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CN116200517A - 一种建兰ssr引物组及应用该引物组构建建兰品种指纹图谱的方法 - Google Patents

一种建兰ssr引物组及应用该引物组构建建兰品种指纹图谱的方法 Download PDF

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CN116200517A CN202210877521.XA CN202210877521A CN116200517A CN 116200517 A CN116200517 A CN 116200517A CN 202210877521 A CN202210877521 A CN 202210877521A CN 116200517 A CN116200517 A CN 116200517A
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朱根发
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魏永路
金建鹏
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Zhaoyalan Agricultural Technology Co ltd
Environmental Horticulture Institute of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
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Zhaoyalan Agricultural Technology Co ltd
Environmental Horticulture Institute of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
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Abstract

本发明公开了一种建兰SSR引物组及应用该引物组构建建兰品种指纹图谱的方法。该建兰SSR引物组包括14对SSR引物序列。本发明利用该14对SSR引物序列对建兰基因组DNA进行多重PCR扩增，利用毛细管荧光电泳检测PCR产物，对SSR标记数据进行分析，构建70种建兰SSR指纹图谱，并能够有效的鉴定出建兰品种。本发明构建建兰品种指纹图谱的方法具有高通量、高精度、成本低的优点，应用前景良好。

Description

一种建兰SSR引物组及应用该引物组构建建兰品种指纹图谱 的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种建兰SSR引物组及应用该引物组构建建兰品种指纹图谱的方法。
背景技术
建兰(Cymbidium ensifolium)，是兰科兰属地生种。株型适中、叶姿优美，总状花序具5-10朵花，有幽香，是我国传统国兰中难得得可以多季开花种类，因此又名四季兰，在国内外市场深受欢迎。尽管建兰拥有悠久栽培历史和文化传承，但品种鉴定大多取决于传统形态指标，在尚未开花的时候难以通过叶片和株型精准鉴定品种。近年来，随着建兰的推广和市场发展壮大，加之互联网技术的迅速发展，各大电商平台、社交媒体和论坛提供了更加多样化的交易渠道，兰花市场上出现的建兰品种超500种，然而尚无统一规范的品种鉴定标准，产品以次充好，品种混淆的现象普遍存在。为促进适应市场需求的品种选育、鉴定和推广，势必要求建立与之相适应的兰花品种鉴定标准。
兰科植物在全球分布广泛，有801属，超27500种。近年来，分子标记，主要包括RAPD、ISSR、SSR、SRAP和ScoT等广泛用于兰花种内、种间及品种间的分类鉴定、遗传多样性、亲缘关系的分析以及种质资源与种群方面的研究。然而对我国特色资源的鉴定评价受限于地域局限和品种收集难度，目前在国内还未见基于毛细管电泳技术和SSR分子标记对建兰品种进行高通量鉴定的相关报道。因此，开展本发明采用SSR分子标记对建兰品种进行鉴定，将对种质资源鉴评、种质创新利用以及商品花质量监督和市场规范等方面具有重要意义。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种建兰SSR引物组及利用该引物组、将毛细管电泳技术与SSR-PCR技术结合的构建建兰品种指纹图谱的方法，以快速高效鉴定建兰品种。
本发明的第一个目的是提供一种建兰SSR引物组，其包括以下14对SSR引物序列：
SSR_41756_c0_g2 F:5’-TTGCAGTCGTGGAAGAGAGA-3’
R:5’-TGCAAATATGTCAGCGAGAAA-3’
SSR_44148_c1_g1 F:5’-AACAATTTTCAAACGAGCCG-3’
R:5’-ATTCGCACTTCCATCTCCAT-3’
SSR_44775_c0_g1 F:5’-GCCCTTTGTGCAATTTAGGA-3’
R:5’-ACATCCAGATCCAAACCTCG-3’
SSR_44824_c2_g1 F:5’-TCCAATTCGATCGTCACGTA-3’
R:5’-TGGACGAAGGAGACCTTGAC-3’
SSR_45085_c1_g2 F:5’-ACCCAGTCCCCTCTCCTTAG-3’
R:5’-TGGCAATTGAGAGGTAGGGA-3’
SSR_47270_c0_g2 F:5’-TTGTTTCTTGTGTGATTTTGAGG-3’
R:5’-CCGGAATGTTATGATGGGAG-3’
SSR_49506_c0_g1 F:5’-AAAAGCATTCAAATCGGGTG-3’
R:5’-TGATGGGGGTCTCGTATCTC-3’
SSR_50081_c2_g1 F:5’-TTCCAACAACCCCTTCTGTC-3’
R:5’-AGCGAAGTGAACTGGGAGAA-3’
SSR_51250_c1_g6 F:5’-TGCTAATTGCCTGTGACCAA-3’
R:5’-CTTCTATCAGAGCACACTTGACA-3’
SSR_52068_c3_g3 F:5’-TCTTAAAGCACCTCACTGGAGA-3’
R:5’-AGAAGCAGTTGGGCTCAGAA-3’
SSR_54963_c0_g1 F:5’-CAATCAGCCTAGGGTTCCAA-3’
R:5’-AAGGAGAAACTTCCTGCGGT-3’
SSR_55127_c0_g1 F:5’-CGATGGAGGACAGCACTTTT-3’
R:5’-GCACCTTCTTCTCCCTCACA-3’
SSR_56903_c1_g2 F:5’-GCGTTGAAGAAAGGCAAAAG-3’
R:5’-TCGTGTATTTGGCACGAAAG-3’
SSR_43897_c1_g1 F:5’-TTGTACGGGGAGGAGTTTTG-3’
R:5’-ACCAGGTTGTAGCCCTCCTT-3’。
本发明的第二个目的是提供上述的建兰SSR引物组在构建建兰品种指纹图谱中的应用。
本发明的第三个目的是提供上述的建兰SSR引物组在鉴定建兰品种中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种建兰品种指纹图谱的构建方法，其包括以下步骤：
(1)提取建兰样品的DNA；
(2)以提取的DNA为模板，以权利要求1所述SSR引物组为扩增引物，建立PCR反应体系并进行PCR扩增；
(3)将扩增产物进行毛细管电泳，根据毛细管电泳结果对建兰每个品种的样品DNA的扩增结果形成扩增片段长度数据化编码，构建得到建兰品种指纹图谱。
进一步的，步骤(2)中的PCR反应体系包括：10×PCR Buffer 3μL、2.5mM dNTP 2μL、MgCl2 2μL、Primer A 2μL、Primer B 2μL、Template 1μL、ddH2O 18μL、Taq酶0.2μL。
所述PCR扩增的反应程序为：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，30个循环；95℃30s，55℃30s，72℃30s，10个循环；60℃30min；4℃保存。
进一步的，步骤(3)中将扩增产物进行毛细管电泳，根据毛细管电泳结果对建兰每个品种的样品DNA的扩增结果形成扩增片段长度数据化编码，具体为：按照SSR_41756_c0_g2、SSR_44148_c1_g1、SSR_44775_c0_g1、SSR_44824_c2_g1、SSR_45085_c1_g2、SSR_47270_c0_g2、SSR_49506_c0_g1、SSR_50081_c2_g1、SSR_51250_c1_g6、SSR_52068_c3_g3、SSR_54963_c0_g1、SSR_55127_c0_g1、SSR_56903_c1_g2、SSR_43897_c1_g1的分子标记顺序排列，通过毛细管电泳结果，依次记录每个建兰品种经每对SSR引物扩增出现的片段长度，依据各个扩增片段长度进行数据化编码，即为该建兰品种的DNA指纹图谱。
进一步的，所述依据各个扩增片段长度进行数据化编码，具体为：将各位点扩增片段的等位基因按分子量大小排列，等位基因从小到大以阿拉伯数字1-9标注，9个以上的等位基因，以大写英文字母A-Z标注，若该位点在某个品种中无扩增则记为0，每个位点占两位。
本发明的第五个目的是提供一种建兰品种指纹图谱，是由上述建兰品种指纹图谱构建方法构建得到。
本发明的第六个目的是提供上述的建兰品种指纹图谱在鉴定建兰品种中的应用。
本发明的第七个目的是提供一种鉴定建兰品种的试剂盒，该试剂盒含有上述的建兰SSR引物组。
本发明的有益效果为：
(1)本发明利用毛细管电泳技术，实现了SSR分子标记与高效、自动化毛细管电泳技术的有益结合，检测结果由分析软件自动保存，检测速度快，分离效率高，灵敏度较高，精确度达到1bp以内，有利于大批量样品的检测分析，为SSR分子标记技术在建兰品种鉴定中的推广和应用打下了坚实的基础。
(2)本发明鉴定方法成本低，试剂耗材市场成熟，不计人工与仪器损耗，一个样品的检测成本低于10元。
附图说明
图1为SSR标记筛选的部分代表图，样品顺序从左到右依次为宝岛仙女，彩绿，翠玉牡丹，峨嵋山奇蝶，荷王。
图2为以引物对SSR_54963_c0_g1对不同建兰品种进行扩增结果峰图，从上到下依次为宝岛仙女，翠玉牡丹，峨嵋山奇蝶，荷王四个不同建兰品种的扩增峰图。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
1、建兰品种采集
样品来源于建兰主产区中国广东省、中国广西省和中国台湾省，囊括不同花型、花色、叶色的70个品种，如下表1所示。
表1 70份建兰品种
Figure SMS_1
Figure SMS_2
Figure SMS_3
Figure SMS_4
2、建兰基因组DNA提取
对所收集的70份建兰种质资源，用植物基因组DNA试剂盒(天根公司)提取。首先，分批采集幼叶，每份样品分2-3份(每份2g左右)存于2mL离心管中，液氮速冻后，-80℃冰箱冻存备用。用预冷的研钵和研棒，将冻存的植物组织充分研磨，提取其基因组DNA。用1％琼脂糖胶上电泳，GV(Gold view)染色，用凝胶成像系统检测条带，判断DNA提取的质量，并用紫外分光光度计测定其DNA浓度。
3、全基因组SSR标记开发及筛选
3.1 SSR引物设计
根据建兰全基因组参考序列，用SSR Hunter等软件，共开发出40个SSR分子标记，并用Primer 5软件设计40对扩增各SSR的上下游引物(表2)。对开发的40个SSR分子标记，以各种兰花基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR扩增用的Mix(由Es Taq DNA Polymerase、Mg2+、dNTPs以及PCR稳定剂和增强剂组成的预混体系，并加入蓝色染料)购自天根公司；40对SSR引物购自加拿大生工公司上海分公司。
表2 40对引物列表
Figure SMS_5
Figure SMS_6
Figure SMS_7
Figure SMS_8
3.2 PCR反应体系包括10×PCR Buffer 3μL，2.5mM dNTP 2μL，MgCl2 2μL，PrimerA 2μL，Primer B 2μL，Template 1μL，H2O 18μL，Taq酶0.2μL。
PCR反应程序为：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，30个循环；95℃30s，55℃30s，72℃30s，10个循环；60℃30min；4℃保存。
3.3 2.0％琼脂糖凝胶电泳检测
每孔上样10μL PCR产物，100bp ladder指示，120v跑电泳60min初步筛选多态性引物(以同一引物不同样品扩增的片段大小为指标)(图1)。根据电泳检测结果，筛选出14对条带特异性强、在各样品中多态性明显的SSR分子标记，进行荧光引物设计，用于建兰种质资源的分子鉴定。14对SSR引物序列具体见表3。
表3 14对SSR引物序列
Figure SMS_9
Figure SMS_10
4、SSR-PCR及毛细管电泳检测
4.1 SSR-PCR反应
PCR反应体系总体积为10μL，包括1.2μL DNA模板(50ng/μL)，1.0μL 10×BufferΙ缓冲液，0.1μL TAKARA HS Taq酶(5U/μL)，0.6μL正向引物(5μM)，0.6μL反向引物(5μM)，0.8μL 2.5mM dNTP，0.5μL TP-M13(5μM)，去离子水补足至10μL。
PCR反应程序：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，30个循环；95℃30s，53℃30s，72℃30s，10个循环；60℃30min；4℃保存。
4.2毛细管电泳检测
96孔板中每孔加入扩增产物1.0μL，ROX-500分子量内标和甲酰胺混合液(体积比0.5:8.5)9μL，95℃变性3min后，上ABI 3730XL检测仪进行检测，1kV电压进样10s，电泳15kV，30min。
5、引物扩增结果分析
用筛选出的14对多态性SSR引物，对检测合格的70份建兰样本进行基于毛细管电泳荧光检测的STR分型。结果显示，引物对SSR_54963_c0_g1能在95.29％样本中检出条带，检出率最高；平均检出率为85.58％(表4)，说明这14对多态性SSR引物可有效用于建兰品种的分子鉴定。以引物对SSR_54963_c0_g1扩增结果峰图为例进行展示(图2)，本发明所述的SSR分子标记引物扩增效果好，检出率高，且可扩增出稳定的DNA条带。
表4筛选出的14对多态性SSR引物在70份建兰样本中的检出情况
Figure SMS_11
6、数据分析
将Data Colletion软件收集的原始数据文件导入到GeneMapper 6.0软件中进行分析，将各峰值的位置与其泳道中的分子量内标予以比较，计算目标DNA片段的准确大小。各荧光标记座位上独立进行3次重复的毛细管电泳检测，取3次重复的平均值并四舍五入取整，作为实验材料在该座位上的数据。
采用POPGENE1.31和PowerMarker软件进行以下遗传多样性参数的分析，运用PAST3等软件进行遗传多样性指标、聚类及多态信息含量(PIC)计算分析：
观测等位基因数(Na)，基因观测杂合度(Ho)，基因期望杂合度(He)，多态性信息含量(PIC)，有效等位基因数(Ne)，遗传偏离指数(D)，Shannon–Weaver diversity index(I)，聚类图谱，DNA指纹条带信息及分子身份证信息等。利用生物信息学软件(POPGENE、MEGA、Joinmap、Structure、R等)对STR分型数据进行遗传多样性和聚类分析。运用NTSYS等软件进行遗传多样性指标、聚类及多态信息含量(PIC)计算分析。结果见表5。
表5遗传多样性分析结果
Figure SMS_12
7、分子身份证构建
按照二倍体标准构建，依据SSR检测结果，对指纹数据进行数据化编码(各位点扩增片段按分子量大小排列，扩增片段(等位基因)从小到大以阿拉伯数字1-9标注，9个以上的等位基因，以大写英文字母A-Z标注)，若该位点在某个品种中无扩增则记为0，每个位点占两位。其中，分子身份证SSR分子标记顺序为：SSR_41756_c0_g2、SSR_44148_c1_g1、SSR_44775_c0_g1、SSR_44824_c2_g1、SSR_45085_c1_g2、SSR_47270_c0_g2、SSR_49506_c0_g1、SSR_50081_c2_g1、SSR_51250_c1_g6、SSR_52068_c3_g3、SSR_54963_c0_g1、SSR_55127_c0_g1、SSR_56903_c1_g2、SSR_43897_c1_g1。
70份建兰品种的指纹图谱见表6。
表6 70份建兰品种的指纹图谱
Figure SMS_13
Figure SMS_14
Figure SMS_15
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.建兰SSR引物组，其特征在于，包括以下14对SSR引物序列：
Figure FDA0003763115250000011
2.权利要求1所述的建兰SSR引物组在构建建兰品种指纹图谱中的应用。
3.权利要求1所述的建兰SSR引物组在鉴定建兰品种中的应用。
4.一种建兰品种指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取建兰样品的DNA；
(2)以提取的DNA为模板，以权利要求1所述SSR引物组为扩增引物，建立PCR反应体系并进行PCR扩增；
(3)将扩增产物进行毛细管电泳，根据毛细管电泳结果对建兰每个品种的样品DNA的扩增结果形成扩增片段长度数据化编码，构建得到建兰品种指纹图谱。
5.根据权利要求4所述的建兰品种指纹图谱的构建方法，其特征在于，步骤(2)中的PCR反应体系包括：10×PCR Buffer 3μL、2.5mM dNTP 2μL、MgCl2 2μL、Primer A 2μL、PrimerB 2μL、Template 1μL、ddH2O 18μL、Taq酶0.2μL；
所述PCR扩增的反应程序为：95℃ 5min；95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，30个循环；95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，10个循环；60℃ 30min；4℃保存。
6.根据权利要求4所述的建兰品种指纹图谱的构建方法，其特征在于，步骤(3)中将扩增产物进行毛细管电泳，根据毛细管电泳结果对建兰每个品种的样品DNA的扩增结果形成扩增片段长度数据化编码，具体为：按照SSR_41756_c0_g2、SSR_44148_c1_g1、SSR_44775_c0_g1、SSR_44824_c2_g1、SSR_45085_c1_g2、SSR_47270_c0_g2、SSR_49506_c0_g1、SSR_50081_c2_g1、SSR_51250_c1_g6、SSR_52068_c3_g3、SSR_54963_c0_g1、SSR_55127_c0_g1、SSR_56903_c1_g2、SSR_43897_c1_g1的分子标记顺序排列，通过毛细管电泳结果，依次记录每个建兰品种经每对SSR引物扩增出现的片段长度，依据各个扩增片段长度进行数据化编码，即为该建兰品种的DNA指纹图谱。
7.根据权利要求6所述的建兰品种指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述依据各个扩增片段长度进行数据化编码，具体为：将各位点扩增片段的等位基因按分子量大小排列，等位基因从小到大以阿拉伯数字1-9标注，9个以上的等位基因，以大写英文字母A-Z标注，若该位点在某个品种中无扩增则记为0，每个位点占两位。
8.一种建兰品种指纹图谱，其特征在于，由权利要求4-7任一项所述建兰品种指纹图谱构建方法构建得到。
9.权利要求8所述的建兰品种指纹图谱在鉴定建兰品种中的应用。
10.一种鉴定建兰品种的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的建兰SSR引物组。
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