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CN116410314A - 一种新型pdl1单域抗体的开发 - Google Patents

一种新型pdl1单域抗体的开发 Download PDF

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CN116410314A
CN116410314A CN202111672054.9A CN202111672054A CN116410314A CN 116410314 A CN116410314 A CN 116410314A CN 202111672054 A CN202111672054 A CN 202111672054A CN 116410314 A CN116410314 A CN 116410314A
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CN
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seq
pdl1
nanobody
present
antibody
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CN202111672054.9A
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杨林
游凤涛
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Original Assignee
Persongen Biotherapeutics Suzhou Co ltd
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Abstract

本发明提供了一种针对PDL1的纳米抗体及其应用。具体地，本发明提供了一种抗针对PDL1的纳米抗体及其序列。本发明还提供了编码上述纳米抗体、相应的表达载体和能够表达该纳米抗体的宿主细胞，以及本发明纳米抗体的生产方法。本发明纳米抗体能够特异性结合人PDL1，且亲和力高；本发明纳米抗体具有良好的PD‑1/PDL1阻断活性；本发明纳米抗体能只阻断PD‑1和PDL1通路，并不影响PD‑1和PD‑L2通路通路，从而能够避免间质性肺炎等副作用的发生，提高了安全性；本发明纳米抗体可更全面激活免疫系统杀伤肿瘤，对于PD‑1无效或PD‑1耐药的患者仍能取得疗效；本发明的PDL1纳米抗体除了可以抑制PD‑1‑PDL1通路外，还可以通过阻断B7.1和PDL1的共抑制功能，有利于全面激活T细胞功能和细胞因子产生，从而取得更好的免疫效果。

Description

一种新型PDL1单域抗体的开发
技术领域
本发明属于生物医学或生物制药技术领域，具体涉及一种特异性靶向PDL1的单域抗体及其应用。
背景技术
PD-1/PDL1免疫疗法(Immunotherapy)是最成功的肿瘤免疫疗法之一，正掀起肿瘤治疗的革命，引领癌症治疗的变革。免疫检查点抑制剂旨在充分利用人体自身的免疫系统抵御、抗击癌症，通过阻断PD-1/PDL1信号通路使癌细胞死亡，具有治疗多种类型肿瘤的潜力，实质性的改善了晚期肿瘤患者的生存期，成为肿瘤患者的“特效”药物。
目前，国内外已有多款PD-1抗体及PD-1抑制剂上市，与PD-1抗体类似，PDL1可以阻断PDL1与T细胞表面的PD-1结合介导的免疫抑制，重新激发T细胞识别杀伤肿瘤细胞，从而抑制肿瘤生长。与PD-1单抗不同的是，它与肿瘤细胞或肿瘤浸润免疫细胞上表达的PDL1结合，而PD-1单抗则与PD-1结合。
然而，目前的PD-1抗体的局限性在于：(1)PD-1抗体除了阻断PD-1和PDL1通路，还可能影响到PD-1和PD-L2通路，可能导致间质性肺炎等副作用的发生；(2)部分患者存在PD-1单抗治疗无效或PD-1耐药的情况，对此类患者而言他们需要可替代使用的药物；(3)PD-1抗体的有效率与安全性还有待提升。
因此，本领域迫切需要开发一种新型的能取得更好疗效、适应范围更广以及安全性更好的抑制PD-1/PDL1信号通路的药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种针对PDL1的纳米抗体及其应用。
在本发明的第一方面，提供了一种针对PDL1的纳米抗体。
在另一优选例中，所述针对PDL1的纳米抗体能够特异性结合PDL1。
在另一优选例中，所述针对PDL1的纳米抗体的互补决定区CDR为选自下组的一种或多种：
(1)SEQ ID NO:7所示的CDR1、SEQ ID NO:8所示的CDR2、和SEQ ID NO:9所示的CDR3；
(2)SEQ ID NO:10所示的CDR1、SEQ ID NO:11所示的CDR2、和SEQ ID NO:12所示的CDR3；
(3)SEQ ID NO:10所示的CDR1、SEQ ID NO:13所示的CDR2、和SEQ ID NO:14所示的CDR3；
(4)SEQ ID NO:10所示的CDR1、SEQ ID NO:13所示的CDR2、和SEQ ID NO:15所示的CDR3；
(5)SEQ ID NO:7所示的CDR1、SEQ ID NO:16所示的CDR2、和SEQ ID NO:17所示的CDR3；
(6)SEQ ID NO:18所示的CDR1、SEQ ID NO:19所示的CDR2、和SEQ ID NO:20所示的CDR3。
在另一优选例中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)氨基酸并能保留与PDL1特异性结合能力的衍生序列。
在另一优选例中，所述的经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留与PDL1特异性结合能力的衍生序列为同源性或序列相同性为至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的CDR1、CDR2和CDR3由VHH链的骨架区FR1、FR2、FR3和FR4所隔开。
在另一优选例中，所述针对PDL1的纳米抗体还包括骨架区FR。
在另一优选例中，所述骨架区FR衍生自如SEQ ID NO:1-6所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的骨架区FR为选自下组的一种或多种：
(1)SEQ ID NO:21所示的FR1、SEQ ID NO:22所示的FR2、SEQ ID NO:23所示的FR3、和SEQ ID NO:24所示的FR4；
(2)SEQ ID NO:25所示的FR1、SEQ ID NO:26所示的FR2、SEQ ID NO:27所示的FR3、和SEQ ID NO:24所示的FR4；
(3)SEQ ID NO:28所示的FR1、SEQ ID NO:29所示的FR2、SEQ ID NO:30所示的FR3、和SEQ ID NO:24所示的FR4；
(4)SEQ ID NO:31所示的FR1、SEQ ID NO:29所示的FR2、SEQ ID NO:32所示的FR3、和SEQ ID NO:24所示的FR4；
(5)SEQ ID NO:33所示的FR1、SEQ ID NO:22所示的FR2、SEQ ID NO:34所示的FR3、和SEQ ID NO:24所示的FR4；
(6)SEQ ID NO:35所示的FR1、SEQ ID NO:36所示的FR2、SEQ ID NO:37所示的FR3、和SEQ ID NO:24所示的FR4。
在另一优选例中，所述的针对PDL1的纳米抗体的VHH链的氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6，或其组合。
在另一优选例中，所述的针对PDL1的纳米抗体包括人源化抗体、骆驼源抗体、嵌合抗体。
在另一优选例中，所述的针对PDL1的纳米抗体为美洲无峰驼源抗体。
在本发明的第二方面，提供一种针对PDL1的抗体，所述抗体包括一个或多个如本发明第一方面所述的针对PDL1的纳米抗体的VHH链。
在另一优选例中，所述的针对PDL1的纳米抗体的VHH链的氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6，或其组合。
在另一优选例中，所述的针对PDL1的抗体，可以为单体、二价抗体、和/或多价抗体。
在另一优选例中，所述的针对PDL1的抗体为二价抗体。
在本发明的第三方面，提供一种嵌合抗原受体CAR，所述CAR含有一胞外结构域，所述胞外结构域包含如本发明的第一方面所述的针对PDL1的纳米抗体，或如本发明的第二方面所述的针对PDL1的抗体。
在另一优选例中，所述胞外结构域还包括信号肽。
在另一优选例中，所述胞外结构域还包括其他的外源蛋白。
在另一优选例中，所述胞外结构域含有的抗体具有SEQ ID NO:1-6所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述胞外结构域含有的抗体其氨基酸序列与SEQ ID NO:7-17的同源性≥85％，较佳地≥90％，更佳地≥95％，或与SEQ ID NO:1-6相比具有1、2或3个氨基酸的差异。
在另一优选例中，所述的CAR具有式Ia所示结构：
L1-Nb-H-TM-C-CD3ζ (Ia)
式中，
L为无或信号肽序列；
Nb是特异性结合结构域；
H为无或铰链区；
TM为跨膜结构域；
C为共刺激信号结构域；
CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列(包括野生型、或其突变体/修饰体)；
所述“-”连接肽或肽键。
在另一优选例中，所述L分别选自下组蛋白的信号肽：CD8、GM-CSF、CD4、CD28、CD137，或其突变/修饰体，或其组合。
在另一优选例中，所述Nb靶向PDL1。
在另一优选例中，所述Nb为PDL1纳米抗体。
在另一优选例中，所述H选自下组蛋白的铰链区：CD8、CD28、CD137、IgG，或其组合。
在另一优选例中，所述H为human IgG1 Fc铰链区。
在另一优选例中，所述TM选自下组蛋白的跨膜区：CD28、CD3 epsilon、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、CD278、CD152、CD279、CD233，或其突变/修饰体，或其组合。
在另一优选例中，所述C选自下组蛋白的共刺激结构域：OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD70、CD134、4-1BB(CD137)、PD-1、Dap10、LIGHT、NKG2C、B7-H3、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、NKG2D、GITR、OX40L、2B4、TLR，或其突变/修饰体，或其组合。
在本发明的第四方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：
(i)如本发明的第一方面所述的针对PDL1的纳米抗体，或如本发明的第二方面所述的针对PDL1的抗体，或如本发明第三方面所述的嵌合抗原受体；和
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
在另一优选例中，所述的标签序列包括Fc标签、HA标签、GGGS序列、FLAG标签、Myc标签、6His标签，或其组合。
在另一优选例中，所述的重组蛋白特异性结合PDL1。
在另一优选例中，所述的重组蛋白(或多肽)包括融合蛋白。
在另一优选例中，所述的重组蛋白为单体、二聚体，或多聚体。
在另一优选例中，所述的重组蛋白特异性结合PDL1。
在另一优选例中，所述的标签序列是Fc标签。
在本发明的第五方面，提供一种多核苷酸，所述多核苷酸编码选自下组的蛋白质：如本发明第一方面所述的针对PDL1的纳米抗体，或本发明第二方面所述的针对PDL1的抗体，或如本发明第三方面所述的嵌合抗原受体，或如本发明第四方面所述的重组蛋白。
在另一优选例中，所述多核苷酸编码选自下组的蛋白质：如本发明第一方面所述的针对PDL1的纳米抗体，或本发明第二方面所述的针对PDL1的抗体。
在另一优选例中，本发明涉及编码本发明的针对PDL1的纳米抗体的核酸分子。本发明的核酸可为RNA、DNA或cDNA。
在本发明的第六方面，提供一种表达载体，所述表达载体含有本发明的第五方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的表达载体选自下组：DNA、RNA、病毒载体、质粒、转座子、其他基因转移系统、或其组合。优选地，所述表达载体包括病毒载体，如慢病毒、腺病毒、AAV病毒、逆转录病毒、或其组合。
在另一优选例中，所述的表达载体选自下组：pTomo慢病毒载体、plenti、pLVTH、pLJM1、pHCMV、pLBS.CAG、pHR、pLV等。
在另一优选例中，所述的表达载体是pcDNA3.4-hIgG1-Fc2载体。
在另一优选例中，所述的表达载体中还包括选自下组的：启动子、转录增强元件WPRE、长末端重复序列LTR等。
在本发明的第七方面，提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明的第六方面所述的表达载体，或其基因组中整合有本发明的第五方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。
在另一优选例中，所述的宿主细胞选自下组：大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞。
在另一优选例中，所述的宿主细胞为293F细胞。
在本发明的第八方面，提供一种工程化免疫细胞，所述工程化免疫细胞含有本发明的第六方面所述的表达载体或染色体中整合有外源的本发明的第五方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述工程化免疫细胞选自下组：
(i)嵌合抗原受体αβT细胞(CAR-T细胞)；
(ii)嵌合抗原受体γδT细胞(CAR-T细胞)；
(iii)嵌合抗原受体NKT细胞(CAR-NKT细胞)；
(iv)嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK细胞)。
在另一优选例中，所述工程化免疫细胞包括自体或异体的αβT细胞、γδT细胞、NKT细胞、NK细胞，或其组合。
在另一优选例中，所述工程化免疫细胞为CAR-T细胞。
在本发明的第九方面，提供一种产生针对PDL1的纳米抗体的方法，包括步骤：
(a)在适合产生纳米抗体的条件下，培养如本发明的第七方面所述的宿主细胞，从而获得含针对PDL1的纳米抗体的培养物；
(b)从所述培养物中分离和/或回收所述的针对PDL1的纳米抗体；和
(c)任选地，对步骤(b)获得的针对PDL1的纳米抗体进行纯化和/或修饰。
在本发明的第十方面，提供一种制备如本发明第八方面所述的工程化免疫细胞的方法，包括以下步骤：将如本发明的第五方面所述的多核苷酸或如本发明的第六方面所述的表达载体转导入免疫细胞内，从而获得所述工程化免疫细胞。
在另一优选例中，所述的方法还包括对获得的工程化免疫细胞进行功能和有效性检测的步骤。
在本发明的第十一方面，提供一种免疫偶联物，所述免疫偶联物含有：
(a)如本发明第一方面所述的针对PDL1的纳米抗体，或如本发明第二方面所述的针对PDL1的抗体，或如本发明第四方面所述的重组蛋白；和
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、细胞因子、放射性核素、酶、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、病毒外壳蛋白或VLP，或其组合。
在另一优选例中，所述的(a)部分为如本发明第一方面所述的针对PDL1的纳米抗体，或如本发明第二方面所述的针对PDL1的抗体。
在另一优选例中，所述的(a)部分与所述的偶联部分通过化学键或接头进行偶联。
在另一优选例中，所述的放射性核素包括：
(i)诊断用同位素，所述的诊断用同位素选自下组：Tc-99m、Ga-68、F-18、I-123、I-125、I-131、In-111、Ga-67、Cu-64、Zr-89、C-11、Lu-177、Re-188，或其组合；和/或
(ii)治疗用同位素，所述的治疗用同位素选自下组：Lu-177、Y-90、Ac-225、As-211、Bi-212、Bi-213、Cs-137、Cr-51、Co-60、Dy-165、Er-169、Fm-255、Au-198、Ho-166、I-125、I-131、Ir-192、Fe-59、Pb-212、Mo-99、Pd-103、P-32、K-42、Re-186、Re-188、Sm-153、Ra223、Ru-106、Na24、Sr89、Tb-149、Th-227、Xe-133、Yb-169、Yb-177，或其组合。
在另一优选例中，所述偶联部分为药物或毒素。
在另一优选例中，所述的药物为靶向治疗PDL1高表达疾病的药物。
在另一优选例中，所述PDL1高表达疾病选自：胃癌、肺癌、肝癌、骨肉瘤、乳腺癌、胰腺癌、淋巴瘤等。
在另一优选例中，所述的药物为细胞毒性药物。
在另一优选例中，所述的细胞毒性药物选自下组：抗微管蛋白药物、DNA小沟结合试剂、DNA复制抑制剂、烷化试剂、抗生素、叶酸拮抗物、抗代谢药物、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱，或其组合。
特别有用的细胞毒性药物类的例子包括，例如，DNA小沟结合试剂、DNA烷基化试剂、和微管蛋白抑制剂、典型的细胞毒性药物包括、例如奥瑞他汀(Auristatins)、喜树碱(Camptothecins)、多卡霉素/倍癌霉素(Duocarmycins)、依托泊甙(Etoposides)、美登木素(Maytansines)和美登素类化合物(Maytansinoids)(例如DM1和DM4)、紫杉烷(Taxanes)、苯二氮卓类(Benzodiazepines)或者含有苯二氮卓的药物(Benzodiazepine containingdrugs)(例如吡咯并[1,4]苯二氮卓类(PBDs)，吲哚啉苯并二氮卓类(Indolinobenzodiazepines)和噁唑烷并苯并二氮卓类(Oxazolidinobenzodiazepines))、长春花生物碱(Vinca alkaloids)，或其组合。
在另一优选例中，所述的毒素选自下组：耳他汀类(例如，耳他汀E、耳他汀F、MMAE和MMAF)、金霉素、类美坦西醇、篦麻毒素、篦麻毒素A-链、考布他汀、多卡米星、多拉司他汀、阿霉素、柔红霉素、紫杉醇、顺铂、cc1065、溴化乙锭、丝裂霉素、依托泊甙、替诺泊甙(Tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙素、二羟基炭疽菌素二酮、放线菌素、白喉毒素、假单胞菌外毒素(PE)A、PE40、相思豆毒素、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-八叠球菌、白树毒素、迈托毒素(Mitogellin)、局限曲菌素(Retstrictocin)、酚霉素、依诺霉素、麻疯树毒蛋白(Curicin)、巴豆毒素、卡奇霉素、肥皂草(Sapaonaria officinalis)抑制剂、糖皮质激素，或其组合。
在另一优选例中，所述偶联部分为可检测标记物。
在另一优选例中，所述偶联部分选自下组：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂，或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2等)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))或任何形式的纳米颗粒。
在另一优选例中，所述免疫偶联物含有：多价(如二价)的如本发明的第一方面所述的针对PDL1的纳米抗体的VHH链。
在另一优选例中，所述多价是指在所述免疫偶联物的氨基酸序列中包含多个重复的相同或不同的如本发明的第一方面所述针对PDL1的纳米抗体VHH链。
在本发明的第十二方面，提供一种活性成分的用途，所述活性成分选自下组：如本发明的第一方面所述的针对PDL1的纳米抗体，或如本发明的第二方面所述的针对PDL1的抗体，或如本发明第三方面所述的嵌合抗原受体，或如本发明第四方面所述的重组蛋白，或如本发明第八方面所述的工程化免疫细胞，或如本发明第十一方面所述的免疫偶联物，或其组合，所述活性成分被用于制备：
(a)预防和/或治疗PDL1高表达疾病的药物；
(b)检测PDL1高表达疾病的试剂。
在另一优选例中，所示试剂为诊断试剂，较佳地，所述的诊断试剂为检测片或检测板。
在另一优选例中，所述诊断试剂用于：检测样品中的PDL1蛋白或其片段。
在在另一优选例中，所述PDL1高表达疾病选自：胃癌、肺癌、肝癌、骨肉瘤、乳腺癌、胰腺癌、淋巴瘤等。
在本发明的第十三方面，提供了一种体外检测样品中PDL1蛋白或其片段的方法，所述方法包括步骤：
(1)在体外，将所述样品与如本发明的第一方面所述的针对PDL1的纳米抗体，或如本发明的第二方面所述的针对PDL1的抗体，或如本发明第三方面所述的嵌合抗原受体，或如本发明第四方面所述的重组蛋白，或如本发明第八方面所述的工程化免疫细胞，或如本发明第十一方面所述的免疫偶联物，或其组合接触；
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在PDL1蛋白或其片段。
在另一优选例中，所述的检测包括诊断性的或非诊断性的。
在本发明的第十四方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有：
(i)如本发明的第一方面所述的针对PDL1的纳米抗体，或如本发明的第二方面所述的针对PDL1的抗体，或如本发明第三方面所述的嵌合抗原受体，或如本发明第四方面所述的重组蛋白，或如本发明第八方面所述的工程化免疫细胞，或如本发明第十一方面所述的免疫偶联物，或其组合作为活性成分；和
(ii)药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在另一优选例中，所述药物组合物的剂型选自下组：注射剂、冻干剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物包括0.01～99.99％的如本发明的第一方面所述的针对PDL1的纳米抗体，或如本发明的第二方面所述的针对PDL1的抗体，或如本发明第三方面所述的嵌合抗原受体，或如本发明第四方面所述的重组蛋白，或如本发明第十一方面所述的免疫偶联物，或其组合和0.01～99.99％的药用载体，所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。
在另一优选例中，所述活性成分中所述工程化的免疫细胞的浓度为1×103-1×108个细胞/mL，较佳地1×104-1×107个细胞/mL。
本发明的第十五方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包括：
(1)第一容器，所述第一容器中含有如本发明的第一方面所述的针对PDL1的纳米抗体，或如本发明的第二方面所述的针对PDL1的抗体，或如本发明第三方面所述的嵌合抗原受体，或如本发明第四方面所述的重组蛋白，或如本发明第八方面所述的工程化免疫细胞，或如本发明第十一方面所述的免疫偶联物，或其组合；和/或
(2)第二容器，所述第二容器中含有抗所述第一容器内容物的二抗；
或者，
所述试剂盒含有一检测板，所述检测板包括：基片(支撑板)和测试条，所述的测试条含有如本发明的第一方面所述的针对PDL1的纳米抗体、如本发明的第二方面所述的针对PDL1的抗体，或如本发明第三方面所述的重组蛋白，或如本发明第八方面所述的免疫偶联物，或其组合。
在另一优选例中，所述试剂盒中还含有一说明书，根据所述的说明书记载，所述的试剂盒用于非侵入性地检测待测对象的PDL1的表达。
在另一优选例中，所述的试剂盒用于PDL1高表达疾病的检测。
在另一优选例中，所述PDL1高表达疾病选自：胃癌、肺癌、肝癌、骨肉瘤、乳腺癌、胰腺癌、淋巴瘤等。
在本发明的第十六方面，提供了一种预防和/或治疗PDL1高表达疾病的方法，所述方法包括：给需要的对象施用如本发明的第一方面所述的针对PDL1的纳米抗体，或如本发明的第二方面所述的针对PDL1的抗体，或如本发明第三方面所述的嵌合抗原受体，或如本发明第四方面所述的重组蛋白，或如本发明第八方面所述的工程化免疫细胞，或如本发明第十一方面所述的免疫偶联物，或如本发明的第十四方面所述的药物组合物，或其组合。
在另一优选例中，所述对象包括哺乳动物，如人。
在另一优选例中，所述PDL1高表达疾病选自：胃癌、肺癌、肝癌、骨肉瘤、乳腺癌、胰腺癌、淋巴瘤等。
在另一优选例中，所述的工程化免疫细胞或药物组合物中所包含的CAR免疫细胞是来源于所述对象的细胞(自体细胞)。
在另一优选例中，所述的工程化免疫细胞或药物组合物中所包含的CAR免疫细胞是来源于健康个体的细胞(异体细胞)。
在另一优选例中，所述的方法可与其他治疗方法联合使用。
在另一优选例中，所述的其他治疗方法包括化疗、放疗、靶向治疗等方法。
在本发明的第十七方面，提供了一种针对PDL1高表达疾病的诊断方法，包括步骤：
(i)从诊断对象获取一样品，将所述的样品与如本发明的第一方面所述的针对PDL1的纳米抗体，或如本发明的第二方面所述的针对PDL1的抗体，或如本发明第三方面所述的嵌合抗原受体，或如本发明第四方面所述的重组蛋白，或如本发明第八方面所述的工程化免疫细胞，或如本发明第十一方面所述的免疫偶联物，或其组合接触；和
(ii)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示所述的对象为PDL1高表达疾病的确诊患者。
在另一优选例中，所述的样品为血液样品或咽拭子样品，或其他组织器官中的样品。
在另一优选例中，所述PDL1高表达疾病选自：胃癌、肺癌、肝癌、骨肉瘤、乳腺癌、胰腺癌、淋巴瘤等。
在本发明的第十八方面，提供了一种重组多肽的制备方法，所述的重组多肽是如本发明的第一方面所述的针对PDL1的纳米抗体，或如本发明的第二方面所述的针对PDL1的抗体，或如本发明第三方面所述的嵌合抗原受体，或如本发明第四方面所述的重组蛋白，所述的方法包括：
(a)在适合表达的条件下，培养如本发明第五方面所述的宿主细胞；和
(b)从培养物中分离出所述的重组多肽。
附图说明
图1显示了SDS-PAGE鉴定PDL1-Fc蛋白的结果。
图2显示了免疫血清的ELISA检测结果。
图3显示了琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的结果，其中图3A显示第一轮PCR获得1000bp和750bp左右的两条PCR条带，从胶上回收750bp的片段作为二轮PCR的模板；图3B显示第二轮PCR获得450bp左右的条带，经琼脂糖凝胶电泳鉴定证明即为VHH片段。
图4显示了噬菌体展示库序列的比对结果。
图5-图9显示了噬菌体展示库固相panning淘选产物phage ELISA结果，其中红色标注为同时与PDL1抗原和Fc都结合的克隆；蓝色代表仅与PDL1靶抗原结合、不与Fc结合的克隆；绿色代表仅与PDL1靶抗原结合、不与Fc结合，并且与PDL1靶抗原结合比较强的克隆。
图10、图11显示了overlap产物瞬时转染产物流式分析检测结果。
图12-图14显示了流式细胞仪检测纯化抗体与过表达PDL1的重组细胞株CHO-K1/PDL1的结合情况。
图15显示了单价抗体的PD-1-PDL1阻断活性检测结果。
图16显示了二价抗体的PD-1-PDL1阻断活性检测结果。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，首次开发了多个针对PDL1的纳米抗体及由其构建的二价抗体。具体地，本发明利用人源的PDL1蛋白免疫美洲无峰驼，获得高质量的免疫纳米抗体基因文库。随后将PDL1蛋白分子偶联在酶标板上，利用抗原-抗体的特异性结合原理，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选免疫纳米抗体基因库(美洲无峰驼重链抗体噬菌体展示基因库)，从而获得了PDL1特异性的纳米抗体基因。此外，相关实验结果表明，本发明获得的针对PDL1的纳米抗体以及尤其构建的二价抗体均能够有效地与PDL1蛋白结合，同时具有阻断功能，能够阻断与其配体PD-1的相互作用。在此基础上完成了本发明。本发明开发的靶向PDL1的纳米抗体可以作为靶向治疗胃癌、肺癌、肝癌、骨肉瘤、乳腺癌、胰腺癌、淋巴瘤等疾病的新型治疗手段。
术语
如本文所用，术语“本发明抗体”、“本发明的抗体”、“本发明的针对PDL1的纳米抗体”、“本发明针对PDL1的纳米抗体”、“针对PDL1的纳米抗体”、“针对PDL1的纳米抗体”具有相同的含义，可互换使用，均指特异性识别和结合于PDL1蛋白(包括人PDL1蛋白)的抗体。
本发明的纳米抗体的抗体编号以及对应的序列编号如下表1所示。
表1
Figure BDA0003453301660000111
注：表中各个数值表示序列编号，即“1”表示“SEQ ID NO:1”，表中显示的CDR1、CDR2、CDR3、FR1、FR2、FR3、FR4的序列编号为其氨基酸序列的编号。
如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
如本文所用，术语“单域抗体”、“VHH”、“纳米抗体(Nanobody)”、“单域抗体(Singledomain antibody,sdAb，或纳米抗体nanobody)”具有相同的含义并可互换使用，指克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体(VHH)，它是具有完整功能的最小的抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体(VHH)。
如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为骨架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分b折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等，NIH Publ.No.91-3242，卷I,647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(Cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与本发明的抗体或其片段结合而形成的偶联物。本发明还包括与所述的针对新型冠状病毒的纳米抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。
如本文所用，术语“重链可变区”与“VH”可互换使用。
如本文所用，术语“可变区”与“互补决定区(Complementarity determiningregion,CDR)”可互换使用。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链可变区包括三个互补决定区CDR1、CDR2、和CDR3。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链包括上述重链可变区和重链恒定区。
在本发明中，术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用，都指特异性结合PDL1蛋白的多肽，例如具有重链可变区的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。
本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含可变区的重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该可变区与本发明抗体的重链可变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。
一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个骨架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
本发明抗体的重链的可变区特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的抗体重链可变区的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。
本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明抗体指具有PDL1蛋白结合活性的、包括上述CDR区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述CDR区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
本发明还提供了其他多肽，如包含抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
在本发明中，“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表2进行氨基酸替换而产生。
表2
Figure BDA0003453301660000131
Figure BDA0003453301660000141
本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的抗体可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。
用于诊断目的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。
可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素；2.生物毒；3.细胞因子如IL-2等；4.金纳米颗粒/纳米棒；5.病毒颗粒；6.脂质体；7.纳米磁粒；8.前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))等。
PDL1蛋白
细胞程序性死亡-配体1(Programmed cell death 1ligand 1,PDL1)也称为表面抗原分化簇274(Cluster of differentiation 274，CD274)或B7同源体(B7 homolog 1,B7-H1)，是人类体内的一种蛋白质，由CD274基因编码。PDL1是大小为40kDa的第一型跨膜蛋白，据信其在某些特殊情形(例如怀孕、组织移植、自体免疫疾病，以及诸如肝炎等某些疾病)下，与免疫系统的抑制有关。正常情形下免疫系统会对聚集在淋巴结或脾脏的外来抗原产生反应，促发具抗原特异性的细胞毒杀性T细胞(CD8+Tcell增生)。而细胞程序性死亡受体-1(PD-1)与细胞程序性死亡-配体1(PDL1)结合，可以传导抑制性的信号，减低淋巴结CD8+T细胞的增生，而且PD-1还可以借由调节Bcl-2基因，控制淋巴结中抗原特异性T细胞的聚积。
PD-1/PDL1
PDL1和PD-1的结合作为介导T细胞活化的抑制性信号，抑制T细胞的杀伤功能，对人体免疫应答起负调控的作用。
药物组合物
本发明还提供了一种组合物。优选地，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％，较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约10微克/千克体重至约50毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重至约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
针对PDL1的纳米抗体
在本发明中，所述针对PDL1的纳米抗体包括单体、二价体(二价抗体)、四价体(四价抗体)、和/或多价体(多价抗体)。
在本发明的一个优选例中，所述针对PDL1的纳米抗体包括一条或多条具有如SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的VHH链。
标记的抗体
在本发明的一个优选例中，所述抗体带有可检测标记物。更佳地，所述的标记物选自下组：同位素、胶体金标记物、有色标记物或荧光标记物。
胶体金标记可采用本领域技术人员已知的方法进行。在本发明的一个优选的方案中，针对PDL1蛋白的抗体用胶体金标记，得到胶体金标记的抗体。
本发明的针对PDL1的纳米抗体能够有效结合PDL1蛋白。
检测方法
本发明还涉及检测PDL1蛋白或其片段的方法。该方法步骤大致如下：获得细胞和/或组织样本；将样本溶解在介质中；检测在所述溶解的样本中PDL1蛋白的水平。
在本发明的检测方法中，所使用的样本没有特别限制，代表性的例子是存在于细胞保存液中的含细胞的样本。
试剂盒
本发明还提供了一种含有本发明的抗体(或其片段)或检测板的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。
本发明还提供了用于检测PDL1蛋白水平的检测试剂盒，该试剂盒包括识别PDL1蛋白的抗体，用于溶解样本的裂解介质，检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、检测标记、检测底物等。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。
应用
如上所述，本发明的抗体有广泛生物应用价值和临床应用价值，其应用涉及到与PDL1蛋白相关的疾病的诊断和治疗、基础医学研究、生物学研究等多个领域。一个优选的应用是用于针对PDL1蛋白的临床诊断、预防和治疗。
本发明也提供了刺激靶向哺乳动物肿瘤细胞群或组织的T细胞所介导的免疫应答的方法，其包括以下步骤：给哺乳动物施用本发明的CAR-T细胞。
在一个实施方式中，本发明包括一类细胞疗法，分离病人自体T细胞(或者异源供体)，激活并进行基因改造产生CAR-T细胞，随后注入同一病人体内。这种方式使移植物抗宿主反应的发生概率极低，抗原被T细胞以无MHC限制方式识别。此外，一种CAR-T就可以治疗表达该抗原的所有癌症。不像抗体疗法，CAR-T细胞能够体内复制，产生可导致持续控制肿瘤的长期持久性。
在一个实施方式中，本发明的CAR-T细胞可经历稳定的体内扩增并可持续数月至数年的时间。另外，CAR介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中，CAR-T细胞可诱导对CAR抗原结合结构域所识别的抗原的高表达肿瘤细胞的特异性免疫应答。例如，本发明的CAR-T细胞引起针对PDL1高表达的肿瘤细胞的特异性免疫应答。
可治疗的癌症包括没有被血管化或基本上还没有被血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。用本发明的CAR治疗的癌症类型包括但不限于：胃癌、肺癌、肝癌、骨肉瘤、乳腺癌、胰腺癌、淋巴瘤等。
通常地，如本文所述活化和扩增的细胞可用于治疗和预防肿瘤等疾病。因此，本发明提供了治疗癌症的方法，其包括给予给需要其的对象治疗有效量的本发明的CAR-T细胞。
本发明的CAR-T细胞可被单独给予或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如IL-2、IL-17或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。
本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度等因素确定，或可由临床试验确定。
当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重的剂量，优选105至107个细胞/kg体重的剂量(包括范围内的所有整数值)施用。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，NewEng.J.of Med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可由医学领域技术人员通过监测患者的疾病迹象容易地确定，并以此调整治疗。
对象组合物的给予可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方式中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的T细胞组合物优选通过静脉内注射施用。T细胞的组合物可被直接注入肿瘤，淋巴结或感染位置。
在本发明的某些实施方式中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将T细胞扩展至治疗性水平的方法活化和扩展的细胞，与任何数量的有关治疗形式结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用以下试剂进行治疗：所述试剂诸如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也已知为ARA-C)或对MS患者的那他珠单抗治疗或对牛皮癣患者的厄法珠单抗治疗或对PML患者的其他治疗。在进一步的实施方式中，本发明的T细胞可与以下结合使用：化疗、辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和FK506，抗体或其他免疫治疗剂。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺结合(例如，之前、同时或之后)而施用给患者。例如，在一个实施方式中，对象可经历高剂量化疗的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在一些实施方式中，在移植后，对象接受本发明的扩展的免疫细胞的注入。在一个额外的实施方式中，扩展的细胞在外科手术前或外科手术后施用。
施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。通常，每次治疗或每个疗程，可将1×105个至1×1010个本发明经修饰的T细胞，通过例如静脉回输的方式，施用于患者。
试剂、耗材及设备
主要试剂
琼脂(Sigma,CAT#A1296)、蛋白胨(Sigma,CAT#93926)、酵母提取物(OXOID,CAT#:LP0021)、氯化钠(阿拉丁，CAT#:C111533)、氯化钾(阿拉丁，CAT#:P112133)、硫酸镁(国药，CAT#:10013018)、氯化镁(国药，CAT#:10012818)、葡萄糖(生工，CAT#:GT1991)、SfiI(NEB,CAT#:R0123L)、T4 DNA ligase(TaKaRa,CAT#:2011A)、PrimeScriptTMII 1st Strand cDNASynthesis Kit(TaKaRa,CAT#:6210B)、NuHi power mix(新海生物，CAT#:NH9303)、3M醋酸钠(pH5.2-6)(Sigma,CAT#:126-96-5)、DNA片段回收试剂盒(TakaRa,CAT#:9761)、胶回收试剂盒(Qiagen,CAT#:28706)、天根质粒大抽试剂盒(天根，CAT#:DP117)、HRP-M13(SinoBiolo,CAT#:11973-MM05)、PE-anti-Human IgG(eBioscience,Cat#:12-4998-82)、Rabbitanti-Llama IgG(H+L)Secondary Antibody[HRP](Novus，CAT#NBP1-75095)、SS320感受态(iCarTab)、pComF噬菌体展示载体(iCarTab)、NHS-biotin(APExBIO,CAT#:A8002)、HRP-Streptavidin(Boster,CAT#:BA1088)、链霉亲和素磁珠(NEB,CAT#:S14205)、抗体亲和力检测缓冲液：HBS-EP+10X(GE,Cat#BR100669)、氨基偶联试剂盒(GE,Cat#BR100050)、10mMGlycine 2.5(GE,Cat#BR100356)、S系列CM5芯片(GE,Cat#29149603)、PBS(Gbico,CAT#14190-250)、DMEM(Gbico,CAT#41965-062)、RPMI1640(Gbico,CAT#61870044)、FBS(Gbico,CAT#10099-141)、Genomic DNA Purification Kit(Lifetech，CAT#K0512)、Polybrene(Sigma，CAT#107689-10G)、LVtransm转染试剂(iCarTab,Cat#LVTran100)、淋巴细胞分离液(Stem Cell,CAT#18051)。
主要耗材
50mL Falcon离心管(Corning,CAT#352070)、电击杯(Bio-Rad 0.2cm)、RNasefree 1.5mL EP管(QSP,CAT#:509-GRD-Q)、200μL RNase free PCR管(Axygen,PCR-02D-C)、T125摇瓶(Corning,CAT#431143)、15mL Falcon离心管(Corning,CAT#430052)、6孔板(Corning,CAT#3516)、96孔板(Corning,CAT#3365)。
主要设备
电转仪(EppendorfMultiporator)、离心机(湘仪H1650R)、恒温培养箱(上海精宏DNP-9052)、恒温震荡培养箱(朗越DZ-85A)、超净工作台(苏净安泰SW-CJ-1FD)、PCR仪(Applied Biosystems ABI2720)、生物安全柜(海尔，HR40-IIA2)、流式细胞仪(ThermoAttune Nxt flow cytometer)、Thermo 3111CO2培养箱、BiaCore T200。
氨基酸序列
SEQ ID NO:1(纳米抗体17-A06)
MAQVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCVASGRSFITYAVGWFRQAPGKEREFVASINWSGAMTYYTDSVNGRFAISRDNAKNTVYLQMNNLKLEDTAVYYCASTISAVTPTNGYQNWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:2(纳米抗体17-C12)
MAQVKLEESGGGLVQPGGSLTLSCAASGRTFGFYGWFRQAPGKEREFVAGITWGGSVTSYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPENTAVYYCARSPRVTTTPREFDVWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:3(纳米抗体17-A01)
MAAVQLVDSGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFGFYGWFRQAPGKEREFVAAITWGGSAISYEDSAKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCARSTRVTTNPREYDYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:4(纳米抗体17-G06)
MAAVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFGFYGWFRQAPGKEREFVAAITWGGSAISYDDSAKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCARSMRVTTNPREYDYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:5(纳米抗体23-G3)
MAAVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCVASGRSFITYAVGWFRQAPGKEREFVASVNWSGAMTYYADAVNGRFTISRDNAKNTVYLQMNNLKLEDTAVYYCAATISAVTPTNGYQNWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:6(纳米抗体29-H9)
RLQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTFSTYAMSWYRGVPEKERELVAFISSDGGGTTYRDSVKGRFTISRDNGKNTVYLQMNSLKPEDTGVYYCARGLAQIWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:7(纳米抗体17-A06、23-G3的CDR1)
GRSFITYA
SEQ ID NO:8(纳米抗体17-A06的CDR2)
INWSGAMT
SEQ ID NO:9(纳米抗体17-A06的CDR3)
ASTISAVTPTNGYQN
SEQ ID NO:10(纳米抗体17-C12、17-A01、17-G06的CDR1)
GRTFGF
SEQ ID NO:11(纳米抗体17-C12的CDR2)
ITWGGSVT
SEQ ID NO:12(纳米抗体17-C12的CDR3)
ARSPRVTTTPREFDV
SEQ ID NO:13(纳米抗体17-A01、17-G06的CDR2)
ITWGGSAI
SEQ ID NO:14(纳米抗体17-A01的CDR3)
ARSTRVTTNPREYDY
SEQ ID NO:15(纳米抗体17-G06的CDR3)
ARSMRVTTNPREYDY
SEQ ID NO:16(纳米抗体23-G3的CDR2)
VNWSGAMT
SEQ ID NO:17(纳米抗体23-G3的CDR3)
AATISAVTPTNGYQN
SEQ ID NO:18(纳米抗体29-H9的CDR1)
GFTFSTYA
SEQ ID NO:19(纳米抗体29-H9的CDR2)
ISSDGGGT
SEQ ID NO:20(纳米抗体29-H9的CDR3)
ARGLAQI
SEQ ID NO:21(纳米抗体17-A06的FR1)
MAQVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCVAS
SEQ ID NO:22(纳米抗体17-A06、23-G3的FR2)
VGWFRQAPGKEREFVAS
SEQ ID NO:23(纳米抗体17-A06的FR3)YYTDSVNGRFAISRDNAKNTVYLQMNNLKLEDTAVYYC
SEQ ID NO:24(纳米抗体17-A06、17-C12、17-A01、17-G06、23-G3、29-H9的FR4)
WGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:25(纳米抗体17-C12的FR1)
MAQVKLEESGGGLVQPGGSLTLSCAAS
SEQ ID NO:26(纳米抗体17-C12的FR2)
YGWFRQAPGKEREFVAG
SEQ ID NO:27(纳米抗体17-C12的FR3)
SYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPENTAVYYC
SEQ ID NO:28(纳米抗体17-A01的FR1)
MAAVQLVDSGGGLVQPGGSLRLSCAAS
SEQ ID NO:29(纳米抗体17-A01、17-G06的FR2)
YGWFRQAPGKEREFVAA
SEQ ID NO:30(纳米抗体17-A01的FR3)
SYEDSAKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYC
SEQ ID NO:31(纳米抗体17-G06的FR1)
MAAVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS
SEQ ID NO:32(纳米抗体17-G06的FR3)
SYDDSAKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYC
SEQ ID NO:33(纳米抗体23-G3的FR1)
MAAVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCVAS
SEQ ID NO:34(纳米抗体23-G3的FR3)
YYADAVNGRFTISRDNAKNTVYLQMNNLKLEDTAVYYC
SEQ ID NO:35(纳米抗体29-H9的FR1)
RLQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAAS
SEQ ID NO:36(纳米抗体29-H9的FR2)
MSWYRGVPEKERELVAF
SEQ ID NO:37(纳米抗体29-H9的FR3)
TYRDSVKGRFTISRDNGKNTVYLQMNSLKPEDTGVYYC
本发明的主要优点包括：
1.本发明的PDL1纳米抗体能够特异性结合PDL1，并且具有高亲和力。
2.本发明的PDL1纳米抗体具有良好的PD-1-PDL1阻断活性，并且对PDL1中和活性较高。
3.本发明同时构建了PDL1单价纳米抗体及二价的PDL1纳米抗体，且都具有明显的阻断活性。
4.本发明的PDL1纳米抗体只阻断PD-1和PDL1通路，并不影响PD-1和PD-L2通路，从而能够避免间质性肺炎等副作用的发生，提高了安全性。
5.本发明的PDL1纳米抗体可更全面激活免疫系统杀伤肿瘤，对于PD-1无效或PD-1耐药的患者能明显获益，仍能取得疗效，因而患者的适应范围得到了扩大。
6.本发明的PDL1纳米抗体除了可以抑制PD-1-PDL1通路外，还可以通过阻断B7.1和PDL1的共抑制功能，有利于全面激活T细胞功能和细胞因子产生，从而取得更好的免疫效果。
7.本发明的PDL1纳米抗体相比多克隆抗体更容易廉价批量生产，可以降低生产成本，从而降低由其制备的药物价格。
8.本发明的PDL1纳米抗体的适用条件广：在更宽的温度范围下是稳定的，在高温下仍能发挥作用。不像传统的抗体片段，高温下纳米体的展开被证明是完全可逆的。此外，纳米抗体在极端的pH值下也很稳定，并能够在胃液中存活。
9.在结构方面，由于纳米抗体存在亲水的一面，因此相比传统抗体，本发明的PDL1纳米抗体不存在与传统抗体相关的溶解度和聚集性问题。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1.抗原制备方案
1.通过基因合成PDL1胞外段(19AA-238AA)序列，在C端添加IgG1 Fc标签，亚克隆至真核表达载体中，构建抗原PDL1-Fc蛋白表达载体。
2.将构建好的PDL1-Fc蛋白表达载体进行质粒大抽，瞬时转染293细胞后，连续培养8天，离心收集培养基上清，用0.45μm的滤膜过滤，滤液转至无菌离心管中，使用proteinA柱进行纯化得到PDL1-Fc蛋白。
3.将PDL1-Fc蛋白使用SDS-PAGE检测进行鉴定。
如图1所示，SDS-PAGE检测显示PDL1-Fc的实际SDS-PAGE分子量约为65kD，与ACRO公司PDL1-Fc产品电泳检测结果一致，且本发明的PDL1-Fc条带纯度高，说明表达及纯化效果好。
所述经纯化得到的PDL1-Fc蛋白即为抗原，也称为免疫原、免疫抗原。
实施例2.抗原免疫美洲无峰驼
采用上述制备的PDL1-Fc蛋白抗原免疫1只美洲无峰驼，皮下多点免疫，3次免疫流程如表3所示。
表3
Figure BDA0003453301660000231
实施例3.免疫效价的检测
1.采集5mL实施例1中的三免后外周血，将收集有血液样本的离心管置于37℃培养箱内放置1小时；然后将血液样本转移至4℃过夜。
2.将血清转移至一个新的无菌离心管中，5000rpm离心20min；使用PDL1切去Fc抗原预包被的96孔板，选取抗骆驼的IgG(H+L)二抗以及抗骆驼的VHH二抗，进行ELISA实验检测免疫效价。
如图2的ELISA检测结果所示，与未免疫(阴性)血清相比：使用抗骆驼的IgG(H+L)二抗进行检测时，免疫血清为阳性，且效价较高。
上述结果说明免疫血清与PDL1发生了特异性结合，且随血清稀释梯度OD450值呈梯度变化，表明免疫成功。
采集100mL外周血，安排进行建库。
实施例4.PBMC分离及VHH抗体片段的获得
1.采集150mL实施例1中制备的外周血，使用淋巴细胞分离液分离PBMC。
2.提取RNA，使用PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit进行反转录，制备cDNA。
(1)在200μLPCR管中配制表4的反应混合液Mix1：
表4
Figure BDA0003453301660000241
(2)65℃保温5min后，冰上迅速冷却；
(3)在上述PCR管中配制表5反应液：
表5
Figure BDA0003453301660000242
(4)吹打混匀后，分装80μL/管，置于PCR仪中42℃、1小时，70℃热失活15分钟，最后将cDNA样品置于冰上或-20℃长期保存。
3.VHH片段的扩增
(1)配置表6的第一轮PCR反应体系(50μL/管)：
表6
Figure BDA0003453301660000251
配置好PCR反应体系后，按照如表7程序设置PCR仪：
表7
Figure BDA0003453301660000252
(2)PCR产物的琼脂糖电泳：
使用1％的琼脂糖进行电泳分析PCR产物，分离分子量大小为750bp左右的片段。使用胶回收试剂盒回收PCR产物，并用NanoDrop测定浓度；
(3)配置表8的二轮PCR反应体系(50μL/管)：
表8
Figure BDA0003453301660000253
配置好PCR反应体系后，按照如表9程序设置PCR仪：
表9
Figure BDA0003453301660000254
(4)二轮PCR产物的琼脂糖电泳分析：
使用1％的琼脂糖进行电泳分析PCR产物，分离分子量大小为400bp左右的VHH片段。使用胶回收试剂盒回收VHH PCR产物，并用NanoDrop测定浓度。
如图3所示显示了琼脂糖凝胶电泳PCR产物的结果：图3A显示第一轮PCR获得1000bp和750bp左右的两条PCR条带，从胶上回收750bp的片段作为二轮PCR的模板；图3B显示第二轮PCR获得450bp左右的条带，经琼脂糖凝胶电泳鉴定证明即为VHH片段。
将VHH片段用SfiI酶切后亚克隆至噬菌体展示载体pComF中，连接产物电转化SS320大肠杆菌感受态细胞，构建单域抗体噬菌体展示库。
实施例5.噬菌体展示库的构建
1.噬菌体展示载体的构建：
(1)使用SfiI分别酶切pCom F载体和上述实施例4中获得的VHH PCR胶回收产物，50℃酶切过夜；
(2)使用1％的琼脂糖凝胶分离pCom F载体片段，切取5000bp的载体片段进行胶回收；同时使用DNA片段回收试剂盒纯化PCR酶切产物，并用NanoDrop测定浓度；
(3)酶切好的pCom F载体和VHH片段使用T4 ligase连接，16℃连接过夜。
2.噬菌体连接产物电转化大肠杆菌：
(1)准备电转杯、连接产物和电转感受态置于冰上预冷；
(2)取预冷的建库连接产物加入到电转感受态中，置于冰上1min，向每个电转杯中加入70μL DNA/感受态混合物，将电转杯放于冰上；
(3)按照2500V，5ms进行电转；
(4)电击结束后，立刻加入平衡至室温的SOC培养基重悬菌体，37℃摇床培养1小时；
(5)取菌液15mL直接进行噬菌体拯救，其余5mL电转产物加入等体积的50％甘油，均匀混合后保存在-80℃；
(6)另外取菌液20μL，加入980μL 2YT培养基进行稀释后，取100μL稀释后产物，加入900μL 2YT培养基进行第二步稀释，取50μL均匀涂布在含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜；
(7)第二天，取出平板，计算每个连接能够产生的克隆数，计算库容；
(8)同时挑取平板上的单克隆20个到含氨苄青霉素的2YT培养基中，37℃震荡培养约6-8小时，送菌液测序(测序通用引物M13R)，计算库的多样性。
如图4所示，噬菌体展示库序列的比对结果显示噬菌体展示库空载率及抗体重复率良好，大肠杆菌库库容为：6.53E8。
实施例6.噬菌体展示库的复苏和拯救及噬菌体沉淀
1.将实施例5中电转后的转化产物用2YT稀释调整至OD600为0.2左右，加入终浓度为100μg/mL的氨苄青霉素置于恒温摇床中，37℃，225rpm培养，至OD600为0.5时停止。
2.投入M13KO7，摇匀后37℃静置30min，随后37℃，225rpm培养1h。
3.M13KO7体积＝10×体积×OD600×5×108/M13KO7滴度。
4.将菌液6000rpm离心10min后用2YT-AK培养基重悬，25℃，200rpm过夜培养。
5.将菌液10000rpm离心15min。
6.弃去沉淀，将上清转至新的离心管，管内加入1/5菌液体积的PEG/NaCl，混匀后放置4℃，静置2h。
7.将沉淀的噬菌体上清，10000rpm，4℃，离心30min；弃去上清，每个50mL离心管的沉淀(噬菌体)用1mL无菌PBS重悬。
8.将重悬的噬菌体转移至1.5mL EP管中，置于离心机中，12000g，4℃，离心5min。
9.将上清转移至新的1.5mL EP管，每管加入250μL的PEG/NaCl，混匀后4℃静置10min。
10. 12000g离心10min，弃上清，加入1mL PBS重悬。
11. 12000g离心5min，弃沉淀，将上清转移至新的1.5mL EP管。
12. 12000g离心5min，将上清转移至新的1.5mL EP管，得到噬菌体原始库。
13.取10μL沉淀投入90μL 2YT培养基，记做10-1，依次往后10倍稀释至10-9，取10-7、10-8、10-9三个梯度20μL稀释好的样品投入200μL事先准备好的OD600为0.5的ER2738，混匀后放于37℃水浴锅，静置10min，每108μL涂1块LB-AMP固体平板，37℃过夜，第二天数斑以确定Titer。
14.Titer计算：选取斑数在30-300之间的平板，两块平板取平均值，斑数量乘以稀释倍数再乘以100得到titer。
经过复苏、拯救及技术的噬菌体展示库可进行后续噬菌体展示库的solutionpanning。
实施例7.噬菌体展示库的solutionpanning
使用Streptavidin magnetic beads，预先结合biotin化的目标抗原，再与待淘选的phage library进行孵育，洗去非特异性结合的噬菌体，使用TEA将结合在目标抗原上的重组噬菌体洗脱下来，并进行扩增；经历3-4轮淘选后，挑选单克隆进行测序。
1.用PBS稀释biotin化的目标抗原至50，10，5，5μg/ml(每轮使用浓度不同)，分别与streptavidin magnetic beads 4℃混合孵育1h，洗去游离的目标抗原。
2.取约6×1011Pfu 150μL的lib phage或上轮扩增产物稀释至600μL，加入到预先包被好Fc的ELISA孔中，做Fc depletion，共做三轮，以去除Fc结合的噬菌体。
3.将Fc depletion过的噬菌体与streptavidin magnetic beads混合，4℃孵育1h，以去除与streptavidin结合的噬菌体。
4.弃去磁珠，将噬菌体用1％PBSA稀释至约1mL，与步骤1中，与目标抗原预先结合过的磁珠混合，4℃孵育1h。
5.将phage吸去，用PBS洗涤磁珠3-5次，每次2-3min，同时用PBS洗涤事先用MPBS封闭的1.5mL EP管。
6.用600μL 1×TEA洗脱磁珠上结合的噬菌体10min，洗脱下来的产物转移至预先封闭过的EP管中，加入300μL Tris-HCl中和。
7.取10μL output产物投入90μL 2YT培养基，记做100，依次往后10倍稀释至10-2，取101、100、10-1、10-2四个梯度20μL稀释好的样品投入200μL事先准备好的OD600为0.5的ER2738(101是直接将未稀释的产物20μL加入ER2738)，混匀后放于37℃水浴锅，静置10min，每108μL涂1块LB-AMP固体平板，37℃过夜，第二天数斑以确定Titer。
8.Titer计算：选取斑数在30-300之间的平板，两块平板取平均值，用斑数量乘以稀释倍数再乘以洗脱体积。
包被Fc蛋白，将构建的噬菌体展示库进行6轮depletion，然后与预结合了biotin-PDL1的链霉亲和素磁珠进行孵育，富集PDL1特异性结合的噬菌体，经过四次富集；统计每一轮的input和output，并计算每轮的富集因子。
如表10所示的计算结果，从富集因子来看(Input/outout)，表明噬菌体库有明显富集，说明PDL1特异性结合的噬菌体库构建成功。
表10
Figure BDA0003453301660000281
Figure BDA0003453301660000291
实施例8.噬菌体展示库的cell-based panning
使用过表达靶蛋白的重组细胞株，将噬菌体库依次与空细胞和过表达靶蛋白的细胞进行孵育后，经数次洗涤洗去非特异性结合的噬菌体后，使用甘氨酸或TEA将结合在细胞表面上的重组噬菌体洗脱下来，并进行扩增；经历3-4轮淘选后，挑选单克隆进行ELISA检测。
1.提前一天用1％PBSA封闭1.5mL EP管，4℃过夜。
2.Target cell和control cell各取1×107，用PBS洗涤三次，用10mL 1％PBSA重悬，放置于脱色摇床室温低速封闭1h。
3.向control cell中投入1×1011的噬菌体，孵育1h，target cell继续封闭。
4.将孵育结束的细胞置于离心机中，1000g离心5min，弃去target cell上清(1％PBSA)，并将control cell的上清小心吸出，加入到target cell管中，重悬后，置于摇床，低速孵育1h。
5.将target cell置于离心机中，1000g离心5min；(同时用PBS洗涤三次前一天封闭的1.5mL EP管)，弃去target cell上清，加入4ml PBS重悬，分装至封闭的1.5mL EP管，用PBS离心洗涤5次，再将细胞转移至另外四个EP管，继续洗涤5次，然后将细胞转移至同一个EP管中。
6.用200μL PBS重悬细胞，然后加入200μL 2×TEA迅速吹吸，直至溶液不再粘稠，再加入200μL Tris-HCl中和，即得到产物。
7.测定output库的titer，同实施例7solutionpanning方案中的步骤7、8。
噬菌体库的淘选可根据实验条件采用实施例7或实施例8中方法进行，本发明优选地使用了实施例7中方法。
实施例9.Phage ELISA
1.分装2YT-Amp培养基至96孔深孔板，每孔500μL，挑取output平板上的单克隆，37℃，225rpm培养至OD600直至0.5；最后两孔H11和H12不挑克隆，只放培养基，作为空白对照。
2.同时用CBS包被抗原至ELISA板，浓度1μg/mL，100μL/well，37℃，包被2h。
3.另取一块96孔深孔板，分装2YT-A培养基，每孔500μL，用排枪依次吸取OD600为0.5的菌液10μL至新分装的96孔板中，置于37℃，225rpm培养过夜，此为送样测序菌液。
4.向OD600为0.5的菌液中，加入M13KO7，混匀后放于37℃，静置15min。
5.M13KO7体积＝10×体积×OD600×5×108/M13KO7滴度。
6.将侵染结束的菌液置于摇床上，37℃，225rpm培养45min。
7.将菌液置于离心机中，4000rpm离心10min，弃去上清，用2YT-AK培养基重悬，每孔800μL重置于摇床中，30℃，210rpm过夜培养。
8.同时ELISA板甩掉抗原，用PBST洗液洗三遍后，用3％MPBS封闭250μL/well，4℃过夜；并额外封闭一块空白板，作为BLANK。
9.第二天，将96孔深孔板置于离心机中，4000rpm离心10min；将ELISA板中的牛奶弃去，用200μL PBST洗涤4次；在每孔先加入50μL PBST，再一一对应加入50μL离心后的噬菌体上清，置4℃孵育1h；弃去上清，并用PBST洗涤5次；用PBST稀释HRP-Anti M13二抗，每孔100μL，4℃孵育45min后，洗去二抗，PBST洗5次，TMB常温显色10min，盐酸终止，读数，选取S/N比大的值的克隆，用保种的菌液送测。
挑选实施例7中第二轮和第三轮的output产物进行phage ELISA检测。分别包被链霉亲和素，biotin-PDL1-Fc和Fc蛋白，取重组噬菌体上清进行ELISA检测，对照组为直接封闭的孔板。
如图5-9所示，根据第二轮与第三轮output产物的ELISA检测结果，其中红色标注为同时与PDL1抗原和Fc都结合的克隆；蓝色代表仅与PDL1靶抗原结合、不与Fc结合的克隆；绿色代表仅与PDL1靶抗原结合、不与Fc结合，并且与PDL1靶抗原结合比较强的克隆(即送出测序的克隆)。从中选择了S/N比值在4以上，且与Fc不结合的克隆进行测序，分析序列抗体。
经分析，采用链霉亲和素磁珠和biotin化抗原进行solution panning，共获得6条不同的抗体序列，即本发明的17-A06、17-C12、17-A01、17-G06、23-G3、29-H9。
取目标克隆的菌液进行PCR扩增，在VHH的N端加上信号肽，C端加上IgG1-Fc，PCR产物瞬时转染HEK293细胞，取表达的抗体上清进行FACS检测。
实施例10.Overlap PCR产物的扩增，瞬时转染和检测
1.第一轮PCR：扩增CMV、VHH及Fc
(1)配置如表11的PCR反应体系【50μL体系/反应】(CMV及Fc片段可以多制备)(CMV片段扩增引物：CMV-F及PCom-R1；VHH片段扩增引物：PCom-F1及PCom-R2；Fc片段扩增引物：PCom-F2及PGK-R)：
表11
Figure BDA0003453301660000311
其中PCR反应程序如下：
Figure BDA0003453301660000312
(2)取50μL PCR产物，加入1/10体积10×loading buffer，使用1％的琼脂糖进行电泳分析，CMV及Fc的条带大小为750bp左右，VHH的条带大小为560bp左右；
(3)从胶上切除目的条带，并纯化PCR产物，并用NanoDrop测定浓度(如浓度过高，可稀释进行后续反应)。
2.第二轮PCR：Overlap Extension PCR连接CMV、VHH及Fc
(1)配置如表12的PCR反应体系：
表12
Figure BDA0003453301660000313
Figure BDA0003453301660000321
其中PCR反应程序如下：
Figure BDA0003453301660000322
(2)PCR反应程序后加入引物CMV-F及PGK-R各2μL，随后进行下一PCR反应程序。
下一PCR反应程序如下：
Figure BDA0003453301660000323
(3)使用TakaRa的DNA片段回收试剂盒纯化overlap PCR产物，并用NanoDrop测定浓度，至少需要10μg PCR产物。用于后续细胞转染验证；
(4)转染步骤同真核表达载体的转染。
实施例11.单域抗体的瞬时转染表达
1.从冰箱中取出LVTransm转染试剂及抗体表达载体pcDNA3.4-hIgG1-Fc2或overlap PCR产物，室温解冻后，用移液枪上下吹打完全混匀。取出PBS缓冲液，温热至室温。取500μL PBS至24孔板的一个孔，加入4μg pcDNA3.4-hIgG1-Fc2，移液枪上下吹打充分混匀后，加入12μL LVTransm，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10分钟。此处的混合物称为DNA/LVTransm复合物。
2.将上述532μL DNA/LVTransm复合物加入到1.5mL 293F细胞中，轻轻晃动充分混匀。将细胞置于37℃、5％CO2培养箱，130RPM培养6～8小时后，加入1.5mL新鲜的293培养基，将细胞重新放回培养箱中继续培养。
3.连续培养3天后，离心收集培养基上清，用0.45μm的滤膜过滤，滤液转至无菌离心管中，进行后续的流式和ELISA检测。
实施例12.VHH真核表达载体的构建
根据实施例9中噬菌体单克隆ELISA检测结果，挑选阳性克隆进行测序，获得VHH抗体序列。将分析获得的VHH抗体序列分别进行基因合成，与human IgG1 Fc串联亚克隆至表达载体pcDNA3.4-hIgG1-Fc2中。载体经测序验证无误后，使用Qiagen质粒大抽试剂盒制备去内毒素质粒备用。
实施例13.流式检测重组抗体与靶蛋白的结合
1.从液氮中复苏CHO-K1和CHO-K1-PDL1细胞株，调整细胞状态至对数生长期。
2.将两种细胞分别分为若干份，每份细胞的数量为5×105个细胞。
3.将表达的抗体分别孵育靶细胞CHO-K1与CHO-K1-PDL1，充分混匀后，室温孵育1小时。
4. 800×g室温离心5分钟，去掉含有抗体的上清，使用PBS洗涤细胞3次。
5.加入1μL PE或Alexa Fluor 488标记的Anti-human IgG，充分混匀后，室温避光孵育30分钟。
6. 800×g室温离心5分钟，去掉含有二抗的上清，使用PBS洗涤细胞3次。
7.使用500μL PBS重悬细胞，进行流式分析。
在候选抗体序列的N端和C端分别通过实施例10的Overlap PCR添加CMV启动子、信号肽及human IgG1 Fc标签，如实施例11纯化PCR产物瞬时转染293细胞，取表达抗体进行流式检测。
如图10、图11所示，根据FACS检测结果，17-A06，17-C12，17-A01，17-G06和23-G3，29-H9与CHO-K1/PDL1重组细胞株能够特异性结合，不与或很少与CHO-K1结合。
安排将该序列合成，并插入到表达载体pcDNA3.4-hIgG1-Fc2中，进行候选抗体的表达和纯化。
实施例14.抗体的表达纯化
1.从冰箱中取出LVTransm转染试剂及单链抗体表达载体，室温解冻后，用移液枪上下吹打完全混匀。取出PBS或HBSS缓冲液，温热至室温。取2mL PBS至6孔板的一个孔，分别加入130μg pcDNA3.4-hIgG1-Fc2，移液枪上下吹打充分混匀后，加入400μL LVTransm，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10分钟。
2.将上述DNA/LVTransm复合物加入到50mL 293F细胞中，轻轻晃动充分混匀。将细胞置于37℃、5％CO2培养箱，130RPM培养6～8小时后，加入50mL新鲜的293培养基，将细胞重新放回培养箱中继续培养。
3.连续培养7天后，离心收集培养基上清，用0.45μm的滤膜过滤，滤液转至无菌离心管中，使用Protein A柱子纯化抗体。
将候选的PDL1抗体(即17-A06，17-C12，17-A01，17-G06、23-G3，29-H9)表达载体瞬时转染293F细胞，收集转染上清，使用protein A纯化候选抗体。
将候选抗体从10μg/mL开始，5倍稀释4个梯度，采用流式细胞仪检测纯化抗体与过表达PDL1的重组细胞株CHO-K1/PDL1的结合情况。
如图12-14所示的流式结果显示，随着候选抗体浓度的逐步降低，候选抗体与过表达细胞株的结合也逐步变化，说明纯化的17-A06，17-C12，17-A01，17-G06和23-G3，29-H9抗体均可与PDL1过表达细胞株特异性结合。
实施例15.PD-1-PDL1阻断活性检测
复苏Jurkat-PD-1-NFAT-Luc报告基因细胞株及aAPCCHO-PDL1细胞，连续继代培养至对数生长期，在96孔板中，每孔接种2×104个效应细胞Jurkat-PD-1-NFAT-Luc，按照1:1加入靶细胞aAPCCHO-PDL1。在对应的孔中加入梯度稀释的检测抗体(阳性抗体：Nivolumab；待检测抗体)，按照3倍梯度稀释抗体，连续稀释9个梯度，终浓度依次为30μg/mL，10μg/mL，3.333μg/mL，1.111μg/mL，0.3704μg/mL，0.1235μg/mL，0.04115μg/mL，0.01372μg/mL，0.004572μg/mL，然后加入对应孔中。共培养18h后，每孔加入25μL One-Glo试剂，使用TecanM1000pro酶标仪检测孔内的荧光素酶活性数值。
如图15所示，Nivolumab阳性对照可以阻断PD-1/PDL1的相互作用，EC50为0.3217μg/mL。待检测抗体中PDL1单域抗体17-A06，23-G3，29-H9均可以阻断PD-1/PDL1的相互作用，而其余三个候选抗体不具有阻断功能。但PDL1候选抗体17-A06，23-G3，29-H9的EC50较阳性对照抗体Nivolumab偏高，推测可能是单域抗体较小，表位占据有限，安排将有阻断功能的3个抗体随机组合构建二价抗体再进行阻断活性检测。
将候选的3个抗体随机组合构建二价抗体，二价抗体表达形式为17-A06-G4S-23-G3，17-A06-G4S-29-H9，23-G3-G4S-29-H9，纯化抗体后，使用Jurkat-PD-1-NFAT-Luc报告基因细胞株及aAPCCHO-PDL1细胞对二价抗体进行PD-1-PDL1阻断活性检测。
如图16所示，Nivolumab(PD-1抗体)阳性对照和Atezolizumab(PDL1抗体)可以阻断PD-1/PDL1的相互作用，EC50相当。待检二价PDL1的抗体均可以阻断PD-1/PDL1的相互作用，二价抗体与阳性对照阻断能力一致。
实施例16.重组抗体亲和力检测
将PDL1候选抗体(Fc标签)按5μg/mL结合在protein A探针上，以梯度稀释的PDL1-His为流动相，终浓度依次为2.6μg/mL，1.3μg/mL，0.65μg/mL，0.325μg/mL，0.1625μg/mL，使用OCTET R2进行亲和力检测。
使用OCTET R2对3个二价PDL1抗体进行了亲和力检测，亲和力检测结果如表13：
表13
Figure BDA0003453301660000341
Figure BDA0003453301660000351
检测结果显示，三个二价抗体的亲和力都很高，从高到低分别为4.198×10-9M、2.729×10-9M、1.915×10-9M。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 博生吉医药科技（苏州）有限公司
<120> 一种新型PDL1单域抗体的开发
<130> P2021-3090
<160> 37
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 纳米抗体17-A06
<400> 1
Met Ala Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Ser Phe Ile
20 25 30
Thr Tyr Ala Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Phe Val Ala Ser Ile Asn Trp Ser Gly Ala Met Thr Tyr Tyr Thr Asp
50 55 60
Ser Val Asn Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Leu Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ser Thr Ile Ser Ala Val Thr Pro Thr Asn Gly Tyr Gln
100 105 110
Asn Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 纳米抗体17-C12
<400> 2
Met Ala Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Gly
20 25 30
Phe Tyr Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Thr Trp Gly Gly Ser Val Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asn Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Pro Arg Val Thr Thr Thr Pro Arg Glu Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 3
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 纳米抗体17-A01
<400> 3
Met Ala Ala Val Gln Leu Val Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Gly
20 25 30
Phe Tyr Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Thr Trp Gly Gly Ser Ala Ile Ser Tyr Glu Asp Ser Ala
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Thr Arg Val Thr Thr Asn Pro Arg Glu Tyr Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 4
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 纳米抗体17-G06
<400> 4
Met Ala Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Gly
20 25 30
Phe Tyr Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Thr Trp Gly Gly Ser Ala Ile Ser Tyr Asp Asp Ser Ala
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Met Arg Val Thr Thr Asn Pro Arg Glu Tyr Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 5
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 纳米抗体23-G3
<400> 5
Met Ala Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Ser Phe Ile
20 25 30
Thr Tyr Ala Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Phe Val Ala Ser Val Asn Trp Ser Gly Ala Met Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ala Val Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Leu Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Thr Ile Ser Ala Val Thr Pro Thr Asn Gly Tyr Gln
100 105 110
Asn Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 6
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 纳米抗体29-H9
<400> 6
Arg Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Tyr Arg Gly Val Pro Glu Lys Glu Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Phe Ile Ser Ser Asp Gly Gly Gly Thr Thr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Leu Ala Gln Ile Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 纳米抗体17-A06、23-G3的CDR1
<400> 7
Gly Arg Ser Phe Ile Thr Tyr Ala
1 5
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 纳米抗体17-A06的CDR2
<400> 8
Ile Asn Trp Ser Gly Ala Met Thr
1 5
<210> 9
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 纳米抗体17-A06的CDR3
<400> 9
Ala Ser Thr Ile Ser Ala Val Thr Pro Thr Asn Gly Tyr Gln Asn
1 5 10 15
<210> 10
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 纳米抗体17-C12、17-A01、17-G06的CDR1
<400> 10
Gly Arg Thr Phe Gly Phe
1 5
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 纳米抗体17-C12的CDR2
<400> 11
Ile Thr Trp Gly Gly Ser Val Thr
1 5
<210> 12
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 纳米抗体17-C12的CDR3
<400> 12
Ala Arg Ser Pro Arg Val Thr Thr Thr Pro Arg Glu Phe Asp Val
1 5 10 15
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 纳米抗体17-A01、17-G06的CDR2
<400> 13
Ile Thr Trp Gly Gly Ser Ala Ile
1 5
<210> 14
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 纳米抗体17-A01的CDR3
<400> 14
Ala Arg Ser Thr Arg Val Thr Thr Asn Pro Arg Glu Tyr Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 15
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 纳米抗体17-G06的CDR3
<400> 15
Ala Arg Ser Met Arg Val Thr Thr Asn Pro Arg Glu Tyr Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 16
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 纳米抗体23-G3的CDR2
<400> 16
Val Asn Trp Ser Gly Ala Met Thr
1 5
<210> 17
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 纳米抗体23-G3的CDR3
<400> 17
Ala Ala Thr Ile Ser Ala Val Thr Pro Thr Asn Gly Tyr Gln Asn
1 5 10 15
<210> 18
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 纳米抗体29-H9的CDR1
<400> 18
Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala
1 5
<210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 纳米抗体29-H9的CDR2
<400> 19
Ile Ser Ser Asp Gly Gly Gly Thr
1 5
<210> 20
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 纳米抗体29-H9的CDR3
<400> 20
Ala Arg Gly Leu Ala Gln Ile
1 5
<210> 21
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 纳米抗体17-A06的FR1
<400> 21
Met Ala Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser
20 25
<210> 22
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 纳米抗体17-A06、23-G3的FR2
<400> 22
Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala
1 5 10 15
Ser
<210> 23
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 纳米抗体17-A06的FR3
<400> 23
Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Asn Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Leu Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 24
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 纳米抗体17-A06、17-C12、17-A01、17-G06、23-G3、29-H9的FR4
<400> 24
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 25
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 纳米抗体17-C12的FR1
<400> 25
Met Ala Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 26
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 纳米抗体17-C12的FR2
<400> 26
Tyr Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala
1 5 10 15
Gly
<210> 27
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 纳米抗体17-C12的FR3
<400> 27
Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asn
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 28
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 纳米抗体17-A01的FR1
<400> 28
Met Ala Ala Val Gln Leu Val Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 29
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 纳米抗体17-A01、17-G06的FR2
<400> 29
Tyr Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala
1 5 10 15
Ala
<210> 30
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 纳米抗体17-A01的FR3
<400> 30
Ser Tyr Glu Asp Ser Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 31
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 纳米抗体17-G06的FR1
<400> 31
Met Ala Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 32
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 纳米抗体17-G06的FR3
<400> 32
Ser Tyr Asp Asp Ser Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 33
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 纳米抗体23-G3的FR1
<400> 33
Met Ala Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser
20 25
<210> 34
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 纳米抗体23-G3的FR3
<400> 34
Tyr Tyr Ala Asp Ala Val Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Leu Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 35
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 纳米抗体29-H9的FR1
<400> 35
Arg Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 36
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 纳米抗体29-H9的FR2
<400> 36
Met Ser Trp Tyr Arg Gly Val Pro Glu Lys Glu Arg Glu Leu Val Ala
1 5 10 15
Phe
<210> 37
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 纳米抗体29-H9的FR3
<400> 37
Thr Tyr Arg Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Gly Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Gly Val Tyr Tyr Cys
35

Claims (10)

1.一种针对PDL1的纳米抗体，其特征在于，所述针对PDL1的纳米抗体的VHH链的互补决定区CDR为选自下组的一种或多种：
(1)SEQ ID NO:7所示的CDR1、SEQ ID NO:8所示的CDR2、和SEQ ID NO:9所示的CDR3；
(2)SEQ ID NO:10所示的CDR1、SEQ ID NO:11所示的CDR2、和SEQ ID NO:12所示的CDR3；
(3)SEQ ID NO:10所示的CDR1、SEQ ID NO:13所示的CDR2、和SEQ ID NO:14所示的CDR3；
(4)SEQ ID NO:10所示的CDR1、SEQ ID NO:13所示的CDR2、和SEQ ID NO:15所示的CDR3；
(5)SEQ ID NO:7所示的CDR1、SEQ ID NO:16所示的CDR2、和SEQ ID NO:17所示的CDR3；
(6)SEQ ID NO:18所示的CDR1、SEQ ID NO:19所示的CDR2、和SEQ ID NO:20所示的CDR3。
2.如权利要求1所述的针对PDL1的纳米抗体，其特征在于，所述针对PDL1的纳米抗体的VHH链还包括骨架区FR，所述的骨架区FR为选自下组的一种或多种：
(1)SEQ ID NO:21所示的FR1、SEQ ID NO:22所示的FR2、SEQ ID NO:23所示的FR3、和SEQ ID NO:24所示的FR4；
(2)SEQ ID NO:25所示的FR1、SEQ ID NO:26所示的FR2、SEQ ID NO:27所示的FR3、和SEQ ID NO:24所示的FR4；
(3)SEQ ID NO:28所示的FR1、SEQ ID NO:29所示的FR2、SEQ ID NO:30所示的FR3、和SEQ ID NO:24所示的FR4；
(4)SEQ ID NO:31所示的FR1、SEQ ID NO:29所示的FR2、SEQ ID NO:32所示的FR3、和SEQ ID NO:24所示的FR4；
(5)SEQ ID NO:33所示的FR1、SEQ ID NO:22所示的FR2、SEQ ID NO:34所示的FR3、和SEQ ID NO:24所示的FR4；
(6)SEQ ID NO:35所示的FR1、SEQ ID NO:36所示的FR2、SEQ ID NO:37所示的FR3、和SEQ ID NO:24所示的FR4。
3.如权利要求1所述的针对PDL1的纳米抗体，其特征在于，所述针对PDL1的纳米抗体的VHH链的氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQID NO:5、SEQ ID NO:6，或其组合。
4.一种针对PDL1的抗体，其特征在于，所述抗体包括一个或多个如权利要求3所述的针对PDL1的纳米抗体。
5.如权利要求4所述的针对PDL1的抗体，其特征在于，所述抗体包括单体、二价抗体、和/或多价抗体。
6.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码选自下组的蛋白质：权利要求1所述的针对PDL1的纳米抗体，或权利要求4所述的针对PDL1的抗体。
7.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求6所述的多核苷酸。
8.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求7所述的表达载体，或其基因组中整合有权利要求6所述的多核苷酸。
9.一种产生针对PDL1的纳米抗体的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)在适合产生纳米抗体的条件下，培养如权利要求8所述的宿主细胞，从而获得含针对PDL1的纳米抗体的培养物；
(b)从所述培养物中分离和/或回收所述的针对PDL1的纳米抗体；和
(c)任选地，对步骤(b)获得的针对PDL1的纳米抗体进行纯化和/或修饰。
10.一种免疫偶联物，其特征在于，所述免疫偶联物含有：
(a)如权利要求1所述的针对PDL1的纳米抗体，或如权利要求4所述的针对PDL1的抗体；和
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、细胞因子、放射性核素、酶、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、病毒外壳蛋白或VLP，或其组合。
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