CN116173075B

CN116173075B - 一种基于生孢梭菌改善认知功能的合生元组合物及其应用

Info

Publication number: CN116173075B
Application number: CN202211266346.7A
Authority: CN
Inventors: 刘志刚; 杨聪; 李铃; 原田�; 郭瑞; 贾翛然
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2022-10-17
Filing date: 2022-10-17
Publication date: 2024-08-20
Anticipated expiration: 2042-10-17
Also published as: CN116173075A

Abstract

本发明涉及一种基于生孢梭菌改善认知功能的合生元组合物及其应用，合生元组合物包括生孢梭菌ATCC15579和木聚糖。本发明的合生元组合物可在预防、辅助治疗、修复改善阿尔兹海默症、认知功能的食品、特殊医学用途配方食品、营养补充剂、功能食品、保健食品和药物中的应用。合生元组合物中加入食品上可以接受的辅料与添加剂，制成食品；加入药学上可以接受的医药用无毒载体，制成药物。本发明筛选所得的合生元组合物安全性较好，可增加体内IPA水平，改善脑部炎症基因表达水平，改善海马突触结构，发挥其有益作用，产生确切的健康功效，动物试验表明其制成的合生元具有较强改善认知记忆的功能。

Description

一种基于生孢梭菌改善认知功能的合生元组合物及其应用

技术领域

本发明属于微生物添加剂技术领域，具体涉及一种基于生孢梭菌改善认知功能的合生元组合物及其应用。

背景技术

随着我国老龄化程度不断加剧，阿尔兹海默症（Alzheimer's disease，AD）等衰老相关的神经退行性疾病逐渐成为威胁居民健康的重大公共卫生问题。据估算，我国目前拥有超1000万AD患者，造成的年经济损失超过2400亿美金，并且这一数据将在2030年成倍增加。在此情况下，老年疾病的预防及治疗成为了研究热点。阿尔兹海默症的症状为认知记忆能力下降，具有一定的语言能力缺失及行为障碍，极大的影响了患者的生活质量，给患者及身边人群带来了许多痛苦和烦恼。

合生元又称合生素或共生元，是益生菌与益生元的复合制品。益生菌是一类对宿主有益的活性微生物。而益生元是指一类能促进有益菌生长的食物成分或物质，是一种不易被人体消化但可选择性刺激肠道内有益菌的生长或增强有益菌的活性的益菌制品。合生元作为一种微生物制剂，可以通过调控肠道微环境来发挥益生作用。合生元现已广泛地用于人类和动物保健与疾病预防治疗，究其使用的高效性与无残留性等众多优点，今后有望成为预防治疗疾病的新策略。

合生元组合物通过益生菌与益生元之间的合理配比，可以使益生菌产生吲哚丙酸的能力增强。吲哚丙酸（Indolepropionic acid，IPA），是色氨酸经微生物代谢所产生的一种代谢物，人体本身不能产生。近年来研究发现IPA具有强大的抗氧化能力及抗炎能力，补充IPA可调节免疫细胞的分化与增殖、炎症因子的产生及粘蛋白基因的表达参与维护肠道稳态。此外IPA也因其强大的神经保护作用、对Aβ纤维产生的抑制能力而有助于延缓阿尔兹海默症的发生进程。因此通过增加体内IPA的含量或可通过改善神经炎症、Aβ堆积等方面影响阿尔兹海默症的发生发展。为此，针对以上存在的问题，研发一种基于生孢梭菌改善认知功能的合生元产品具有重大意义。

发明内容

要解决的技术问题：本发明的目的在于提供一种基于生孢梭菌改善认知功能的合生元组合物，以有效的改善认知功能损伤以及脑部炎症等疾病。

技术方案：一种基于生孢梭菌改善认知功能的合生元组合物，包括益生菌和益生元，所述益生菌包括梭菌属，所述益生元包括木聚糖。

上述基于生孢梭菌改善认知功能的合生元组合物，制备过程包括以下步骤：

S1：根据备选菌株的全基因组信息，通过生物信息学手段对所有基因序列进行功能预测，筛选出所有碳水化合物利用相关基因，预测底物及碳水化合物转运子信息；

S2：根据底物及转运子信息及其在基因组上的定位构建相应的代谢途径，进而进行碳水化合物利用的功能基因组分析，完成对菌株特定益生元的预测；

S3：对预测信息进行体外验证，以预测到的益生元为唯一碳源，以无碳源的半合成培养基为对照，利用BioScreen生长曲线分析仪测定菌株在以相应益生元为底物的生培养基中的生长曲线，进而确定益生元的效果；

S4：将备选菌株接种在普通培养基和添加益生元的培养基中，发酵72 h后离心制样，利用岛津LC-20A高效液相色谱分析仪测定菌株在普通及相应益生元培养基中的IPA产生量。

S5：确定合生元的组成及其比例，得到合生元组合物。

进一步的，S1中所述备选菌株包括生孢梭菌ATCC 15579、乳酸杆菌、植物乳杆菌、副干酪乳杆菌。

进一步的，S5中所述合生元的组成为生孢梭菌ATCC 15579和木聚糖。

进一步的，所述木聚糖聚合度为2~10。

进一步的，上述生孢梭菌ATCC 15579和木聚糖的剂量比例为(1×10⁹~1×10¹³)CFU/mL:(8~12) g/L。

进一步的，上述生孢梭菌ATCC 15579和木聚糖的剂量比例为(1×10¹⁰~1×10¹²)CFU/mL:(9~11) g/L。

进一步的，上述生孢梭菌ATCC 15579浓度为1×10¹¹ CFU/mL，木聚糖的浓度为10g/L。

上述合生元组合物在预防、辅助治疗、修复改善阿尔兹海默症、认知功能的食品、特殊医学用途配方食品、营养补充剂、功能食品、保健食品和药物中的应用。

进一步的，在所述合生元组合物中加入食品上可以接受的辅料与添加剂，制成食品；或者，在所述合生元组合物中加入药学上可以接受的医药用无毒载体，制成药物；所述药物的剂型选自散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、悬浮剂、乳剂、冻干制剂的一种。

有益效果：

本发明的合生元组合物，即益生菌(生孢梭菌ATCC 15579)和益生元(木聚糖)，属于新发现的合生元组合，经过对其研究发现，两者均具有较好的改善认知损伤的作用，两者联合使用后，效果显著增加，具有明显的协同增效作用，具体表现在显著增加吲哚丙酸的产生，改善认知功能，改善脑部突触结构，增加突触长度及宽度，抑制脑部炎症水平。

本发明的合生元组合物通过益生菌与益生元之间的合理配比，有效增强功效，益生元能够有效增加组合物中的益生菌数量，增强益生菌的产IPA能力，延长合生元的有效期，不仅使得其功效持久，而且促进益生菌在肠道中的存活率。

本发明的服用方法剂量合理，功效显著，有效避免了现有的益生菌制剂剂量不明确导致的服用后无效果或服用过多有可能带来的不良效果。

附图说明

图1为四株菌在添加木聚糖培养基中的生长曲线，其中，(A)植物乳杆菌、(B)副干酪乳杆菌、(C)乳酸杆菌、(D)生孢梭菌ATCC 15579。

图2为不同木聚糖浓度下四株菌的生长情况，其中，(A)5 g/L、(B)10 g/L、(C)20g/L、(D)30 g/L、(E)40 g/L。

图3为木聚糖对四株菌产IPA能力的影响，其中，(A)GAM培养基、(B)GAM+0.025 mMIPyA培养基。

图4为不同浓度木聚糖培养基中生孢梭菌ATCC 15579生长情况。

图5为增加体内IPA含量试验，其中(A)粪便IPA含量、(B)血清IPA含量。

图6为改善认知记忆能力试验，其中(A)巴恩斯迷宫目标孔探头次数、(B)Y迷宫辨别指数。

图7为改善海马突触损伤试验，其中(A)海马突触宽度、(B)海马突触长度。

图8为改善炎症水平试验，其中(A)IL-7 mRNA表达量、(B)IL-22 mRNA表达量。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。本发明中的生孢梭菌购买自美国菌种保藏中心，保藏编号为ATCC 15579；下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

在一些具体的实施案例中，所述合生元组合物包括益生菌与益生元，益生菌为生孢梭菌ATCC 15579，益生元为木聚糖，合生元组合物中含有剂量为1×10¹⁰ CFU/day的益生菌以及含有剂量为0.01 g/mL的木聚糖。

以下通过实施例并结合附图进一步详细说明本发明的技术方案。然而，所选的实施例仅用于说明本发明，而不限制本发明的范围。

实施例1

合生元组合物中益生菌的筛选

1.材料与方法

1.1 实验材料

备选菌株：生孢梭菌ATCC 15579、乳酸杆菌、植物乳杆菌、副干酪乳杆菌。主要试剂：GAM培养基，木聚糖（CAS:No . 9014-63-5，X820567）购于上海麦克林生化科技有限公司；IPA标准品（CAS:No . 830-96-6，B27264）购于上海源叶生物科技有限公司，色谱级甲醇、色谱级乙腈均购自天津科密欧化学试剂有限公司。

1.2 实验方法

首先对备选菌株（生孢梭菌ATCC 15579、乳酸杆菌、植物乳杆菌、副干酪乳杆菌）进行全基因组测序获得菌株的基因组信息，通过生物信息学手段将所有菌株的基因信息与CAZy碳水化合物酶数据库、KEGG数据库进行比对注释、功能预测，筛选出所有碳水化合物利用相关基因，预测底物及碳水化合物转运子信息；根据底物及转运子信息及其在基因组上的定位构建相应的代谢途径，进而进行碳水化合物利用的功能基因组分析，完成对备选菌株特定益生元的预测。

其次对预测信息进行体外验证：以无碳源的半合成培养基（GAM）为对照，将备选菌株接种至不同浓度的木聚糖培养基中培养48h，利用BioScreen生长曲线分析仪每隔1 h测定一次培养基的OD₆₀₀ nm吸光度值，根据所测得吸光度值绘制生长曲线，进而确定木聚糖对备选菌株生长情况的影响。其中培养基中木聚糖浓度为5 g/L，10 g/L，20 g/L，30 g/L，40g/L。

最后将备选菌株接种在GAM培养基、GAM+10 g/L木聚糖培养基、GAM+0.025mM IpyA培养基、GAM+10 g/L木聚糖+0.025mM IpyA培养基中，发酵72 h后离心制样，利用岛津LC-20A高效液相色谱分析仪测定菌株在普通及相应益生元培养基中的IPA产生量。

根据生长曲线结果及发酵产生IPA结果确定合生元的组成。

试验结果

1.全基因组功能分析

将生孢梭菌ATCC 15579、植物乳杆菌、乳酸杆菌及副干酪乳杆菌的基因信息与碳水化合物活性酶数据库比对，结果如表1，发现四种菌均具有潜在代谢木聚糖的能力。

表1 四种菌株具有的木聚糖代谢酶种类

	生孢梭菌ATCC 15579	植物乳杆菌AM25-20AC	副干酪乳杆菌AF66-2pH10A	乳酸杆菌AF91-01CMCA
					β-1,4-内切木聚糖酶EC:3.2.1.8	×	√	√	√
β-木糖苷酶EC:3.2.1.37	√	√	√	√
					α-L-阿拉伯糖苷酶EC:3.2.1.55	×	√	√	√
α-D-葡糖苷酸酶EC:3.2.1.139	√	×	×	√
					乙酰木聚糖酯酶EC:3.1.1.72	√	√	√	×

生长曲线结果

将生孢梭菌ATCC 15579、植物乳杆菌、乳酸杆菌及副干酪乳杆菌培养在补充木聚糖的GAM培养基中，利用全自动生长曲线分析仪分析菌株的生长情况，结果如图1所示，可以看出木聚糖可提高副干酪乳杆菌及生孢梭菌ATCC 15579的生长情况。由图2可知，木聚糖对生孢梭菌ATCC 15579的促进生长效果最好。

产IPA能力对比

将生孢梭菌ATCC 15579、植物乳杆菌、乳酸杆菌及副干酪乳杆菌培养在补充木聚糖的GAM培养基中，厌氧培养72 h后取出菌液，离心收集上清。利用高效液相色谱仪对上清中的IPA含量进行分析，结果如图3所示，在GAM培养基或者添加了IPyA的GAM培养基中，木聚糖可促进副干酪乳杆菌及生孢梭菌ATCC 15579的产IPA能力，且对生孢梭菌ATCC 15579产IPA能力的促进作用最好。

综上，根据生长曲线及液相结果确定合生元组合为生孢梭菌ATCC 15579和木聚糖。

实施例2

预测合生元的配比

1. 实验材料：GAM培养基，木聚糖

2. 实验方法：将生孢梭菌ATCC 15579接种至不同浓度的木聚糖培养基中培养48h，探究生孢梭菌与木聚糖的最佳配比。生孢梭菌ATCC 15579的浓度为1×10¹¹ CFU/ml，木聚糖浓度为5 g/L，10 g/L，20 g/L，30 g/L，40 g/L。

试验结果：

试验结果如图4所示，可以看到生孢梭菌ATCC 15579在10 g/L的木聚糖浓度下生长情况最好，因此确定合生元配比为生孢梭菌ATCC 15579为1×10¹¹ CFU/mL，木聚糖的浓度为10 g/L。

增加小鼠体内IPA含量试验

本发明运用动物实验对本发明的合生元组合物进行功效评价，以说明该合生元组合物的有效性。

1. 实验动物分组

实验选取7月龄的AD小鼠40只及WT小鼠，共分为5组，对照组（Con）、阿尔兹海默症模型组（AD），模型补充益生元组（ADX）、模型补充益生菌组（ADC）、模型补充合生元组（ADS），每组10只。小鼠进行4周的对照、益生菌、益生元、合生元干预。

2. 各分组处理方法

对照处理：正常饮水，每天灌胃补充PBS 100μL。

益生元处理：将木聚糖溶解于无菌水，调配至浓度为10g/L，饮水补充。

益生菌处理：将培养后的生孢梭菌ATCC 15579悬于适量的PBS中，至活菌数为10¹¹CFU/mL，现配现用。每天灌胃补充菌悬液100μL。

合生元处理：每天进行菌悬液的灌胃补充及益生元的饮水补充。

3. 样品采集与分析测试

小鼠喂养4周后，收集粪便及血清。采用高效液相色谱法，利用标准品建立标准曲线并测定小鼠血清及粪便中IPA含量。

试验结果及分析

由图5可知，灌胃4周后，补充合生元组与模型组相比，粪便及血清中IPA含量显著升高，且相较于单独的益生菌或益生元组效果更好。

改善认知记忆能力试验

1. 实验分组及处理同实施例2。

2. 实验方法

Y迷宫实验

受试小鼠被置于内壁黑暗，连有三叉臂通道(20 cm*4 cm*40 cm)的Y迷宫装置中心，在视频监测装置正下方自由探索，录像装置与相关软件记录其行走路线、速度、总路程与进臂次数等数据。每只受试小鼠被置于设备中央后开始为期8 min的计时活动，测试重复3次，间隔时间大于1 h。

巴恩斯迷宫实验

实验开始前一天，将动物单个从目标洞置于目标箱里内适应4 min。将动物置于迷宫中央的塑料圆筒(20 cm*27 cm)内限制活动5 s。移开圆筒，启动软件。动物四肢均进入目标箱，则计为一次逃离，并让动物在箱里停留30 s。每一只动物一次最多观察4 min。在此期间如果动物仍然找不到目标箱，则将动物从迷宫移开，放入目标箱停留30 s。利用这一间隙清洁迷宫。动物每天训练1次，连续4天。从第二次训练开始，每次训练之前将迷宫转动一至数个洞的位置，但目标箱始终固定在同一方向。这样做的目的是防止动物依靠气味，而凭借记忆来确定目标箱的位置。记录到达目标箱的潜伏期和每只动物的错误次数等。第五天撤去目标箱，让小鼠自由探索120 s，记录下探究任何一个洞的次数，在目标箱附近停留时间，以及首次找到目标箱的时间。

试验结果

利用巴恩斯迷宫及Y迷宫评价小鼠的空间记忆及工作记忆能力，由图6可知，相较于WT小鼠，AD小鼠表现出了空间记忆能力损伤及工作记忆能力损伤。在经过4周的合生元干预后，AD小鼠的目标孔探头次数有显著的提高。同时Y迷宫结果显示AD小鼠的自发性交替臂正确率得到了显著的提高、且优于益生元及益生菌组。以上结果说明合生元可以改善阿尔兹海默症小鼠的空间记忆及工作记忆能力。

改善海马突触损伤试验

1. 实验分组及处理同实施例2。

2. 实验方法

小鼠进行4周的干预后处死，收集小鼠海马组织，浸入预冷的2.5%戊二醛固定液。将组织切为1 mm³左右的小块，经过固定、漂洗、脱水、渗透、包埋、切片等步骤后制成样品，在透射电镜下观察突触后致密物形态。

试验结果

利用透射电镜观察小鼠海马突触结构。由图7可知，相较于WT小鼠，AD小鼠的突出结构受损，突触长度及突触宽度降低。在经过4周的合生元干预后，AD小鼠的突触长度及突触宽度有所改善。以上结果说明合生元可以改善阿尔兹海默症小鼠的海马突触结构。

改善神经炎症试验

1. 实验分组及处理同实施例2。

2. 实验方法

小鼠进行4周的干预后处死，收集小鼠脑组织，通过qRT-PCR对脑组织中的炎症因子水平进行测定。

试验结果

通过qRT-PCR检测脑组织炎症水平。由图8可知，AD小鼠大脑中炎症因子转录水平显著升高，在经过4周的合生元干预后，炎症水平显著降低。

实施例3

将此合生元组合物制备成片剂

一种改善认知记忆合生元组合物的制剂，所述制剂为在所述具有改善认知记忆的合生元组合物中加入食品上可接受的辅料制成食品，或药学上可以接受的辅料制成片剂。

实施例4

将此合生元组合物制备成散剂

一种改善认知记忆合生元组合物的制剂，所述制剂为在所述具有改善认知记忆的合生元组合物中加入食品上可接受的辅料制成食品，或药学上可以接受的辅料制成散剂。

Claims

1.一种基于生孢梭菌改善认知功能的合生元组合物在制备辅助治疗、修复改善阿尔兹海默症的药物中的应用，其特征在于：所述合生元组合物为生孢梭菌(Clostridium sporogenes)ATCC 15579和木聚糖；所述生孢梭菌ATCC 15579和木聚糖的剂量比例为(1×10⁹～1×10¹³)CFU/mL:(8～12)g/L；所述木聚糖聚合度为2～10。

2.根据权利要求1所述的一种基于生孢梭菌改善认知功能的合生元组合物在制备辅助治疗、修复改善阿尔兹海默症的药物中的应用，其特征在于，所述生孢梭菌ATCC 15579和木聚糖的剂量比例为(1×10¹⁰～1×10¹²)CFU/mL:(9～11)g/L。

3.根据权利要求1所述的一种基于生孢梭菌改善认知功能的合生元组合物在制备辅助治疗、修复改善阿尔兹海默症的药物中的应用，其特征在于，所述生孢梭菌ATCC 15579为浓度为1×10¹¹CFU/mL，木聚糖的浓度为10g/L。