CN116348483A

CN116348483A - 嵌合t细胞受体，核酸及其制造和使用方法

Info

Publication number: CN116348483A
Application number: CN202180050112.6A
Authority: CN
Inventors: H·加尔邦
Original assignee: Nantes Biological Co
Current assignee: Nantes Biological Co
Priority date: 2020-07-31
Filing date: 2021-07-28
Publication date: 2023-06-27
Also published as: WO2022026577A1; US20220033459A1; EP4188949A1; WO2022026577A4

Abstract

本发明考虑了组合物和使用新颖组合物根除肿瘤细胞的方法。在一方面，提供了在单一嵌合物种中包含CAR支架和抗原结合结构域的药物组合物。在一些方面，CAR支架可以包含CD28共刺激信号传导区和CD3ζ激活结构域或完整的CD3ζ激活结构域。在一些方面，可以对CAR支架进行密码子优化，以改善在哺乳动物细胞系中的表达和/或在转染到天然杀伤(NK)或其他免疫细胞中时改善功能。在另外的方面，抗原结合结构域可以包含通过间隔区连接的VL和VH结构域，并且可以进行密码子优化。CD64前导序列可以附接至抗原结合结构域，例如在该抗原结合结构域的N末端处。

Description

嵌合T细胞受体，核酸及其制造和使用方法

技术领域

本发明的领域涉及编码嵌合T细胞受体(TCR)的嵌合受体基因，以及使用该嵌合受体基因用于治疗疾病如癌症的方法，该嵌合受体基因提供对用所述基因转化的免疫细胞的抗体类型特异性。

背景技术

背景描述包括可用于理解本文所述的组合物和方法的信息。并非承认本文提供的任何信息是现有技术或与组合物和方法相关，或承认特定或隐含提及的任何出版物为先前技术。

近年来，免疫疗法已经成为治疗癌症的治疗选择。多种单克隆抗体已被监管机构批准并被批准用于治疗各种类型的癌症。正在研究包括癌症疫苗和佐剂、嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法、免疫检查点抑制剂及其组合的其他方法。

然而，仍然需要提供特异性靶向肿瘤细胞用于治疗包括实体和血液恶性肿瘤的新型组合物和方法。因此，仍然需要提供CAR T细胞的改善的组合物和方法，其具有比它们的前身改善的性质。

发明内容

本文提供的方法和技术涉及开发和施用靶向免疫疗法的各种系统和方法，以及编码其的核酸。

在一方面，提供了在单一嵌合物种中包含CAR支架和抗原结合结构域的药物组合物。在一些方面，CAR支架可以包含CD28共刺激信号传导区和CD3ζ激活结构域。CD28共刺激信号传导区可包含胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域。在一些方面，胞质结构域可以包括CD28共激活结构域。在其他方面，CD3ζ激活结构域可以包含至少两个基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。在一些方面，可以对CAR支架进行密码子优化，以改善在哺乳动物细胞系中的表达和/或在转染到天然杀伤(NK)或其他类型的免疫细胞中时改善功能。在另外的方面，抗原结合结构域可以包含通过间隔区连接的VL和VH结构域。CD64前导序列可以附接至抗原结合结构域，例如在该抗原结合结构域的N末端处。

本文提供的组合物包括嵌合TCR和编码嵌合TCR的核酸。还提供了制造和施用嵌合TCR的方法。

可以将本文提供的组合物提供给任何合适的细胞，包括NK细胞、辅助T细胞、抑制性T细胞、细胞毒性T细胞、淋巴因子激活的T细胞和能够表达嵌合受体的任何其他免疫细胞。合适的NK细胞包括但不限于高亲和力自然杀伤细胞(haNK)、肿瘤激活的自然杀伤细胞(taNK)和激活的自然杀伤细胞(aNK)。

在一些方面，抗原结合结构域可包含scFv，其包括通过间隔区与VH结构域连接的VL结构域。scFv可以包括来自任何合适的单克隆抗体(包括但不限于已经被监管机构批准或正在研究的单克隆抗体，例如西妥昔单抗、加尼妥单抗等)的VH和VL结构域。

在其他方面，可以提供无信号传导结构域的抗原结合结构域和支架，使得表达CAR支架的NK细胞和表达抗原的细胞之间的接触刺激表达抗原的细胞的裂解。

在其他方面，抗原结合结构域可包含抗体片段，包括但不限于scFv、双scFv、Fab、Fab’、F(ab′)2、sdAb或互补决定区(CDR)。在又其他方面，抗原结合结构域可包含适体、亲和性多聚体(affimer)、肽、蛋白质、蛋白质支架、小分子等。

在又其他方面，抗原结合结构域可以包含蛋白结合结构域，包括但不限于FK506结合蛋白5(FKBP5)。与靶细胞表面上的抗原结合的任何合适的结合蛋白适于与本文提供的CAR支架一起使用。

抗体片段可以是人的、人源化的、合成的或嵌合的。

在其他方面，本主题还可包括包含本文披露的核酸的DNA载体和用于表达DNA载体的宿主细胞。可以将编码抗原结合结构域和CAR支架的核苷酸插入任何合适的表达载体中，其实例是本领域已知的。宿主细胞可包括但不限于哺乳动物细胞、昆虫细胞、真核细胞、原核细胞、酵母细胞、动物细胞或人细胞。宿主细胞还可以包括但不限于CHO细胞、NSO细胞、SP2-O细胞或J558细胞。

还考虑了制造和表达包含抗原结合结构域和CAR支架的构建体的方法。在某些方面，该方法包括：(a)将编码与CAR支架偶联的抗原结合结构域的DNA引入宿主细胞；和(b)在足以表达该抗原结合结构域和CAR支架的条件下在培养基中培养该宿主细胞。

根据本技术，考虑了用于治疗受试者的癌症的方法。该方法可以包括向所述受试者施用治疗有效量的药物组合物，该药物组合物包含与CAR支架偶联的抗原结合结构域。如本文所用，“治疗有效量”是指根据足以治疗特定疾病的剂量和/或给药方案施用药物组合物。本领域普通技术人员将理解，治疗有效量或剂量可取决于多种因素，包括肿瘤或癌症的类型、治疗组合物的施用途径、患者的特征、肿瘤或癌症已转移的程度和/或患者的总体健康状况。有效剂量也可以从得自体外或动物模型测试系统的剂量-反应曲线外推。

在一些实施例中，癌症选自但不限于由以下组成的组：脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、胃癌、肺癌、β细胞淋巴瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、间皮瘤、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、甲状腺癌、尿路上皮癌/膀胱癌和血液恶性肿瘤，例如急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和霍奇金淋巴瘤。本文呈现的技术适用于任何类型的肿瘤，包括但不限于原发性肿瘤、继发性肿瘤、复发性肿瘤和衍生性肿瘤。

在一些方面，施用每周进行一次、两次或三次。如本文所用，“施用”是指将药物组合物施用至有需要的患者。在其他方面，药物组合物可以通过任何合适的途径施用，包括但不限于支气管、肠内、皮肤内(interdermal)、动脉内、皮内、胃内、髓内、肌内、鼻内、鞘内、静脉内、心室内、黏膜、鼻、口服、直肠、皮下、舌下、局部、气管、透皮、阴道和玻璃体。

本文还考虑了上述组合物的各种用途。上述组合物的各种实施例也可以施用于有需要的患者。根据优选实施例的以下详细描述，组合物的各种目的、特征、方面和优点将变得更加显而易见。

附图说明

图1是显示根据本文提供的实例的抗原结合结构域和CAR支架的各种结构域的图示。抗原结合结构域包括附接至scFv结合分子的N末端的CD64前导序列，其中VL和VH结构域通过间隔区彼此连接。scFv结构域与包含CD28结构域和激活结构域的CAR支架偶联。CD28结构域包含胞外结构域、跨膜结构域、CD28共激活结构域，并且与包含至少两个ITAM区的CD3ζ激活结构域偶联。

图2A-2B是显示用于与本文提供的CAR支架比较的CAR-T受体的可替代构型的图示。图2A显示了包含与胞外CD8铰链区偶联的单链抗体片段的CAR构建体。铰链区与CD28跨膜结构域连接，该CD28跨膜结构域与胞内信号传导结构域连接，在这种情况下，胞内信号传导结构域是FcεRIγ信号传导结构域(而不是图1中所示的CD28-CD3ζ构建体)。该CAR构建体在比较研究中显示了细胞毒性/ADCC。

图2B显示了三顺反子构建体的图示，可以将其插入载体中，例如pNEUKv1载体。该构建体包含编码(按顺序)CD19CAR结构域、P2A序列、任选接头、CD16(158V)结构域、IRES序列和ERIL-2结构域的核苷酸序列。三顺反子构建体掺入了Fc受体(CD16-158V)的高亲和力变体的表达，并在不存在外源IL-2的情况下允许生长活性。

图3A-3B显示了根据本文提供的方面的CD28-CD3ζ构建体的另外的图示。图3A显示了与CD28-CD3ζ支架偶联的抗原结合结构域的详细功能组织。抗原结合结构域包含FMC63-V_L结构域-GS间隔区-FMC63-V_H结构域(也称为19slh28ζ)。抗原结合结构域和CAR支架可以插入任何合适的载体中，并且可以包含约1464bp。在该图中，显示了CDR(重链和轻链的CDR1、CDR2、CDR3)的位置。

图3B显示了19slh28ζ(p123)构建体的另一个图示，其类似于图1，并且包括通过SG_x间隔区连接的FMC63-VL和FMC63-VH结构域。显示了CAR支架的各种结构域，包括CD28和CD3ζ激活结构域。如本文所述，对照载体(未示出)可用于功能比较。

图4显示了人密码子优化的DNA序列(CAR19slh28ζ(αCD19-CD28/CD3ζ))的核苷酸序列。显示了编码各种结构域的核苷酸序列，包括编码CD64前导序列的核苷酸序列(SEQ IDNO.：1)，编码可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO.：2，4)，编码G-S间隔区的核苷酸序列(SEQID NO.：3)和编码胞外结构域、跨膜和信号传导结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO.：5)。如前所示，SEQ ID NO.：1-5可以连接在一起形成编码抗原结合结构域的全长CAR构建体。

SEQ ID NO.：5表示图4-17的CAR支架，除非另有说明。此外，图4-17对应于已经进行密码子优化用于在人细胞系中表达的核苷酸序列，在一些情况下，导致CAR支架构建体的表达水平比未密码子优化的构建体改善高达25％。因此，编码VH、VL和/或CD28/CD3ζ结构域的一个或多个核苷酸序列可以进行密码子优化。

图5显示图4的核苷酸序列的另一表示，但限于编码抗原结合结构域的序列。显示了多种结构域，包括编码CD64前导序列的核苷酸序列(SEQ ID NO.：1)，编码可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO.：2，4)和编码G-S间隔区的核苷酸序列(SEQ ID NO.：3)。将序列连接在一起(前导区-可变区-间隔区-可变区)以在表达时形成scFv序列。这些序列已进行密码子优化用于在人细胞中表达。

图6显示氨基酸序列(SEQ ID NO.：6)，对应于scFv形式的FMC63衍生的结合结构域的核苷酸序列(图5)。第一个下划线部分是CD64前导序列，其后是可变区(FMC63-VL)，第二个下划线部分代表G-S间隔区，其后是可变区(FMC63-VH)。

图7A-7B显示了比较图1和2B中构建体的特异性细胞裂解量的实验数据。这些构建体代表与CD19结合的抗CD19 CAR，CD19是在超过95％的B细胞恶性肿瘤中表达的B谱系特异性跨膜糖蛋白。由于该蛋白是细胞表面蛋白，因此它是新颖的基于CAR的免疫疗法的理想靶标。这些抗CD19 CAR可以将细胞毒性细胞靶向恶性细胞。

图7A显示了基于效应细胞与sup-B15细胞中靶细胞的比率的特异性裂解百分比。抗CD19 scFv三顺反子构建体和抗CD19 scFv CD28CD3ζ构建体均显示出比对照更高的细胞裂解百分比。三顺反子构建体似乎具有比CD28-CD3ζ构建体略高的细胞裂解百分比。这些差异可部分归因于抗原结合结构域的表达水平，其可基于细胞类型而变化。图7B显示了基于效应细胞与Ramos细胞中靶细胞的比率的特异性裂解百分比。抗CD19 scFv三顺反子构建体和抗CD19 scFv CD28-CD3ζ构建体均显示出比对照更高的细胞裂解百分比。三顺反子构建体和CD28-CD3ζ构建体显示相当的(10％以内)裂解百分比。

图8A显示了抗αPD-L1(SHIE2)scFv构建体的图示。显示了各种结构域，包括CD64前导结构域、重链和轻链可变区以及接头。

图8B显示了编码图8A的结构域的相应核苷酸序列，包括编码前导序列(SEQ IDNO.：1)、抗αPD-L1轻链和重链(SEQ ID NO.：7，9)和接头(SEQ ID NO.：8)的核苷酸序列。该核苷酸序列(前导区-可变区-接头-可变区)已进行密码子优化用于在人细胞中表达。

图9A显示了人密码子优化的抗αPD-L1(RBSC6)scFv构建体的图示。显示了各种结构域，包括CD64前导序列和通过接头/间隔区连接的重链和轻链可变区(RBSC6-VL和RBSC6-VH)。可变区连接在一起形成scFv序列。

图9B显示了编码图9A的抗αPD-L1(RBSC6)scFv构建体的核苷酸序列，包括编码CD64前导序列(SEQ ID NO.：1)、可变区(RBSC6-VL)(SEQ ID NO.：10)、接头(SEQ ID NO.：11)和另一个可变区(RBSC6-VH)(SEQ ID NO.：12)的核苷酸。该核苷酸序列(前导区-可变区-间隔区-可变区)已进行密码子优化用于在人细胞中表达。

图10显示了比较图8A-8B和9A-9B的表达构建体的特异性细胞裂解百分比的实验数据。这些构建体代表抗PD-L1 CAR。PD-L1(一种跨膜糖蛋白)在不同类型的癌细胞中表达，并且是基于CAR的免疫疗法的理想靶标。抗PD-L1抗体靶向癌细胞表面上的PD-L1以引发恶性细胞的细胞杀伤。图10显示了基于效应细胞与MDA-MB-231细胞中靶细胞的比率的抗PD-L1 CAR的特异性裂解百分比。RBSC6 scFv三顺反子构建体和SH1E2 scFv三顺反子构建体均显示出比对照更高的细胞裂解百分比。SH1E2 scFv CD28-CD3ζ构建体和RBSC6 scFv CD28-CD3ζ构建体均显示出比三顺反子构建体更高的细胞裂解百分比。

图11A显示了人密码子优化的αIGF1R(加尼妥单抗)scFv构建体的图示。显示了各种结构域，包括CD64前导序列和通过G-S间隔区连接的重链和轻链可变区(Gani-VL和Gani-VH)。可变区通过间隔区连接在一起形成scFv序列。

图11B显示了图11A的构建体的结构域的相应核苷酸序列。显示了编码前导序列(SEQ ID NO.：1)、加尼妥单抗轻链(SEQ ID NO.：13)、接头(SEQ ID NO.：30)和加尼妥单抗重链(SEQ ID NO.：14)的核苷酸序列。该序列(前导区-可变区-间隔区-可变区)已进行密码子优化用于在人细胞中表达。

图12A显示了αEGFR(西妥昔单抗)scFv构建体的图示。显示了各种结构域，包括CD64前导序列和通过G-S间隔区连接以形成scFv序列的重链和轻链可变区。

图12B显示了图12A的αEGFR scFv构建体的结构域的相应核苷酸序列。显示了编码前导序列(SEQ ID NO.：1)、抗αEGFR轻链(SEQ ID NO.：15)、G-S间隔区(SEQ ID NO.：3)和抗αEGFR重链(SEQ ID NO.：16)的核苷酸序列。该序列(前导区-可变区-间隔区-可变区)已进行密码子优化用于在人细胞中表达。

图13A-13B显示了比较图11A-11B和12A-12B的构建体的特异性细胞裂解百分比的实验数据。这些构建体代表抗IGFR-1或抗EGFR CAR。IGFR-1和EGFR是跨膜糖蛋白，在不同类型的癌细胞中表达，并且是基于CAR的免疫疗法的理想靶标。图13A显示了基于效应细胞与A549细胞中靶细胞的比率的特异性裂解百分比。抗EGFR scFv三顺反子构建体和抗EGFRscFv CD28/CD3ζ构建体均显示出比对照更高的细胞裂解百分比。抗EGFR scFv CD28-CD3ζ构建体通常显示出比抗EGFR三顺反子构建体更高的裂解百分比。

图13B显示了基于效应细胞与MDA-MB-231细胞中靶细胞的比率的特异性裂解百分比。抗IGFR-1 scFv CD28-CD3ζ构建体和抗IGFR-1 scFv三顺反子构建体均显示出比对照更高的细胞裂解百分比。抗IGFR-1 scFv CD28-CD3ζ构建体显示出比抗IGFR-1 scFv三顺反子构建体略高的裂解百分比。

图14A显示了人密码子优化的FRP5 scFv构建体的图示。显示了各种结构域，包括CD64前导序列和通过G-S间隔区/接头连接的重链和轻链可变区。可变区连接在一起形成scFv序列。抗原结合结构域可以结合HER2。

图14B显示了图14A的αERBB2(FRP5)scFv构建体的结构域的相应核苷酸序列。显示了编码前导序列(SEQ ID NO.：1)、(αFRP5-VH)FRP5重链(SEQ ID NO.：17)、接头(SEQ IDNO.：3)和(αFRP5-VL)FRP5轻链(SEQ ID NO.：18)的核苷酸序列。该序列(前导区-可变区-间隔区-可变区)已进行优化用于在人细胞中表达。

图15A显示了人密码子优化的曲妥珠单抗scFv构建体的图示。显示了各种结构域，包括CD64前导序列和通过G-S间隔区连接以形成scFv序列的重链和轻链可变区。

图15B显示了图15A的构建体的结构域的相应核苷酸序列。提供了编码CD64前导序列(SEQ ID NO.：1)、曲妥珠单抗-VH(SEQ ID NO.：19)、G-S间隔区(SEQ ID NO.：3)和曲妥珠单抗-VL(SEQ ID NO.：20)的核苷酸序列。该序列(前导区-可变区-间隔区-可变区)已进行优化用于在人细胞中表达。

图16显示了比较图14A-14B和15A-15B的构建体的特异性细胞裂解百分比的实验数据。FRP5CAR和曲妥珠单抗CAR均结合HER2(αERBB2)。图16显示了基于效应细胞与SK-OV3细胞中靶细胞的比率的特异性裂解百分比。αERBB2/FRP5 scFv三顺反子构建体和αERBB2/FRP5 scFv CD28-CD3ζ构建体均显示出比对照更高的细胞裂解百分比。

图17显示了编码CAR支架的核苷酸序列(SEQ ID NO.：5)，该CAR支架包含来自CD28的CD28共刺激区段和具有两个最终的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的CD3ζ的激活结构域。抗原结合结构域之后是CD28衍生的铰链(胞外结构域)、跨膜和共激活胞质结构域，之后是来自CD3ζ的远端激活结构域。核苷酸序列(SEQ ID NO.：5)可以被翻译以产生氨基酸序列(SEQ ID NO.：21)。

图18A-18B显示了含有CD3ζCO激活结构域的另一种CAR构建体的示意图。该构建体含有完整的CD3ζ基因，包括胞外结构域(铰链)、跨膜结构域和胞质结构域(例如，包括3 xITAM)。该构建体已进行密码子优化(CO)。

图18C显示了已进行密码子优化用于人表达的核苷酸序列，对应于图18A-18B的结构域。密码子优化改善了表达(例如，较高水平的构建体)，一旦转染到NK细胞(例如，taNK)中，这可以导致改善的功效(杀伤)。核苷酸序列(SEQ ID NO.：22)可以被翻译以产生氨基酸序列(SEQ ID NO.：23)。

图18D和18E显示了编码scFv-CD3ζ(SEQ ID NO.：22)和scFv-CD28/CD3ζ(SEQ IDNO.：5)支架的密码子优化的核苷酸。图18D显示了编码scFv-CD3ζ结构域(SEQ ID NO.：22)的胞外结构域(SEQ ID NO.：24)、跨膜结构域(SEQ ID NO.：25)、和胞质结构域(SEQ IDNO.：26)的核苷酸。图18E显示了编码scFv-CD28/CD3ζ结构域(SEQ ID NO.：5)的胞外结构域(SEQ ID NO.：27)、跨膜结构域(SEQ ID NO.：28)和胞质结构域(SEQ ID NO.：29)的核苷酸序列。

图19显示了根据本文提供的技术的构建体的多个示意图。激活结构域包含跨膜组分和具有三个ITAM的CD3ζ，并且可以进行密码子优化(CO)(P-WT-0031和P-WT-0032)或可以不进行密码子优化(P-WT-0029和P-WT-0030)。在一些情况下，可存在CD28铰链结构域(P-WT-0029和P-WT-0031)。重链和轻链结构域可以从任何合适的单克隆抗体(例如西妥昔单抗、加尼妥单抗等)获得。可以使用任何合适的表达载体，例如pRNi、pShuttle-CMV等。构建体可以包括单个载体构建体，例如scFv。可替代地，构建体可以包括pShuttle-CMV载体，其允许分别表达HC和LC链并在体内形成抗原结合结构域。

P-WT-0029和0030支架包括天然T细胞结构。P-WT-0031对应于包含CD28铰链+CD3ζ的支架，P-WT-0032对应于完整的CD3ζ支架。可以将这些支架中的任一种掺入NK细胞。

图20A显示了根据本技术的构建体的构建、取向和限制位点的示意图。显示了限制位点以及相关结构域(CD64-VH结构域-G-S间隔区/接头-VL结构域-CD3ζ完整CO)。

图20B显示了图20所示构建体的核苷酸序列(SEQ ID NO：31)、氨基酸序列(SEQ IDNO：32)、CDR和结构域的序列比对。

图21A显示了SPScFvFM63-VLVH-28Z 19 slh28ζ的构建、取向和限制位点。图21B显示了SPScFvFM63-VLVH-28Z 19 slh28ζ的序列比对、限制位点、核苷酸序列和氨基酸序列。核苷酸序列依次对应于SEQ ID NO：1-5(其分别对应于CD64信号序列、FMC63-VL(也描述为FMC63轻链可变区)、G-S间隔区、FMC63-VH(也描述为FMC63重链可变区)以及统称CD28和CD3ζ激活结构域(也描述为胞外结构域、跨膜和信号传导结构域))。氨基酸序列对应于SEQ IDNO：6，其对应于CD19-SPScFvFMC63，和SEQ ID NO：21，其对应于CAR-CD19-CD28/CD3ζ。

图22A显示了CD19-SPScFvFMC63的构建和取向，其分别对应于CD64信号序列、FMC63-VL、G-S间隔区和FMC63-VH。图22B显示了CD19-SPScFvFMC63的氨基酸序列(SEQ IDNO：6)。

图23A显示了αPD-L1 SHIE2 pNBS-XL52 ScFv的构建、取向和限制位点。图23B显示了αPD-L1 SHIE2 pNBS-XL52 ScFv的序列比对、限制位点、核苷酸序列和氨基酸序列。核苷酸序列依次对应于SEQ ID NO：1、7、8和9(其分别对应于CD64信号序列、SHIE2 VL(也描述为SHIE2轻链可变区)、接头和SHIE2 VH(也描述为SHIE2重链可变区))。氨基酸序列依次对应于SEQ ID NO：38和33-35，其分别对应于CD64、SHIE2 VL、接头和SHIE2 VH。

图24A显示了αPD-L1(RBSC6)ScFv的构建、取向和限制位点，其分别对应于CD64信号序列、RBSC6 VL、接头和RBSC6 VH。图24B显示了αPD-L1(RBSC6)ScFv的序列比对、限制位点、核苷酸序列和氨基酸序列。核苷酸序列依次对应于SEQ ID NO：1、10、8和12(其分别对应于CD64信号序列、RBSC6 VL(也描述为RBSC6轻链可变区)、接头和RBSC6 VH(也描述为RBSC6重链可变区))。氨基酸序列依次对应于SEQ ID NO：38、36、34和37(其分别对应于CD64、RBSC6 VL、接头和RBSC6 VH)。

图25A显示了αIGF1R(加尼妥单抗)ScFv的构建、取向和限制位点，其分别对应于CD64信号序列、Gani VL、G-S间隔区和Gani VH。图25B显示了αIGF1R(加尼妥单抗)ScFv的序列比对、限制位点、核苷酸序列和氨基酸序列。核苷酸序列依次对应于SEQ ID NO：1、13、3和14(其分别对应于CD64信号序列、Gani VL(也描述为加尼妥单抗轻链可变区)、G-S间隔区和Gani VH(也描述为加尼妥单抗重链可变区))。氨基酸序列依次对应于SEQ ID NO：38、40、39和41，其分别对应于CD64、Gani VL、G-S间隔区和Gani VH。

图26A显示了αEGFR(西妥昔单抗)pXL101b的构建、取向和限制位点，其分别对应于CD64信号序列、西妥昔单抗VL、G-S间隔区和西妥昔单抗VH。图26B显示了αEGFR(西妥昔单抗)pXL101b的序列比对、限制位点、核苷酸序列和氨基酸序列。核苷酸序列依次对应于SEQID NO：1、15、3和16(其分别对应于CD64信号序列、西妥昔单抗VL(也描述为西妥昔单抗轻链可变区)、G-S间隔区和西妥昔单抗VH(也描述为加尼妥单抗重链可变区))。氨基酸序列依次对应于SEQ ID NO：38、42、39和43，其分别对应于CD64、西妥昔单抗VL、G-S间隔区和西妥昔单抗VH。

图27A显示了αERBB2(FRP5)ScFv pXL011的构建、取向和限制位点，其分别对应于CD64信号序列、FRP5 VH、G-S接头和FRP5 VL。图27B显示了αERBB2(FRP5)ScFv pXL011的序列比对、限制位点、核苷酸序列和氨基酸序列。核苷酸序列依次对应于SEQ ID NO：1、17、3和18(其分别对应于CD64信号序列、FRP5 VH(也描述为FRP5重链可变区)、G-S接头和FRP5 VL(也描述为FRP5轻链可变区))。氨基酸序列依次对应于SEQ ID NO：38、44、39和45(其分别对应于CD64、FRP5 VL、G-S接头和FRP5 VH)。

图28A显示了αERBB2(曲妥珠单抗)ScFv TSHL28z-p147的构建、取向和限制位点，其分别对应于CD64信号序列、曲妥珠单抗VH、G-S间隔区和曲妥珠单抗VL。图28B显示了αERBB2(FRP5)ScFv DXL011的序列比对、限制位点、核苷酸序列和氨基酸序列。核苷酸序列依次对应于SEQ ID NO：1、19、3和20(其分别对应于CD64信号序列、曲妥珠单抗VH(也描述为曲妥珠单抗重链可变区)、G-S间隔区和曲妥珠单抗VL(也描述为曲妥珠单抗轻链可变区))。氨基酸序列依次对应于SEQ ID NO：38、46、39和47(其分别对应于CD64、曲妥珠单抗VL、G-S间隔区和曲妥珠单抗VH)。

具体实施方式

抗原结合结构域(例如，单链Fv结构域(scFv))可以与CAR支架融合，其中所述scFv基因包含经由柔性接头(例如，SG₂₅间隔区)连接至VH结构域的VL结构域，其中该CAR支架编码胞外结构域、跨膜结构域和能够激活免疫细胞(例如，诸如淋巴细胞或细胞毒性细胞)的胞质结构域。所得构建体由于抗原结合结构域(例如scFv)而提供对免疫细胞的抗体或抗体样特异性，并且由于包含胞质结构域的基因区段而提供激活免疫细胞的能力。这些技术可以在T细胞、肥大细胞和NK细胞以及其他合适的细胞类型中实施。

根据本实施例，提供了CAR支架和密码子优化形式的CAR支架，用于在免疫或其他细胞毒性细胞(包括NK细胞)中表达所述构建体，其中该CAR支架与抗原结合分子偶联。在一些方面，将这些CAR支架进行密码子优化，用于在免疫或其他细胞毒性细胞中表达以改善功效。

在一些方面，CAR支架可以包含与CD3ζ结构域或完整CD3ζ结构域偶联的CD28结构域，其与scFv连接。例如，序列可包含与scFv结构域偶联的前导序列，该scFv结构域与CAR支架偶联，其中该scFv包含：VL结构域-间隔区-VH结构域或VH结构域-间隔区-VL结构域。

在一些方面，间隔区可以是SG间隔区(例如，SG₂₅)，然而，间隔区可以包含在scFv内提供足够柔性以允许scFv结合至其预期靶标的任何排列的氨基酸。

在又其他实施例中，前导序列可以是CD64前导信号序列。CD64信号序列可包含指导scFv-激活结构域转运至细胞(例如，免疫或细胞毒性细胞)表面的信号肽。

在一些实施例中，抗原结合分子可以直接或通过接头附接至激活区(例如，这可以通过编码抗原结合分子的核苷酸、任选的间隔区和编码激活结构域的序列的重组表达来实现)。可以将重组表达系统转染到宿主细胞中，其中融合蛋白是组成型或诱导表达的。

抗原结合结构域可以包含前导序列、可变区、接头和另一个可变区。可以将编码这些结构域的核苷酸序列进行密码子优化，用于在特定细胞系中表达，导致基于CAR的构建体的更高表达水平和比非密码子优化的对应物改善的功效。应注意，密码子优化不改变多肽序列，但可改变密码子频率以优化在宿主生物体中的表达。

任何合适的抗原结合分子可以附接至尾部激活结构域。在一些方面，抗原结合分子可包含VH和VL结构域。VH和VL结构域可以从任何合适的单克隆抗体获得。

在一些方面，抗原结合分子可包括scFv、抗体、适体(DNA、RNA或Xeno核酸(XNA)核苷酸的短序列)、肽、蛋白质、蛋白质支架、融合蛋白或可被工程化以特异性与靶抗原结合的任何其他合适的分子。在一些实施例中，蛋白质支架与肽适体相关或衍生自肽适体。

在其他方面，编码CD28结构域的核酸序列可包含部分或全部编码CD28胞外结构域、CD28跨膜结构域和CD28胞质结构域的核酸。

在又其他方面，CD28结构域可以与CD3ζ激活结构域偶联。编码CD3ζ激活结构域的核酸序列可以编码至少两个ITAM、至少三个ITAM等。

示例性序列如下提供。在一方面，CAR-19slh28ζ支架可以包含尾端激活结构域，如SEQ ID NO.：21。该序列(SEQ ID NO.：21)包含各种结构域，包括胞外结构域(由SEQ IDNO.：27编码)、跨膜结构域(由SEQ ID NO.：28编码)和胞质结构域(由SEQ ID NO.：29编码)。

在另一方面，CAR支架含有密码子优化的CD3ζ结构域，例如SEQ ID NO.：23。该序列(SEQ ID NO.：23)还包含各种结构域，包括胞外结构域(由SEQ ID NO.：24编码)、跨膜结构域(由SEQ ID NO.：25编码)和胞质结构域(由SEQ ID NO.：26编码)。密码子优化可改善基于CAR的治疗性组合物在其靶宿主细胞(例如NK细胞)中的表达并由此改善其活性/功效。

在其他方面，任一种CAR支架(由SEQ ID NO.：5或SEQ ID NO.：22编码)可以附接至抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含CD64前导信号序列(由SEQ ID NO.：1编码)、可变重链(VH)或可变轻链(VL)(参见各种VH和VL结构域的图)、和GS间隔区(由SEQ ID NO.：3、SEQ ID NO.：10、SEQ ID NO.：13或SEQ ID NO.：30编码)，其中该GS间隔区连接VH和VL结构域。

在一些方面，预期与整个序列或序列的特定区域(例如，编码VH和/或VL结构域、CAR支架等的核苷酸序列)具有75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列落入本文提供的实施例的范围内。

同一性百分比是指在序列的全长上或在序列的指定区域上进行最大对应性比较和比对时相同的氨基酸残基或核苷酸的指定百分比。区域可包含至少50个核苷酸、至少100个核苷酸、至少200个核苷酸或更多。区域可包含至少10个氨基酸、至少20个氨基酸、至少50个氨基酸或更多。

如本文所用，“抗原结合结构域”是指特异性结合细胞表面(例如，恶性或癌细胞)上的抗原的分子。抗原结合结构域包括但不限于单链Fv(scFv)和其他抗体片段以及亲和性多聚体、适体、肽、蛋白质、小分子等。其他抗体片段包括但不限于F(ab’)₂、Fab₂、Fab’、Fab、Fv、scFv-Fc、VhH、二硫键连接的Fv(sdFv)等或其任何活性片段，即与抗原(例如EGFR、IGFR-1、FRP5、PD-L1等)或其变体免疫特异性结合的抗体片段或其他分子。

还应理解，任何抗体片段的任一个或多个CDR可以移植到本文所述的抗原结合结构域上。重链和轻链具有通过三个超可变区或CDR(CDR1、CDR2、CDR3)连接的相对保守的框架区(FR)的一般结构。通过框架区进行比对的重链和轻链的CDR能够与抗原结合。本领域技术人员能够基于已知技术确定CDR。

VH和VL结构域可以衍生自任何合适的抗体，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、人抗体、人源化抗体、鼠抗体、缀合的抗体(例如，与化疗剂、放射性核素、另一种蛋白质等缀合的抗体)、合成抗体、双特异性抗体、嵌合抗体、单链抗体、由Fab表达文库产生的抗体片段、由mRNA展示或噬菌体展示产生的抗体片段、和单价免疫球蛋白(例如，IgG)。

抗体或其片段可以使用本领域已知的任何合适的技术产生，包括杂交瘤技术、噬菌体展示的scFv的产生、mRNA展示的scFv或肽的产生、或抗血清的分离和筛选、化学合成、或通过使用重组表达系统。

可根据本领域已知的技术筛选抗体片段(例如scFv)以结合合适的抗原。亲和力成熟可用于提高scFv对其期望靶标的亲和力。施用给患者的治疗组合物包括包含本文所述的抗体片段(例如，scFv等)的复合物，并且通常是人或人源化的。

抗体片段(例如，scFv)可以是任何来源，包括但不限于人、鼠(例如，小鼠和大鼠)、驴、兔、山羊、豚鼠、鸟、骆驼、马或鸡。出于治疗目的，优选人抗体或人源化抗体。

可以应用本领域已知的用于筛选大组合文库以鉴定与抗原结合的抗体片段的任何方法，包括但不限于噬菌体展示、酵母表面展示、核糖体展示或mRNA展示或其任何组合(参见，Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual[抗体：实验室手册]，Cold SpringHarbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社]，第2版1988；Hammerling等人，Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas[单克隆抗体与T细胞杂交瘤](1981)563-681；WO 98/31700)。

如本文所用，“特异性结合”典型地是指靶标实体(例如，细胞)与抗原结合结构域之间的非共价相互作用，并且通常是指靶标实体的特定结构特征(例如，细胞表面上的抗原决定簇)与抗原结合结构域之间存在这种相互作用。如本领域技术人员所理解的，如果在存在其他替代相互作用的情况下发生相互作用，则认为该相互作用是特异性的。

如本文所用，“组合物”或“药物组合物”是指包含递送至患者的治疗性细胞的配制品，该治疗性细胞包含与抗原结合结构域偶联的CAR支架并且可包括一种或多种另外的成分(例如，缓冲剂、赋形剂、稳定剂、稀释剂、乳化剂、防腐剂等)。

如本文所用，并且除非上下文另外指明，否则术语“连接到”或“与…连接”旨在包括直接偶联(其中两个彼此偶联的要素彼此接触)和间接偶联(其中至少一个另外的要素位于两个要素之间)。

在其他实施例中，可进行测定以确定组合物的有效性。对于这种检测，可以使用包括以下步骤的测定：在适合生长的条件下和在肿瘤微环境中培养肿瘤细胞，使这些细胞与本文所述的基于CAR的治疗剂接触，然后评估基于CAR的治疗剂是否减小或抑制肿块的大小。

本文披露的组合物的组分可以以几乎任何方式组织，条件是维持所设计的复合物的功能活性。另外，本文所述的复合物可包括一个或多个标签，例如以促进复合物的组分的修饰、鉴定和/或纯化。

接头/间隔区

接头序列可用于连接scFv的VH和VL结构域，同时保持VH和VL结构域的期望功能活性。如本文所用，除非另有说明，否则术语“接头序列”、“接头”、“间隔区”和“G-S间隔区”是可互换的并且是指连接VH和VL结构域的序列。当考虑特定的接头序列时，其将与相应的SEQID NO相关联。接头序列应允许VH和VL结构域的有效定位，以允许包括与它们各自的抗原靶标结合的功能活性。

接头优选由产生肽的核苷酸序列编码，该核苷酸序列可有效定位VH和VL结构域或其他抗体片段以识别其预期靶标。

在一些方面，接头序列是柔性的，以便不将VH和VL结构域限制在不期望的构象中。在一些实施例中，接头包含具有小侧链的氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸，以提供柔性。优选约80％或90％或更多的接头序列包含此类残基。在说明书中提供了编码接头的示例性核苷酸序列(SEQ ID NO.：3、SEQ ID NO.：10、SEQ ID NO.：13和SEQ ID NO.：30)，尽管任何合适的接头序列可以与本文提供的实施例一起使用。可以使用不同的接头序列，包括已经成功地用于将抗体可变区连接在一起的许多柔性接头设计中的任何一种，参见Whitlow，M.等人，(1991)Methods：A Companion to Methods in Enzymology[方法：与酶学方法的比较]2：97-105。合适的接头序列可凭经验鉴定，或通过计算机建模技术确定。

本文所述的组合物可以与任何抗癌疗法组合施用，该抗癌疗法包括但不限于化疗剂(此类方法是本领域技术人员已知的并且描述于E.W.Martin的Remington′sPharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学]中)、手术、放射疗法和/或化疗。

重组表达系统

将多核苷酸导入宿主细胞用于表达的方法是本领域熟知的，包括但不限于将外源核苷酸序列整合到细胞基因组中、其中外源多核苷酸序列不整合到细胞基因组中的基于载体的方法、以及病毒介导的方法。

目的序列(SOI)，在这种情况下，编码抗原结合结构域和CAR支架的核苷酸序列可以通过将核苷酸序列插入到合适的载体中以在哺乳动物细胞中表达并将载体转染到宿主哺乳动物细胞中而在宿主细胞中重组表达。

载体包括已经引入了遗传插入物的DNA分子，允许插入物在宿主细胞中复制和表达。载体包括质粒、病毒载体、粘粒和人工染色体。表达载体典型地包含复制起点(ORI)、包含可克隆插入物的各种限制位点的多克隆位点、和用于选择的一个或多个选择性标志物(例如，氨苄青霉素或四环素等)。另外，载体可以包括一个或多个转录单元，其中转录单元包括启动子、聚A信号序列和转录终止序列。在一些实施例中，启动子是哺乳动物启动子。在其他实施例中，启动子是病毒启动子。在又其他实施例中，启动子与目的基因相关。启动子可以是组成型的或诱导型的。如果被诱导，向细胞培养物中添加化学物质如IPTG以使系统重组表达期望的蛋白质。

病毒启动子包括但不限于来自腺病毒(例如，腺病毒2或5)、巨细胞病毒(CMV)、单纯疱疹病毒(胸苷激酶启动子)、逆转录病毒启动子(例如，MoMLV或RSV LTR)、泛素C(UBC)、EF1a、PGK、CAGG和猿猴病毒40(SV40)的启动子。许多其他病毒启动子是合适的，并且本文考虑了所有此类病毒启动子。

除非另有说明，否则这些技术使用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、病毒学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，所有这些都在普通技术人员的技能范围内。此类技术在文献中得到了更充分的解释。为了描述表达载体的功能组分，包括启动子、增强子、末端信号、剪接信号、聚A信号等的特定实例，参考以下实验室手册，这些实验室手册描述分子生物学标准技术，并且是本领域技术人员已知的(参见例如，Green和Sambrook编辑，Molecular Cloning：A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册]，第4版，Cold SpringHarbor Laboratory[冷泉港实验室]，纽约冷泉港，2012；Ausubel等人，Current Protocolsin Molecular Biology[当代分子生物学方案]，第3版1995；Bothwell等人Methods forCloning and Analysis of Eukaryotic Genes[真核基因的克隆和分析方法]，Jones andBartlett Publ.[琼斯和巴特利特出版社]1990；Wu，Grossman，Moldave编辑RecombinantDNA Methodology[重组DNA方法]，Academic Press[学术出版社]1989；Adams编辑，CellCulture for Biochemists[生物化学家的细胞培养]，Elsevier/North-HollandBiomedical Press[爱思唯尔/北荷兰生物医学出版社]，1990；Butler编辑，MammalianCell Biotechnology[哺乳动物细胞生物技术]，IRL Press[IRL出版社]，1991；Griffiths，等人，recombinant DNA technology in eukaryotes[真核生物中的重组DNA技术]，AnIntroduction to Genetic Analysis[遗传分析导论](2000)，纽约)。

哺乳动物表达载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关载体、杆状病毒载体、冠状病毒、单纯疱疹载体、慢病毒、pCMV系列质粒载体、pSV系列质粒载体、逆转录病毒载体、牛痘等。适合于哺乳动物表达的各种载体来源于病毒，存在许多这样的适合于在哺乳动物细胞中表达的载体，并且本文考虑了所有这些载体。

在其中需要将SOI整合到宿主细胞基因组中的实施例中，可以选择慢病毒表达系统。在其中不期望整合到宿主基因组中的实施例中，可以选择腺病毒表达系统或腺相关病毒表达系统。

将哺乳动物表达载体转染到宿主细胞中进行表达的各种方法是本领域已知的，包括病毒转染，脂质体转染，电穿孔，磷酸钙共沉淀，氯化铷或聚阳离子(例如DEAE-葡聚糖)介导的转染，原生质体融合和显微注射，参见例如Sambrook等人对这些技术的描述。优选地，转染方法将提供最佳的转染频率和构建体在特定宿主细胞系中的表达。可以使用本领域公知的技术进行优化。

在一些实施例中，细菌宿主细胞用于繁殖哺乳动物表达载体以制备用于亚克隆或用于引入宿主细胞的DNA储备液。在其他实施例中，细菌宿主细胞用于产生大量由SOI编码的蛋白质(例如复合物)。细菌宿主细胞包括但不限于大肠杆菌。酵母宿主细胞包括但不限于毕赤酵母。

用于细菌细胞的合适的表达载体包括但不限于细菌表达载体(例如，大肠杆菌表达载体如pGEX和pET系列)。在又其他实施例中，合适的表达载体包括但不限于酵母表达载体(例如pPIC系列)。在又其他实施例中，提供了含有转录和翻译所需组分的无细胞系统。

在优选的实施例中，使用腺病毒表达系统。在这样的系统中，可以将包含编码SOI的核苷酸的插入物克隆到穿梭载体中。穿梭载体和腺病毒骨架载体(例如，可商购获得的系统，例如来自细胞生物实验室公司(Cell Biolabs)的

腺病毒表达系统)均被线性化并共转染到293细胞中以在约2-3周内产生病毒储备溶液。然后可以使用病毒储备溶液以用编码一种或多种SOI的核苷酸转染靶宿主细胞。

在一些实施例中，可以将转染的细胞在表达重组蛋白的条件下培养。在一些实施例中，可以将细胞进行悬浮培养。在其他实施例中，可以将细胞进行组织培养。在又其他实施例中，可以诱导重组蛋白的表达。在又其他实施例中，重组蛋白的表达可以是组成型表达。

在一些实施例中，SOI与共刺激分子如细胞因子共表达。添加免疫刺激细胞因子以促进或引发免疫应答。细胞因子包括但不限于IL2、IL4、IL7、IL11、IL15、IL21、TNF-α、IFN-γ等。

与细胞毒性细胞一起使用

基因工程化细胞可表达本文提供的构建体(与CAR支架偶联的抗原结合结构域)。这些细胞可施用给患者以识别和消除致瘤和/或癌细胞。可以进行免疫应答测定以验证工程化细胞是否具有针对肿瘤或癌细胞的活性。

NK细胞被认为特别适用于本文，尤其是NK细胞是自体NK细胞，从获得肿瘤的相同个体获得的情况下。

可替代地，NK细胞也可以从单克隆来源(例如NK-92或NK-92衍生物)生长，其中细胞被修饰以具有至少一种杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)的降低的或消除的表达，以使此类细胞被组成型激活。可以使用本领域熟知的方案制备此类经修饰的细胞。

当然，还应理解，可以制备具有Fc受体和信号部分的不同组合或亚组合的多种不同细胞群体，从而甚至进一步提高预期的治疗效果。例如，可以施用两种不同的NK细胞群体，其中第一种类型的Fc受体是CD16a并且其中该细胞过表达Fcγ信号传导亚基，并且其中第二种类型的Fc受体是CD32a并且其中该细胞过表达Fcγ信号传导亚基。在另一个实例中，可以施用两种不同的细胞群体，其中第一细胞是表达CD16a并过表达Fcγ信号传导亚基的NK细胞，并且其中第二细胞是表达CD16a并过表达Fcγ信号传导亚基的CD8+T细胞。无论细胞来源如何，通常考虑的是，细胞是哺乳动物细胞，尤其是人细胞。

另外，特别是在细胞不是从接受随后修饰的细胞的哺乳动物获得的情况下，预期细胞对哺乳动物的免疫原性较低(例如，通过HLA移植或MHC复合物的缺失)。

在又另一个实例中，用于施用的合适的NK细胞可以是(或可以衍生自)本领域熟知的先前建立的治疗性细胞系。例如，合适的细胞系包括aNK细胞、haNK细胞、taNK细胞、NK-92细胞(例如，可从加利福尼亚州卡尔弗城杰弗逊大道9920号南特夸斯特公司(Nantkwest，9920 Jefferson Blvd.Culver City，CA)90232商购获得)或TALL 104细胞(例如，可从ATCC，CRL-11386，美国弗吉尼亚州马纳萨斯大学大道10801号，20110(10801 UniversityBoulevard，Manassas，VA 20110 USA)商购获得)。

在一些情况下，施用的细胞可以是同种异体的，并且可以被受体的免疫系统排斥。因此，在一些实施例中，将同种异体细胞毒性细胞修饰为对免疫抑制剂具有抗性(例如，灭活作为免疫抑制剂的靶标的基因，例如亲环蛋白基因成员、CD52、FKBP受体、糖皮质激素受体等)，使得细胞毒性细胞能够在免疫抑制剂存在下起作用。细胞毒性细胞与免疫抑制剂结合施用，这些免疫抑制剂包括但不限于免疫抑制性抗代谢物、钙调磷酸酶抑制剂、皮质类固醇、二氢叶酸还原酶抑制剂、肌苷一磷酸脱氢酶抑制剂、白介素-2ot链阻断剂或雷帕霉素靶标。

NK细胞表达多种激活受体，包括NKG2D、Ly49(一些是激活的，大多数是抑制性的)、KIR(激活的和抑制性的)、CD94-NKG2C和CD94-NKG2E、以及抑制性受体，包括Ly49和KIR。这些受体识别细胞应激配体以及I类MHC和相关分子(参见，Pegram等人，Immunology andCell Biology[免疫学和细胞生物学](2011)89：216-224)。

免疫激活

一旦基于CAR的治疗剂(例如，偶联至CAR支架的抗原结合结构域)结合至由癌细胞表达的抗原，细胞毒性细胞可引发癌细胞的破坏。尽管通常预期所有细胞毒性细胞都被认为适用于本文，但尤其优选的细胞毒性细胞包括NK细胞、激活的NK细胞、高亲和力NK细胞、CD8+T细胞和CD4+T细胞，它们已被修饰以重组表达基于CAR的治疗剂，它们中的任一种可以是不同来源的。

然而，应当理解，在其他方面，细胞毒性细胞也可以是巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞或嗜酸性粒细胞。因此，从不同的角度看，本文考虑的细胞可通过吞噬作用、孔形成、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的诱导、通过引发TNF或fas介导的杀伤途径等实现细胞毒性作用。

作为该过程的一部分，细胞毒性细胞可以释放各种类型的细胞毒性颗粒(例如，颗粒溶素、穿孔素、颗粒酶)。多种测定可用于监测细胞介导的细胞毒性，包括流式细胞术测定(例如基于裂解颗粒如穿孔素、颗粒酶的存在，或TNF家族成员如TNF-α、FasL或TRAIL的产生)(Zaritskaya 2010，Clay，T.等人，Clin.Cancer Res.[临床癌症研究](2001)&：1127-1135)。

在一个实施例中，获得体液，其中该体液包含细胞组分，例如展示与本文所述的表达CAR支架的细胞结合的抗原的致瘤细胞或癌细胞，并且表达抗原结合部分的细胞毒性细胞与这些细胞接触。然后进行测定以检测免疫应答，例如指示ADCC应答或ADCP应答已被患者自身的免疫细胞引发。

用于检测免疫应答的测定是本领域已知的并且在本文中描述。例如，用于检测这样的应答的测定可检测细胞毒性颗粒(例如，颗粒溶素、穿孔素、颗粒酶)的释放，或吞噬作用，或受体-配体介导的细胞溶解(例如，由Fas/APO途径介导)。多种流式细胞术测定可用于监测细胞介导的细胞毒性，例如基于裂解颗粒如穿孔素、颗粒酶的存在，或TNF家族成员如TNF-α、FasL或TRAIL的产生(Zaritskaya 2010，Clay，T.等人，Clin.Cancer Res.[临床癌症研究](2001)&：1127-1135)。

在其他实施例中，免疫刺激细胞因子与宿主细胞(表达基于CAR的治疗剂(例如，偶联至CAR支架的抗原结合结构域))组合施用给患者以促进或引发免疫应答。细胞因子包括但不限于IL2、IL4、IL7、IL11、IL15、IL21、TNF-α、IFN-γ等。在一些实施例中，细胞因子可以重新激活耗竭的T细胞。在其他情况下，免疫感受态细胞可以被工程化以重组表达一种或多种细胞因子。

治疗癌症的技术包括手术、放射疗法、化疗、免疫抑制剂(例如硫唑嘌呤、环孢菌素、甲氨蝶呤、霉酚酸酯等)、免疫疗法、靶向疗法、激素疗法、干细胞移植或其他精确方法。这些技术中的任一种可与本发明的实施例组合以治疗癌症。

应当理解，本发明的实施例可以使用适当的配制品、适应症和给药方案施用给患者，这些配制品、适应症和给药方案适用于政府监管机构如美国食品和药物管理局(FDA)。

在一些实施例中，将表达基于CAR的治疗剂(例如，偶联至CAR支架的抗原结合结构域)的细胞毒性细胞作为药物组合物施用给患者。在另一个实施例中，考虑了通过向受试者施用细胞毒性细胞来治疗癌症的方法。在又另一个实施例中，考虑了通过向受试者施用细胞毒性细胞来抑制在其细胞表面上表达相应抗原(抗原结合区与其结合)的细胞的增殖或减少其增殖的方法。

在一些实施例中，相对于阴性对照，表达基于CAR的治疗剂(例如，偶联至CAR支架的抗原结合结构域)的细胞毒性细胞使患有与细胞表面上相应抗原的表达相关的癌症的受试者的量(例如，细胞数目、肿块大小等)减少至少25％、至少50％、至少75％、至少90％、至少95％或至少99％。

可由本文考虑的细胞毒性细胞治疗的癌症的实例包括在其细胞表面上表达或过表达癌症相关抗原的任何癌症。可以用表达基于CAR的治疗剂(例如，偶联至CAR支架的抗原结合结构域)的细胞毒性细胞治疗的癌症的实例包括但不限于乳腺癌、结肠癌、白血病、肺癌、黑素瘤、成神经细胞瘤、胰腺癌、儿科颅内室管膜瘤和前列腺癌。

药物组合物

药物组合物可以包含细胞毒性细胞，这些细胞毒性细胞包含本文所述的与CAR支架偶联或连接的抗原结合结构域，以及一种或多种药学上或生理学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。另外，药物组合物可包含一种或多种佐剂(例如氢氧化铝)、抗氧化剂、抑菌剂、缓冲剂、碳水化合物、螯合剂如EDTA或谷胱甘肽；着色剂、调味剂和/或芳香物质、乳化剂、赋形剂、润滑剂、pH缓冲剂、防腐剂、用于影响渗透压的盐、多肽(例如甘氨酸)、蛋白质、增溶剂、稳定剂、润湿剂等，其不有害地与活性化合物(例如与CAR支架偶联的抗原结合结构域等)发生反应或以其他方式干扰其活性。缓冲剂包括但不限于中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等。碳水化合物包括但不限于葡聚糖、葡萄糖、甘露糖、甘露醇、蔗糖等。

药物组合物可以被配制用于特定的施用模式。施用模式可包括但不限于：关节内、皮内、鼻内、腹膜内、鞘内、肿瘤内、静脉内、心室内、皮下、透皮、经黏膜或局部途径。

在优选的实施例中，细胞毒性细胞通过静脉内输注施用。这样的配制品可以根据本领域普通技术人员已知的标准技术制备。例如，待静脉内施用的组合物在输注到患者中之前可具有一种或多种成分(例如，稀释剂、悬浮缓冲液、盐水或葡萄糖/水、其他组分如细胞因子等)。

用于配制和施用药物组合物的许多此类技术是本领域已知的，例如美国专利申请公开号2014/0242025，并且所有此类参考文献通过引用整体并入本文。

在一些实施例中，细胞毒性细胞在体内增殖，从而在施用后在患者体内持续数月或甚至数年以提供抑制肿瘤生长或复发的持续机制。在一些方面，在向患者施用细胞毒性细胞后，这些细胞毒性细胞持续至少三个月、六个月、九个月、十二个月、十五个月、十八个月、两年、三年、四年或五年。

细胞毒性细胞可获自多种来源中的任一种(例如，分离自人、分离自可商购获得的细胞毒性细胞、分离自细胞库等)。用于离体扩增NK细胞、T细胞或其他类型的细胞毒性细胞的程序是本领域已知的(例如，Smith等人，Clinical&Translational Immunology[临床和移植免疫学](2015)4：e31)。本文呈现的实例不旨在限于细胞毒性细胞离体扩增的任何特定方法。

如本文所述的包含细胞毒性细胞的药物组合物可以10⁴至10⁹个细胞/kg体重、10⁵至10⁶个细胞/kg体重或这些范围内的任何整数值的剂量施用。细胞毒性细胞组合物可以这些剂量一次性或连续(在数天或数周或数月的过程中)施用。用于细胞毒性细胞如T细胞的输注技术是本领域已知的(参见例如Rosenberg等人，New Eng.J.of Med.[新英格兰医学杂志]319：1676，1988)。

在其他实施例中，药物组合物以治疗有效量施用，该治疗有效量是有效治疗特定适应症的量。施用可以作为一次性剂量或基于间隔进行。如本文所用，“间隔”指示定期施用治疗有效量(与一次性剂量不同)。对于单个个体的施用间隔不需要以固定的间隔进行，而是可以随时间变化。术语“与…组合”或“共同施用”指示组合物可在另一组合物之前不久、同时或大约同时或之后不久施用。

对于本领域技术人员应当清楚的是，在不脱离本文构思的情况下，除了已经描述的那些之外的更多修改是可能的。因此，本主题仅受限于所附权利要求书的范围。此外，在解释本说明书和权利要求书时，所有术语都应当以与上下文一致的尽可能广泛的方式来解释。特别地，术语“包含/包括(comprises和comprising)”应当被解释为以非排他性方式提及要素、组分或步骤，从而指示所提及的要素、组分或步骤可以与未明确提及的其他要素、组分或步骤一起存在、或使用、或组合。在本说明书的权利要求书提及选自由A、B、C和N组成的组的某物中的至少一种的情况下，该文本应当被解释为仅需要该组中的一种要素，而不是A加N或B加N等。

实例

实例1.抗原结合结构域-CAR支架的产生

多种技术可用于产生本文提供的构建体。这些构建体包含与接头融合的抗体片段(例如scFv、一个或多个CDR等)，该抗体片段与CAR支架融合。产生这些构建体的各种方案是本领域普通技术人员已知的。

在一个实施例中，编码scFv的核苷酸序列可根据本文呈现的技术(例如噬菌体展示、mRNA展示、来自单克隆抗体等)获得。在一些情况下，VH和VL结构域可以是本领域已知的，并且使用已知技术连接在一起以形成scFv。对应于scFv的核苷酸序列可以与CAR支架偶联。一旦获得完整的核苷酸序列，可以将其连接到合适的载体中。然后用载体转染免疫细胞，表达构建体，并对工程化细胞进行本文披露的测定。

CAR构建体将NK细胞引导至NK细胞特定靶标而不依赖于HLA匹配(与T细胞不同)(参见，例如，Hermanson等人，Front Immunol[免疫学前沿](2015)6：195；和Carlsten等人，Front Immunol[免疫学前沿](2015)6：266)。本文考虑的各种NK细胞系包括但不限于aNK、HaNK、NK-92、NKG、NKL、NK-YS、TaNK、YT和YTS细胞。

本文还考虑用编码一种或多种细胞因子例如IL2、IL4、IL7、IL11、IL15、IL21、TNF-α、IFN-γ的基因转染。在一些实施例中，转染IL-2和/或IL-15以促进体内扩增和持久性。

细胞毒性细胞可以用编码本文披露的构建体的载体进行基因修饰(即，体外转导或转染)。可以将细胞毒性细胞施用给哺乳动物受体以提供治疗益处，即指导细胞毒性细胞破坏在其表面上表达与抗原结合部分结合的抗原的细胞，例如癌细胞。

哺乳动物受体可以是人，并且相对于受体，细胞毒性细胞可以是自体的。可替代地，相对于受体，细胞可以是同种异体的、同基因的或异种异体的。在一些实施例中，同种异体细胞与免疫抑制剂一起施用。

实例2.细胞杀伤测定

杀伤测定是本领域已知的，例如在美国专利号7，741，465中。例如，如′465专利中所提供的，通过⁵¹Cr释放测定来测定转染细胞介导特异性靶细胞杀伤的能力。

例如，可以用本文提供的构建体转化工程化细胞，并且当与未转染的对照比较时，基于⁵¹Cr释放信号测量细胞裂解水平。与相应的对照细胞相比，转染细胞通常诱导从人肿瘤或癌细胞中显著更高的特异性⁵¹Cr释放。

实例3.免疫应答的检测

可以测试基因工程化细胞引发免疫应答的能力。可使用在体内和体外监测细胞免疫应答的多种测定(参见例如，Clay T.等人，Clin.Cancer Res.[临床癌症研究](2001)第1127-1135页)。

在一些实施例中，可以测试表达本文提供的构建体(与CAR支架偶联的抗原结合结构域)的细胞毒性细胞以从裂解的肿瘤细胞确定免疫应答是否被引发，例如通过检测细胞毒性颗粒的释放、吞噬作用或受体-配体介导的细胞溶解。

用于测量细胞裂解的传统测定包括向细胞培养物中添加放射性同位素，例如⁵¹Cr，其被捕获在活细胞内部。放射性同位素在细胞裂解时释放到细胞外液中，提供了发生裂解的量的指示物。

存在测量颗粒酶B水平的其他测定。颗粒酶B由激活的细胞毒性T细胞或NK细胞分泌。颗粒酶B通过胞吐作用释放，并且结合穿孔素能够进入靶细胞以帮助引发细胞死亡。酶联免疫测定(例如ELISpot、ELISA夹心测定)是本领域已知的，用于定量分泌的颗粒酶B的量。基本上，在对颗粒酶B特异的抗体存在下孵育细胞。除去细胞，添加第二颗粒酶B特异性抗体和可检测的标志物(例如生物素/碱性磷酸酶链霉亲和素复合物)。基于颜色形成的强度，可以量化颗粒酶B的量(参见，www.rndsystems.com/products/human-granzyme-b-elispot-kit_e12906#product-details；Malyguine A.等人.，Cells[细胞](2012)1(2)：111-126)。