CN116426477A - 一种诱导人羊膜上皮干细胞向人角膜基质细胞分化的方法及其应用 - Google Patents
一种诱导人羊膜上皮干细胞向人角膜基质细胞分化的方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种诱导人羊膜上皮干细胞向人角膜基质细胞分化的方法及其应用，向人羊膜上皮干细胞中加入含有抗坏血酸或其衍生物、碱性成纤维细胞生长因子以及视黄酸的细胞培养基，诱导产生的细胞高表达Keratocan、Lumican和ALDH1A1等角膜基质细胞特异性标记物。诱导产生的细胞免疫原性低，可以良好地整合到天然的角膜基质结构中，表明其具有移植潜力。将诱导产生的细胞结合GelMA水凝胶，移植到角膜损伤部位。通过荧光素钠染色以及裂隙灯观察显示其具有促进角膜损伤愈合，抑制纤维化形成的作用。本发明开发的无血清诱导体系能够用于人羊膜上皮干细胞向人角膜基质细胞的分化以及治疗角膜损伤相关的疾病。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及从人羊膜上皮干细胞诱导分化出人角膜基质细胞样细胞的方法及其在治疗角膜损伤性疾病中的应用
背景技术
一直以来，临床上角膜移植供体短缺的问题都亟待解决。近年来，组织工程化角膜作为天然角膜的替代品，被认为是值得发展的新策略。然而，角膜生物工程受到种子细胞(如角膜基质细胞)不足的限制。考虑到人类胚胎干细胞和诱导多能干细胞具有分化成三胚层细胞的多能性，多个研究团队尝试将这两类细胞或其分化产物作为种子细胞。值得注意的是，关于这两类干细胞的致瘤性以及伦理等问题尚未得到很好地解决，限制了进一步的临床转化。鉴于胚胎干细胞和诱导多能干细胞应用的局限性，体细胞来源的干细胞又逐渐成为研究热点，然而对于这类细胞而言，如何大规模获得以及伦理问题仍有待解决。基于以上现状，开发一种新型干细胞用于角膜细胞的分化显得尤为必要。
胎盘作为一种通常被丢弃的器官，较少涉及伦理问题，是得到大量围产期干细胞的理想来源。此外，胎盘属于新生儿附属组织，其环境和年龄相关性的基因损伤较少，是再生医学的理想选择。胎盘的最内层结构是羊膜，羊膜在眼科中作为生物敷料被广泛应用，大量临床试验证实了其具有促进角膜创面愈合的能力。值得一提的是，从羊膜中分离出的人羊膜上皮干细胞(human amniotic epithelial stem cells,hAESCs)具有多向分化潜能、免疫调节能力、低免疫原性、无致瘤性、来源广泛等显著优势。结合hAESCs的上述特性，利用其诱导分化出种子细胞用于角膜组织工程将充满希望和前景。大多数情况下，角膜机械损伤只涉及到角膜上皮层和基质层。一方面，角膜上皮细胞相较于基质细胞，具有更强的自我更新和伤口愈合能力，另一方面，从角膜解剖结构来看，基质层占整体厚度的90％以上，因此构建组织工程化角膜对于角膜基质细胞的需求更大。目前将hAESCs诱导分化成人角膜基质细胞的方法还未被报道。
基于hAESCs的优势属性，本发明开发了一套无动物血清，且化学成分明确的分化体系，首次尝试将胎盘来源的hAESCs诱导分化成人角膜基质细胞样细胞，实现了生物废弃物的再利用。同时该分化体系克服了常规分化体系中添加动物血清或使用成分不明培养基等违反临床使用指南的操作，为临床转化应用奠定了基础。最后，本发明在角膜损伤模型中验证了其对于角膜损伤修复的促进作用。
发明内容
针对当前组织工程化角膜缺乏种子细胞的问题，本发明提供了一种诱导人羊膜上皮干细胞向人角膜基质细胞分化的方法及其应用，本发明地将废弃胎盘来源的hAESCs诱导分化成人角膜基质细胞样细胞。本发明开发的hAESCs分化体系无动物血清、化学成分明确，并且在角膜损伤动物模型中验证了其应用潜力。
为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种诱导人羊膜上皮干细胞向人角膜基质细胞分化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)分离人羊膜上皮干细胞，在合适条件下贴壁培养24-48小时；
(2)将细胞培养液换为诱导组合物继续培养，诱导人羊膜上皮干细胞分化为人角膜基质细胞；
其中，所述的诱导组合物为含有0.01-5mM抗坏血酸或抗坏血酸的衍生物、1-40ng/ml碱性成纤维细胞生长因子以及0.05-20uM视黄酸的细胞培养基。
所述方法步骤(1)中的人羊膜上皮干细胞为小于P2代次的人羊膜上皮干细胞。
所述方法步骤(2)中将细胞培养液换为诱导组合物继续培养3-12天，诱导人羊膜上皮干细胞向人角膜基质细胞分化。
所述方法步骤(2)中的诱导组合物为含有0.01-5mM抗坏血酸或其衍生物,1-40ng/ml碱性成纤维细胞生长因子，以及0.05-20uM视黄酸的细胞培养基。
所述方法中的人羊膜上皮干细胞通过包括以下步骤的方法制备:
(1)在胎盘内表面用机械剥离法获取羊膜；
(2)将羊膜清洗干净后，依次经过酶消化、离心步骤，即可得到人羊膜上皮干细胞。
由人羊膜上皮干细胞诱导分化产生的人角膜基质细胞样细胞或其细胞制剂在制备治疗和/或改善角膜损伤性疾病的药物中的用途。
使用有效剂量的由人羊膜上皮干细胞诱导分化产生的人角膜基质细胞样细胞或其细胞制剂单独或者与其它药物或生物材料联合使用进行治疗和/或改善角膜损伤性疾病。
所述的角膜损伤性性疾病包括但不限于外伤、手术或者感染所导致的角膜损伤。
所述的由人羊膜上皮干细胞诱导分化产生的人角膜基质细胞样细胞或其细胞制剂。
一种细胞制剂，其包括由人羊膜上皮干细胞诱导分化产生的人角膜基质细胞样细胞和药学可接受的各类载体。
本发明采取的技术方案之一为：一种从废弃胎盘的羊膜组织中分离得到hAESCs的方法，所述方法包括以下步骤：
步骤1：人羊膜的获取；经健康剖腹产产妇授权知情同意后，从胎盘内表面机械剥离出羊膜，转运至生物安全柜；
步骤2：hAESCs的分离；用清洗液洗去羊膜表面的血液及其他杂质，剪成小块组织后用胰蛋白酶消化，离心后得到细胞沉淀。用培养液重悬后过细胞筛；
步骤3：hAESCs的培养；细胞计数后，将约1×107个细胞接种于15cm培养皿，置于37度，5％CO2细胞培养箱中，待细胞贴壁后换培养液。每两天更换一次培养液；
步骤4：hAESCs的冻存；待细胞长满后用胰酶消化，离心收集后置于冻存管中，放入冻存盒并置于-80度保存，12小时后转移到液氮。
在本发明的其中一个方面，上述制备方法的步骤1产妇的HIV、梅毒、甲肝、乙肝和丙肝等的血清学反应均为阴性。
在本发明的其中一个方面，上述制备方法的步骤1需将羊膜置于装有50ml培养液的锥形瓶中，4度条件下运输。
在本发明的其中一个方面，上述制备方法的步骤2中清洗液配方是加入双抗(青霉素跟链霉素)的PBS缓冲液，用清洗液漂洗整张羊膜3遍。
在本发明的其中一个方面，上述制备方法的步骤2中消化包括一次预消化：加入0.25％胰酶，37度水浴消化10分钟；正式消化：加入0.25％胰酶，37度水浴消化30分钟，期间每隔10分钟上下摇晃10次；终止消化：1:1等体积加入消化终止液。
在本发明的其中一个方面，上述制备方法的步骤2中离心收集细胞的条件为：室温下，离心转速1000rpm，离心10min后弃去上清。
本发明采取的技术方案之二为：人角膜基质细胞样细胞诱导分化方案，所述方法包括以下步骤：
步骤1：hAESCs的复苏；取出液氮中的细胞冻存管，快速置于37度水浴中化冻后离心。用羊膜培养液重悬后铺板。
步骤2：分化培养液的配制。
步骤3：诱导分化；弃去羊膜培养液，加入分化培养液诱导分化3-12天，每两天换一次液。
本发明采取的技术方案之三为：验证诱导分化细胞可以与天然的角膜基质良好地整合，所述方法包括以下步骤：
步骤1：取分化得到的人角膜基质细胞样细胞，加入0.25％胰蛋白酶消化成单细胞悬液，4度，1000rpm离心5分钟后弃去上清，用培养液重悬细胞。
步骤2：将细胞悬液加入提前放有脱细胞角膜的孔板中，置于37度、含5.5％ CO2的细胞培养箱中培养五天。
本发明采取的技术方案之四为：将分化得到的人角膜基质细胞样细胞与甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)混合，所述方法包括以下步骤：
步骤1：取分化得到的人角膜基质细胞样细胞，加入0.25％胰蛋白酶消化成单细胞悬液，4度，1000rpm离心5分钟后弃去上清，得到细胞沉淀；
步骤2：将细胞以105-109/ml的密度与GelMA预聚体混合，待用。
本发明采取的技术方案之五为：构建角膜损伤的兔子模型，所述方法包括以下步骤：
步骤1：实验动物的购买；实验动物为新西兰白兔，普通级，2.0-2.5kg，雄性，由杭州余杭科联提供。
步骤2：实验动物的饲养；单笼饲养。
步骤3：实验动物分组；共4组，分别为损伤不治疗组4只(Ctrl)，材料治疗组4只(GelMA)，未分化细胞+材料治疗组4只(hAESCs@Gel)，诱导分化细胞+材料治疗组6只(iCell@Gel)。
步骤4：建立新西兰兔角膜损伤模型；将兔子称重麻醉，眼周碘伏消毒后，用3mm角膜环钻，钻取眼角膜中央约1/3～1/2厚度，约150um厚度)，再用刀片刮去组织，用生理盐水冲洗伤口，即得到兔角膜缺损模型；
步骤5：细胞/材料移植；对于GelMA组，将预聚体溶液用注射器注入缺损部位，再用365nm波长的照射探头照射10秒使凝胶固化。对于hAESCs@Gel组，将hAESCs与预聚体混合物用注射器注入缺损部位，再行光固化。对于iCell@Gel组，将诱导分化后的细胞与预聚体混合物用注射器注入缺损部位，再行光固化。Ctrl组在角膜损伤后不予处理。
步骤6：术后护理；术后滴可乐必妥左氧氟沙星抗菌滴眼液，每天3次，共7天，同时关注新西兰兔状态，如进食体重等。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明首次成功将胎盘来源的hAESCs诱导分化成人角膜基质细胞样细胞，且本发明开发的分化体系中无动物血清、化学成分明确，与临床应用更贴近；
(2)本发明中分化得到的细胞与GelMA水凝胶支架结合后可以促进兔角膜损伤修复，并且抑制角膜纤维化形成，减轻角膜浑浊，具有临床转化前景。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1：hAESCs分化得到的人角膜基质细胞样细胞形态及标记物表达。分化第5天细胞明场形态图，高密度(A)和低密度形态(B)；(C-F)分化后角膜基质细胞特异性标记物Keratocan/Lumican/ALDH1A1的表达。
图2：分化后细胞表面HLA-DR和HLA-DQ的表达情况。(A)流式检测分化后细胞表面HLA-DR表达情况；(B)流式检测分化后细胞表面HLA-DQ表达情况。
图3：分化得到的人角膜基质细胞样细胞与脱细胞角膜的整合情况。(A)将细胞接种于脱细胞角膜的示意图，水平视野；(B)细胞接种24小时后，用活死染色试剂盒检测细胞的生长状态；(C)人角膜基质细胞样细胞与角膜基质整合示意图(垂直切面视野)；(D)对脱细胞角膜和接种细胞角膜分别进行细胞骨架染色。(E-F)接种5天后，检测角膜基质细胞特异性标记物的表达情况。白色箭头指的是迁移进入基质层的细胞。
图4:兔角膜损伤后不同时间点的愈合情况。(A)四个实验分组在不同时间点的角膜荧光素钠染色情况；(B-D)分别为第4、12、28天角膜荧光素钠染色统计；(E)术后第28天角膜裂隙灯照片；(F)角膜浑浊程度评分(评分越高，浑浊程度越严重)。#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。
图5:兔角膜损伤后基质纤维化程度。(A)不同组别的HE染色情况，字母E指示上皮，字母S指示基质；(B)不同组别的角膜马松染色情况。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验条件及方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
本发明的目的是开发一套无动物血清，且化学成分明确的分化体系，将胎盘来源的hAESCs诱导分化成人角膜基质细胞样细胞，解决构建组织工程化角膜过程中种子细胞不足的限制，并且在角膜损伤动物模型中进一步验证其对于角膜损伤相关疾病的治疗作用。
为达到上述目标，本发明采取的技术方案如下：
1.原代hAESCs的分离培养；
2.无血清、化学成分明确的分化体系的构建；
3.体外实验验证分化产生的细胞可以与角膜结构良好地整合；
4.在角膜损伤动物模型中进一步验证其治疗作用
实施例1hAESCs相关溶液的配制
1、hAESCs培养液的配制：在DMEM/F12培养基中加入15％(v/v)KSR，1×非必需氨基酸，1×L-谷氨酰胺，1×丙酮酸钠，1×双抗，临用前加入10ng/ml的EGF；
2、hAESCs冻存液：无血清细胞冻存液。
实施例2hAESCs的分离和冻存
1、人羊膜的获取：经剖腹产产妇授权同意后，取健康产妇(HIV、梅毒、甲肝、乙肝、丙肝等血清学反应均显示为阴性)剖腹产后的胎盘组织，十字切割胎盘，通过机械分离得到整张羊膜。将人羊膜置于装有50ml培养液的锥形瓶中，4度条件下运输至实验室；
2、hAESCs的分离：在1×PBS缓冲液中加入双抗，即得到漂洗液，用漂洗液漂洗羊膜3次，洗去其表面的血液及其他杂质。将羊膜剪碎成小块组织后，转移到50ml离心管中。加入提前温育好的15ml 0.25％胰酶，37度水浴10分钟，弃去消化液，将羊膜转移到另一新的50ml离心管中。在新的离心管中加入20ml 0.25％胰酶，37度水浴消化30分钟，期间每隔5分钟上下摇晃5次。然后用无血清消化终止液终止消化，放入离心机中，以1000rpm的速度离心10分钟，去上清，用4ml培养基重悬细胞。再加入16ml培养基混匀，分别过200目和400目细胞筛得到hAESCs细胞悬液；
3、hAESCs的培养：用细胞计数板进行计数后，将约1×107个细胞接种于15cm培养皿，置于37度，5.5％CO2细胞培养箱中，待细胞贴壁后换培养液。每两天更换一次培养液；
4、hAESCs的冻存：待细胞长满后，每15cm培养皿加入5ml 0.25％胰酶，置于37度消化约7分钟，待细胞变圆，晃动培养皿细胞呈流沙样脱落时即可加入无血清消化终止液。用移液器吹打成单细胞悬液后转移到离心管中。室温下1000rpm离心5分钟，弃上清。用冻存液重悬细胞后收集置于冻存管中，放入冻存盒并置于-80度保存，12小时后转移到液氮中冻存。
实施例3人角膜基质细胞样细胞诱导分化方案
1、诱导hAESCs向人角膜基质细胞样细胞分化组合物的制备：向含有1％ITS(Insulin-Transferrin-Selenium)，2mM L-谷氨酰胺(L-Glutamine)，1mM非必需氨基酸(non-essential amino acid)，1mM丙酮酸钠(sodium pyruvate)，100units/mlpenicillin，100ug/ml streptomycin的DMEM/F12 1:1(1X)培养基中加入终浓度为0.01-5mM L-Ascorbic Acid 2-phosphate(CAS号113170-55-1)、1-40ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(FGF-basic)、0.05-20uM视黄酸(Retinoic acid，CAS号302-79-4)，即得到hAESCs向人角膜基质细胞分化组合物。
2、诱导hAESCs向人角膜基质细胞分化的方法：取P0或者P1 hAESCs，按照5×107个细胞/孔的数量接种于12孔板内。24小时后弃去上清，每孔添加1ml诱导组合物，置于37度含5.5％ CO2的细胞培养箱中。隔天换液，培养3-12天。
实施例4细胞免疫荧光
1、细胞固定：从细胞培养箱中取出细胞后，弃去上清。每孔加入1×PSB缓冲液1ml洗涤细胞，洗2次。然后每孔加入4％PFA固定液1ml，室温固定15分钟；
2、细胞清洗：弃去固定液，每孔加入1×PSB缓冲液1ml，洗涤细胞3次，每次5分钟；
3、细胞透化：每孔加入含0.25％ Triton X-100的1×PSB缓冲液1ml，室温透化5-10分钟；
4、细胞清洗：弃去透化液，每孔加入1×PSB缓冲液1ml，洗涤细胞3次，每次5分钟；
5、封闭：每孔加入1ml封闭液(封闭液配方：850ul PBS+100ul10％BSA+50ul HBS)，室温封闭1小时；
6、一抗孵育：将抗体以1:50-1:200的比例稀释于封闭液中，4度孵育过夜；
7、细胞清洗：弃去一抗稀释液，每孔加入1×PSB缓冲液1ml，洗涤细胞3次，每次5分钟；
8、二抗孵育：将荧光二抗以1:200-1:500的比例稀释于1×PSB缓冲液中，每孔加入1ml，室温避光孵育1小时；
9、细胞清洗：弃去二抗稀释液，每孔加入1×PSB缓冲液1ml，洗涤细胞3次，每次10分钟；
10、DAPI染色：将DAPI染色液以1:300的比例稀释于1×PSB缓冲液中，每孔加入1ml，室温孵育10分钟；
11、细胞清洗：弃去DAPI染色液，每孔加入1×PSB缓冲液1ml，洗涤细胞3次，每次5分钟；
12、封片：从12孔板中取出爬片，用无尘纸吸去多余水份。在载玻片上加入封片液，将爬片上细胞生长一侧倒扣在载玻片上。
13、观察拍照：在荧光显微镜下观察并拍照记录；
图示(图1)结果显示分化后的人角膜基质细胞样细胞形态呈伸展样，并且角膜基质细胞特异性标记物Keratocan、Lumican、ALDH1A1及COL1A1的免疫荧光结果显示其阳性率较高。因此，可以说明分化得到的细胞从形态到蛋白表达皆符合人角膜基质细胞的基本特征。
实施例5流式细胞术鉴定细胞表面标记物
1、清洗缓冲液的配制：含2％FBS的1×PBS溶液。
2、取分化后的人角膜基质细胞样细胞，加入0.25％胰蛋白酶消化成单细胞悬液，4度，1000rpm离心5分钟后弃去上清，用1ml PBS重悬细胞，平均分成四份装于1.5ml离心管中，4度，1000rpm离心3分钟后弃上清。
3、加入800ul清洗缓冲液重悬细胞，4度1000rpm离心3分钟后弃上清。重复此步骤2次。
4、向细胞中加入50ul清洗缓冲液，每管中加入5ul HLA-DQ同型、HLA-DQ、HLA-DR同型、HLA-DR抗体，混匀后避光4度放置30分钟；
5、4度1000rpm离心3分钟后弃上清，加入800ul清洗缓冲液重悬细胞。重复两次。
6、每管加入500ul 4％PFA固定液，避光4度过夜固定。
7、取出后4度1000rpm离心3分钟后弃上清，加入800ul清洗缓冲液重悬细胞，重复两次。
8、加入500ul清洗缓冲液重悬细胞，移入流式管中上机检测。
图示(图2)显示从hAESCs分化得到的人角膜基质细胞样细胞，HLA-DR/HLA-DQ均为阴性，表明细胞分化后MHC-II抗原低表达，保持着低免疫原性，有利于细胞的体内移植。
实施例6脱细胞角膜的获取
1、将角膜移植后剩余的角-巩膜缘组织，用含1％双抗的无菌PBS缓冲液漂洗3次。
2、在15ml离心管中加入1.5M氯化钠溶液，将清洗后的组织置入离心管中，在4度环境下，以300rpm的速度震荡摇晃过夜。
3、取出组织，用双蒸水漂洗后冻于-80度冰箱备用。
实施例7将分化得到的人角膜基质细胞样细胞接种于脱细胞角膜上
1、细胞培养液的配制：向含有1％ITS，2mM L-谷氨酰胺，1mM非必需氨基酸，1mM丙酮酸钠，100units/ml penicillin，100ug/ml streptomycin的DMEM/F12 1:1(1X)培养基中加入浓度为0.01-5mM的L-Ascorbic Acid2-phosphate和终浓度为1-40ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子。
2、将冻存于-80度的角巩膜缘组织取出，待恢复至室温后放置于12孔板中待用。
3、取分化得到的人角膜基质细胞样细胞，加入0.25％胰蛋白酶消化成单细胞悬液，4度，1000rpm离心5分钟后弃去上清，用2ml培养液重悬细胞，调整细胞密度为1×105/ml,将细胞悬液加入提前放有脱细胞角膜的12孔板中，置于37度、含5.5％ CO2的细胞培养箱中培养五天。
实施例8角膜组织冰冻切片
1、组织的固定：用1×PSB缓冲液漂洗角膜组织1次，然后将其置于4％PFA溶液中固定过夜；
2、组织脱水：将固定好的角膜组织依次放入10％蔗糖溶液中2小时，20％蔗糖溶液中2小时，最后置于30％蔗糖溶液中过夜。整个脱水过程的温度维持在4度环境。
3、组织包埋：将组织包埋于冰冻切片包埋剂中，-80度条件保存。
4、组织切片：调整冰冻切片机使刀片与组织块的距离和角度合适。先将切片厚度调到50um，切到样品后将切片厚度调到7um，继续切片。切片保存于-80度冰箱中。
实施例9冰冻切片荧光染色
1、将切片从-80度环境中取出后，室温放置半小时。
2、用1×PSB缓冲液浸洗切片3次，每次5分钟。
3、切片透化：将含0.25％ Triton X-100的1×PSB缓冲液滴在切片上，室温透化5分钟。
4、弃去透化液，用1×PSB缓冲液浸洗3次，每次5分钟。
5、封闭：将封闭液(封闭液配方：850ul PBS+100ul 10％BSA+50ul HBS)滴在切片上，室温封闭1小时。
6、一抗孵育：在组织周围用油性笔画圈，然后在组织上滴加一抗浸泡组织(一抗用封闭液按照1：200比例进行稀释)，4度孵育过夜。
7、弃去一抗稀释液，用1×PSB缓冲液浸洗3次，每次5分钟。
8、二抗孵育：将荧光二抗以1:200-1:500的比例稀释于1×PSB缓冲液中，在组织上滴加二抗，室温避光孵育1小时；
9、弃去荧光二抗稀释液，用1×PSB缓冲液浸洗3次，每次10分钟。
10、DAPI染细胞核：将DAPI染色液以1:300的比例稀释于1×PSB缓冲液中，滴加在组织上，室温孵育10分钟；
11、弃去DAPI染色液，用1×PSB缓冲液浸洗涤3次，每次5分钟。
12、封片液封片，在荧光显微镜下观察并拍照记录。
图示(图3)显示分化得到的人角膜基质细胞样细胞在脱细胞角膜上，具有良好的生长状态。并且细胞可以迁移到基质中去，与天然角膜基质骨架良好地整合。同时免疫荧光结果显示，接种的细胞仍能维持基质细胞特异性标记物的表达。
实施例10将分化得到的细胞与甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)混合
1、取分化得到的细胞，加入0.25％胰蛋白酶消化成单细胞悬液，4度，1000rpm离心5分钟后弃去上清，得到细胞沉淀；
2、以15％质量体积比的浓度将GelMA粉末溶解于无菌PBS溶液中，并加入0.02％的光引发剂，在避光条件下，37度搅拌溶解；
2、将细胞以105-109/ml的密度与GelMA预聚体混合，37度避光待用。
实施例11构建新西兰兔角膜损伤模型
1、实验动物的购买和饲养
新西兰白兔，普通级，2.0-2.5kg，雄性，动物由杭州余杭科联提供。单笼饲养，在浙江省实验动物中心饲养，空调控制室温23-26摄氏度之间，相对湿度55±10％以内，照明12小时昼夜周期实施，摄食及饮水自由摄取。
2、实验药品
(1)兽用戊巴比妥钠苏州坤宸生物科技有限公司
(2)盐酸丙美卡因滴眼液南京瑞年百思特制药有限公司
(3)可乐必妥滴眼液参天制药(中国)有限公司
3、实验动物分组
共4组，分别为损伤不治疗组4只(Ctrl)，材料治疗组4只(GelMA)，未分化细胞+材料治疗组4只(hAESCs@Gel)，诱导分化细胞+材料治疗组6只(iCell@Gel)。
4、角膜损伤模型手术
术前将新西兰兔置于固定架中，拔去耳缘静脉周围毛发，并用碘伏消毒穿刺区域。通过耳缘静脉注射3％戊巴比妥钠溶液，剂量为30mg/kg，缓慢推注。动物进入麻醉状态后，将动物进行仰卧位固定于手术台上，进行必要的生命体征监护。用碘伏消毒兔子术眼的眼周区域，然后铺上眼科洞巾，再用盐酸丙美卡因滴眼液进行局部麻醉；使用眼睑撑开器撑开眼睑，用3mm角膜环钻，钻取术眼角膜中央约1/3～1/2厚度，约150um厚度)，再用刀片刮去组织，用生理盐水冲洗伤口，即得到兔角膜缺损模型；
5、细胞/材料移植
对于GelMA组，将预聚体溶液用注射器注入缺损部位，再用365nm波长的照射探头照射10秒使凝胶固化。对于hAESCs@Gel组，将hAESCs与预聚体混合物用注射器注入缺损部位，再行光固化。对于iCell@Gel组，将诱导分化后的细胞与预聚体混合物用注射器注入缺损部位，再行光固化。Ctrl组在角膜损伤后不予处理。
6、术后护理
麻醉和苏醒期应注意对动物进行保温，麻醉结束后，应将动物安置在安静、干净的环境中等待动物苏醒。术后滴可乐必妥左氧氟沙星抗菌滴眼液，每天3次，共7天，同时关注新西兰兔状态，如进食体重等；
实施例12兔角膜损伤修复的裂隙灯观察
在术日当天以及术后第4、12、28天，用角膜荧光素钠染色试纸进行角膜损伤的评估，并用裂隙灯拍照记录，进行统计。
图示(图4)显示，iCell@Gel组角膜损伤的愈合速度相对最快，且角膜浑浊程度评分最低，表明分化得到的人角膜基质细胞样细胞可以促进角膜损伤的有序修复。
实施例13兔角膜损伤修复的病理学检测
1、收集兔子的角膜组织
术后第28天，耳缘静脉注射过量戊巴比妥钠使兔子安乐死，使用开睑器暴露眼球，利用组织剪剪取角膜，置于福尔马林溶液中固定过夜。
2、角膜组织病理学染色
2.1脱水及透蜡：
脱水：装有兔角膜的包埋盒依次通过70％、80％、90％乙醇脱水缸，分别浸没15min，两个95％乙醇脱水缸，分别浸没30min，最后在两个100％乙醇脱水缸，分别浸没30min；
透明：装有兔角膜的包埋盒依次放入50％二甲苯，浸没60分钟，50％酒精，浸没60min，两个二甲苯脱水缸中浸没60min；
透腊：通过两个装有纯蜡的脱水缸中，浸没60min。
2.2石蜡包埋
2.3石蜡切片：
先将蜡块固定在切片机的卡槽中，修片切去多余蜡块。切到角膜面时，调整切片厚度为4um，收集切片于展片仪中，进行贴片和烘片。
2.4石蜡切片HE染色
根据苏木素伊红(HE)染色试剂盒(碧云天)的说明书步骤进行HE染色，并用光学显微镜拍照记录。
2.5石蜡切片马松染色
根据Masson三色染色试剂盒(索莱宝)的说明书步骤进行马松染色，并用光学显微镜拍照记录。
图示(图5)显示，iCell@Gel组角膜基质纤维化程度最轻，表明分化得到的人角膜基质细胞样细胞可以抑制纤维化形成，促进更好的视觉质量。
本发明体外诱导人羊膜上皮干细胞向人角膜基质细胞分化的方法，诱导产生的人角膜基质细胞样细胞高表达经典的角膜基质细胞标记物；另外，用组合物诱导分化后其HLA-DR和HLA-DQ抗原的表达仍然维持较低水平，表示该细胞经过分化后仍具有很低的免疫原性，适合作为移植物进行细胞治疗。将分化后的细胞接种于脱细胞角膜上培养，组织切片染色显示，分化后的细胞可以良好地整合到天然的角膜基质结构中，并且可以维持角膜基质细胞标记物的表达。进一步地，我们在角膜损伤动物模型中验证了分化后的细胞具有促进损伤愈合以及抑制纤维化形成的作用，表明其具有良好的临床转化前景。
Claims (9)
1.一种诱导人羊膜上皮干细胞向人角膜基质细胞分化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)分离人羊膜上皮干细胞，贴壁培养；
(2)将细胞培养液换为诱导组合物继续培养，诱导人羊膜上皮干细胞分化为人角膜基质细胞；
其中，所述的诱导组合物为含有0.01-5mM抗坏血酸或抗坏血酸的衍生物、1-40ng/ml碱性成纤维细胞生长因子以及0.05-20uM视黄酸的细胞培养基。
2.根据权利要求1所述的诱导人羊膜上皮干细胞向人角膜基质细胞分化的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述人羊膜上皮干细胞为小于P2代次的人羊膜上皮干细胞。
3.根据权利要求1所述的诱导人羊膜上皮干细胞向人角膜基质细胞分化的方法，其特征在于：步骤(1)中，贴壁培养24-48小时。
4.根据权利要求1所述的诱导人羊膜上皮干细胞向人角膜基质细胞分化的方法，其特征在于：步骤(2)中，换为诱导组合物继续培养3-12天。
5.根据权利要求1所述的诱导人羊膜上皮干细胞向人角膜基质细胞分化的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的诱导组合物为含有0.01-5mM抗坏血酸或抗坏血酸的衍生物、1-40ng/ml碱性成纤维细胞生长因子以及0.05-20uM视黄酸的细胞培养基。
6.根据权利要求1所述的诱导人羊膜上皮干细胞向人角膜基质细胞分化的方法，其特征在于：步骤(1)中，分离人羊膜上皮干细胞，具体包括
将羊膜清洗干净后，依次经过酶消化、离心步骤，得到人羊膜上皮干细胞。
7.根据权利要求1～6任一项所述的方法得到的人角膜基质细胞。
8.根据权利要求7所述的人角膜基质细胞或其细胞制剂在制备治疗和/或改善角膜损伤性疾病的药物中的用途。
9.一种细胞制剂，其特征在于，包括权利要求7所述的人角膜基质细胞以及药学可接受的各类载体。
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