CN116368223A - siRNA及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了选择性抑制P525L点突变FUS表达的siRNA、含有该siRNA的医药组合物、ALS治疗剂以及筛选ALS治疗剂的方法。
Description
技术领域
本发明涉及选择性抑制P525L点突变FUS表达的siRNA、含有该siRNA的医药组合物、ALS的治疗用途以及筛选ALS治疗剂的方法。
背景技术
肌萎缩侧索硬化症(ALS：Amyotrophic lateral sclerosis)也被称为卢伽雷病，是一种极为致命的进行性神经退行性疾病，其特征是初级运动皮层、脑干和脊髓中运动神经元(MN)的支配性丧失。运动神经元的丧失会导致呼吸等基本的基础运动崩溃，典型的是在诊断后2-5年内导致患者死亡。患者运动功能的进行性恶化会严重降低呼吸能力，因此患者的生存需要某种形式的呼吸辅助。其他症状包括手、手臂、腿部或吞咽肌肉的肌肉无力，某些患者(如FTD-ALS)可能出现额颞痴呆。ALS的好发年龄为50岁至70岁，是老年人的高发疾病。
ALS可以分为两大类：散发性ALS和家族性ALS，其中大多数是非遗传性的散发性ALS，家族性ALS占ALS总数的5％～10％左右，是患者人数相对较少的疾病。
ALS的发病原因复杂。一般认为，其发病与环境暴露相结合，是由多个基因变异引起的复杂的遗传性疾病。作为与ALS发病相关的因子，已鉴定出包括SOD-1(Cu2+/Zn2+超氧化物歧化酶)、TDP-43(TAR DNA结合蛋白-43kD)、FUS(Fused in sarcoma)、ANG(血管紧张素)、ATXN2(Ataxin-2)、VCP(含缬酪肽蛋白)、OPTN(自噬受体蛋白)和C9orf72(9号染色体开放阅读框72)的十几种以上致病基因。但是，运动神经元变性的确切机制还不清楚。
众所周知，在家族性ALS中，FUS是继SOD1之后频率较高的致病基因。与16号染色体连锁的ALS6的致病基因FUS是2009年由美国的Robert等人鉴定的RNA结合蛋白，作为家族性ALS中在较年轻层中较多的致病基因而广为人知。
FUS往来于细胞核内和细胞质之间，承担着DNA修复和剪接调节等重要RNA代谢功能。众所周知，若该FUS发生变异，会引起向细胞质异常聚集，作为家族性ALS发病的主要原因，提出了以下2个假说。一是应该在核内进行的RNA代谢不能正常进行的丧失功能说，二是由变异蛋白聚集在细胞质中引起的毒性获得说。
FUS蛋白的C末端存在核定位信号，如果该区域发生变异，与作为核内运输受体的转运蛋白的亲和力有时会降低。一般认为，在这种情况下，FUS的核定位不能正常进行，变异FUS在细胞质中积累。对FUS突变位置的实际研究表明，P495X，G507D，K510R/E，S513P，R514G/S，R514S；G515C，H517Q/P，R518G/K，R521G/C/H，R522G，R524W/T/S，P525L等核定位信号部位的变异较多。而且，在核定位信号部位内的变异中，P525L点突变在10～20多岁发病的年轻人ALS中较多，而且，这些患者大部分在发病后2年内死亡，目前还没有开发出治疗药物。
如前文所述，野生型FUS具有重要的RNA代谢功能，实际上有报道称，小鼠前脑皮质神经元中的FUS敲除会导致其与RNA剪接因子SFPQ的相互作用降低，从而导致tau亚型发生变化。因此，在开发FUS变异为原因的ALS治疗药物时，对变异FUS的高选择性是必不可少的。
另一方面，关于靶向点突变基因的siRNA的报道，虽可列举靶向G356D点突变EGFR的siRNA(专利文献1)、靶向V337M点突变APP的siRNA(非专利文献1)和靶向G85R点突变SOD1的siRNA(非专利文献2)等，但没有关于选择性抑制P525L点突变FUS表达的siRNA的教导和提示。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第5941842号
非专利文献
非专利文献1：Nucleic Acids Research,Miller VM.et al.p 661-668：2004
非专利文献2：Aging Cell,Ding H,p 209-217：2003
发明内容
发明要解决的课题
本发明的目的是提供选择性抑制P525L点突变FUS表达的siRNA。此外，本发明的目的是提供一种含有本发明的siRNA的医药组合物、ALS的治疗剂和筛选ALS治疗剂的方法。
解决课题的手段
本发明人着眼于P525L点突变FUS，针对含有P525L点突变部分的突变FUSmRNA设计了siRNA，进而在其几个序列中找到了高选择性抑制突变mRNA的siRNA。即，发现含有高选择性抑制突变mRNA的siRNA的医药组合物可以治疗ALS，从而完成了本发明。
也就是说，本发明的目的通过以下的发明来实现。
(1)
一种siRNA，其为由有义链和反义链组成的siRNA，
该反义链包括与编码P525L点突变FUS的mRNA的一部分互补或实质上互补的区域，其中所述互补的区域为19～21个核苷酸长度。
(2)
(1)所述的siRNA，所述反义链包括与序列号2、序列号4、序列号6、序列号8、序列号10、序列号12、序列号16、序列号18、序列号20、序列号22、序列号24、序列号28或序列号32相同或实质上相同的序列。
(3)
(1)所述的siRNA，所述反义链包括与序列号2、序列号4、序列号6、序列号8、序列号10、序列号12、序列号16、序列号18、序列号20、序列号22或序列号32相同或实质上相同的序列。
(4)
(1)所述的siRNA，所述反义链包括与序列号2、序列号4、序列号6、序列号8、序列号12、序列号16、序列号18、序列号20、序列号22、序列号24、序列号28或序列号32相同或实质上相同的序列。
(5)
(1)所述的siRNA，所述反义链包括与序列号4、序列号6、序列号12、序列号16、序列号18、序列号20或序列号22相同或实质上相同的序列。
(6)
(1)所述的siRNA，其包括与以下相同或实质上相同的序列：
由序列号1的有义链和序列号2的反义链构成的双链RNA；
由序列号3的有义链和序列号4的反义链构成的双链RNA；
由序列号5的有义链和序列号6的反义链构成的双链RNA；
由序列号7的有义链和序列号8的反义链构成的双链RNA；
由序列号9的有义链和序列号10的反义链构成的双链RNA；
由序列号11的有义链和序列号12的反义链构成的双链RNA；
由序列号15的有义链和序列号16的反义链构成的双链RNA；
由序列号17的有义链和序列号18的反义链构成的双链RNA；
由序列号19的有义链和序列号20的反义链构成的双链RNA；
由序列号21的有义链和序列号22的反义链构成的双链RNA；
由序列号23的有义链和序列号24的反义链构成的双链RNA；
由序列号27的有义链和序列号28的反义链构成的双链RNA；
由序列号31的有义链和序列号32的反义链构成的双链RNA；
由序列号39的有义链和序列号40的反义链构成的双链RNA；
由序列号41的有义链和序列号42的反义链构成的双链RNA；
由序列号43的有义链和序列号44的反义链构成的双链RNA；
由序列号45的有义链和序列号46的反义链构成的双链RNA，
由序列号47的有义链和序列号48的反义链构成的双链RNA；
由序列号49的有义链和序列号50的反义链构成的双链RNA；
由序列号53的有义链和序列号54的反义链构成的双链RNA；
由序列号55的有义链和序列号56的反义链构成的双链RNA，
由序列号57的有义链和序列号58的反义链构成的双链RNA；
由序列号59的有义链和序列号60的反义链构成的双链RNA；
由序列号61的有义链和序列号62的反义链构成的双链RNA；
由序列号71的有义链和序列号72的反义链构成的双链RNA；
由序列号89的有义链和序列号90的反义链构成的双链RNA；
由序列号95的有义链和序列号96的反义链构成的双链RNA；
由序列号97的有义链和序列号98的反义链构成的双链RNA；或
由序列号113的有义链和序列号114的反义链构成的双链RNA。
(7)
(1)所述的siRNA，其包括与以下相同或实质上相同的序列：由序列号1的有义链和序列号2的反义链构成的双链RNA；
由序列号3的有义链和序列号4的反义链构成的双链RNA；
由序列号5的有义链和序列号6的反义链构成的双链RNA；
由序列号7的有义链和序列号8的反义链构成的双链RNA；
由序列号9的有义链和序列号10的反义链构成的双链RNA；
由序列号11的有义链和序列号12的反义链构成的双链RNA；
由序列号15的有义链和序列号16的反义链构成的双链RNA；
由序列号17的有义链和序列号18的反义链构成的双链RNA；
由序列号19的有义链和序列号20的反义链构成的双链RNA；
由序列号21的有义链和序列号22的反义链构成的双链RNA；
由序列号45的有义链和序列号46的反义链构成的双链RNA，由序列号47的有义链和序列号48的反义链构成的双链RNA；
由序列号49的有义链和序列号50的反义链构成的双链RNA；
由序列号53的有义链和序列号54的反义链构成的双链RNA；
由序列号55的有义链和序列号56的反义链构成的双链RNA，由序列号57的有义链和序列号58的反义链构成的双链RNA；
由序列号59的有义链和序列号60的反义链构成的双链RNA；
由序列号89的有义链和序列号90的反义链构成的双链RNA；
由序列号97的有义链和序列号98的反义链构成的双链RNA；或由序列号113的有义链和序列号114的反义链构成的双链RNA。
(8)
(1)所述的siRNA，其包括与以下相同或实质上相同的序列：由序列号3的有义链和序列号为4的反义链构成的双链RNA；
由序列号5的有义链和序列号6的反义链构成的双链RNA；
由序列号7的有义链和序列号8的反义链构成的双链RNA；
由序列号11的有义链和序列号12的反义链构成的双链RNA；
由序列号15的有义链和序列号16的反义链构成的双链RNA；
由序列号17的有义链和序列号18的反义链构成的双链RNA；
由序列号19的有义链和序列号20的反义链构成的双链RNA；
由序列号21的有义链和序列号22的反义链构成的双链RNA；
由序列号23的有义链和序列号24的反义链构成的双链RNA；
由序列号27的有义链和序列号28的反义链构成的双链RNA；
由序列号31的有义链和序列号32的反义链构成的双链RNA；
由序列号39的有义链和序列号40的反义链构成的双链RNA；
由序列号41的有义链和序列号42的反义链构成的双链RNA；
由序列号43的有义链和序列号44的反义链构成的双链RNA；
由序列号45的有义链和序列号46的反义链构成的双链RNA，由序列号49的有义链和序列号50的反义链构成的双链RNA；
由序列号53的有义链和序列号54的反义链构成的双链RNA；
由序列号55的有义链和序列号56的反义链构成的双链RNA，由序列号57的有义链和序列号58的反义链构成的双链RNA；
由序列号59的有义链和序列号60的反义链构成的双链RNA；
由序列号61的有义链和序列号62的反义链构成的双链RNA；
由序列号71的有义链和序列号72的反义链构成的双链RNA；
由序列号89的有义链和序列号90的反义链构成的双链RNA；
由序列号95的有义链和序列号96的反义链构成的双链RNA；或由序列号97的有义链和序列号98的反义链构成的双链RNA。
(9)
(1)所述的siRNA，其包括与以下相同或实质上相同的序列：由序列号3的有义链和序列号4的反义链构成的双链RNA；
由序列号5的有义链和序列号6的反义链构成的双链RNA；
由序列号11的有义链和序列号12的反义链构成的双链RNA；
由序列号15的有义链和序列号16的反义链构成的双链RNA；
由序列号17的有义链和序列号18的反义链构成的双链RNA；
由序列号19的有义链和序列号20的反义链构成的双链RNA；
由序列号21的有义链和序列号22的反义链构成的双链RNA；
由序列号45的有义链和序列号46的反义链构成的双链RNA，由序列号49的有义链和序列号50的反义链构成的双链RNA；
由序列号53的有义链和序列号54的反义链构成的双链RNA；
由序列号55的有义链和序列号56的反义链构成的双链RNA，由序列号57的有义链和序列号58的反义链构成的双链RNA；
由序列号59的有义链和序列号60的反义链构成的双链RNA；
由序列号89的有义链和序列号90的反义链构成的双链RNA，或由序列号97的有义链和序列号98的反义链构成的双链RNA。
(10)
(1)-(9)中任一项所述的siRNA，所述siRNA在其有义链和/或反义链的3’末端包含2个核苷酸长度的突出端(overhang)，为21-23个碱基对。
(11)
(1)至(10)中任一项所述的siRNA，其中所述siRNA包括至少一个修饰的核苷酸。
(12)
(1)至(11)中任一项所述的siRNA，其中所述修饰的核苷酸中至少一个含有5’-硫代磷酸酯基。
(13)
(1)至(12)中任一项所述的siRNA，其中所述修饰的核苷酸中至少一个选自2’-脱氧修饰的核苷酸、2’-脱氧-2’-氟修饰的核苷酸、2’-O-甲基修饰的核苷酸、2’-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸和2’-O原子和4’-C原子经由亚甲基或亚乙基交联的核苷酸。
(14)
(1)至(13)中任一项所述的siRNA，其用于抑制P525L点突变FUS表达。
(15)
(1)至(13)中任一项所述的siRNA，其用于选择性抑制P525L点突变FUS表达，而不实质上抑制野生型FUS表达。
(16)
医药组合物，其包含(1)至(13)中任一项所述的siRNA。
(17)
用于抑制P525L点突变FUS表达的医药组合物，其包含(1)至(13)中任一项所述的siRNA。
(18)
用于选择性抑制P525L点突变FUS表达而不实质上抑制野生型FUS表达的医药组合物，其包含(1)至(13)中任一项所述的siRNA。
(19)
P525L点突变FUS表达抑制剂，其包含(1)至(13)中任一项所述的siRNA。
(20)
ALS治疗剂，其包含(1)至(13)中任一项所述的siRNA或(16)至(18)中任一项所述的医药组合物。
(21)
(20)所述的ALS治疗剂，其中ALS是具有P525L点突变FUS的年轻人ALS。
(22)
治疗ALS的方法，其特征在于给予有效量的(1)至(13)中任一项所述的siRNA。
(23)
(1)至(13)中任一项所述的siRNA用于制备ALS治疗剂的用途。
(24)
DNA载体，其用于在细胞中表达(1)至(13)中任一项所述的siRNA。
(25)
包含(24)所述的DNA载体和药学上允许的载体的医药组合物。
(26)
包含(24)所述的DNA载体的细胞。
(27)
(26)所述的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
(28)
筛选选择性抑制P525L点突变FUS表达的ALS治疗剂的方法，其特征在于检测野生型FUS的表达抑制率和P525L点突变FUS的表达抑制率。
(29)
一种筛选方法，其为筛选作为ALS治疗剂的活性成分而使用的siRNA的方法，包括
(1)设计siRNA的步骤，所述siRNA包含与编码P525L点突变FUS的mRNA的一部分互补或实质上互补的区域，所述互补的区域为19～21个核苷酸长度；
(2)制备步骤(1)中设计的siRNA的步骤，以及
(3)从步骤(2)制备的siRNA中筛选选择性抑制P525L点突变FUS表达而不实质上抑制野生型FUS表达的siRNA的步骤。
(30)
一种制备方法，其为以选择性抑制P525L点突变FUS表达的siRNA为活性成分的ALS治疗剂的制备方法，包括
(1)设计siRNA的步骤，所述siRNA包含与编码P525L点突变FUS的mRNA的一部分互补或实质上互补的区域，所述互补的区域为19～21个核苷酸长度；
(2)制备步骤(1)中设计的siRNA的步骤；
(3)从步骤(2)制备的siRNA中筛选选择性抑制P525L点突变FUS表达而不实质上抑制野生型FUS的siRNA的步骤；
(4)制备含有步骤(3)中筛选的siRNA作为活性成分的医药组合物的步骤；以及
(5)确认使用步骤(4)中制备的医药组合物作为ALS治疗剂的效果的步骤。
发明效果
通过使用本发明的siRNA，可以选择性抑制P525L点突变FUS表达而不实质上抑制野生型FUS表达。此外，通过含有本发明的siRNA的药物可以治疗ALS。
附图说明
[图1]示出21mer siRNA对P525L点突变FUS表达率的影响。
[图2]示出21mer siRNA对P525L点突变FUS的表达抑制效果。
[图3]示出22mer siRNA对P525L点突变FUS表达率的影响。
[图4]示出22mer siRNA对P525L点突变FUS的表达抑制效果。
[图5]示出23mer siRNA对P525L点突变FUS表达率的影响。
[图6]示出23mer siRNA对P525L点突变FUS的表达抑制效果。
[图7]示出共表达HEK293细胞株中的代表性成像图像。
[图8]示出共表达HEK293细胞株中21mer siRNA对P525L点突变FUS表达率的影响。
[图9]示出共表达HEK293细胞株中21mer siRNA对P525L点突变FUS的表达抑制效果。
[图10]示出共表达HEK293细胞株中22mer siRNA对P525L点突变FUS表达率的影响。
[图11]示出共表达HEK293细胞株中22mer siRNA对P525L点突变FUS的表达抑制效果。
[图12]示出共表达HEK293细胞株中23mer siRNA对P525L点突变FUS表达率的影响。
[图13]示出共表达HEK293细胞株中23mer siRNA对P525L点突变FUS的表达抑制效果。
[图14]示出siRNA-010对P525L点突变FUS的浓度依赖性表达抑制效果。
[图15]示出siRNA-029对P525L点突变FUS的浓度依赖性表达抑制效果。
[图16]示出siRNA-049对P525L点突变FUS的浓度依赖性表达抑制效果。
[图17]示出siRNA-010对P525L点突变FUS随时间变化的表达抑制效果。
[图18]示出siRNA-029对P525L点突变FUS随时间变化的表达抑制效果。
[图19]示出siRNA-049对P525L点突变FUS随时间变化的表达抑制效果。
具体实施形式
本发明的siRNA(小干扰RNA，small interfering RNA)是由与目标P525L点突变FUS mRNA(转录产物)互补的RNA(反义链)和与该RNA互补的RNA(有义链)构成的双链RNA。
一般情况下，siRNA被引入细胞后，会通过RNA干扰促使mRNA降解，抑制目标基因的表达，但本发明的siRNA以P525L点突变FUS的mRNA为目标降解，可选择性抑制参与ALS的P525L点突变FUS表达。
本发明的siRNA含有反义链，所述反义链包含与编码P525L点突变FUS的mRNA的一部分互补或实质上互补的区域，所述互补的区域为19～21个核苷酸长度。
此外，本发明的siRNA的有义链和反义链中的每一个为19～26个核苷酸长度，优选为19～23个核苷酸长度。
本文中的术语“互补”和“实质上互补”是指siRNA的有义链和反义链之间或siRNA的反义链和目标mRNA之间的相对碱基可以形成氢键，如从使用其的上下文中所理解。
这里，本发明的siRNA包含具有与下表1所示序列号中任一序列相同或实质上相同的序列的反义链，但优选地包含具有与序列号2、序列号4、序列号6、序列号8、序列号10、序列号12、序列号16、序列号18、序列号20、序列号22或序列号32相同或实质上相同的序列的反义链。
(表1)
链：s＝有义链，as＝反义链
本发明的siRNA包含具有与上述表1所示序列号相同或实际上相同的序列的有义链和反义链，优选包含与以下相同或实质上相同的序列：
由序列号1的有义链和序列号2的反义链构成的双链RNA；
由序列号3的有义链和序列号4的反义链构成的双链RNA；
由序列号5的有义链和序列号6的反义链构成的双链RNA；
由序列号7的有义链和序列号8的反义链构成的双链RNA；
由序列号9的有义链和序列号10的反义链构成的双链RNA；
由序列号11的有义链和序列号12的反义链构成的双链RNA；
由序列号15的有义链和序列号16的反义链构成的双链RNA；
由序列号17的有义链和序列号18的反义链构成的双链RNA；
由序列号19的有义链和序列号20的反义链构成的双链RNA；
由序列号21的有义链和序列号22的反义链构成的双链RNA；
由序列号23的有义链和序列号24的反义链构成的双链RNA；
由序列号27的有义链和序列号28的反义链构成的双链RNA；
由序列号31的有义链和序列号32的反义链构成的双链RNA；
由序列号39的有义链和序列号40的反义链构成的双链RNA；
由序列号41的有义链和序列号42的反义链构成的双链RNA；
由序列号43的有义链和序列号44的反义链构成的双链RNA；
由序列号45的有义链和序列号46的反义链构成的双链RNA，由序列号47的有义链和序列号48的反义链构成的双链RNA；
由序列号49的有义链和序列号50的反义链构成的双链RNA；
由序列号53的有义链和序列号54的反义链构成的双链RNA；
由序列号55的有义链和序列号56的反义链构成的双链RNA，由序列号57的有义链和序列号58的反义链构成的双链RNA；
由序列号59的有义链和序列号60的反义链构成的双链RNA；
由序列号61的有义链和序列号62的反义链构成的双链RNA；
由序列号71的有义链和序列号72的反义链构成的双链RNA；
由序列号89的有义链和序列号90的反义链构成的双链RNA；
由序列号95的有义链和序列号96的反义链构成的双链RNA；
由序列号97的有义链和序列号98的反义链构成的双链RNA；或由序列号113的有义链和序列号114的反义链构成的双链RNA，更优选包含与以下相同或实质上相同的序列：
由序列号1的有义链和序列号2的反义链构成的双链RNA；
由序列号3的有义链和序列号4的反义链构成的双链RNA；
由序列号5的有义链和序列号6的反义链构成的双链RNA；
由序列号7的有义链和序列号8的反义链构成的双链RNA；
由序列号9的有义链和序列号10的反义链构成的双链RNA；
由序列号11的有义链和序列号12的反义链构成的双链RNA；
由序列号15的有义链和序列号16的反义链构成的双链RNA；
由序列号17的有义链和序列号18的反义链构成的双链RNA；
由序列号19的有义链和序列号20的反义链构成的双链RNA；
由序列号21的有义链和序列号22的反义链构成的双链RNA；
由序列号45的有义链和序列号46的反义链构成的双链RNA，由序列号47的有义链和序列号48的反义链构成的双链RNA；
由序列号49的有义链和序列号50的反义链构成的双链RNA；
由序列号53的有义链和序列号54的反义链构成的双链RNA；
由序列号55的有义链和序列号56的反义链构成的双链RNA，由序列号57的有义链和序列号58的反义链构成的双链RNA；
由序列号59的有义链和序列号60的反义链构成的双链RNA；
由序列号89的有义链和序列号90的反义链构成的双链RNA；
由序列号97的有义链和序列号98的反义链构成的双链RNA；或
由序列号113的有义链和序列号114的反义链构成的双链RNA。
本说明书中的“实质上相同的序列”是指只要siRNA的反义链和目标mRNA保持形成双链RNA的能力，表1的序列号中可以含有化学修饰或错配碱基。这里，错配碱基可以优选地包含三个以下，更优选包含一个为止。
本发明的siRNA的有义链和反义链可以在3’末端包含二核苷酸突出端。“dT”是指脱氧胸苷。突出端可从DNA或RNA的任何物质中选择。例如，经常使用dTdT和UU。通常使用价格更便宜的dTdT。
本说明书中使用的“核苷酸突出端”是指不配对核苷酸，或者当siRNA中一条链的3’末端延伸超过另一条链的5’末端，或与之相反时，从siRNA双链结构突出的核苷酸。
本发明的siRNA可以含有至少一个修饰的核苷酸。这里，修饰的核苷酸中的至少一个可含有5’-硫代磷酸酯基。
此外，修饰的核苷酸中的至少一个选自选自2’-脱氧修饰的核苷酸、2’-脱氧-2’-氟修饰的核苷酸、2’-O-甲基修饰的核苷酸、2’-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸和2’-O原子和4’-C原子经由亚甲基或亚乙基交联的核苷酸。
本说明书中使用的术语“反义链”是指siRNA的链，其包括与目标序列实质上互补的区域。本说明书中使用的术语“互补的区域”指反义链的区域，其与序列(例如本说明书中定义的目标序列)实质上互补。
本说明书中使用的术语“有义链”是指siRNA的链，其包括与反义链的区域实质上互补的区域。
本发明的siRNA是通过选择基于P525L点突变FUS mRNA为目标的序列并制备而得。
例如，选择P525L点突变FUS mRNA连续区域的序列。具体而言，从包含点突变的前后19～21个核苷酸的mRNA序列中选择。
可以根据合成本身公知的核酸分子的方法制备本发明的siRNA。公知的方法例如包括以下(i)和(ii)中描述的方法。
(i)“核酸医药的开发与应用展开”(核酸医薬の創製と応用展開)CMC出版，2016
(ii)“有助于中分子创新药的肽、核酸和糖链的合成技术”(中分子創薬に資するペプチド·核酸·糖鎖の合成技術)CMC出版，2018年
本领域技术人员可以基于本说明书公开的碱基序列适当地制备本发明的siRNA。具体地说，可以基于序列号：1～240中任一项所述的碱基序列，制备本发明的双链RNA。如果一条链(例如序列号：1中描述的碱基序列)已经清楚，那么本领域技术人员就很容易知道另一条链(互补链)的碱基序列。本发明的siRNA对于本领域技术人员来说，可以利用市售的核酸合成机适当地制备。此外，对于所需RNA的合成，可以利用一般的合成委托服务。
本发明的siRNA可以通过退火互补的单链寡核苷酸来合成。各寡核苷酸可以通过使用市售的酰胺(amidite)的固相合成法合成。固相合成使用市售的核酸合成机和固相载体进行。使用单体核苷酸的3’末端通过烷基链结合在固相载体表面上，并添加酰胺(amidite)，即从目标寡核苷酸序列的3’末端向5’末端各伸长1个核苷酸而合成。合成循环完成后，从固相载体切取寡核苷酸，进行碱基部分和2’位的脱保护，而可以制备目标单链RNA。
另外，所获得的siRNA序列只要能够诱导RNA干扰并降解目标mRNA，则可以是序列中替换、缺失、插入和/或添加一个或几个的序列。
本发明的siRNA能诱导RNA干扰，以P525L点突变FUS的mRNA为目标降解，选择性抑制参与ALS的P525L点突变FUS的表达。
选择性的程度如下计算。
选择性(1)＝(野生型FUS表达率)/(P525L点突变FUS表达率)
或
选择性(2)＝(P525L点突变FUS表达抑制率)-(野生型FUS表达抑制率)
图1所示的21mer siRNA对野生型FUS/P525L点突变FUS表达率及选择性如表2所示。
(表2)
图2所示的21mer siRNA对野生型FUS表达抑制率和P525L点突变FUS表达抑制率及选择性如表3所示。
(表3)
图3所示的22mer siRNA对野生型FUS/P525L点突变FUS表达率及选择性如表4所示。
(表4)
图4所示的22mer siRNA对野生型FUS表达抑制率和P525L点突变FUS表达抑制率及选择性如表5所示。
(表5)
图5所示的23mer siRNA对野生型FUS/P525L点突变FUS表达率及选择性如表6所示。
(表6)
图6所示的23mer siRNA对野生型FUS表达抑制率和P525L点突变FUS表达抑制率及选择性如表7所示。
(表7)
本发明的siRNA抑制P525L点突变FUS表达，尤其是选择性抑制P525L点突变FUS表达，而不实质上抑制野生型FUS表达。这里，所谓“不实质上抑制野生型FUS表达”，是指由于野生型FUS的表达抑制导致的不希望的症状实质上不出现，而选择性抑制P525L点突变FUS表达。具体而言，如上表2、4、6所示，野生型FUS表达率通常相较于P525L点突变FUS表达率为1.5倍以上、优选2倍以上，如上表3、5、7所示，将P525L点突变FUS表达抑制率通常相较于野生型FUS表达抑制率为20％以上、优选40％以上定义为有选择性。既可以分别单独评价选择性，也可以两者结合而评价。
作为本发明中使用的选择性抑制P525L点突变FUS表达的siRNA，例如，可列举作为反义链包含与序列号2、序列号4、序列号6、序列号8、序列号10、序列号12、序列号16、序列号18、序列号20、序列号22、序列号24、序列号28、序列号32相同或实质上相同的序列的siRNA。优选作为反义链包含与序列号2、序列号4、序列号6、序列号8、序列号10、序列号12、序列号16、序列号18、序列号20、序列号22或序列号32相同或实质上相同的序列的siRNA。
另外，例如，作为本发明中使用的siRNA，可列举作为有义链/反义链包含与由序列号1/序列号2、序列号3/序列号4、序列号5/序列号6、序列号7/序列号8、序列号9/序列号10、序列号11/序列号12、序列号15/序列号16、序列号17/序列号18、序列号19/序列号20、序列号21/序列号22、序列号23/序列号24、序列号27/序列号28、序列号31/序列号32、序列号39/序列号40、序列号41/序列号42、序列号43/序列号44、序列号45/序列号46、序列号47/序列号48、序列号49/序列号50、序列号53/序列号54、序列号55/序列号56、序列号57/序列号58、序列号59/序列号60、序列号61/序列号62、序列号71/序列号72、序列号89/序列号90、序列号95/序列号96、序列号97/序列号98、序列号113/序列号114构成的双链RNA相同或实质上相同的序列的siRNA。更优选作为有义链/反义链包含与由序列号1/序列号2、序列号3/序列号4、序列号5/序列号6、序列号7/序列号8、序列号9/序列号10、序列号11/序列号12、序列号15/序列号16、序列号17/序列号18、序列号19/序列号20、序列号21/序列号22、序列号45/序列号46、序列号47/序列号48、序列号49/序列号50、序列号53/序列号54、序列号55/序列号56、序列号57/序列号58、序列号59/序列号60、序列号89/序列号90、序列号97/序列号98、序列号113/序列号114构成的双链RNA相同或实质上相同的序列的siRNA。
这里所说的实质上相同的序列为在有义链或/和反义链的3’末端具有至少1个核苷酸或更多(优选2个核苷酸)的突出端。
本发明的siRNA作为ALS治疗药物是有用的，其疗效可采用下述文献中描述的方法或与之相当的方法进行评估。
文献(1)：临床研究杂志(J Clin Invest)，McCampbell A.et al.p 3558-3567：2018
文献(2)：E Bio Medcine，Akiyama T.et al.p 362-378：2019
文献(3)：BRAIN，Shiihashi G.et al.p 2380-2394：2016
本发明的药物组合物可以直接用于治疗ALS，或者可以使用医药上允许的载体或赋形剂以本领域技术人员公知的方法配制成各种剂型。所使用的载体或赋形剂为本领域技术人员所公知，可以适当选择。本发明的药剂可以使用本领域技术人员公知的手段、方法制备。
本发明的ALS治疗剂可以通过混合、溶解、颗粒化、片剂化、乳化、胶囊封装、冻干等方式，将以P525L点突变FUS为目标的siRNA与该技术领域众所周知的药学上可接受的载体一起制成制剂。
对于口服给药，以P525L点突变FUS为目标的siRNA可以与药学上可接受的溶剂、赋形剂、结合剂、稳定剂、分散剂等一起配制成片剂、丸剂、糖衣剂、软胶囊、硬胶囊、溶液、混悬液、乳剂、凝胶、糖浆、浆液等剂型。
对于非口服给药，以P525L点突变FUS为目标的siRNA可以与药学上可接受的溶剂、赋形剂、结合剂、稳定剂、分散剂等一起配制成注射用溶液、混悬液、乳剂、乳膏剂、软膏剂、吸入剂、栓剂等剂型。
在注射用处方中，可将以P525L点突变FUS为目标的siRNA溶解在水性溶液中，优选汉克斯溶液、林格尔溶液或生理盐水缓冲液等生理学上适合性的缓冲液中。此外，组合物可以在油性或水性载体中具有悬浊液、溶液或乳浊液等的形状。或者，治疗剂可以粉体形式制备，使用前用灭菌水等调制水溶液或悬浊液。对于吸入给药，可将以P525L点突变FUS为目标的siRNA粉末化，与乳糖或淀粉等适当的基剂一起制成粉末混合物。
此外，以P525L点突变FUS为目标的siRNA可以非病毒载体或病毒载体形式给药。这种给药形式使用公知的方法即可，例如记载于别册实验医学“基因治疗的基础技术”(遺伝子治療の基礎技術)羊土社，1996；别册实验医学“基因导入&表达分析实验法”(遺伝子導入&発現解析実験法)羊土社，1997等。
剂量和给药次数因剂型和给药途径以及患者的症状、年龄和体重而异，但一般来说，以P525L点突变FUS为目标的siRNA每日可给药一次至多次，使每日每1kg体重为约0.001mg至1000mg的范围，优选为约0.01mg至10mg的范围。
在另一个方面中，本发明提供了上述组合物用于制备ALS治疗剂的组合物的用途。
在另一个方面中，本发明提供了上述组合物用于ALS治疗的用途。
在另一个方面，本发明提供了一种治疗方法，包括将上述组合物给予ALS患者。
ALS优选是FUS基因中伴随P525L点突变的年轻人ALS。
在另一个方面，本发明提供用于使本发明的siRNA在细胞内表达的DNA载体、含有该DNA载体及药学上允许的载体的医药组合物及
含有该DNA载体的细胞。
在另一个方面，本发明提供了一种选择性抑制P525L点突变FUS表达的ALS治疗剂的筛选方法，其特征在于测定野生型FUS的表达抑制率和P525L点突变FUS的表达抑制率。
作为ALS治疗剂，例如可列举核酸分子、肽、蛋白质、非肽化合物、合成化合物、发酵产物、细胞提取液、植物提取液、动物组织提取液、血浆等，这些化合物可以是新化合物，也可以是已知化合物。
在另一个方面中，本发明提供了一种筛选作为ALS治疗剂活性成分而使用的siRNA的方法。该筛选方法包括
(1)设计siRNA的步骤，所述siRNA包含与编码P525L点突变FUS的mRNA的一部分互补或实质上互补的区域，所述互补的区域为19～21个核苷酸长度；
(2)制备步骤(1)中设计的siRNA的步骤，以及
(3)从步骤(2)制备的siRNA中筛选选择性抑制P525L点突变FUS表达而不实质上抑制野生型FUS表达的siRNA的步骤。
在另一个方面，本发明提供了一种以选择性抑制P525L点突变FUS表达的siRNA为活性成分的ALS治疗剂的制备方法。该制备方法包括
(1)设计siRNA的步骤，所述siRNA包含与编码P525L点突变FUS的mRNA的一部分互补或实质上互补的区域，所述互补的区域为19～21个核苷酸长度；
(2)制备步骤(1)中设计的siRNA的步骤；
(3)从步骤(2)制备的siRNA中筛选选择性抑制P525L点突变FUS表达而不实质上抑制野生型FUS的siRNA的步骤；
(4)制备含有步骤(3)中筛选的siRNA作为活性成分的医药组合物的步骤；以及
(5)确认使用步骤(4)中制备的医药组合物作为ALS治疗剂的效果的步骤。
以下，根据实施例说明本发明，但是本发明不限于以下的实施例。
实施例1
人FUS野生型和FUSP525L cDNA的合成
人野生FUS(以下简称FUS野生型)cDNA序列示于序列1中，人P525L点突变FUS(以下简称FUSP525L)cDNA示于序列2中。
人工基因由Jenscript Japan株式会社提供。
另外，合成基因插入pcDNA3.1+载体的多克隆位点内的BamHI/XhoI位点。
(序列1)
tgcgcggacatggcctcaaacgattatacccaacaagcaacccaaagctatggggcctaccccacccagcccgggcagggctattcccagcagagcagtcagccctacggacagcagagttacagtggttatagccagtccacggacacttcaggctatggccagagcagctattcttcttatggccagagccagaacagctatggaactcagtcaactccccagggatatggctcgactggcggctatggcagtagccagagctcccaatcgtcttacgggcagcagtcctcctatcctggctatggccagcagccagctcccagcagcacctcgggaagttacggtagcagttctcagagcagcagctatgggcagccccagagtgggagctacagccagcagcctagctatggtggacagcagcaaagctatggacagcagcaaagctataatccccctcagggctatggacagcagaaccagtacaacagcagcagtggtggtggaggtggaggtggaggtggaggtaactatggccaagatcaatcctccatgagtagtggtggtggcagtggtggcggttatggcaatcaagaccagagtggtggaggtggcagcggtggctatggacagcaggaccgtggaggccgcggcaggggtggcagtggtggcggcggcggcggcggcggtggtggttacaaccgcagcagtggtggctatgaacccagaggtcgtggaggtggccgtggaggcagaggtggcatgggcggaagtgaccgtggtggcttcaataaatttggtggccctcgggaccaaggatcacgtcatgactccgaacaggataattcagacaacaacaccatctttgtgcaaggcctgggtgagaatgttacaattgagtctgtggctgattacttcaagcagattggtattattaagacaaacaagaaaacgggacagcccatgattaatttgtacacagacagggaaactggcaagctgaagggagaggcaacggtctcttttgatgacccaccttcagctaaagcagctattgactggtttgatggtaaagaattctccggaaatcctatcaaggtctcatttgctactcgccgggcagactttaatcggggtggtggcaatggtcgtggaggccgagggcgaggaggacccatgggccgtggaggctatggaggtggtggcagtggtggtggtggccgaggaggatttcccagtggaggtggtggcggtggaggacagcagcgagctggtgactggaagtgtcctaatcccacctgtgagaatatgaacttctcttggaggaatgaatgcaaccagtgtaaggcccctaaaccagatggcccaggagggggaccaggtggctctcacatggggggtaactacggggatgatcgtcgtggtggcagaggaggctatgatcgaggcggctaccggggccgcggcggggaccgtggaggcttccgagggggccggggtggtggggacagaggtggctttggccctggcaagatggattccaggggtgagcacagacaggatcgcagggagaggccgtattaattagcctggctccccaggttctggaacagctttttgtcctgtacccagtgttaccctcgttattttgtaaccttccaattcctgatcacccaagggtttttttgtgtcggactatgtaattgtaactatacctctggttcccattaaaagtgaccattttagttaaaaaaaa(序列号246)
(序列2)
tgcgcggacatggcctcaaacgattatacccaacaagcaacccaaagctatggggcctaccccacccagcccgggcagggctattcccagcagagcagtcagccctacggacagcagagttacagtggttatagccagtccacggacacttcaggctatggccagagcagctattcttcttatggccagagccagaacagctatggaactcagtcaactccccagggatatggctcgactggcggctatggcagtagccagagctcccaatcgtcttacgggcagcagtcctcctatcctggctatggccagcagccagctcccagcagcacctcgggaagttacggtagcagttctcagagcagcagctatgggcagccccagagtgggagctacagccagcagcctagctatggtggacagcagcaaagctatggacagcagcaaagctataatccccctcagggctatggacagcagaaccagtacaacagcagcagtggtggtggaggtggaggtggaggtggaggtaactatggccaagatcaatcctccatgagtagtggtggtggcagtggtggcggttatggcaatcaagaccagagtggtggaggtggcagcggtggctatggacagcaggaccgtggaggccgcggcaggggtggcagtggtggcggcggcggcggcggcggtggtggttacaaccgcagcagtggtggctatgaacccagaggtcgtggaggtggccgtggaggcagaggtggcatgggcggaagtgaccgtggtggcttcaataaatttggtggccctcgggaccaaggatcacgtcatgactccgaacaggataattcagacaacaacaccatctttgtgcaaggcctgggtgagaatgttacaattgagtctgtggctgattacttcaagcagattggtattattaagacaaacaagaaaacgggacagcccatgattaatttgtacacagacagggaaactggcaagctgaagggagaggcaacggtctcttttgatgacccaccttcagctaaagcagctattgactggtttgatggtaaagaattctccggaaatcctatcaaggtctcatttgctactcgccgggcagactttaatcggggtggtggcaatggtcgtggaggccgagggcgaggaggacccatgggccgtggaggctatggaggtggtggcagtggtggtggtggccgaggaggatttcccagtggaggtggtggcggtggaggacagcagcgagctggtgactggaagtgtcctaatcccacctgtgagaatatgaacttctcttggaggaatgaatgcaaccagtgtaaggcccctaaaccagatggcccaggagggggaccaggtggctctcacatggggggtaactacggggatgatcgtcgtggtggcagaggaggctatgatcgaggcggctaccggggccgcggcggggaccgtggaggcttccgagggggccggggtggtggggacagaggtggctttggccctggcaagatggattccaggggtgagcacagacaggatcgcagggagaggctgtattaattagcctggctccccaggttctggaacagctttttgtcctgtacccagtgttaccctcgttattttgtaaccttccaattcctgatcacccaagggtttttttgtgtcggactatgtaattgtaactatacctctggttcccattaaaagtgaccattttagttaaaaaaaa(序列号247)
实施例2
构建GFP融合FUS野生型和FP635融合FUSP525L基因表达载体
使用表8所示的引物组，对pTurboGFP载体、pTurboFP635载体以及“1.人FUS野生型和FUSP525L cDNA的合成”制备的人工基因进行PCR。
PCR是将PrimeSTAR Max Premix(Takara Bio株式会社)25μl、2.5μM引物各4μL(最终浓度0.2μM)、模板1μL(20ng)、水20μL混合，在98℃下孵育10秒后，在98℃下10秒、55℃下5秒、72℃下10秒(但以载体为模板时为25秒)进行了35个循环。
载体扩增片段与FUS基因扩增片段通过In-Fusion反应连接。即，将插入片段2μL、载体扩增物1μL、5×In-Fusion HD Enzyme Premix(Takara Bio株式会社)2μL和5μL水混合，在50℃下反应15分钟，转化为NEB Turbo Competent E.coli(New England BiolabsJapan)。从转化体制备质粒载体，从其DNA序列中确认了目标cDNA被适当插入。
以FUS野生型在其N端添加Turbo GFP荧光蛋白，FUSP525L在其N端添加Turbo FP635荧光蛋白，而使之分别与pTurboGFP载体(Evrogen)和pTurboFP635载体(Evrogen)同框的方式进行克隆。
(表8)
实施例3
制备TurboGFP融合FUS野生型和TurboFP635融合FUSP525L稳定表达HEK293细胞株
TurboGFP融合FUS野生型cDNA或TurboFP635融合FUSP525L cDNA通过插入HEK293细胞基因组上的安全港(安全区，safe harbor)AAVS1区来制备稳定表达细胞株。
使用AAVS1 Transgene knockin vector kit(ORIGENE)制备稳定表达细胞株。
使用表9所示的模板和引物组，从先前制备的TurboGFP融合FUS野生型表达载体和TurboFP635融合FUSP525L表达载体的各荧光蛋白的起始密码子起，对包含各FUS cDNA的序列进行PCR。
PCR是将PrimeSTAR Max Premix(2×)25μl、2.5μM引物各4μL(最终浓度0.2μM)、模板1μL(20ng)、水20μL混合，在98℃下孵育10秒后，在98℃下10秒、55℃下5秒、72℃下10秒进行35个循环，各PCR产物用GFX(注册商标)PCR DNA and Gel Band Purification Kit(全球生命科学技术日本株式会社)进行纯化。
纯化PCR产物和pAAVS1-puro-DNR质粒载体(ORIGENE)用限制性酶AscI和NotI-HF(均为New England Biolabs Japan)消化后，用GFX(注册商标)PCR DNA and Gel BandPurification Kit纯化。通过质粒载体与插入cDNA的连接反应(Ligation high ver.2，东洋纺株式会社)，转化为NEB Turbo Competent E.coli。从转化体制备质粒载体，从其DNA序列中确认了目标cDNA被适当插入。
制备的pAAVS1-puro-DNR质粒载体与pCAS-Guide-AAVS1质粒载体一起采用电穿孔法(使用4D-Nucleofector系统，AD1 4D-Nucleofector(注册商标)Y模块，程序代码CA-215，Lonza)共同导入。从基因导入48小时后起，用嘌呤霉素(3μg/ml)进行约1周药剂选择后，利用TurboGFP或TurboFP635的发光进行克隆。
(表9)
实施例4
细胞培养
HEK293细胞使用含有10％FBS、4mM GlutaMAX(注册商标)Supplement的AdvancedDMEM(Thermo Fisher Scientific株式会社)，在37℃、5％CO2下培养。
此外，使用了HEK293细胞，其为从日本国立研究开发法人医药基础·健康·营养研究所培养资源实验室·JCRB细胞库获得的细胞(细胞编号JCRB9068)。
实施例5
使用稳定表达株的RNA干扰的评价样品的制备
由表1所示的序列号121～240的有义链/反义链构成的siRNA001～siRNA060通过核酸合成领域公知的方法制备(委托株式会社Gene Design制备)。
阴性对照siRNA是与人·小鼠·大鼠已知基因序列不相似的序列的siRNA，由Horizon Discovery提供。该序列为UAGCGACUAAACACAUCAA(序列编号241)。而阳性对照siRNA是以人FUS mRNA的任意区域为目标而设计的四种siRNA(序列号242～245)的混合物，由Horizon Discovery提供。这四种序列分别为：CCUACGGACAGCAGAGUUA(序列号242)、GAUUAUACCCAACAAGCAA(序列号243)、GAUCAAUCCUCCAUGAGUA(序列号244)、CGGGACAGCCCAUGAUUAA(序列号245)。
将各种siRNA(siRNA001～siRNA060，10μM)0.12μL加入到Opti-MEM(注册商标)I无血清培养基20μL中，温和搅拌。在该溶液中加入Lipofectamine(注册商标)RNAiMAX转染试剂0.2μL，温和混合后，在室温下孵育10～20分钟。
将TurboGFP融合FUS野生型稳定表达HEK293细胞株和TurboFP635融合FUSP525L稳定表达HEK293细胞株以1：1混合，用含有10％FBS和4mM GlutaMAX(注册商标)Supplement的FluoroBrite(注册商标)DMEM稀释至5～8×104细胞/mL。
在Cell Carrier-96ultra(黑色，96孔，底透，有盖，胶原包被，PerkinElmer)中加入并混合稀释的细胞100μL和siRNA/Lipofectamine(注册商标)RNAiMAX复合物20.32μL，在37℃、5％CO2培养箱中培养48小时(siRNA的最终浓度为1nM/孔)。从基因导入起约48小时后，添加2μL/孔NucBlue(注册商标)Live ReadyProbes(注册商标)试剂(Thermo FisherScientific)，温和搅拌后，室温下孵育30分钟，并对细胞核染色。
加入100μL的10％中性福尔马林固定液(Sigma-Aldrich)，温和搅拌后，在室温下孵育1小时，使细胞固定。
实施例6
FUS野生型和FUSP525L的表达量分析
使用Hoechst33342(最大激发波长461nm)作为核的报告蛋白，TurboGFP(最大激发波长452nm)作为野生型FUS的报告蛋白，TurboFP635(最大激发波长588nm)作为突变型FUS的报告蛋白，使用Operetta CLS(注册商标)高内涵共聚焦成像系统(PerkinElmer)在20倍水浸透镜、共聚焦模式下获取图像。此外，使用图像分析软件Harmony(注册商标)(Ver.4.9，PerkinElmer)分别测量核区TurboGFP荧光强度和细胞质区TurboFP635荧光强度，选择TurboGFP阳性细胞(荧光强度为1500以上)和TurboFP635阳性细胞(荧光强度为800以上)。从选择的细胞中计算出TurboGFP阳性细胞率(TurboGFP阳性细胞数/总细胞数)以及TurboFP635阳性细胞率(TurboFP635阳性细胞数/总细胞数)。然后，如下所示，根据对照值计算出表达率及表达抑制率的相对值。
*(表达率)＝100×{(各种siRNA(siRNA001～060)处理后TurboGFP阳性细胞率)-(阳性对照siRNA处理后TurboGFP阳性细胞率)}/{(阴性对照siRNA处理后TurboGFP阳性细胞率)-(阳性对照siRNA处理后TurboGFP阳性细胞率)}
*(表达抑制率)＝100×{(各种siRNA(siRNA001～060)处理后TurboGFP阳性细胞率)-(阴性对照siRNA处理后TurboGFP阳性细胞率)}/{(阳性对照siRNA处理后TurboGFP阳性细胞率)-(阴性对照siRNA处理后TurboGFP阳性细胞率)}
该表达率如图1、3、5所示，该表达抑制率如图2、4、6所示。
图1-6的结果证实，siRNA-001、002、003、004、005、006、008、009、010、011、012、014、016、020、021、022、023、024、025、027、028、029、030、031、036、045、048、049、057是比野生型FUS表达更选择性抑制P525L点突变FUS表达的siRNA。
因此，由包含从上述siRNA的反义链中除去突出端(dTdT)，与序列号2、序列号4、序列号6、序列号8、序列号10、序列号12、序列号16、序列号18、序列号20、序列号22、序列号24、序列号28或序列号32的序列相同或实质上相同的序列的反义链构成的siRNA等，特别期待作为本发明的siRNA可用作与P525L点突变FUS基因相关的ALS的治疗剂。
实施例7
FUS基因敲除(KO)HEK293细胞株的制备
将FUS/TLS CRISPR/Cas9 KO(sc-400612)质粒(Santa Cruz)和FUS/TLS HDR质粒(h)(sc-400612-HDR)(Santa Cruz)通过TransIT(注册商标)-293转染试剂(Mirus)转染，制备FUS KO HEK细胞株。
FUS基因敲除的确认是使用RT-PCR(使用含ezDNase(注册商标)的SuperScript(注册商标)IV一步法RT-PCR系统，invitrogen，#12595100)来确认有无FUS mRNA的表达。使用的引物组如表10所示。
另外，总RNA使用RNeasy Plus Mini Kit(QIAGEN)制备，gDNA的消化为将10xezDNase缓冲液1μL、ezDNase酶1μL、模板RNA(500ng/μL)1μL、水7μL混合，在37℃下进行5分钟。另外，RT-PCR为将模板RNA(消化后的gDNA)10μL、2x Platinum SuperFi RT-PCR预混液25μL、引物组I混合物(各10μM)2.5μL、引物组V混合物(各10μM)2.5μL、SuperScript IV RTMix0.5μL、9.5μL水混合，在60℃下10分钟、98℃下2分钟、98℃下10秒、62℃下10秒、72℃下1分钟进行40个循环后，使之在72℃下反应5分钟。
(表10)
实施例8
制备TurboGFP融合FUS野生型和TurboFP635融合FUSP525L共表达HEK293细胞株
将TurboGFP融合FUS野生型cDNA以及TurboFP635融合FUSP525L cDNA克隆到pAAVS1-puro-DNR(Origene)的多克隆位点。将pAAVS1-puro-DNR(Origene)_TurboGFP-FUS野生型、pAAVS1-puro-DNR(Origene)_TurboFP635-FUSP525L和pCas-Guide-AAVS1(Origene)导入先前制备的FUS KO HEK293细胞，制备共表达TurboGFP融合FUS野生型和TurboFP635融合FUSP525L的细胞。
细胞株的克隆是利用On-chip Sort(On-chip Biotechnologies Co.，Ltd.)分选TurboGFP和TurboFP635的双阳性细胞后，利用On-chip SPiS(On-chip BiotechnologiesCo.，Ltd.)将单个细胞分离培养到384板上。
实施例9
使用TurboGFP融合FUS野生型和TurboFP635融合FUSP525L共表达HEK293细胞株评价RNA干扰
将Opti-MEM(Invitrogen)25μL和Lipofectamine(注册商标)RNAi MAX(Invitrogen)1.5μL的混合溶液25μL与Opti-MEM(Invitrogen)25μL和10μM的siRNA 0.5μL的混合溶液25μL混合，在室温下孵育15～20分钟。
TurboGFP融合FUS野生型和TurboFP635融合FUSP525L的共表达HEK293细胞株在加温的培养基(含5％FBS的FluoroBriteTM DMEM，下同)中悬浮成3.0×105细胞/mL。将细胞悬浮液100μL与先前制备的Lipofectamine-siRNA复合物10μL混合，接种于CellCarrier Ultra、胶原包被的96孔板(PerkinElmer)中，在37℃、5％CO2条件下培养(以下，在相同条件下进行培养)。转染24小时后添加100μL培养基，转染48小时后去除各孔的100μL培养基后，向10％中性缓冲福尔马林溶液(Sigma-Aldrich)50mL中添加并混合100μL含50滴Live Ready Probe(注册商标)试剂、Hoechst33342(Invitrogen)的100μL溶液，进行固定和核染色。
在37℃下孵育约30分钟后，用Operetta CLS(注册商标)高内涵共聚焦成像系统(PerkinElmer)(20倍水浸透镜，共聚焦模式)获取数据。成像的图像如图7所示。从得到的图像数据中计算总细胞数(核数)、TurboGFP阳性细胞数以及TurboFP635阳性细胞数，计算出TurboGFP阳性细胞率(TurboGFP阳性细胞数/总细胞数)以及TurboFP635阳性细胞率(TurboFP635阳性细胞数/总细胞数)。
TurboGFP阳性细胞以及TurboFP635阳性细胞定义如下。
<TurboGFP阳性细胞(FUS野生型表达细胞)>
·TurboGFP在核区内的荧光强度总和除以核区的面积(像素)得到的值为400以上
<TurboFP635阳性细胞(FUSP525L表达细胞)>
·TurboFP635在细胞质区内的荧光强度总和除以细胞质区的面积(像素)得到的值为400以上
将各阳性细胞率代入下述计算式，计算出表达率及表达抑制率的相对值。
*(表达率)＝100×{(各种siRNA(siRNA001～060)处理后TurboGFP阳性细胞率)-(阳性对照siRNA处理后TurboGFP阳性细胞率)}/{(阴性对照siRNA处理后TurboGFP阳性细胞率)-(阳性对照siRNA处理后TurboGFP阳性细胞率)}
*(表达抑制率)＝100×{(各种siRNA(siRNA001～060)处理后TurboGFP阳性细胞率)-(阴性对照siRNA处理后TurboGFP阳性细胞率)}/{(阳性对照siRNA处理后TurboGFP阳性细胞率)-(阴性对照siRNA处理后TurboGFP阳性细胞率)}
该表达率如图8、10、12所示，该表达抑制率如图9、11、13所示。
图8～13的结果表明，本发明的siRNA(siRNA-002、003、004、006、007、008、009、010、011、012、014、015、016、019、020、021、022、023、025、026、027、028、029、030、031、033、034、035、036、038、039、040、041、042、043、045、046、047、048、049、050、051、052、053、055、056、058、059、060)为使用共表达HEK细胞株时，与野生型FUS表达相比，更选择性抑制P525L点突变FUS表达的siRNA。在分别表达野生型FUS以及P525L点变异FUS的HEK细胞株和共表达的HEK细胞株的任一系统中，与野生型FUS表达相比，更选择性抑制P525L点变异FUS表达的代表性siRNA列举如下。作为第一代表例，包括siRNA-002、003、004、006、008、009、010、011、012、014、016、020、021、022、023、025、027、028、029、030、031、036、045、048、049。作为第二代表例，包括siRNA-002、003、006、008、009、010、011、023、025、027、028、029、030、045、049。
因此，由包含从上述siRNA的反义链中除去突出端(dTdT)，与序列号2、序列号4、序列号6、序列号8、序列号12、序列号16、序列号18、序列号20、序列号22、序列号24、序列号28或序列号32的序列相同或实质上相同的序列的反义链构成的siRNA，以及由包含从上述siRNA的反义链中除去突出端(dTdT)，与序列号4、序列号6、序列号12、序列号16、序列号18、序列号20或序列号22的序列相同或实质上相同的序列的反义链构成的siRNA，特别期待作为本发明的siRNA可用作与P525L点突变FUS基因相关的ALS的治疗剂。
实施例10
通过实时PCR确认浓度依赖性FUS基因的表达抑制效果
将Opti-MEM(Invitrogen)25μL和Lipofectamine(注册商标)RNAi MAX(Invitrogen)1.5μL的混合溶液25μL与Opti-MEM(Invitrogen)25μL和siRNA(0.01μM、0.1μM、1μM、10μM)0.5μL的混合溶液25μL混合，在室温下孵育15～20分钟。以下，关于向细胞导入siRNA，按照“使用TurboGFP融合FUS野生型和TurboFP635融合FUSP525L共表达HEK293细胞株评价RNA干扰”中所示的方法。
转染48小时后，完全去除培养基，加入50μL混合了DNase I(Life TechnologiesJapan)0.5μL、裂解液(Life Technologies Japan)49.5μL的细胞溶解液，在室温下孵育5分钟。之后，加入5μL终止液(Life Technologies Japan)混合后，在室温下孵育2分钟，将其供逆转录反应使用。
在混合了2X Fast Advanced RT缓冲液(Life Technologies Japan)25μL、20XFast Advanced RT酶混合物(Life Technologies Japan)2.5μL、无核酸酶水12.5μL的逆转录反应液中加入先前制备的细胞溶解液10μL，使其在37℃下30分钟、95℃下5分钟反应，合成cDNA。
实时PCR在同一反应系统中检测出TurboGFP融合FUS野生型基因、TurboFP635融合FUSP525L基因以及内源性对照基因(使用GAPDH)这3个基因。
反应液由TaqMan(注册商标)Fast Advanced预混液(Life Technologies Japan)10μL、100μM引物(GFP_X_F、GFP_X_R、FP635_X_F、FP635_X_R)各0.06μL、10μM TaqMan(注册商标)探针(TurboGFP(NED)、TurboFP635(FAM))各0.5μL、20X TaqMan(注册商标)Assay(GAPDH)(Life Technologies Japan)1.0μL以及先前制备的cDNA 4μL混合配制而成。使该反应液在实时PCR装置(QuantStudio 3，Life Technologies Japan)进行50℃下2分钟、95℃下20秒反应后，在95℃下1秒、60℃下20秒实施40个循环。
实时PCR中使用的引物和TaqMan探针如表11和12所示。
遗传基因表达量的计算是通过ΔΔCt法作为相对值计算出来的。在此，以转染试剂对照(Mock transfection)为100％计算出表达率，根据表达率计算出表达抑制率(＝100-表达率)。
siRNA-010、siRNA-029、siRNA-049的结果分别如图14～16所示。
(表11)
| 引物名 | 序列 | 序列号 |
| GFP_X_F | TGGGCATCGTGGAGTACCA | 264 |
| GFP_X_R | TGCTTGTTGGGTATAATCGTTTGA | 265 |
| FP635_X_F | CTGCGACCTGCCTAGCAAAC | 266 |
| FP635_X_R | CCATAGCTTTGGGTTGCTTGTT | 267 |
(表12)
| 探针名 | 序列 | 序列号 |
| TurboGFP(NED) | AGACCCCGGATGCAG | 268 |
| TurboFP635(FAM) | ACAGCTCCGGACTCA | 269 |
根据图14～16的结果，各siRNA的IC50使用XLFit的四参数拟合模型，如表13所示计算出。比较对野生型FUS的IC50和对P525L点突变FUS的IC50，提示siRNA-010、siRNA-029和siRNA-049是与野生型FUS相比，以更高选择性抑制P525L点突变FUS的siRNA。
(表13)
| 对野生型FUS的IC50 | 对P525L点突变FUS的IC50 | |
| 阳性对照 | 0.3nM | 0.9nM |
| siRNA-010 | ＞＞10nM | ＞10nM |
| siRNA-029 | ＞10nM | 1.6nM |
| siRNA-049 | ＞＞10nM | ＞10nM |
实施例11
通过实时PCR确认随时间变化的FUS基因表达抑制效果
按照“使用TurboGFP融合FUS野生型和TurboFP635融合FUSP525L共表达HEK293细胞株评价RNA干扰”中所示的方法转染siRNA(10nM)。转染12、24、48和72小时后完全去除培养基，冷冻保存(-80℃以下)直至实施测量。
按照“通过实时PCR确认浓度依赖性FUS基因的表达抑制效果”中所示的方法，对各冷冻保存样本进行基因表达量的分析。实时PCR中使用的引物和TaqMan探针如表11和12所示。
遗传基因表达量的计算是通过ΔΔCt法作为相对值计算出来的。在此，以阴性对照siRNA的表达量为100％计算出表达率，根据表达率计算出表达抑制率(＝100-表达率)。
siRNA-010、siRNA-029、siRNA-049的结果分别如图17～19所示。
图17～19的结果表明，在转染后的任何时间，siRNA-010、siRNA-029和siRNA-049都是与野生型FUS相比，以更高选择性抑制P525L点突变FUS的siRNA。
序列表
<110> 大原药品工业株式会社
<120> siRNA及其用途
<130> OHARA-PCT17
<160> 269
<170>
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
aggaucgcag ggagaggcu 19
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
agccucuccc ugcgauccu 19
<210> 3
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
ggaucgcagg gagaggcug 19
<210> 4
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 4
cagccucucc cugcgaucc 19
<210> 5
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 5
gaucgcaggg agaggcugu 19
<210> 6
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 6
acagccucuc ccugcgauc 19
<210> 7
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 7
aucgcaggga gaggcugua 19
<210> 8
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 8
uacagccucu cccugcgau 19
<210> 9
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 9
ucgcagggag aggcuguau 19
<210> 10
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 10
auacagccuc ucccugcga 19
<210> 11
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 11
cgcagggaga ggcuguauu 19
<210> 12
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 12
aauacagccu cucccugcg 19
<210> 13
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 13
gcagggagag gcuguauua 19
<210> 14
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 14
uaauacagcc ucucccugc 19
<210> 15
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 15
cagggagagg cuguauuaa 19
<210> 16
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 16
uuaauacagc cucucccug 19
<210> 17
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 17
agggagaggc uguauuaau 19
<210> 18
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 18
auuaauacag ccucucccu 19
<210> 19
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 19
gggagaggcu guauuaauu 19
<210> 20
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 20
aauuaauaca gccucuccc 19
<210> 21
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 21
ggagaggcug uauuaauua 19
<210> 22
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 22
uaauuaauac agccucucc 19
<210> 23
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 23
gagaggcugu auuaauuag 19
<210> 24
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 24
cuaauuaaua cagccucuc 19
<210> 25
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 25
agaggcugua uuaauuagc 19
<210> 26
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 26
gcuaauuaau acagccucu 19
<210> 27
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 27
gaggcuguau uaauuagcc 19
<210> 28
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 28
ggcuaauuaa uacagccuc 19
<210> 29
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 29
aggcuguauu aauuagccu 19
<210> 30
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 30
aggcuaauua auacagccu 19
<210> 31
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 31
ggcuguauua auuagccug 19
<210> 32
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 32
caggcuaauu aauacagcc 19
<210> 33
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 33
gcuguauuaa uuagccugg 19
<210> 34
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 34
ccaggcuaau uaauacagc 19
<210> 35
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 35
cuguauuaau uagccuggc 19
<210> 36
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 36
gccaggcuaa uuaauacag 19
<210> 37
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 37
uguauuaauu agccuggcu 19
<210> 38
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 38
agccaggcua auuaauaca 19
<210> 39
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 39
caggaucgca gggagaggcu 20
<210> 40
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 40
agccucuccc ugcgauccug 20
<210> 41
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 41
aggaucgcag ggagaggcug 20
<210> 42
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 42
cagccucucc cugcgauccu 20
<210> 43
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 43
ggaucgcagg gagaggcugu 20
<210> 44
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 44
acagccucuc ccugcgaucc 20
<210> 45
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 45
gaucgcaggg agaggcugua 20
<210> 46
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 46
uacagccucu cccugcgauc 20
<210> 47
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 47
aucgcaggga gaggcuguau 20
<210> 48
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 48
auacagccuc ucccugcgau 20
<210> 49
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 49
ucgcagggag aggcuguauu 20
<210> 50
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 50
aauacagccu cucccugcga 20
<210> 51
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 51
cgcagggaga ggcuguauua 20
<210> 52
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 52
uaauacagcc ucucccugcg 20
<210> 53
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 53
gcagggagag gcuguauuaa 20
<210> 54
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 54
uuaauacagc cucucccugc 20
<210> 55
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 55
cagggagagg cuguauuaau 20
<210> 56
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 56
auuaauacag ccucucccug 20
<210> 57
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 57
agggagaggc uguauuaauu 20
<210> 58
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 58
aauuaauaca gccucucccu 20
<210> 59
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 59
gggagaggcu guauuaauua 20
<210> 60
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 60
uaauuaauac agccucuccc 20
<210> 61
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 61
ggagaggcug uauuaauuag 20
<210> 62
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 62
cuaauuaaua cagccucucc 20
<210> 63
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 63
gagaggcugu auuaauuagc 20
<210> 64
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 64
gcuaauuaau acagccucuc 20
<210> 65
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 65
agaggcugua uuaauuagcc 20
<210> 66
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 66
ggcuaauuaa uacagccucu 20
<210> 67
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 67
gaggcuguau uaauuagccu 20
<210> 68
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 68
aggcuaauua auacagccuc 20
<210> 69
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 69
aggcuguauu aauuagccug 20
<210> 70
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 70
caggcuaauu aauacagccu 20
<210> 71
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 71
ggcuguauua auuagccugg 20
<210> 72
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 72
ccaggcuaau uaauacagcc 20
<210> 73
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 73
gcuguauuaa uuagccuggc 20
<210> 74
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 74
gccaggcuaa uuaauacagc 20
<210> 75
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 75
cuguauuaau uagccuggcu 20
<210> 76
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 76
agccaggcua auuaauacag 20
<210> 77
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 77
uguauuaauu agccuggcuc 20
<210> 78
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 78
gagccaggcu aauuaauaca 20
<210> 79
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 79
acaggaucgc agggagaggc u 21
<210> 80
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 80
agccucuccc ugcgauccug u 21
<210> 81
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 81
caggaucgca gggagaggcu g 21
<210> 82
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 82
cagccucucc cugcgauccu g 21
<210> 83
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 83
aggaucgcag ggagaggcug u 21
<210> 84
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 84
acagccucuc ccugcgaucc u 21
<210> 85
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 85
ggaucgcagg gagaggcugu a 21
<210> 86
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 86
uacagccucu cccugcgauc c 21
<210> 87
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 87
gaucgcaggg agaggcugua u 21
<210> 88
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 88
auacagccuc ucccugcgau c 21
<210> 89
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 89
atcgcaggga gaggcuguau u 21
<210> 90
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 90
aauacagccu cucccugcga u 21
<210> 91
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 91
ucgcagggag aggcuguauu a 21
<210> 92
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 92
uaauacagcc ucucccugcg a 21
<210> 93
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 93
cgcagggaga ggcuguauua a 21
<210> 94
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 94
uuaauacagc cucucccugc g 21
<210> 95
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 95
gcagggagag gcuguauuaa u 21
<210> 96
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 96
auuaauacag ccucucccug c 21
<210> 97
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 97
cagggagagg cuguauuaau u 21
<210> 98
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 98
aauuaauaca gccucucccu g 21
<210> 99
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 99
agggagaggc uguauuaauu a 21
<210> 100
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 100
uaauuaauac agccucuccc u 21
<210> 101
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 101
gggagaggcu guauuaauua g 21
<210> 102
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 102
cuaauuaaua cagccucucc c 21
<210> 103
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 103
ggagaggcug uauuaauuag c 21
<210> 104
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 104
gcuaauuaau acagccucuc c 21
<210> 105
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 105
gagaggcugu auuaauuagc c 21
<210> 106
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 106
ggcuaauuaa uacagccucu c 21
<210> 107
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 107
agaggcugua uuaauuagcc u 21
<210> 108
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 108
aggcuaauua auacagccuc u 21
<210> 109
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 109
gaggcuguau uaauuagccu g 21
<210> 110
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 110
caggcuaauu aauacagccu c 21
<210> 111
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 111
aggcuguauu aauuagccug g 21
<210> 112
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 112
ccaggcuaau uaauacagcc u 21
<210> 113
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 113
ggcuguauua auuagccugg c 21
<210> 114
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 114
gccaggcuaa uuaauacagc c 21
<210> 115
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 115
gcuguauuaa uuagccuggc u 21
<210> 116
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 116
agccaggcua auuaauacag c 21
<210> 117
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 117
cuguauuaau uagccuggcu c 21
<210> 118
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 118
gagccaggcu aauuaauaca g 21
<210> 119
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 119
uguauuaauu agccuggcuc c 21
<210> 120
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 120
ggagccaggc uaauuaauac a 21
<210> 121
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 121
aggaucgcag ggagaggcut t 21
<210> 122
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 122
agccucuccc ugcgauccut t 21
<210> 123
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 123
ggaucgcagg gagaggcugt t 21
<210> 124
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 124
cagccucucc cugcgaucct t 21
<210> 125
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 125
gaucgcaggg agaggcugut t 21
<210> 126
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 126
acagccucuc ccugcgauct t 21
<210> 127
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 127
aucgcaggga gaggcuguat t 21
<210> 128
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 128
uacagccucu cccugcgaut t 21
<210> 129
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 129
ucgcagggag aggcuguaut t 21
<210> 130
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 130
auacagccuc ucccugcgat t 21
<210> 131
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 131
cgcagggaga ggcuguauut t 21
<210> 132
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 132
aauacagccu cucccugcgt t 21
<210> 133
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 133
gcagggagag gcuguauuat t 21
<210> 134
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 134
uaauacagcc ucucccugct t 21
<210> 135
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 135
cagggagagg cuguauuaat t 21
<210> 136
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 136
uuaauacagc cucucccugt t 21
<210> 137
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 137
agggagaggc uguauuaaut t 21
<210> 138
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 138
auuaauacag ccucucccut t 21
<210> 139
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 139
gggagaggcu guauuaauut t 21
<210> 140
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 140
aauuaauaca gccucuccct t 21
<210> 141
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 141
ggagaggcug uauuaauuat t 21
<210> 142
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 142
uaauuaauac agccucucct t 21
<210> 143
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 143
gagaggcugu auuaauuagt t 21
<210> 144
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 144
cuaauuaaua cagccucuct t 21
<210> 145
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 145
agaggcugua uuaauuagct t 21
<210> 146
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 146
gcuaauuaau acagccucut t 21
<210> 147
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 147
gaggcuguau uaauuagcct t 21
<210> 148
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 148
ggcuaauuaa uacagccuct t 21
<210> 149
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 149
aggcuguauu aauuagccut t 21
<210> 150
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 150
aggcuaauua auacagccut t 21
<210> 151
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 151
ggcuguauua auuagccugt t 21
<210> 152
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 152
caggcuaauu aauacagcct t 21
<210> 153
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 153
gcuguauuaa uuagccuggt t 21
<210> 154
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 154
ccaggcuaau uaauacagct t 21
<210> 155
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 155
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<210> 156
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 156
gccaggcuaa uuaauacagt t 21
<210> 157
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 157
uguauuaauu agccuggcut t 21
<210> 158
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 158
agccaggcua auuaauacat t 21
<210> 159
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (21)..(22)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 159
caggaucgca gggagaggcu tt 22
<210> 160
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (21)..(22)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 160
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<210> 161
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (21)..(22)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 161
aggaucgcag ggagaggcug tt 22
<210> 162
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (21)..(22)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 162
cagccucucc cugcgauccu tt 22
<210> 163
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (21)..(22)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 163
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<210> 164
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (21)..(22)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 164
acagccucuc ccugcgaucc tt 22
<210> 165
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (21)..(22)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 165
gaucgcaggg agaggcugua tt 22
<210> 166
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (21)..(22)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 166
uacagccucu cccugcgauc tt 22
<210> 167
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (21)..(22)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 167
aucgcaggga gaggcuguau tt 22
<210> 168
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (21)..(22)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 168
auacagccuc ucccugcgau tt 22
<210> 169
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (21)..(22)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 169
ucgcagggag aggcuguauu tt 22
<210> 170
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (21)..(22)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 170
aauacagccu cucccugcga tt 22
<210> 171
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (21)..(22)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 171
cgcagggaga ggcuguauua tt 22
<210> 172
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (21)..(22)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 172
uaauacagcc ucucccugcg tt 22
<210> 173
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (21)..(22)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 173
gcagggagag gcuguauuaa tt 22
<210> 174
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (21)..(22)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 174
uuaauacagc cucucccugc tt 22
<210> 175
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (21)..(22)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 175
cagggagagg cuguauuaau tt 22
<210> 176
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (21)..(22)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 176
auuaauacag ccucucccug tt 22
<210> 177
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (21)..(22)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 177
agggagaggc uguauuaauu tt 22
<210> 178
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (21)..(22)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 178
aauuaauaca gccucucccu tt 22
<210> 179
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (21)..(22)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 179
gggagaggcu guauuaauua tt 22
<210> 180
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (21)..(22)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 180
uaauuaauac agccucuccc tt 22
<210> 181
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (21)..(22)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 181
ggagaggcug uauuaauuag tt 22
<210> 182
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (21)..(22)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 182
cuaauuaaua cagccucucc tt 22
<210> 183
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (21)..(22)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 183
gagaggcugu auuaauuagc tt 22
<210> 184
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (21)..(22)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 184
gcuaauuaau acagccucuc tt 22
<210> 185
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (21)..(22)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 185
agaggcugua uuaauuagcc tt 22
<210> 186
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (21)..(22)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 186
ggcuaauuaa uacagccucu tt 22
<210> 187
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (21)..(22)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 187
gaggcuguau uaauuagccu tt 22
<210> 188
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (21)..(22)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 188
aggcuaauua auacagccuc tt 22
<210> 189
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (21)..(22)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 189
aggcuguauu aauuagccug tt 22
<210> 190
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (21)..(22)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 190
caggcuaauu aauacagccu tt 22
<210> 191
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (21)..(22)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 191
ggcuguauua auuagccugg tt 22
<210> 192
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (21)..(22)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 192
ccaggcuaau uaauacagcc tt 22
<210> 193
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (21)..(22)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 193
gcuguauuaa uuagccuggc tt 22
<210> 194
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (21)..(22)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 194
gccaggcuaa uuaauacagc tt 22
<210> 195
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (21)..(22)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 195
cuguauuaau uagccuggcu tt 22
<210> 196
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (21)..(22)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 196
agccaggcua auuaauacag tt 22
<210> 197
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (21)..(22)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 197
uguauuaauu agccuggcuc tt 22
<210> 198
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (21)..(22)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 198
gagccaggcu aauuaauaca tt 22
<210> 199
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(23)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 199
acaggaucgc agggagaggc utt 23
<210> 200
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(23)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 200
agccucuccc ugcgauccug utt 23
<210> 201
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(23)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 201
caggaucgca gggagaggcu gtt 23
<210> 202
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(23)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 202
cagccucucc cugcgauccu gtt 23
<210> 203
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(23)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 203
aggaucgcag ggagaggcug utt 23
<210> 204
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(23)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 204
acagccucuc ccugcgaucc utt 23
<210> 205
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(23)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 205
ggaucgcagg gagaggcugu att 23
<210> 206
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(23)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 206
uacagccucu cccugcgauc ctt 23
<210> 207
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(23)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 207
gaucgcaggg agaggcugua utt 23
<210> 208
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(23)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 208
auacagccuc ucccugcgau ctt 23
<210> 209
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(23)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 209
atcgcaggga gaggcuguau utt 23
<210> 210
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(23)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 210
aauacagccu cucccugcga utt 23
<210> 211
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(23)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 211
ucgcagggag aggcuguauu att 23
<210> 212
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(23)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 212
uaauacagcc ucucccugcg att 23
<210> 213
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(23)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 213
cgcagggaga ggcuguauua att 23
<210> 214
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(23)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 214
uuaauacagc cucucccugc gtt 23
<210> 215
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(23)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 215
gcagggagag gcuguauuaa utt 23
<210> 216
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(23)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 216
auuaauacag ccucucccug ctt 23
<210> 217
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(23)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 217
cagggagagg cuguauuaau utt 23
<210> 218
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(23)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 218
aauuaauaca gccucucccu gtt 23
<210> 219
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(23)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 219
agggagaggc uguauuaauu att 23
<210> 220
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(23)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 220
uaauuaauac agccucuccc utt 23
<210> 221
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(23)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 221
gggagaggcu guauuaauua gtt 23
<210> 222
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(23)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 222
cuaauuaaua cagccucucc ctt 23
<210> 223
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(23)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 223
ggagaggcug uauuaauuag ctt 23
<210> 224
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(23)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 224
gcuaauuaau acagccucuc ctt 23
<210> 225
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(23)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 225
gagaggcugu auuaauuagc ctt 23
<210> 226
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(23)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 226
ggcuaauuaa uacagccucu ctt 23
<210> 227
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(23)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 227
agaggcugua uuaauuagcc utt 23
<210> 228
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(23)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 228
aggcuaauua auacagccuc utt 23
<210> 229
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(23)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 229
gaggcuguau uaauuagccu gtt 23
<210> 230
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(23)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 230
caggcuaauu aauacagccu ctt 23
<210> 231
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(23)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 231
aggcuguauu aauuagccug gtt 23
<210> 232
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(23)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 232
ccaggcuaau uaauacagcc utt 23
<210> 233
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(23)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 233
ggcuguauua auuagccugg ctt 23
<210> 234
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(23)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 234
gccaggcuaa uuaauacagc ctt 23
<210> 235
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(23)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 235
gcuguauuaa uuagccuggc utt 23
<210> 236
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(23)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 236
agccaggcua auuaauacag ctt 23
<210> 237
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(23)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 237
cuguauuaau uagccuggcu ctt 23
<210> 238
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(23)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 238
gagccaggcu aauuaauaca gtt 23
<210> 239
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(23)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 239
uguauuaauu agccuggcuc ctt 23
<210> 240
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(23)
<223> 2'-脱氧核苷酸
<400> 240
ggagccaggc uaauuaauac att 23
<210> 241
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<400> 241
uagcgacuaa acacaucaa 19
<210> 242
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<400> 242
ccuacggaca gcagaguua 19
<210> 243
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<400> 243
gauuauaccc aacaagcaa 19
<210> 244
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<400> 244
gaucaauccu ccaugagua 19
<210> 245
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<400> 245
cgggacagcc caugauuaa 19
<210> 246
<211> 1759
<212> DNA
<213> 智人(Homo Sapiens)
<400> 246
tgcgcggaca tggcctcaaa cgattatacc caacaagcaa cccaaagcta tggggcctac 60
cccacccagc ccgggcaggg ctattcccag cagagcagtc agccctacgg acagcagagt 120
tacagtggtt atagccagtc cacggacact tcaggctatg gccagagcag ctattcttct 180
tatggccaga gccagaacag ctatggaact cagtcaactc cccagggata tggctcgact 240
ggcggctatg gcagtagcca gagctcccaa tcgtcttacg ggcagcagtc ctcctatcct 300
ggctatggcc agcagccagc tcccagcagc acctcgggaa gttacggtag cagttctcag 360
agcagcagct atgggcagcc ccagagtggg agctacagcc agcagcctag ctatggtgga 420
cagcagcaaa gctatggaca gcagcaaagc tataatcccc ctcagggcta tggacagcag 480
aaccagtaca acagcagcag tggtggtgga ggtggaggtg gaggtggagg taactatggc 540
caagatcaat cctccatgag tagtggtggt ggcagtggtg gcggttatgg caatcaagac 600
cagagtggtg gaggtggcag cggtggctat ggacagcagg accgtggagg ccgcggcagg 660
ggtggcagtg gtggcggcgg cggcggcggc ggtggtggtt acaaccgcag cagtggtggc 720
tatgaaccca gaggtcgtgg aggtggccgt ggaggcagag gtggcatggg cggaagtgac 780
cgtggtggct tcaataaatt tggtggccct cgggaccaag gatcacgtca tgactccgaa 840
caggataatt cagacaacaa caccatcttt gtgcaaggcc tgggtgagaa tgttacaatt 900
gagtctgtgg ctgattactt caagcagatt ggtattatta agacaaacaa gaaaacggga 960
cagcccatga ttaatttgta cacagacagg gaaactggca agctgaaggg agaggcaacg 1020
gtctcttttg atgacccacc ttcagctaaa gcagctattg actggtttga tggtaaagaa 1080
ttctccggaa atcctatcaa ggtctcattt gctactcgcc gggcagactt taatcggggt 1140
ggtggcaatg gtcgtggagg ccgagggcga ggaggaccca tgggccgtgg aggctatgga 1200
ggtggtggca gtggtggtgg tggccgagga ggatttccca gtggaggtgg tggcggtgga 1260
ggacagcagc gagctggtga ctggaagtgt cctaatccca cctgtgagaa tatgaacttc 1320
tcttggagga atgaatgcaa ccagtgtaag gcccctaaac cagatggccc aggaggggga 1380
ccaggtggct ctcacatggg gggtaactac ggggatgatc gtcgtggtgg cagaggaggc 1440
tatgatcgag gcggctaccg gggccgcggc ggggaccgtg gaggcttccg agggggccgg 1500
ggtggtgggg acagaggtgg ctttggccct ggcaagatgg attccagggg tgagcacaga 1560
caggatcgca gggagaggcc gtattaatta gcctggctcc ccaggttctg gaacagcttt 1620
ttgtcctgta cccagtgtta ccctcgttat tttgtaacct tccaattcct gatcacccaa 1680
gggttttttt gtgtcggact atgtaattgt aactatacct ctggttccca ttaaaagtga 1740
ccattttagt taaaaaaaa 1759
<210> 247
<211> 1759
<212> DNA
<213> 智人(Homo Sapiens)
<400> 247
tgcgcggaca tggcctcaaa cgattatacc caacaagcaa cccaaagcta tggggcctac 60
cccacccagc ccgggcaggg ctattcccag cagagcagtc agccctacgg acagcagagt 120
tacagtggtt atagccagtc cacggacact tcaggctatg gccagagcag ctattcttct 180
tatggccaga gccagaacag ctatggaact cagtcaactc cccagggata tggctcgact 240
ggcggctatg gcagtagcca gagctcccaa tcgtcttacg ggcagcagtc ctcctatcct 300
ggctatggcc agcagccagc tcccagcagc acctcgggaa gttacggtag cagttctcag 360
agcagcagct atgggcagcc ccagagtggg agctacagcc agcagcctag ctatggtgga 420
cagcagcaaa gctatggaca gcagcaaagc tataatcccc ctcagggcta tggacagcag 480
aaccagtaca acagcagcag tggtggtgga ggtggaggtg gaggtggagg taactatggc 540
caagatcaat cctccatgag tagtggtggt ggcagtggtg gcggttatgg caatcaagac 600
cagagtggtg gaggtggcag cggtggctat ggacagcagg accgtggagg ccgcggcagg 660
ggtggcagtg gtggcggcgg cggcggcggc ggtggtggtt acaaccgcag cagtggtggc 720
tatgaaccca gaggtcgtgg aggtggccgt ggaggcagag gtggcatggg cggaagtgac 780
cgtggtggct tcaataaatt tggtggccct cgggaccaag gatcacgtca tgactccgaa 840
caggataatt cagacaacaa caccatcttt gtgcaaggcc tgggtgagaa tgttacaatt 900
gagtctgtgg ctgattactt caagcagatt ggtattatta agacaaacaa gaaaacggga 960
cagcccatga ttaatttgta cacagacagg gaaactggca agctgaaggg agaggcaacg 1020
gtctcttttg atgacccacc ttcagctaaa gcagctattg actggtttga tggtaaagaa 1080
ttctccggaa atcctatcaa ggtctcattt gctactcgcc gggcagactt taatcggggt 1140
ggtggcaatg gtcgtggagg ccgagggcga ggaggaccca tgggccgtgg aggctatgga 1200
ggtggtggca gtggtggtgg tggccgagga ggatttccca gtggaggtgg tggcggtgga 1260
ggacagcagc gagctggtga ctggaagtgt cctaatccca cctgtgagaa tatgaacttc 1320
tcttggagga atgaatgcaa ccagtgtaag gcccctaaac cagatggccc aggaggggga 1380
ccaggtggct ctcacatggg gggtaactac ggggatgatc gtcgtggtgg cagaggaggc 1440
tatgatcgag gcggctaccg gggccgcggc ggggaccgtg gaggcttccg agggggccgg 1500
ggtggtgggg acagaggtgg ctttggccct ggcaagatgg attccagggg tgagcacaga 1560
caggatcgca gggagaggct gtattaatta gcctggctcc ccaggttctg gaacagcttt 1620
ttgtcctgta cccagtgtta ccctcgttat tttgtaacct tccaattcct gatcacccaa 1680
gggttttttt gtgtcggact atgtaattgt aactatacct ctggttccca ttaaaagtga 1740
ccattttagt taaaaaaaa 1759
<210> 248
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 248
tctcgagctc aagcttcgaa ttctg 25
<210> 249
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 249
tctttcttca ccggcatctg catcc 25
<210> 250
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 250
gccggtgaag aaagaatggc ctcaaacgat tatac 35
<210> 251
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 251
agcttgagct cgagattttt tttaactaaa atggtcac 38
<210> 252
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 252
tctcgagctc aagcttcgaa ttctg 25
<210> 253
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 253
tctgagtccg gagctgtgcc ccagt 25
<210> 254
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 254
agctccggac tcagaatggc ctcaaacgat tatac 35
<210> 255
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 255
agcttgagct cgagattttt tttaactaaa atggtcac 38
<210> 256
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 256
attaggcgcg ccaccatgga gagcgacgag 30
<210> 257
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 257
taatgcggcc gcttgagctc gag 23
<210> 258
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 258
attaggcgcg ccaccatggt gggtgaggat ag 32
<210> 259
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 259
taatgcggcc gcttgagctc gag 23
<210> 260
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 260
caccaactgg gacgacat 18
<210> 261
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 261
acagcctgga tagcaacg 18
<210> 262
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 262
cttatggcca gagccagaac a 21
<210> 263
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 263
atcatgggct gtcccgtttt 20
<210> 264
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 264
tgggcatcgt ggagtacca 19
<210> 265
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 265
tgcttgttgg gtataatcgt ttga 24
<210> 266
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 266
ctgcgacctg cctagcaaac 20
<210> 267
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 267
ccatagcttt gggttgcttg tt 22
<210> 268
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针
<400> 268
agaccccgga tgcag 15
<210> 269
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针
<400> 269
acagctccgg actca 15
Claims (30)
1.一种siRNA，其为由有义链和反义链组成的siRNA，
该反义链包括与编码P525L点突变FUS的mRNA的一部分互补或实质上互补的区域，其中所述互补的区域为19～21个核苷酸长度。
2.权利要求1所述的siRNA，所述反义链包括与序列号2、序列号4、序列号6、序列号8、序列号10、序列号12、序列号16、序列号18、序列号20、序列号22、序列号24、序列号28或序列号32相同或实质上相同的序列。
3.权利要求1所述的siRNA，所述反义链包括与序列号2、序列号4、序列号6、序列号8、序列号10、序列号12、序列号16、序列号18、序列号20、序列号22或序列号32相同或实质上相同的序列。
4.权利要求1所述的siRNA，所述反义链包括与序列号2、序列号4、序列号6、序列号8、序列号12、序列号16、序列号18、序列号20、序列号22、序列号24、序列号28或序列号32相同或实质上相同的序列。
5.权利要求1所述的siRNA，所述反义链包括与序列号4、序列号6、序列号12、序列号16、序列号18、序列号20或序列号22相同或实质上相同的序列。
6.权利要求1所述的siRNA，其包括与以下相同或实质上相同的序列：
由序列号1的有义链和序列号2的反义链构成的双链RNA；
由序列号3的有义链和序列号4的反义链构成的双链RNA；
由序列号5的有义链和序列号6的反义链构成的双链RNA；
由序列号7的有义链和序列号8的反义链构成的双链RNA；
由序列号9的有义链和序列号10的反义链构成的双链RNA；
由序列号11的有义链和序列号12的反义链构成的双链RNA；
由序列号15的有义链和序列号16的反义链构成的双链RNA；
由序列号17的有义链和序列号18的反义链构成的双链RNA；
由序列号19的有义链和序列号20的反义链构成的双链RNA；
由序列号21的有义链和序列号22的反义链构成的双链RNA；
由序列号23的有义链和序列号24的反义链构成的双链RNA；
由序列号27的有义链和序列号28的反义链构成的双链RNA；
由序列号31的有义链和序列号32的反义链构成的双链RNA；
由序列号39的有义链和序列号40的反义链构成的双链RNA；
由序列号41的有义链和序列号42的反义链构成的双链RNA；
由序列号43的有义链和序列号44的反义链构成的双链RNA；
由序列号45的有义链和序列号46的反义链构成的双链RNA，
由序列号47的有义链和序列号48的反义链构成的双链RNA；
由序列号49的有义链和序列号50的反义链构成的双链RNA；
由序列号53的有义链和序列号54的反义链构成的双链RNA；
由序列号55的有义链和序列号56的反义链构成的双链RNA，
由序列号57的有义链和序列号58的反义链构成的双链RNA；
由序列号59的有义链和序列号60的反义链构成的双链RNA；
由序列号61的有义链和序列号62的反义链构成的双链RNA；
由序列号71的有义链和序列号72的反义链构成的双链RNA；
由序列号89的有义链和序列号90的反义链构成的双链RNA；
由序列号95的有义链和序列号96的反义链构成的双链RNA；
由序列号97的有义链和序列号98的反义链构成的双链RNA；或
由序列号113的有义链和序列号114的反义链构成的双链RNA。
7.权利要求1所述的siRNA，其包括与以下相同或实质上相同的序列：
由序列号1的有义链和序列号2的反义链构成的双链RNA；
由序列号3的有义链和序列号4的反义链构成的双链RNA；
由序列号5的有义链和序列号6的反义链构成的双链RNA；
由序列号7的有义链和序列号8的反义链构成的双链RNA；
由序列号9的有义链和序列号10的反义链构成的双链RNA；
由序列号11的有义链和序列号12的反义链构成的双链RNA；
由序列号15的有义链和序列号16的反义链构成的双链RNA；
由序列号17的有义链和序列号18的反义链构成的双链RNA；
由序列号19的有义链和序列号20的反义链构成的双链RNA；
由序列号21的有义链和序列号22的反义链构成的双链RNA；
由序列号45的有义链和序列号46的反义链构成的双链RNA，
由序列号47的有义链和序列号48的反义链构成的双链RNA；
由序列号49的有义链和序列号50的反义链构成的双链RNA；
由序列号53的有义链和序列号54的反义链构成的双链RNA；
由序列号55的有义链和序列号56的反义链构成的双链RNA，
由序列号57的有义链和序列号58的反义链构成的双链RNA；
由序列号59的有义链和序列号60的反义链构成的双链RNA；
由序列号89的有义链和序列号90的反义链构成的双链RNA；
由序列号97的有义链和序列号98的反义链构成的双链RNA；或
由序列号113的有义链和序列号114的反义链构成的双链RNA。
8.权利要求1所述的siRNA，其包括与以下相同或实质上相同的序列：
由序列号3的有义链和序列号为4的反义链构成的双链RNA；
由序列号5的有义链和序列号6的反义链构成的双链RNA；
由序列号7的有义链和序列号8的反义链构成的双链RNA；
由序列号11的有义链和序列号12的反义链构成的双链RNA；
由序列号15的有义链和序列号16的反义链构成的双链RNA；
由序列号17的有义链和序列号18的反义链构成的双链RNA；
由序列号19的有义链和序列号20的反义链构成的双链RNA；
由序列号21的有义链和序列号22的反义链构成的双链RNA；
由序列号23的有义链和序列号24的反义链构成的双链RNA；
由序列号27的有义链和序列号28的反义链构成的双链RNA；
由序列号31的有义链和序列号32的反义链构成的双链RNA；
由序列号39的有义链和序列号40的反义链构成的双链RNA；
由序列号41的有义链和序列号42的反义链构成的双链RNA；
由序列号43的有义链和序列号44的反义链构成的双链RNA；
由序列号45的有义链和序列号46的反义链构成的双链RNA，
由序列号49的有义链和序列号50的反义链构成的双链RNA；
由序列号53的有义链和序列号54的反义链构成的双链RNA；
由序列号55的有义链和序列号56的反义链构成的双链RNA，
由序列号57的有义链和序列号58的反义链构成的双链RNA；
由序列号59的有义链和序列号60的反义链构成的双链RNA；
由序列号61的有义链和序列号62的反义链构成的双链RNA；
由序列号71的有义链和序列号72的反义链构成的双链RNA；
由序列号89的有义链和序列号90的反义链构成的双链RNA；
由序列号95的有义链和序列号96的反义链构成的双链RNA；或
由序列号97的有义链和序列号98的反义链构成的双链RNA。
9.权利要求1所述的siRNA，其包括与以下相同或实质上相同的序列：
由序列号3的有义链和序列号4的反义链构成的双链RNA；
由序列号5的有义链和序列号6的反义链构成的双链RNA；
由序列号11的有义链和序列号12的反义链构成的双链RNA；
由序列号15的有义链和序列号16的反义链构成的双链RNA；
由序列号17的有义链和序列号18的反义链构成的双链RNA；
由序列号19的有义链和序列号20的反义链构成的双链RNA；
由序列号21的有义链和序列号22的反义链构成的双链RNA；
由序列号45的有义链和序列号46的反义链构成的双链RNA，
由序列号49的有义链和序列号50的反义链构成的双链RNA；
由序列号53的有义链和序列号54的反义链构成的双链RNA；
由序列号55的有义链和序列号56的反义链构成的双链RNA，
由序列号57的有义链和序列号58的反义链构成的双链RNA；
由序列号59的有义链和序列号60的反义链构成的双链RNA；
由序列号89的有义链和序列号90的反义链构成的双链RNA，或
由序列号97的有义链和序列号98的反义链构成的双链RNA。
10.权利要求1至9中任一项所述的siRNA，所述siRNA在其有义链和/或反义链的3’末端包含2个核苷酸长度的突出端，为21～23个碱基对。
11.权利要求1至10中任一项所述的siRNA，其中所述siRNA包括至少一个修饰的核苷酸。
12.权利要求1至11中任一项所述的siRNA，其中所述修饰的核苷酸中至少一个含有5’-硫代磷酸酯基。
13.权利要求1至12中任一项所述的siRNA，其中所述修饰的核苷酸中至少一个选自2’-脱氧修饰的核苷酸、2’-脱氧-2’-氟修饰的核苷酸、2’-O-甲基修饰的核苷酸、2’-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸和2’-O原子和4’-C原子经由亚甲基或亚乙基交联的核苷酸。
14.权利要求1至13中任一项所述的siRNA，其用于抑制P525L点突变FUS表达。
15.权利要求1至13中任一项所述的siRNA，其用于选择性抑制P525L点突变FUS表达，而不实质上抑制野生型FUS表达。
16.医药组合物，其包含权利要求1至13中任一项所述的siRNA。
17.用于抑制P525L点突变FUS表达的医药组合物，其包含权利要求1至13中任一项所述的siRNA。
18.用于选择性抑制P525L点突变FUS表达，而不实质上抑制野生型FUS表达的医药组合物，其包含权利要求1至13中任一项所述的siRNA。
19.P525L点突变FUS表达抑制剂，其包含权利要求1至13中任一项所述的siRNA。
20.ALS治疗剂，其包含权利要求1至13中任一项所述的siRNA或权利要求16至18中任一项所述的医药组合物。
21.权利要求20所述的ALS治疗剂，其中ALS是FUS基因中伴随P525L点突变的年轻人ALS。
22.治疗ALS的方法，其特征在于给予有效量的权利要求1至13中任一项所述的siRNA。
23.权利要求1至13中任一项所述的siRNA用于制备ALS治疗剂的用途。
24.DNA载体，其用于在细胞中表达权利要求1至13中任一项所述的siRNA。
25.包含权利要求24所述的DNA载体和药学上允许的载体的医药组合物。
26.包含权利要求24所述的DNA载体的细胞。
27.权利要求26所述的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
28.一种筛选选择性抑制P525L点突变FUS表达的ALS治疗剂的方法，其特征在于检测野生型FUS的表达抑制率和P525L点突变FUS的表达抑制率。
29.一种筛选方法，其为筛选作为ALS治疗剂活性成分而使用的siRNA的方法，包括
(1)设计siRNA的步骤，所述siRNA包含与编码P525L点突变FUS的mRNA的一部分互补或实质上互补的区域，所述互补的区域为19～21个核苷酸长度；
(2)制备步骤(1)中设计的siRNA的步骤，以及
(3)从步骤(2)制备的siRNA中筛选选择性抑制P525L点突变FUS表达而不实质上抑制野生型FUS表达的siRNA的步骤。
30.一种制备方法，其为以选择性抑制P525L点突变FUS表达的siRNA为活性成分的ALS治疗剂的制备方法，包括
(1)设计siRNA的步骤，所述siRNA包含与编码P525L点突变FUS的mRNA的一部分互补或实质上互补的区域，所述互补的区域为19～21个核苷酸长度；
(2)制备步骤(1)中设计的siRNA的步骤；
(3)从步骤(2)制备的siRNA中筛选选择性抑制P525L点突变FUS表达而不实质上抑制野生型FUS表达的siRNA的步骤；
(4)制备含有步骤(3)中筛选的siRNA作为活性成分的医药组合物的步骤；以及
(5)确认使用步骤(4)中制备的医药组合物作为ALS治疗剂的效果的步骤。
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