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CN116333187A - 一种香蕉果肉中百分百甲酯化果胶的制备与应用 - Google Patents

一种香蕉果肉中百分百甲酯化果胶的制备与应用 Download PDF

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CN116333187A
CN116333187A CN202310412194.5A CN202310412194A CN116333187A CN 116333187 A CN116333187 A CN 116333187A CN 202310412194 A CN202310412194 A CN 202310412194A CN 116333187 A CN116333187 A CN 116333187A
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banana pulp
methyl
acid
water
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吕岱竹
宋佳
王明月
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Analysis & Testing Center Chinese Academy Of Tropical Agricultural Sciences
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Abstract

本发明公开了一种香蕉果肉中百分百甲酯化果胶，其结构为：同聚6‑O‑甲基‑(1→4)‑α‑D‑GalAp，分子量为117822Da，纯度为100％，由半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖组成，其摩尔比为0.95：0.042：0.007。本发明还公开了该果胶的制备方法，采用酶解结合酸解法，同时协同超声处理提取果胶，更能大大提高果胶的提取率。通过本发明的制备方法得到的果胶为百分百甲酯化果胶，命名为果胶BP，具有炎症调控和调节血糖的作用，可以应用于制备药品和功能性食品中。

Description

一种香蕉果肉中百分百甲酯化果胶的制备与应用
技术领域
本发明涉及食品、医药化工技术领域，尤其涉及一种香蕉果肉中百分百甲酯化果胶的制备与应用。
背景技术
果胶是羧基被不同程度甲酯化的线性聚半乳糖醛酸和聚L-鼠李糖半乳糖醛酸，一般从柑橘皮、苹果皮、葡萄皮、蚕砂和甜菜渣等植物细胞中提取。果胶来源广泛，自然界的植物、动物、海洋微生物等中均含有大量果胶，研究显示其具有多种生物活性，如抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗衰老等。目前已有表征的活性果胶化合物主要存在于海洋微生物、药用植物(如昆布、藻类、人参、当归)中。但是目前对于香蕉中果胶活性的报道仅有部分关于血脂调控功能的研究仍是较少的，Bagabaldo等研究发现相比高脂模型组小鼠肝脏切片显示有轻度坏死和脂肪浸润，香蕉果胶粗提物干预高脂模型组小鼠肝脏组织切片仅偶有脂肪沉积，该研究表明香蕉果胶具有较好调控血脂的功效。然而已有文献中并未对香蕉果胶提取物进一步纯化和对其结构进行较系统全面的表征。同时目前较少有对香蕉果胶应用于抗炎、调控血糖等方面的研究，对于香蕉来源的高酯果胶的结构解析更是鲜有报道。
果胶的提取方法有酸解法、酶解法、水提取法和离子交换法，其中水提法提取率不高，酸解提取方法的优势在于将大量水不溶性果胶分解成为水溶性果胶的同时，可以将果胶与纤维素、淀粉等物质进行分离。同时，高酯果胶在pH值2.5～4.5之间显示出更高的稳定性。本发明采用酶解结合酸解法，协同超声处理提取果胶，更大程度地提高果胶的提取率。
在上述背景基础上，本发明提出了一种香蕉果肉中完全甲酯化果胶的制备方法，并对该果胶进行了结构分析和应用研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，针对目前尚未发现将香蕉果肉果胶应用于炎症调控和血糖调节研究。
本发明的目的之一在于：提出了一种香蕉果肉中百分百完全甲酯化果胶。
其结构为：同聚6-O-甲基-(1→4)-α-D-GalAp，分子量为117822Da，分子量分布系数Mw/Mn为1.58，表明果胶BP分子量均一，纯度为100％，命名为果胶BP。
香蕉果肉中百分百甲酯化果胶由半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖组成，其摩尔比为0.95：0.042：0.007。
本发明的目的之二在于，香蕉果肉中百分百甲酯化果胶制备方法包括以下步骤：
步骤一、采用酶解和超声结合将原果胶转化为水溶性果胶：在香蕉果肉中加入果胶酯酶浸没，同时结合超声处理提取果胶；
步骤二、酸法提取：向上述提取液中加入盐酸溶液，调节pH值至2-2.5，采用热水浴浸提；
步骤三、将混合液过滤、离心至全部除去杂质，得到的上清液采用旋转蒸发仪浓缩，得到浓缩液；向浓缩液中加入1％稀氨水，调节pH值至4-5；
步骤四、分级沉淀：向浓缩液中恒速滴入95％无水乙醇待有悬浮颗粒沉淀出现后停止，放置过夜，待沉淀充分沉降后，离心或使用滤纸过滤至完全除去沉淀，收集上清液；继续滴入95％无水乙醇至上清液中，直至出现大量絮状沉淀物，停止滴入95％无水乙醇；放入冰箱中冷藏，待沉淀充分沉降后，离心除去多余水分和无水乙醇，收集沉淀部分，将沉淀物残留的乙醇完全蒸发去除；
步骤五、将沉淀冻干后，配制成1mg/mL的果胶溶液，通过离子交换柱，使用NaCl水溶液洗脱，得到流出液；
步骤六、将测出糖含量的流出液收集透析除盐后，浓缩并真空冻干，得到的纯品，命名为果胶BP。
进一步地，步骤一中采用酶解和超声结合将原果胶转化为水溶性果胶的方法为：将香蕉果肉切成薄块，晒干后研磨成粉，加入果胶酯酶淹没浸泡，然后超声处理。
进一步地，香蕉果肉和果胶酯酶用量比为1g:0.5-2mL；酶解温度为45-55℃，酶解时间为0.5-1.5h。超声处理条件为100-150w，15-30min。
进一步地，步骤二中酸法提取的方法为：将步骤一中的提取液中加入到4倍质量的超纯水中，使用浓度为0.5mol/L的盐酸调节pH值至2-2.5，在95℃热水浴中不停搅拌浸提2h，用纱布过滤除渣，将滤液回收；用滤渣再次重复以上浸提过程1-2次，过滤，除去滤渣，将浸提液与滤液混合。
进一步地，步骤三中离心条件为7100g/min，旋转蒸发仪的温度不超过50℃，得到浓缩液体积为上清液体积的3/4。
进一步地，步骤五中采用DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱纯化的方法为：洗脱液NaCl的浓度为0.15mol/L，收集的流出液通过苯酚-硫酸法测定糖含量，合并糖含量高的流出液收集管进一步透析处理。
本发明的目的之三在于，香蕉果肉中百分百甲酯化果胶在制备药品或保健食品上的应用。
进一步地，香蕉果肉中百分百甲酯化果胶在制备抑制炎症药品或血糖调节药品、功能性食品中的应用。
实施本发明实施例，具有如下有益效果：
本发明公开了一种香蕉果肉中百分百甲酯化果胶的制备方法，采用酶解和酸解结合，同时协同超声处理的方法提取，使得果胶能够与纤维素、淀粉等杂质去除，大幅度提升了果胶的提取率。
通过乙醇分级沉淀的分离方法，通过乙醇分级沉淀先行对果胶与其他多糖组分进行分离，减少了后续过柱纯化中出现较多组分，从而导致分离步骤繁琐、果胶损耗较过多的情况。
通过本发明的制备方法得到的果胶为百分百甲酯化果胶，命名为果胶BP，其结构为：同聚6-O-甲基-(1→4)-α-D-GalAp，分子量为117822Da，分子均一性高，纯度为100％。
本发明制备的百分百完全甲酯化果胶BP，具有炎症调控和血糖调节的作用，可以应用于制备药品和功能性食品中。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为果胶BP的高效液相色谱图；
图2为果胶BP的红外光谱图；
图3为果胶BP的扫描电镜图；
图4为果胶BP的HSQC谱图；
图5为果胶BP的COSY谱图；
图6为果胶BP的NOE谱图；
图7为果胶BP的C谱图；
图8为果胶BP的H谱图；
图9为果胶BP的HMBC远程相关谱图；
图10为果胶BP对LPS诱导炎症RAW264.7细胞分泌TNF-α含量影响的示意图；
图11为果胶BP炎症调控作用的蛋白表达谱图；
图12为果胶BP对炎症调控与JNK通路活化影响的蛋白定量图；
图13为果胶BP对预炎症调控与NF-κB通路活化影响的蛋白定量图；
图14为果胶BP对高糖诱导VEGF表达与ERK通路活化影响的蛋白条带图；
图15为果胶BP对高糖诱导ICAM-1表达与p38 MAPK通路活化影响的蛋白条带图；
图16为果胶BP对高糖诱导VEGF表达与ERK通路活化影响的蛋白定量图；
图17为果胶BP对高糖诱导ICAM-1表达与p38 MAPK通路活化影响的蛋白定量图。
具体实施方式
下面将结合本发明中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
果胶的溶解度与提取液pH相关。本发明采用酸解法的优势在于酸法使用的低pH能够加大果胶的溶解度，从而提高果胶提取率。同时，果胶的甲酯化程度和半乳糖醛酸含量也与提取液pH有关，高酯果胶在pH值2.5～4.5之间显示出更高的稳定性。因此使用酸提法提取高酯果胶的得率更高，并且可以将果胶与纤维素、淀粉等物质进行分离。协同超声处理提取果胶，更大程度地提高果胶的提取率。。
本发明的香蕉果肉中百分百甲酯化果胶制备方法包括以下步骤：
步骤一、采用酶解、超声处理结合将原果胶转化为水溶性果胶：在香蕉果肉中加入果胶酯酶浸没，同时结合超声提取果胶；采用酶解和超声结合将原果胶转化为水溶性果胶的方法具体为：将香蕉果肉切成薄块，晒干后研磨成粉，加入果胶酯酶淹没浸泡，然后超声处理。香蕉果肉和果胶酯酶用量比为1g:0.5-2mL；酶解温度为45-55℃，酶解时间为0.5-1.5h。超声处理条件为100-150w，15-30min。
步骤二、酸法提取：将步骤一中的提取液中加入到4倍质量的超纯水中，使用浓度为0.5mol/L的盐酸调节pH值至2-2.5，在95℃热水浴中不停搅拌浸提2h，用纱布过滤除渣，将滤液回收；用滤渣再次重复以上浸提过程1-2次，过滤，除去滤渣，将浸提液与滤液混合。
步骤三、将混合液过滤、离心至全部除去杂质，得到的上清液采用旋转蒸发仪浓缩，得到浓缩液；向浓缩液中加入1％稀氨水，调节pH值至4-5；其中，离心条件为7100g/min，旋转蒸发仪的温度不超过50℃，得到浓缩液体积为上清液体积的3/4。
步骤四、分级沉淀：向浓缩液中恒速滴入无水乙醇待有悬浮颗粒沉淀出现后停止，放置过夜，待沉淀充分沉降后，离心或使用滤纸过滤至完全除去沉淀，收集上清液；继续滴入无水乙醇至上清液中，直至出现大量絮状沉淀物，停止滴入无水乙醇；放入冰箱中冷藏，待沉淀充分沉降后，离心除去多余水分和无水乙醇，收集沉淀部分，将沉淀物残留的乙醇完全蒸发去除；
步骤五、将沉淀冻干后，配制成1mg/mL的果胶溶液，通过DEAE-Sepharose FastFlow离子交换柱纯化，采用的纯化方法为：使用0.15mol/L的NaCl溶液洗脱，收集流出液；将收集的流出液各管依次通过苯酚-硫酸法测定各管中糖含量，合并糖含量高的流出液EP管。
步骤六、将收集的流出液透析除盐后，浓缩，真空冻干，得到的白色疏松絮状纯品，命名为果胶BP。
通过上述步骤制备得到的果胶BP为百分百完全甲酯化果胶。
对果胶BP进行表征分析(各表征方法均为现有常用表征分析方法，具体步骤不多做描述)：
1、高效液相色谱分析：采用示差检测器检测，色谱柱BRT105-104-102串联凝胶柱，结果请参见图1和表1。
表1果胶BP的分子量
Figure BDA0004183582320000061
经过高效液相色谱检测分析可得知，果胶BP的平均分子量为117822Da，Mw/Mn为1.58，表明果胶BP均一，纯度为100％。
2、离子色谱分析：采用离子色谱仪测定果胶BP的单糖组成，结果请参见表2。
表2果胶BP的组分
Figure BDA0004183582320000071
由表2可以得知，果胶BP的单糖组成为：半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖，三者的摩尔比为0.95：0.042：0.007。
3、红外光谱分析：采用红外分析仪对果胶BP进行红外光谱分析，结果请参见图2，图2为果胶BP的红外光谱图。
吸收带在3600-3200cm-1是-OH的伸缩振动吸收峰，这个区域的吸收峰是糖类的特征峰。具体如下：3397cm-1是O-H的伸缩振动吸收峰，是糖类的特征峰。在2935cm-1处有一个吸收峰，可能归属于C-H伸缩振动。在1743cm-1处有一个吸收峰，可能归属于C＝O伸缩振动。在1625cm-1处有一个吸收峰，可能归属于结晶水。在1438cm-1处有吸收峰，可能归属于C-O伸缩振动。在1234cm-1处有吸收峰，可能归属于O-H变角振动。在1103cm-1处、1018cm-1处有吸收峰，可能归属于O-H变角振动。在919cm-1处有吸收峰，可能归属于吡喃环的非对称环伸缩振动。在831cm-1处有吸收峰，可能归属于吡喃环的α-端基差向异构的C-H变角振动。
4、扫描电镜分析：采用扫描电镜对果胶BP的外表面进行分析，结果请参见图3，图3为果胶BP的扫描电镜图。
由图中可以看出，在5000及10000倍下，样品均呈现卷曲状，可见刺突圆钝状，凸起部分膨大。
5、核磁结构分析：采用核磁共振谱仪对果胶BP的分子结构进行分析，结果请参见图4-9，图4为果胶BP的HSQC谱图，图5为果胶BP的COSY谱图，图6为果胶BP的NOE谱图，图7为果胶BP的C谱图，图8为果胶BP的H谱图，图9为果胶BP的HMBC远程相关谱图。
在HSQC谱中出现了一个单一、清晰的异头碳氢一键耦合相关δ101.60/4.88，说明该多糖主要由一种类型的糖残基组成，是个同聚多糖，下面对该残基进行化学位移归属。
在COSY谱中，H1-2的信号为δ4.88/3.61；H2-3的信号为δ3.61/3.91；H3-4的信号为δ3.91/4.37；H4-5的信号为δ4.37/5.00；可以推断出H1、H2、H3、H4、H5分别为δ4.88、3.61、3.91、4.37、5.00，在HSQC谱中对应的C1-5为δ101.60、65.22、70.33、80.25、71.76。结合单糖组分分析，可以推断该糖残基为半乳糖醛酸，
C谱中δ172.01为羰基C6的化学位移。一维和二维谱中都出现一个强的O甲基信号δ53.91/3.72，说明该半乳糖醛酸酸携带CH3O基团。
在NOE谱中，出现明显清晰的H1/H2、H1/H4偶极耦合相关，同时QC谱C4的化学位移往高场移动，可以得出，该多糖为1→4连接的GalA。
在HMBC远程相关谱中发现，CH3O的甲基H和GalA的羰基C6有强相关，同时GalA的羰基C6与GalA的H5有远程相关，说明甲氧基连接在GalA的6位。
结合H谱定量分析得出，糖环上的H和甲基H峰面积存在1：3的比值，可以得出该多糖的糖醛酸完全甲酯化，综合单糖组分、核磁分析以及相关文献，表征该多糖为同聚6-O-甲基半乳糖醛酸(HG)，因此，本果胶BP的结构式如下：
→[4)-α-D-GalAp-6-O-Me(1]n→。
经过研究发现，果胶BP具有抑制炎症和降糖的功能作用。
1、关于果胶BP对炎症调控作用的研究：
对果胶BP展开了影响小鼠RAW264.7细胞细胞因子TNF-α的研究：使用ELISA方法检测，如图10所示(柱形图从左到右依次对应右侧从上到下的标注，同下)，第一列和第二列柱形图分别为空白组和阳性LPS对照组，后面各列依次为在阳性药物LPS诱导后，加入果胶BP和抑制剂干预后各组细胞TNF-α的含量。结果显示，果胶BP的干预显著降低了LPS诱导的细胞TNF-α的分泌，起到了抑制炎症产生的作用。
开展的果胶BP对信号通路活化状态调控的研究：基于JNK、NF-κB信号通路研究了果胶BP对通路活化状态的影响，Western Blotting结果如图11所述，如图12和13定量所示，第一列为空白对照，第二列为阳性药物LPS处理组，结果显示果胶BP干预显著抑制了LPS诱导的JNK、NF-κB信号通路的激活，且呈现一定剂量的依赖性。
2、关于果胶BP降糖作用的研究：
使用人视网膜色素上皮ARPE-19细胞对果胶BP降糖功效进行研究：
请参见图14和图15，图14为果胶BP对高糖诱导VEGF表达与ERK通路活化影响的蛋白条带图；图15为果胶BP对高糖诱导ICAM-1表达与p38 MAPK通路活化影响的蛋白条带图；高糖HG诱导糖尿病模型组，VEGF、ICAM-1的表达与对照组Mock比较显著上调，然而在加入果胶BP干预后，VEGF、ICAM-1表达显著降低，表明果胶BP明显抑制了高糖诱导的糖尿病视网膜病变趋势，具有明显的降糖效果。
请参见图16和图17，图16为果胶BP对高糖诱导VEGF表达与ERK通路活化影响的蛋白定量图；图17为果胶BP对高糖诱导ICAM-1表达与p38 MAPK通路活化影响的蛋白定量图。加入果胶干预后，VEGF、ICAM-1含量的变化趋势与ERK和p38 MAPK磷酸化的变化趋势呈现高度一致性，表明果胶干预下调了高糖环境下VEGF、ICAM-1的分泌，可能与果胶对ERK和p38MAPK通路的活化状态下调相关。
综上所述，通过本发明的制备方法在香蕉果肉中提取得到的果胶BP，具有抑制炎症和降糖的功能作用，为制备炎症调节或降糖的药品或功能性食品，提供了一个新的方向。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种香蕉果肉中百分百甲酯化果胶，其特征在于，其结构为：同聚6-O-甲基-(1→4)-α-D-GalAp，分子量为117822Da，分布系数Mw/Mn为1.58，纯度为100％。
2.根据权利要求1所述的香蕉果肉中百分百甲酯化果胶，其特征在于，所述香蕉果肉中百分百甲酯化果胶由半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖组成，其摩尔比为0.95：0.042：0.007。
3.根据权利要求1所述的香蕉果肉中百分百甲酯化果胶，其特征在于，制备方法包括以下步骤：
步骤一、采用酶解和超声结合将原果胶转化为水溶性果胶：在香蕉果肉中加入果胶酯酶浸没，同时结合超声提取果胶；
步骤二、酸法提取：向上述提取液中加入盐酸溶液，调节pH值至2-2.5，采用热水浴浸提；
步骤三、将混合液过滤、离心至全部除去杂质，得到的上清液采用旋转蒸发仪浓缩，得到浓缩液；向浓缩液中加入稀氨水，调节pH值至4-5；
步骤四、分级沉淀：向浓缩液中恒速滴入95％无水乙醇待有悬浮颗粒沉淀出现后停止，放置过夜，待沉淀充分沉降后，离心或使用滤纸过滤至完全除去沉淀，收集上清液；继续滴入95％无水乙醇至上清液中，直至出现大量絮状沉淀物，停止滴入95％无水乙醇；放入冰箱中冷藏，待沉淀充分沉降后，离心除去多余水分和无水乙醇，收集沉淀部分，将沉淀物残留的乙醇完全蒸发去除；
步骤五、将沉淀冻干后，配制成1mg/mL的果胶溶液，通过离子交换柱，使用NaCl水溶液洗脱，得到流出液；
步骤六、将测出糖含量的流出液收集透析除盐后，浓缩并真空冻干，得到的纯品，命名为果胶BP。
4.根据权利要求3所述的香蕉果肉中百分百甲酯化果胶，其特征在于，所述步骤一中采用酶解和超声结合将原果胶转化为水溶性果胶的方法为：将香蕉果肉切成薄块，晒干后研磨成粉，加入果胶酯酶淹没浸泡，然后超声处理。
5.根据权利要求4所述的香蕉果肉中百分百甲酯化果胶，其特征在于，香蕉果肉和果胶酯酶用量比为1g:0.5-2mL；酶解温度为45-55℃，酶解时间为0.5-1.5h。超声处理条件为100-150w，15-30min。
6.根据权利要求3所述的香蕉果肉中百分百甲酯化果胶，其特征在于，所述步骤二中酸法提取的方法为：将步骤一中的提取液中加入到4倍质量的超纯水中，使用浓度为0.5mol/L的盐酸调节pH值至2-2.5，在95℃热水浴中不停搅拌浸提2h，用纱布过滤除渣，将滤液回收；用滤渣再次重复以上浸提过程1-2次，过滤，除去滤渣，将浸提液与滤液混合。
7.根据权利要求3所述的香蕉果肉中百分百甲酯化果胶，其特征在于，所述步骤三中离心条件为7100g/min，步骤三中旋转蒸发仪的温度不超过50℃，得到浓缩液体积为上清液体积的3/4，使用的稀氨水是浓度为1％的氨水。
8.根据权利要求3所述的香蕉果肉中百分百甲酯化果胶，其特征在于，所述步骤五中采用DEAE-SepharoseFastFlow离子交换柱纯化的方法为：洗脱液NaCl的浓度为0.15mol/L，收集的流出液通过苯酚-硫酸法测定糖含量，合并糖含量高的流出液收集管进一步透析处理。
9.根据权利要求1-8中任意一项所述的香蕉果肉中百分百甲酯化果胶在制备药品或保健食品上的应用。
10.根据权利要求9所述的香蕉果肉中百分百甲酯化果胶在制备抑制炎症药品或血糖调节药品、功能性食品中的应用。
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