子、凝胶形成和/或粘度改变分子、免疫测定可检测分子、基于细胞的扩增可检测物或核酸条形码或其任何组合。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述报告物包含荧光标记。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述荧光标记选自5-羧基荧光素(5-FAM)、7-氨基-4-氨基甲酰基甲基香豆素(ACC)、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)、2-氨基苯甲酰基(Abz)、Cy7、Cy5、Cy3和(5-((2-氨基乙基)氨基)萘-1-磺酸)(EDANS)。
25.如权利要求23-24所述的方法，其中所述分子进一步包含荧光猝灭剂。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述荧光猝灭剂选自BHQ0、BHQ1、BHQ2、BHQ3、BBQ650、ATTO 540Q、ATTO 580Q、ATTO612Q、CPQ2、QSY-21、QSY-35、QSY-7、QSY-9、DABCYL(4-([4'-二甲基氨基)苯基]偶氮)苯甲酰基)、Dnp(2,4-二硝基苯基)和Eclipse。
27.如权利要求25-26所述的方法，其中所述荧光猝灭剂通过共价键直接连接至所述可切割接头。
28.如权利要求1-27所述的方法，其中所述分子进一步包含载体。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述载体包含天然的、标记的或合成的蛋白质、准确已知化学组成或具有围绕平均分子量分布的合成化学聚合物、寡核苷酸、磷酰二胺吗啉代低聚物(PMO)、折叠体、脂质、脂质胶束、纳米颗粒、由聚苯乙烯、聚丙烯或任何其他类型的塑料制成的固体载体、或其任何组合。
30.如权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述对象是哺乳动物。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
32.如权利要求1-31所述的方法，其中所述报告物通过自消除间隔物与所述可切割接头连接。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述自消除间隔物选自二硫化物、异胺二官能团二硫化物、基于硫醇的哒嗪二酮、对氨基苄氧羰基、二肽、Gly-Pro、L-Phe-Sar、反式环辛烯四嗪、邻羟基保护的芳基硫酸盐、基于氨基磷酸酯的间隔物、羟基苄基、氨基甲酸三甲酯、基于醌甲基化物的间隔物。
34.如权利要求1-33所述的方法，其中所述检测包含荧光检测、光谱检测、质谱、免疫学检测或成像检测。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述检测包含荧光检测。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述荧光检测是荧光共振能量转移(FRET)。
37.如权利要求32-36所述的方法，其中所述切割的报告物包含沉淀荧光团。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述沉淀荧光团包括HPQ、Cl-HPQ、HTPQ、HBPQ或HQPQ。
39.一种方法，其包括：
测量来自对象的体液样本中两种或更多种作用物的活性，
基于所述活性确定所述对象的疾病或病症，
其中所述疾病或病症选自肝病、器官移植排斥、感染性疾病、变应性疾病、自身免疫、阿尔茨海默氏病和慢性炎症。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述肝病包含非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、毒素介导的肝损伤、病毒性肝炎、暴发性肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎、肝硬化、肝细胞癌(HCC)、原发性胆汁性胆管炎(PBC)、胆管癌、原发性硬化性胆管炎、移植肝的急性或慢性排斥、遗传性肝病或其组合。
41.一种方法，其包括：
测量来自对象的体液样本中两种或更多种作用物的活性，
基于所述活性确定所述对象的疾病或病症，
其中所述疾病或病症是非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的某一纤维化阶段或某一非酒精性脂肪性肝病活动度评分(NAS)。
42.如权利要求39-41所述的方法，其中所述测量进一步包含：
使来自所述对象的所述体液样本与分子离体接触，
其中所述分子包含可切割接头和报告物，并且
其中所述可切割接头被来自所述血浆的所述蛋白酶切割，释放来自所述分子的所述报告物；
检测所述释放的报告物的形成速率或量。
43.如权利要求39-42所述的方法，其中所述作用物选自氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶、连接酶、蛋白酶(肽酶)、水解酶、酯酶、β-糖苷酶、磷脂酶和磷酸二酯酶、过氧化物酶、脂肪酶、淀粉酶、亲核试剂、还原试剂、亲电/酸性试剂、有机金属/金属催化剂、氧化试剂、羟基离子、硫醇类亲核物质、氮亲核物质、连二亚硫酸钠和高碘酸钠。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述作用物是蛋白酶。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述蛋白酶是内肽酶或外肽酶。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述蛋白酶选自A20(TNFa诱导的蛋白质3)、α/β水解酶结构域4、α/β水解酶结构域12、α/β水解酶结构域12B、α/β水解酶结构域13、顶体酶、酰氨基酰肽酶、解聚素金属蛋白酶(ADAM)、ADAM1a、ADAM2(受精素-b)、ADAM3B、ADAM4、ADAM4B、ADAM5、ADAM6、ADAM7、ADAM8、ADAM9、ADAM10、ADAM11、ADAM12金属蛋白酶、ADAM15、ADAM17、ADAM18、ADAM19、ADAM20、ADAM21、ADAM22、ADAM23、ADAM28、ADAM29、ADAM30、ADAM32、ADAM33、具有血小板反应蛋白基序的解聚素金属蛋白酶(ADAMTS)、ADAMTS1、ADAMTS2、ADAMTS3、ADAMTS4、ADAMTS5/11、ADAMTS6、ADAMTS7、ADAMTS8、ADAMTS9、ADAMTS10、ADAMTS12、ADAMTS13、ADAMTS14、ADAMTS15、ADAMTS16、ADAMTS17、ADAMTS18、ADAMTS19、ADAMTS20、脂肪细胞增强结合蛋白1、Afg3样蛋白1、Afg3样蛋白2、气道胰蛋白酶样蛋白酶、氨酰基转移酶、氨肽酶A、氨肽酶B、氨肽酶B样1、氨肽酶MAMS/L-RAP、氨肽酶N、氨肽酶O、氨肽酶P同系物、氨肽酶P1、氨肽酶PILS、氨肽酶Q、氨肽酶样1、AMSH/STAMBP、AMSH-LP/STAMBPL1、血管紧张素转换酶1(ACE1)、血管紧张素转换酶2(ACE2)、血管紧张素转换酶3(ACE3)、阴离子胰蛋白酶(II)、载脂蛋白(a)、阿奇霉素-1、阿奇霉素-2、天冬氨酸酰基转移酶、天冬氨酸酰基转移酶-3、天冬氨酰氨肽酶、共济失调蛋白-3、共济失调蛋白-3样、ATP/GTP结合蛋白1、ATP/GTP结合蛋白样2、ATP/GTP结合蛋白样3、ATP/GTP结合蛋白样4、ATP/GTP结合蛋白样5、ATP23肽酶、自噬蛋白-1、自噬蛋白-2、自噬蛋白-3、自噬蛋白-4、天青蛋白(azurocidin)、β内酰胺酶、β-分泌酶1、β-分泌酶2、博来霉素水解酶、脑丝氨酸蛋白酶2、BRCC36(含BRCA2的复合物亚基3)、钙蛋白酶、钙蛋白酶1、钙蛋白酶2、钙蛋白酶3、钙蛋白酶4、钙蛋白酶5、钙蛋白酶6、钙蛋白酶7、钙蛋白酶7样、钙蛋白酶8、钙蛋白酶9、钙蛋白酶10、钙蛋白酶11、钙蛋白酶12、钙蛋白酶13、钙蛋白酶14、钙蛋白酶15(Solh蛋白)、半胱氨酸蛋白酶、羧肽酶A1、羧肽酶A2、羧肽酶A3、羧肽酶A4、羧肽酶A5、羧肽酶A6、羧肽酶B、羧肽酶D、羧肽酶E、羧肽酶M、羧肽酶N、羧肽酶O、羧肽酶U、羧肽酶X1、羧肽酶X2、羧肽酶Z、肌肽二肽酶1、肌肽二肽酶2、半胱天冬酶募集结构域家族成员8、半胱天冬酶、半胱天冬酶-1、半胱天冬酶-2、半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-4/11、半胱天冬酶-5、半胱天冬酶-6、半胱天冬酶-7、半胱天冬酶-8、半胱天冬酶-9、半胱天冬酶-10、半胱天冬酶-12、半胱天冬酶-14、半胱天冬酶-14样、casper/FLIP、组织蛋白酶、组织蛋白酶A(CTSA)、组织蛋白酶B(CTSB)、组织蛋白酶C(CTSC)、组织蛋白酶D(CTSD)、组织蛋白酶E(CTSE)、组织蛋白酶F、组织蛋白酶G、组织蛋白酶H(CTSH)、组织蛋白酶K(CTSK)、组织蛋白酶L(CTSL)、组织蛋白酶L2、组织蛋白酶O、组织蛋白酶S(CTSS)、组织蛋白酶V(CTSV)、组织蛋白酶W、组织蛋白酶Z(CTSZ)、阳离子胰蛋白酶、cezanne/OTU结构域7B、cezanne-2、CGI-58、类糜蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶、凝乳酶、胰凝乳蛋白酶B、胰凝乳蛋白酶C、凝血因子IXa、凝血因子VIIa、凝血因子Xa、凝血因子XIa、凝血因子XIIa、胶原酶1、胶原酶2、胶原酶3、补体蛋白酶C1r丝氨酸蛋白酶、补体蛋白酶C1s丝氨酸蛋白酶、补体C1r同系物、补体成分2、补体成分C1ra、补体成分C1sa、补体因子B、补体因子D、补体因子D样、补体因子I、COPS6、corin、CSN5(JAB1)、圆柱瘤蛋白、胞质溶胶丙氨酰氨肽酶样1、胞质溶胶丙氨酰氨肽酶、DDI相关蛋白酶、DECYSIN、Der1样结构域家族成员1、Der1样结构域家族成员2、Der1样结构域家族成员3、DESC1蛋白酶、沙漠刺猬蛋白、去SUMO异肽酶1、去SUMO异肽酶2、二氢乳清酸酶、二氢嘧啶酶、二氢嘧啶酶相关蛋白1、二氢嘧啶酶相关蛋白2、二氢嘧啶酶相关蛋白3、二氢嘧啶酶相关蛋白4、二氢嘧啶酶相关蛋白5、DINE肽酶、二肽基肽酶(DPP)、二肽基肽酶(DPP1)、二肽基肽酶4(DPP4)、二肽基肽酶6(DPP6)、二肽基肽酶8(DPP8)、二肽基肽酶9(DPP9)、二肽基肽酶II、二肽基肽酶III、二肽基肽酶10(DPP10)、DJ-1、DNA损伤诱导蛋白、DNA损伤诱导蛋白2、DUB-1、DUB-2、DUB2a、DUB2a样、DUB2a样2、DUB6或其组合。
47.如权利要求44所述的方法，其中所述蛋白酶选自T细胞蛋白酶、补体蛋白酶、纤维化蛋白酶和炎症相关蛋白酶。
48.如权利要求42-47所述的方法，其中所述可切割接头是肽、碳水化合物、核酸、脂质、酯、糖苷、磷脂、磷酸二酯、亲核物质/碱敏感接头、还原敏感接头、亲电物质/酸敏感接头、金属可切割接头、氧化敏感接头或其组合。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述可切割接头是肽。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述肽包含选自SEQ ID No:1-SEQ ID No:677的氨基酸序列。
51.如权利要求42-50所述的方法，其中所述可切割接头通过共价键直接连接至所述报告物。
52.如权利要求42-51所述的方法，其中所述报告物包含荧光标记、质量标签、发色团、电化学活性分子、生物层干涉测量或表面等离子体共振可检测分子、沉淀物质、质谱和液相色谱底物、磁活性分子、凝胶形成和/或粘度改变分子、免疫测定可检测分子、基于细胞的扩增可检测物或核酸条形码或其任何组合。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述报告物包含荧光标记。
54.如权利要求53所述的方法，其中所述荧光标记选自5-羧基荧光素(5-FAM)、7-氨基-4-氨基甲酰基甲基香豆素(ACC)、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)、2-氨基苯甲酰基(Abz)、Cy7、Cy5、Cy3和(5-((2-氨基乙基)氨基)萘-1-磺酸)(EDANS)。
55.如权利要求42-54所述的方法，其中所述分子进一步包含荧光猝灭剂。
56.如权利要求55所述的方法，其中所述荧光猝灭剂选自：BHQ0、BHQ1、BHQ2、BHQ3、BBQ650、ATTO 540Q、ATTO 580Q、ATTO612Q、CPQ2、QSY-21、QSY-35、QSY-7、QSY-9、DABCYL(4-([4'-二甲基氨基)苯基]偶氮)苯甲酰基)、Dnp(2,4-二硝基苯基)和Eclipse。
57.如权利要求55-56所述的方法，其中所述荧光猝灭剂通过共价键直接连接于所述可切割接头。
58.如权利要求42-57所述的方法，其中所述分子进一步包含载体。
59.如权利要求55所述的方法，其中所述载体包含天然的、标记的或合成的蛋白质、准确已知化学组成或具有围绕平均分子量分布的合成化学聚合物、寡核苷酸、磷酰二胺吗啉代低聚物(PMO)、折叠体、脂质、脂质胶束、纳米颗粒、由聚苯乙烯、聚丙烯或任何其他类型的塑料制成的固体载体、或其任何组合。
60.如权利要求42-59所述的方法，其中所述对象是哺乳动物。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
62.如权利要求42-61所述的方法，其中所述报告物通过自消除间隔物与所述可切割接头连接。
63.如权利要求62所述的方法，其中所述自消除间隔物选自二硫化物、异胺二官能团二硫化物、基于硫醇的哒嗪二酮、对氨基苄氧羰基、二肽、Gly-Pro、L-Phe-Sar、反式环辛烯四嗪、邻羟基保护的芳基硫酸盐、基于氨基磷酸酯的间隔物、羟基苄基、氨基甲酸三甲酯、基于醌甲基化物的间隔物。
64.如权利要求42-63所述的方法，其中所述检测包含荧光检测、光谱检测、质谱、免疫学检测或成像检测。
65.如权利要求64所述的方法，其中所述检测包含荧光检测。
66.如权利要求65所述的方法，其中所述荧光检测是荧光共振能量转移(FRET)。
67.如权利要求42-66所述的方法，其中所述切割的报告物包含沉淀荧光团。
68.如权利要求67所述的方法，其中所述沉淀荧光团包括HPQ、Cl-HPQ、HTPQ、HBPQ或HQPQ。
69.如权利要求39-68所述的方法，其中所述体液样本选自血液、血浆、骨髓液、淋巴液、胆汁、羊水、粘膜液、唾液、尿、脑脊液、脊髓液、滑液、精液、导管吸出物、粪便、粪质、阴道流出物、泪液、组织裂解物和患者来源的细胞系上清液。
70.如权利要求39-68所述的方法，其中所述体液样本包含洗液、调理介质或缓冲液、拭子病毒运输介质、盐水、培养基或细胞培养物上清液。
71.如权利要求70所述的方法，其中所述洗液选自漱口洗液、细支气管肺泡洗液、灌洗液、洗发洗液、鼻喷雾流出物、应用于盐水或任何介质的任何体表、孔口、器官结构或实体瘤活检的拭子或其任何衍生物。
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