CN116134122A - 用于转运和培养漂浮组织的方法和系统 - Google Patents

Abstract

提供了用于使用夹心构建体培养漂浮目标组织的装置、系统和方法。实施方案包括制备在用于运输的夹心构建体中的漂浮目标组织，以及制备包含活体肿瘤组织的夹心构建体，用于评估治疗肿瘤的候选疗法。漂浮目标组织可包括各种细胞类型，包括癌细胞和肿瘤。

Description

用于转运和培养漂浮组织的方法和系统

相关申请的交叉引用

本申请要求获得2020年3月12日提交的美国临时申请第62/988,472号的优先权的权益，该申请的公开内容通过引用以其整体纳入。

技术领域

本公开一般性地涉及培养漂浮组织的方法和应用。

背景技术

白色脂肪组织

白色脂肪组织(WAT)是健康状态和疾病状态中的一个关键器官。作为能量蓄积库和内分泌器官，WAT调节能量稳态、免疫力、血管紧张度和凝血功能。作为肥胖症的疾病器官，WAT的过度增长是每个主要死亡原因的强效风险因素，包括心脏病、糖尿病、卒中和癌症。适当地，WAT是密集研究的对象。

然而，原发性WAT很难在体外维持，因为脂肪细胞是漂浮的、终末分化的、和易于破裂的。自20世纪70年代以来，已经报道了克服这些障碍的方法。虽然这些技术在啮齿动物的WAT中是部分成功的，但它们罕有扩展到人类WAT。啮齿类动物和人类的WAT之间存在着深刻的差异，这一持久的障碍拖慢了治疗人类疾病的进展。

大多数WAT研究通过依靠体外分化的前体脂肪细胞(diffAds)完全避免了培养原始WAT的挑战。DiffAds的好处是由非漂浮的基质细胞(stromal cell)产生，使用标准组织培养方法很容易传代。虽然diffAds有时在科学文献中可能被称为"脂肪细胞"，但它们并不等同于本文所描述的脂肪细胞。相反，diffAds模仿脂肪形成的机制。例如，白色脂肪细胞是非粘附性的，代谢活性低，而且是单室的，而diffAds很容易粘附在典型的细胞培养塑料上，代谢活跃，而且是多室的。

如果没有经过充分验证的成熟人类WAT的体外模型，我们研究生理学和疾病的能力将受到阻碍。这一挑战并不是WAT独有的，对所有人类器官系统的生理忠实模型的需求导致了美国国立卫生院(NIH)微生理系统计划(Microphysiological Systems Program)的建立。微生理系统被定义为使用人类细胞制造的组织工程的、多细胞3D器官构建体，预计将加速从实验室到病床边的转化。作为一项广泛的、多机构的努力，美国国立卫生研究院微生理系统计划还确定了一套严格的基准，可以根据这些基准来评估微生理系统。

肿瘤微环境

虽然在乳腺癌研究领域已经取得了很大的进展，但仍然需要适当的模型来准确评估肿瘤微环境在乳腺癌进展中的作用。已知的导致癌症进展和耐药性的因素被归于肿瘤微环境的重塑。其中一些因素包括细胞的串扰(crosstalk)、肿瘤微环境的细胞外基质(ECM)重塑、以及缺氧。

乳腺肿瘤微环境是一个异质性细胞群的所在地，可能包括脂肪源性基质细胞(ASCs)、脂肪细胞、基质细胞、免疫细胞和癌细胞。这些细胞以复杂的关系共存；这些细胞类型之间的串扰是相互的，并推动疾病的发展。ASCs被招募到肿瘤微环境中，它们通过多种方式促进肿瘤的发生。ASCs具有免疫调节能力，已被证明能抑制自然杀伤细胞和细胞毒性T淋巴细胞。此外，当ASCs暴露于三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231细胞系)和雌激素受体阳性(ER+)乳腺癌细胞(MCF-7细胞系)的分泌组中时，ASCs可以通过经由SMAD3的TGFβ1成为癌症相关的成纤维细胞。癌细胞还可以积极引导基质细胞的代谢活动：成纤维细胞和脂肪细胞可以被引导使用分解代谢途径，通过将乳酸、酮体、谷氨酰胺和脂肪酸转移到癌细胞而给合成代谢的肿瘤生长火上浇油。肿瘤-基质界面上的癌症相关脂肪细胞可以经历去脂化，并获得成纤维细胞样表型，因为它们经历了癌症介导的脂肪分解，向癌细胞释放游离脂肪酸。此外，脂肪细胞已被证明可以封存和代谢化疗药物，减少肿瘤微环境中的活性药物浓度。

生长中的肿瘤也会经历免疫细胞的浸润和炎症。巨噬细胞被分泌单核细胞趋化蛋白1和肿瘤坏死因子α(TNFα)的脂肪细胞所招募。激活的巨噬细胞促进了促肿瘤发生性重塑，如血管生成。随着组织的扩张，稳态被破坏，导致常驻的巨噬细胞和肥大细胞释放信号分子，从循环中招募白细胞到生长的组织。在脂肪组织中，巨噬细胞是最常见的白细胞类型。被激活的巨噬细胞会促进促肿瘤发生性重塑，如血管生成。

随着乳腺癌进展，肿瘤的微环境发生了巨大的变化。发生了ECM的纤维化重塑，称为结缔组织生成。肌成纤维细胞在乳腺脂肪组织重塑中起着主要作用，它通过降解现有的ECM和产生更密集的、纤维状的胶原蛋白I和富含纤连蛋白的基质。基质金属蛋白酶被基质细胞用来降解ECM，从而释放出结合的生长因子，激活细胞生长信号通路，促进肿瘤的发生。基质金属蛋白酶也被用来降解肿瘤-间质界面的基底膜，基底膜被垂直于肿瘤排列的纤维胶原所取代，以促进肿瘤的入侵。

肿瘤的生长也创造了缺氧的区域，导致血管生成，这是癌症的一个标志。肿瘤扩大所引起的代谢负担耗尽了微环境的营养和氧气，同时用必须清除的代谢废物污染了它。为了应对这些低氧条件，转录因子缺氧诱导因子1被表达，引发血管生成诱导剂血管内皮生长因子A、胎盘生长因子和血管生成素1的释放。缺氧诱导因子1也可以通过将ATP的生成从氧化磷酸化转移到糖酵解而导致扩张的肿瘤中代谢失调。在肿瘤细胞中，这种转变被称为Warburg效应，甚至可以在正常氧浓度下发生。有趣的是，发现与癌症相关的成纤维细胞在与肿瘤细胞相互的旁分泌中分泌乳酸和丙酮酸，从而使肿瘤细胞通过线粒体氧化代谢产生能量，即观察到了反向Warburg效应。

迄今为止讨论的所有因素都表明，肿瘤微环境是复杂和动态的。为了试图开发更复杂的乳腺肿瘤模型，重演肿瘤微环境，研究人员正在转向工程化的肿瘤微环境和3D生物打印技术。三维水凝胶是创建更准确的肿瘤模型的一个有趣的选择。它们提供了一个可调谐的平台，允许研究人员选择ECM成分，改变硬度，并控制缺氧水平。虽然三维水凝胶乳腺肿瘤模型允许整合成分有助于建立更加模拟人体生理环境的肿瘤模型，但它们往往仅由一种或两种ECM基质组成，未能考虑到肿瘤微环境的细胞之间复杂的相互作用。一种水凝胶模型通过将HepG2人类肝细胞肝癌细胞系与生长停滞的成纤维细胞在3D胶原蛋白I水凝胶中形成异质球体(heterospheroid)来解决单一细胞类型问题。事实证明，异质球体比二维单层和同质球体细胞培养物更加耐药。虽然这种异质球体模型是水凝胶的改进，但它仍然只包含胶原蛋白I和两种细胞类型。微流控设备是更复杂的模型，可用于将生理现象如液体流动、空间受控的共培养物和信号梯度整合到癌症模型中。在癌症模型中，微流控设备已被用于研究血管生成、迁移和转移。尽管这些工程化的微系统尽可能地强大和复杂，但它们仍然缺乏准确再现肿瘤微环境的能力，因为它们缺乏肿瘤来源的基质和癌症相关的基质细胞群。患者来源的异种移植(PDX)模型通过使用体内培养的实际乳腺肿瘤，使我们更接近于一个完整的模型，但PDX模型存在一些固有的问题。异种移植模型涉及跨物种的植入，而且必须在免疫缺陷的动物中进行，这就消除了免疫和其他常驻细胞之间的串扰，而这是肿瘤发生的一个关键因素。免疫疗法是一种很有前途的实体瘤抗癌疗法，然而由于缺乏具有免疫能力的3D肿瘤模型，其到临床的转化受限制。跨物种模型在信息学分析中受到限制，因为需要对物种进行分离。小鼠模型也缺乏对人类肿瘤微环境重塑的再现。此外，患者来源的乳腺肿瘤在植入时的成功率很低(10-25％)，而相关费用很高。使用PDX模型进行实验的高成本限制了只有资金充足的实验室才能使用。

只有18％的II期临床试验的化合物和50％的III期临床试验的化合物能成功获得FDA的批准，这进一步说明了对更好的肿瘤模型的需求。新化合物的开发是劳动和资源密集型的。如此高的失败率导致NIH为微生理系统计划投资7000万美元，目的是开发更好的模型来预测新化合物的疗效和毒理学，以提高成功率。

大多数目前的乳腺肿瘤模型缺乏复杂性，导致我们对肿瘤微环境具体促成乳腺癌进展为更具侵略性表型的作用的认识存在差距。在体外药物研究中，金标准仍然是组织培养塑料(tissue culture plastic)，ECM和脂肪组织并不是不可或缺的组成部分。为了充分了解乳腺肿瘤微环境和乳腺癌之间的联系，需要一个能够重演这些相互作用、串扰以及肿瘤微环境和癌细胞之间反馈回路的肿瘤模型。我们在本文中描述了一种新的离体人乳腺肿瘤模型。该模型预计将符合NIH微生理系统的标准。这种新型的乳腺肿瘤模型是可行的、通用的和模拟生理环境的。

乳腺癌细胞与其微环境之间的相互作用是影响肿瘤生物学和治疗反应的一个关键因素。为了开发新的治疗方法，研究乳腺癌的适当模型需要一个能够再现乳腺肿瘤和肿瘤微环境的异质性特点的系统。目前体外研究乳腺癌的模型依赖于在常规组织培养塑料、简单的胶原蛋白凝胶或3D肿瘤球状体上培养癌细胞系的简化系统。虽然这些模型相对便宜且易于使用，但它们并不能完全重演乳腺组织的原始环境。使用PDX在体内研究乳腺癌依赖于免疫力低下的小鼠模型，而且人类肿瘤是在小鼠环境中生长的，可能无法准确模拟人体中发生什么。此外，PDX模型是耗时和昂贵的。

癌细胞很难在体外生长；少数常规使用的细胞(如HeLa细胞)与目前患者体内可能存在的任何癌细胞有很大的不同。此外，绝大多数原代肿瘤细胞(例如，从患者身上分离出来的肿瘤)不能在培养中生长。因此，即使像WAT这样的漂浮脂肪组织可以在培养中维持，也并不表明癌细胞或肿瘤组织同样可以在类似的培养系统中维持。例如，如果将小的肿瘤碎片放入标准的组织培养中，这些碎片最通常发生坏死。虽然偶尔可以从肿瘤碎片中衍生出细胞系，但肿瘤的结构会丢失。本公开提出了新的技术和证据，证明本文所描述的夹心构建体培养系统可以适用于维持癌细胞和肿瘤组织--这是一个突破性的进步。

有些癌症对特定的治疗方案的反应是不可预测的，有些癌症有许多可能的治疗方案可供选择。化疗的过程可能受到癌症和附近组织(如脂肪组织)之间相互作用的影响。例如，一类浸润性乳腺癌——激素受体阳性、HER2阴性的luminal肿瘤——对新辅助内分泌治疗(neoadjuvant endocrine therapy)的反应不一。30％的患者对单一的新辅助内分泌治疗没有反应，而会从更激进的治疗方案中受益。需要能够模拟肿瘤/乳腺组织相互作用的离体模型系统来指导治疗方案的决策，以限制在患者上的尝试、或对患者的过度治疗和治疗不足。

发明概述

申请人发现，包含两层支持细胞夹住原生漂浮组织和肿瘤组织或癌细胞的目标组织的夹心构建体可以在培养中维持目标组织，而以前活体肿瘤组织一般不能在培养中维持。当目标组织包含白色脂肪组织(WAT)时，夹心构建体是夹层WAT(SWAT)。此外申请人还开发了一种基于夹心构建体的转运(transport)目标组织的方案。

在一个方面，提供了一种制备用于转运的漂浮组织培养物的方法。该方法包括在容器中形成第一层支持细胞，其粘附在浸没在水性培养基中的容器表面；将漂浮组织样品放置到毗连(adjacent to)形成的第一层支持细胞的上表面；在第一层支持细胞和组织样品上方放置第二层支持细胞，以形成浸没在水性培养基中的夹心构建体；培养漂浮组织样品，其中组织样品包括来自个体的组织外植体；并在夹心构建体上放置一层保护材料。

在另一个方面，提供了一种用于评估个体中用于肿瘤的候选疗法的方法。该方法包括从健康漂浮组织的第一样品中分离出健康细胞群；基于健康细胞群产生支持细胞群；培养支持细胞群以形成两层支持细胞；基于健康漂浮组织的第二样品和活体肿瘤组织的第三样品制备目标组织，其中第二和第三样品来自所述个体，目标组织包含肿瘤组织群。在培养容器中组装夹心构建体，其中夹心构建体包括双层结构，其中两层支持细胞夹住目标组织；将夹心构建体暴露于候选疗法；以及评估目标组织中的肿瘤组织群的状态响应于候选疗法的变化。

附图说明

在考虑到以下详细描述以及结合附图后，本发明的方面和优点将变得更加明显，附图中相似的参考字符在整个过程中指的是相似的部分，并且在其中：

图1A显示了2天的常规胶原包埋的培养后，在胶原基质中培养的人白色脂肪组织(WAT)的显微图像。

图1B显示了显微图像，其图解了diffAds和原代脂肪细胞之间的形态学差异。

图2是比较常规培养模型和原代WAT之间的脂肪细胞身份基因的基因表达的图解说明。

图3是根据本公开的示例性实施方案的具有设置在温敏盘中的支持细胞层和用于从盘中移除支持细胞层的插入装置的培养装置的等距视图。

图4是图3所示的插入装置的等距视图，其中依据本公开的示例性实施方案，支持细胞层附着到插入装置的基部。

图5是图4所示的培养装置的等距视图，依据本公开的示例性实施方案，附着于插入装置基部的支持细胞层已经从温敏盘和含有第二层支持细胞的第二培养盘中移除。

图6是培养装置的等距视图，根据本公开的示例性实施方案，所述培养装置具有沉积在培养容器中的一层支持细胞上的漂浮细胞或组织外植体。

图7是图6所示的培养装置的等距视图，根据本公开的示例性实施方案，插入装置具有附着到插入装置的基部的第二层支持细胞，所述第二层支持细胞将沉积在组织外植体和第一层支持细胞的顶部。

图8是根据本公开的示例性实施方案，夹在两层支持细胞之间的白色脂肪组织的等距视图。

图9显示了显微图像，其图解了根据本公开的示例性实施方案，SWAT细胞培养系统的形态稳定性。

图9A示出根据本公开的示例性实施方案，具有围绕WAT细胞簇的双层支持细胞的SWAT培养系统的显微图像。

图9B显示了显微图像，其图解了根据本公开的示例性实施方案，SWAT细胞培养系统中WAT细胞簇的形态稳定性。

图10是一系列显微镜图像，显示了根据本公开的示例性实施方案，SWAT培养系统中WAT细胞簇的长期稳定性。

图11是图解说明，显示了根据本公开的示例性实施方案，SWAT培养物具有转录活性并表达与脂肪组织身份相关的基因。

图12显示了显微图像，指出根据本公开的示例性实施方案，SWAT培养物具有翻译活性并表达与脂肪组织身份相关的蛋白质。

图13A是图解说明，显示了根据本公开的示例性实施方案，SWAT培养物在反映原代WAT的培养的第1天和第5天以基础水平分泌瘦蛋白。

图13B是图解说明，显示了根据本公开的示例性实施方案，SWAT培养物在反映原代WAT的培养的第1天和第5天以基础水平分泌脂连蛋白。

图13C是图解说明，显示了根据本公开的示例性实施方案，SWAT培养物在培养的第1天和第5天后响应于儿茶酚胺刺激进行脂解。

图14示出了图像，说明根据本公开的示例性实施方案，SWAT培养物完全植入免疫受损的eGFP标记的小鼠。

图15A和B显示了根据本公开的示例性实施方案，说明用肿瘤细胞接种的SWAT模型的图像。

图16是根据本公开的示例性实施方案，用于运输SWAT模型的手段的图示，所述手段旨在避免破坏在SWAT模型上方和下方合并了明胶层的漂浮组织的放置。

图17是根据本公开的示例性实施方案的用于运输SWAT模型的手段的进一步图示，所述手段具有在运输期间将明胶层固定在适当位置的机械手段。

图18是根据本公开的示例性实施方案，用于制备维持目标漂浮组织的夹心构建体的示例性过程的流程图。

图19是根据本公开的示例性实施方案，制备用于运输的含有漂浮组织的夹层构造物的示例性过程的流程图。

图20是根据本公开的示例性实施方案，制备用于评估肿瘤对候选疗法组的敏感性的患者匹配的离体模型的示例性过程的流程图。

发明详述

如本文所用，"白色脂肪组织"(WAT)是指主要包括成熟、终末分化的白色脂肪细胞的组织。原代WAT是指从动物(如人类)身上分离出来的WAT，与例如衍生自细胞系的组织不同。

如本文所用，"脂肪细胞(adipocyte)"是指成熟的、终末分化的脂肪细胞。原代脂肪细胞已从动物身上分离出来。脂肪细胞可以是，例如，白色或棕色。

如本文所用，"DiffAd"是指体外分化的前体脂肪细胞(preadipocyte)。DiffAds和脂肪细胞有不同的表达谱。

如本文所用，"支持细胞(support cell)"是指能在组织培养容器表面生长并粘附在上面的细胞，其自身能支持漂浮细胞组织的生长和/或维持。支持细胞可以包括，例如，与组织类型相关的多能干细胞，体外分化的干细胞诸如diffAds，基质细胞诸如脂肪源性基质细胞(ASC)和乳腺诸如基质细胞(BSC)，或衍生自基质细胞的体外分化细胞。ASC粘附在多种细胞培养容器表面，并通过例如分泌特定脂肪组织所特有的细胞因子、生长因子和/或细胞外基质蛋白在功能上支持脂肪组织。

如本文所使用的，"温敏性材料"是一种具有两种或多种温度依赖状态的材料。例如，在第一种温度依赖状态(例如，在各自的温度范围内)下，该材料可允许或促进细胞在表面粘附，而在第二种温度依赖状态(例如，在各自的温度范围之外)下，破坏或抑制细胞在表面的粘附。温敏性材料可包括温热的粘附促进材料和冷的粘附促进材料。温热粘附促进材料可允许或促进细胞在阈值温度或温度范围之上温度时的粘附，并在较低温度下破坏或抑制细胞粘附，例如，通过收缩或破坏表面稳定性。温热粘附促进材料的一个例子是基于多聚(N-异丙基丙烯酰胺)(pNIPAAm)，它可以用来形成一个表面涂层，在典型的哺乳动物体温下允许细胞粘附，但在接近0℃的低温下可以破坏细胞粘附。冷粘附促进材料通常允许或促进细胞在低于阈值温度或范围的温度时粘附在表面，例如，低于材料的融点(meltingpoint)，并在较高温度下破坏细胞粘附，例如，因为材料已经融化。冷粘附促进的材料的例子包括基于明胶或蜡的涂层或结构。温敏性材料可以包括，例如，用于结构的一个或多个表面(诸如标准组织培养塑料或另一种培养容器)的聚合物或水凝胶涂层，或者可以形成结构的大部分，在稳定的、促进粘附的状态下提供表面本身。

如本文所用，乳腺肿瘤微环境是一个异质性的细胞群，可能包括WAT、ASC和其他基质细胞、脂肪细胞、免疫细胞和癌细胞。

如本文所用，"漂浮的组织"是指以下至少一种：可能无法直接粘附在标准培养组织塑料或另一培养容器表面的组织；如果与培养容器表面接触即可能无法被维持的组织；或在水性培养基中可能漂浮的组织。

肥胖症是一种越来越普遍的疾病，困扰着7900多万美国人。肥胖症可能与各种疾病有关，包括：2型糖尿病、心脏病、中风、关节炎和一些癌症。目前，非常需要批准用于人类干预的抗肥胖疗法。

肥胖是越来越常见的疾病，折磨着超过7900万美国人。肥胖可能与多种疾病有关，包括2型糖尿病，心脏病，中风，关节炎和一些癌症。目前，强烈需要批准用于人类干预的抗肥胖治疗剂。

肥胖可以被描述为体内白色脂肪组织(WAT)的过度生长。一般来说，WAT可以被认为是人体内的一个器官，作为可以储存额外卡路里的能量储存器。WAT在整个人体中都有发现，并且可能是皮下来源的，或者来源于各种解剖学区域，其中包括腹部，胸部，臀部和四肢。WAT也可被认为是产生激素以调节多种生理系统例如饥饿/饱腹感，葡萄糖代谢和脂质代谢的内分泌器官。功能正常的WAT器官至关重要。事实上，WAT不足可能导致疾病或死亡。

作为器官，WAT包括成熟的白色脂肪细胞，其可以在形态学上被描述为具有超过细胞体积95％的单室脂滴的大细胞。这种大脂滴的存在使白色脂肪细胞漂浮。人白色脂肪细胞也可能被认为是特别脆弱的细胞，这在很大程度上是由于它们的尺寸。例如，人类白色脂肪细胞的尺寸范围为约100至约140μm，其为啮齿动物白色脂肪细胞体积的九(9)倍。

尝试培养原代的人白色脂肪细胞在很大程度上是不成功的。常规的体外培养方法学采用诸如酶处理和机械处理等技术来解离原代WAT并分离白色脂肪细胞。这种处理通常破坏或严重损害大部分白色脂肪细胞，其中大部分白色脂肪细胞在处理后72小时内经历细胞裂解。因此，不存在来自白色脂肪细胞的人WAT的研究模型。

尝试克服与白色脂肪细胞培养相关的挑战包括将白色脂肪细胞包埋在胶原蛋白基质中。但是，这种技术的成功有限。图1显示用碘化丙锭染色的胶原包埋的人WAT的显微照片，显示培养2天后程序性细胞死亡，即细胞凋亡的诱导。除了它们的脆弱性之外，脂肪细胞也被认为是终末分化的并且有丝分裂惰性的。因此，白色脂肪细胞在不改变它们的分化状态(即去分化)的情况下可能不会在培养物中扩增。

与大多数其他模型细胞类型(细胞原种可以被冷冻用于长期储存)不同，必须从手术室或诊所新鲜获得人WAT/白色脂肪细胞，并立即用于每个实验。因此，研究人员必须依靠手术获得的人WAT作为来源材料，这会限制WAT/白色脂肪细胞向非临床研究人员的可及性。事实上，缺乏与临床医生关系的研究人员可能无法获得人WAT。然后研究实验可能受临床医师的时间表限制，而所述时间表可能是不可预测的。此外，组织获得可能是耗时的，并且通常需要旅行，穿上手术服装以及医院批准调查方案。获得来源WAT的这些障碍已经放慢了科学发现的整体速度，并可能阻止研究人员研究人类WAT的生物学。

目前，研究人员依赖于模型，包括化学分化成脂肪细胞样细胞(即diffAds)的啮齿动物模型或基质/干细胞模型。然而，这些实验模型无法重演原代的人类WAT生物学。例如，最早确定的抗肥胖途径之一受到β-3肾上腺素受体(β3-AR)的控制。使用选择性β3-AR激动剂，肥胖症和糖尿病在几种啮齿动物模型中被成功治愈。然而，在啮齿动物肥胖模型中成功的相同的选择性β3-AR对人类β3-ARs没有活性，导致多次失败的临床试验。

类似地，某些模型细胞类型，例如基质和干细胞可以化学分化成脂肪细胞样细胞(即diffAds)。然而，diffAds仅以降低的水平表达人类白色脂肪细胞标记，包括CCAAT/增强子结合蛋白α，脂蛋白脂肪酶，脂肪酸结合蛋白4和激素敏感性脂肪酶。此外，基于diffAds的肥胖模型在测量甘油释放，脂连蛋白释放和葡萄糖摄取的代谢测定中不能重演白色脂肪细胞功能。

遗传学上，体外细胞模型与白色脂肪细胞不共享相似的基因表达模式。图2图示了常规培养模型和原代WAT之间的脂肪细胞身份基因表达的变化。图2中的“diffAd 1”条形代表diffAds的表达水平，其是使用标准方案分化成多室的脂肪细胞样细胞的干细胞。图2中的“diffAd 2”条形代表体外使用表达PPARg的慢病毒构建体分化成“脂肪细胞”的干细胞的表达水平。图2中的标记为“原代”的条形代表原代脂肪组织的表达水平。如图所示，原代脂肪组织以比体外模型高10至100倍的水平表达脂肪细胞基因。因此，常规模型无法重演原代脂肪组织的基因表达水平。

稳定的原代人WAT体外培养是很重要的，因为长期生存能力是细胞健康的代表。渐进地死亡的细胞群产生不可靠的数据和误导性的结果。WAT的长期培养一直是一个未解决的挑战，因为脂肪细胞是漂浮的，易于死亡。这些特性排除了对标准组织培养表面的使用。将脂肪细胞嵌入细胞外基质(ECM)中的尝试保护了啮齿动物脂肪细胞的活力，但据我们所知，尚未成功地扩展到人WAT。

在细胞片层工程中，细胞片层生长在聚(N-异丙基丙烯酰胺)等温敏性基质上并从其上被释放。由于释放过程不需要酶的消化，所以保存了ECM。在SWAT中，保存的ASC ECM有两个功能。1)它重演了原生基质环境；2)它迅速而有力地粘合ASC片层，从而克服了WAT的漂浮。

与其他脂肪微生理系统不同，SWAT利用原代人WAT，而不是diffAds或啮齿动物脂肪细胞。这一区别很重要，因为即使在优化的条件下，diffAds也不能重演原代脂肪细胞的生理状况。例如，我们此前表明，完全分化成diffAds的人类多能细胞所表达的关键脂肪细胞基因只有原代WAT的<1％，即使在慢病毒驱动的条件下。进一步证明了体外和体内的分化在转录上是不同的，这表明diffAds是一个不完整的脂肪生成模型。类似地，人们早已认识到，啮齿动物和人类脂肪细胞的生理结构在关键方面是不同的，诸如β-3肾上腺素受体的密度。由于这些缺陷，脂肪的微观生理系统利用原代人WAT是至关重要的。

对于脂肪生物学家来说，SWAT提供了几个优势。首先，培养SWAT数周的能力允许研究缓慢发生的WAT现象，诸如脂肪细胞更新(turnover)、肥大和纤维化。第二，SWAT的非漂荡性允许通过以前不适用的技术(如延时成像)对单个脂肪细胞进行长期监测。第三，所使用的温敏基质是市面上可以买到的，而且价格低廉，从而避免了对微芯片制造专业技术的需求。最后，SWAT很容易产生自多个脂肪组织库中，自女性和男性个体两者，自正常体重、超重和肥胖受试者，以及自糖尿病和非糖尿病受试者。这些优点使SWAT成为一种低成本和高度可行的技术，避免了对漫长的分化方案的需要。

实施SWAT模型或其他夹心构建体的一个问题是，组成性漂浮组织的性质使得模型在处理过程中对破坏很敏感。这个问题在将模型运输到实验室外部的过程中被放大了。本文介绍了减轻这种破坏的运输方案。这些运输方案旨在防止流体剪切力将漂浮组织或细胞以及悬浮在其中的任何其他细胞(如癌细胞或肿瘤)从平板上抬起。在某些实施方案中，运输方案降低了模型的温度，使漂浮组织或细胞以及悬浮在其中的任何其他细胞(如癌细胞或肿瘤)的新陈代谢率降至最低，而不会引起冰晶损伤。在某些实施方案中，运输方案允许足够的营养物质循环并促进气体交换，以防止细胞死亡。

在一个单孔或多孔板或其他适当的培养皿或容器中，可以在孔的底部放置一层明胶。然后，本文所描述的SWAT模型可以层铺在这一明胶层顶部上。然后在SWAT模型的顶部上放置第二层明胶，从而将SWAT模型的所有面完全封装起来。可以使用生物防冻剂(例如Wisconsin移植溶液)，使模型降至冰点或接近冰点的温度。可以进一步采用柱塞系统来固定顶部的明胶层。在某些运输方案的实施方案中，可以使用任何夹心构建体来代替SWAT模型。在某些实施方案中，可以使用替代性保护材料，如冷粘附促进材料，代替明胶层或明胶涂层，来封装或夹住SWAT或夹心构建体。

人类乳腺组织模型

人类乳腺组织模型可以使用夹心构建体来制作。例如，可使用先前用胶原酶消化从天然乳腺组织中分离出来的ASCs，并储存在液氮中，形成顶部和底部的细胞片层(支持细胞层)。底层细胞片层可在组织培养塑料盘上进行培养。切碎的天然乳腺组织与乳腺癌细胞混合，然后夹在顶部和底部细胞片层之间。可以用一个一端含有明胶层的柱塞装置，通过在冰上冷却，将顶层细胞片层从盘中取出。细胞片层/柱塞可以放置在上面铺种了细胞和/或脂肪的底层顶部。盘子可以放在孵箱中，以融化明胶并释放出细胞片层来创建模型。人类乳腺组织可以是完整的组织——即它可以包含可能自然出现在人乳腺组织中的任何细胞类型。例如，除脂肪组织外，本文所用的人乳腺组织可以包含免疫细胞，和/或可以包含ER+或ER-乳腺癌细胞系或实体肿瘤。

在构建时，人类乳腺组织可能是一个完整的组织。由异质细胞群组成的天然乳腺组织可与ER+或ER-乳腺癌细胞系混合，并被包裹在工程化的ASC细胞片层中。这种设计允许乳腺癌细胞系与基质细胞在模拟人体生理状态的3D环境中进行共培养。该实验设计允许人们收集多个时间点来跟踪肿瘤内的进展。兼容的测定方法包括但不限于扫描电子显微镜(SEM)成像、免疫组织化学(IHC)、免疫荧光(IF)抗体染色、定量PCR(qPCR)、蛋白质组学、脂质组学和蛋白质印迹。QPCR和蛋白质印迹可用于分析整个人乳腺组织样品，或分析分离自人乳腺组织并使用荧光激活细胞分选(FACS)分开的单个细胞类型的群体。

人乳腺ASCs和来自选择性手术的乳房组织可用于制作人类乳房组织模型。ASCs是乳房微环境的正常基质细胞，分泌细胞外基质蛋白、生长因子和细胞因子，是乳房组织的原生细胞。ASC细胞片提供生长因子，以保持乳腺组织的健康，并起到固定人类乳腺组织漂浮的作用。通过使用来自人类乳腺组织的ASCs，这种方法确保了ASCs与癌细胞的相互作用将模仿体内乳腺癌的情况；来自不同库房的ASCs显示出不同的基因表达和ECM重塑。

来自人类乳腺组织的完全成熟的脂肪细胞的使用也很重要，因为脂肪细胞影响癌症的发展、药物反应和侵袭性。此前研究脂肪细胞和癌细胞之间相互作用的模型使用体外分化的前脂肪细胞(即diffAds)。在体外分化的前脂肪细胞并没有完全成熟到与体内成熟的脂肪细胞相同的程度。为了了解脂肪细胞如何影响癌症进展和药物反应，我们必须使用与天然乳腺组织中的脂肪细胞表达相同基因的、并以相同的方式作出反应的细胞，这一点至关重要。培养未经酶解的原代成熟乳腺组织，可以使乳腺组织中的ECM蛋白和生长因子保留在人体乳腺组织中。这个模型系统将使我们能够更准确地了解基质环境如何影响肿瘤生物学。

实施方式的描述

提供了用于培养组织和细胞的装置，方法和系统。在示例性的非限制性实施方案中，提供了用于在甚至在长期培养后,能够维持原代细胞类型特征(包括形态，基因和蛋白质表达水平以及代谢功能)的条件下培养漂浮的原代人体组织外植体和细胞的装置，方法和系统。

在示例性实施方案中，提供了用于体外培养人WAT的漂浮组织外植体的装置，方法和系统。

本公开的实施方案提供了用于在加入含水培养基中时培养漂浮组织和细胞的系统，方法和装置。本公开的实施方案提供了用于培养从个体(例如患者)获得的原代人组织外植体和细胞的系统，方法和装置。本公开的实施方案提供了用于在延长的时间段(例如几周)以稳定的分化状态培养人组织和细胞的系统，方法和装置。

本公开的实施方案提供了用于配置微生理学，例如芯片上器官模型系统的系统，方法和装置。本公开的实施方案提供了评估化学化合物例如药物对通过本文公开的系统，方法和装置培养的人组织外植体和细胞的影响。本实施方案可包括整合在漂浮组织和细胞类型内的其他细胞类型。这可能包括癌细胞和肿瘤，包括但不限于乳腺癌(如导管原位癌(DCIS)、小叶原位癌(LCIS)、ER+乳腺癌、PR+乳腺癌、Her2/neu+乳腺癌、三阴性乳腺癌、BRCA1+乳腺癌、BRCA2+乳腺癌和炎性乳腺癌)，结肠癌(CMS1亚型。CMS2亚型、CMS3亚型、CMS4亚型、癌病(carcinomatosis，扩散到整个腹腔))、前列腺癌(腺癌、小细胞癌、神经内分泌肿瘤(除小细胞癌外)、过渡细胞癌)、肉瘤、脂肪肉瘤(分化良好的、去分化的、黏液样的、圆细胞型、多形性)，胰腺癌(导管腺癌、导管内乳头状粘液肿瘤(IPMN)、腺泡细胞癌、腺鳞癌、胶样癌、巨细胞癌、肝样癌、粘液性囊性肿瘤、胰母细胞瘤、浆液性囊腺瘤、印戒细胞癌、实性假乳头状瘤、鳞状细胞癌和未分化癌、胰腺神经内分泌瘤(PNETs)或胰岛细胞瘤：胰岛素瘤、胰高血糖素瘤、胃泌素瘤、生长抑素瘤、血管活性肠肽瘤、胰多肽瘤)、脂肪瘤、多形性胶质细胞瘤、星形细胞瘤、肝细胞癌和肾细胞癌。

通常，体外组织和细胞培养系统使用培养容器，例如培养皿，平板，烧瓶，载玻片，组织或细胞以及富营养培养基一起添加到所述培养容器。在某些情况下，培养皿可提供可粘附组织或细胞的基质，并且培养基可提供必要的组分以支持和促进添加到其中的组织和细胞的代谢功能。建立组织或细胞的新培养物需要将样品组织或细胞转移到具有含水培养基的培养皿中。不漂浮的组织和细胞类型可以停留在培养容器的表面上，其中通常称为细胞粘附的复杂过程发生对表面的组织或细胞粘附。然而，某些组织和细胞类型是漂浮的，因此漂荡(float)在它们的培养基中而不是附着到培养皿的表面。对于某些细胞类型，不附着可能会导致细胞死亡。

本公开的实施方案提供用于体外培养漂浮组织和细胞的系统，方法和装置。在具体的实施方案中，本文所述的系统，方法和装置可以适用于培养所有组织和细胞类型，包括但不限于：白色脂肪组织(WAT)，棕色脂肪组织，脑，神经系统组织，甲状腺，胰腺，脾脏，软骨，肝脏，肾脏和骨骼。

参考图3至8，显示了用于培养漂浮细胞类型的系统的不同视图。图3示出了用于培养漂浮细胞类型的培养装置500的示例性实施方案。培养装置500可以包括培养容器200(例如培养皿200)和插入件100。在某些非限制性实施方案中，培养容器200和插入件100可以包含促进组织或细胞粘附到容器或插入件表面的材料。

在一些实施方案中，粘附促进材料本身可以是容器200或插入件100的组件。在其他实施方案中，可以向容器200和/或插入件100添加粘附促进材料。在该实施方案中，容器200和/或插入件100的相应基底/表面可以涂覆有蛋白质基质或细胞外物质。粘附促进材料的非限制性实例包括但不限于聚(N-异丙基丙烯酰胺)(pNIPAAM/pNIPAm)，改性甲基纤维素和温敏性材料，例如温敏性聚电解质多层膜，明胶，胶原，透明质酸和纤维素。

在本公开的一个示例性实施方案中，培养容器200可以包括具有基底201，侧壁203和开口202的培养皿200。培养皿200的基底201可以被配置为允许培养至少一层支持细胞。培养皿200可配置为包括用于插入插入件100装置的开口202。

如图3所示，插入件100可以包括基底102和手柄101。手柄101可以被配置为允许插入穿过培养皿开口202。基底102可以被配置成允许培养至少一层支持细胞104。

在多种实施方案中，可以在培养支持细胞之前将温敏层(未显示)添加至培养皿基底201、401或插入件基底102的表面。可以在覆盖培养皿基底201或插入件表面102的温敏层的表面上培养支持细胞层104。参见图3。用温敏层处理培养皿200和插入件100表面可允许将完整的支持细胞层从培养皿200或插入件100转移到另一个培养皿或插入件。参见图3，图4和图5。

在一个示例性实施方案中，在第一培养皿基底201的表面上具有一层温敏材料的第一培养皿200可用于培养可用于形成夹心构建体的顶部层的支持细胞层104，。插入件100可通过第一培养皿200的开口202放置，使得插入件100的表面102可以接触支持细胞层104。培养环境中的条件可以被改变以激活温敏材料，例如温度变化，并且将支持细胞层104从第一培养皿200的基底表面201释放，允许支持细胞层104粘附到插入件100的表面102。参见图4。图5中还显示了通过活化温敏材料从第一培养皿200的基底表面201移除支持细胞104并且附着到插入件100的表面102，以及具有开口402的第二培养皿400和生长在第二培养皿400基底表面401上的支持细胞层204。在某些实施方案中，第二培养皿基面401可选地包被了温敏材料。在某些实施方案中，支持细胞层204可用于形成夹心构建体的底部层。

在一个示例性实施方案中，皮下WAT样品可以在选择性外科手术过程中从人类受试者获得。在该实施方案中，样品尺寸可以在约100至约5000克WAT的范围内。在特定实施方案中，可以为各种实验目的将实验样品分开。在一个特定的实施方案中，可将皮下WAT样品的一部分(例如10克)切碎，快速冷冻并作为匹配的原代WAT样品进行储存。在一个具体实施方案中，皮下WAT样品的一部分，例如10克，可以作为用于转录确认的匹配的原代WAT样品储存在核酸裂解缓冲液，例如RNeasy Lipid Tissue Mini Kit^TM(Qiagen)中。在特定实施方案中，根据本公开的实施方案，皮下WAT样品的一部分(例如25克)可用于生产SWAT培养物。在一个具体的实施方案中，当WAT被切碎，酶促消化并离心时，可以使用皮下WAT样品的一部分(例如25克)来分离匹配的支持细胞，例如用于使用标准方案分化成diffAd的脂肪细胞和ASC。

在本公开的示例性实施方案中，可将原代WAT从患者分离并机械切碎成目标组织300的碎片。目标组织300可以是人WAT。可以将目标组织300转移到培养皿400中，培养皿400具有在培养皿基底401上生长的支持细胞层204。参见图6。

然后可以将具有支持细胞层104的插入件100插入培养皿400中，后者包含在支持细胞层204顶部上的目标组织300。参见图7。在该实施方案中，目标组织300(例如，切碎的原代人WAT)然后可以夹在两层支持细胞104、204之间以形成夹心构建体800(例如，夹心WAT(SWAT)共培养系统)。参见图8。上方支持细胞层104可以附着到插入件100的基底102并且用于保持目标组织300(例如，漂浮组织诸如人WAT)与附着于培养皿200的下层支持细胞204接触直至发生附着。在示例性实施方案中，目标组织300与支持细胞层104,204之间的附着在几分钟内发生。。在某些实施方案中，夹心构建体800包括两层支持细胞。在某些实施方案中，夹心构建体800可以包括三层、四层或更多层支持细胞和/或合成、无细胞层。在某些实施方案中，SWAT系统的双层构建体可以是完全细胞的或可以含有多种合成组分或无细胞组分。

在一个示例性实施方案中，将人类原代WAT的0.5-1mm碎片夹在两层支持细胞(例如脂肪来源的基质细胞(ADSC))之间以形成本文所述的SWAT共培养系统。支持细胞，例如ADSC，可以在包被温敏基质的标准组织培养板上培养。如本文所公开的SWAT培养系统也可以使用标准培养基发挥功能。标准培养基的实例包括至少低葡萄糖DMEM，约10％新生小牛血清和约1％青霉素/链霉素抗生素溶液。

在示例性实施方案中，本文描述的SWAT系统可以用作旨在修饰脂肪组织或脂肪细胞的生物学或生理学的任何外在因素或系统的测试模型。在多种实施方案中，可以将测试因子引入细胞培养基中，并在分离的人脂肪细胞或原代人WAT的碎片中评估它们的影响。测试因子的非限制性实施方案可以包括但不限于药物化合物，重组或天然病毒，重组或分离的核酸构建体，表达载体，siRNA构建体，微RNA构建体，遗传工具，细菌和环境调节，包括温度，压力和气体的调节。

如图9A的显微照片所示，在双层支持细胞之间可以建立SWAT培养物。将WAT添加到未标记的支持细胞的底层，并添加表达增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的支持细胞的顶层。如图9A所示，将WAT簇细胞夹在双层支持细胞(例如，eGFP阴性(底层)和eGFP阳性(顶层))之间以形成示例性SWAT培养体系。而且，图9B显示了SWAT培养物随时间的显微图像。SWAT培养物内的WAT细胞簇能够保持其形态稳定性达至少47天或约6.7周。参见图9B。

在多种实施方案中，本文描述的SWAT共培养系统展示长期生存力和稳定性，这些是终末分化细胞(包括WAT)的微生理学模型的重要特征。在本公开的一个示例性实施方案中，在图10中的SWAT细胞簇的染色中说明了长期形态学稳定性。在图10A中，通过将中性脂质仅限于WAT细胞阐明了WAT细胞簇的结构稳定性,即使在SWAT培养物中51天后。同样，SWAT培养物中WAT细胞的碘化丙锭染色如图10B所示为阴性。碘化丙锭阴性WAT细胞表明，在SWAT培养至少18天后，WAT细胞没有经历程序性细胞死亡，即细胞凋亡。最后，将亲脂性染色限制于SWAT共培养物的脂肪细胞进一步证明了本文所述系统和方法的长期生存力。参见图10C。与常规方法相反，本公开的示例性实施方案证明，SWAT培养物内的WAT细胞簇保持其细胞内结构，例如图10A，是可行的并且不进入程序性细胞死亡状态，例如图10B，并且保持为不同的人群。

图11证明本文所述的SWAT系统能够维持至少六(6)个关键脂肪细胞身份基因的基因表达谱，包括：作为脂肪细胞分化/同一性的主要调节剂的活化受体γ(PPARγ)；脂肪酸结合蛋白4(FABP4)，其是终端脂肪细胞分化所必需的转录因子；CCAAT/增强子结合蛋白α(CEBPa)，其将长链脂肪酸和视黄酸递送至核受体；脂蛋白脂肪酶(LPL)，其是水解甘油三酯的酶；激素敏感性脂肪酶(HSL)，其将存储的甘油三酯水解为游离脂肪酸；和脂连蛋白(ADIPOQ)，其是控制脂肪代谢和胰岛素敏感性的中心脂肪因子。在实验上，从SWAT培养物收集总RNA，并使用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)将表达水平与受试者匹配的原代WAT进行比较。在转录水平上，本公开内容的SWAT培养系统保持了脂肪组织的身份。参见图11。

在翻译水平上，本公开的SWAT培养系统也维持脂肪细胞蛋白质。如图12所示，SWAT培养物的免疫细胞化学染色证明了脂肪细胞标记物的蛋白质产生，所述标记物包括：PPARg，FABP4，与脂肪细胞脂解有关的β-3肾上腺素能受体(B3-AR)和围脂滴蛋白(perilipin)，其已知为蛋白质脂滴相关蛋白并在脂肪细胞中包被脂滴。

除了表达与脂肪细胞相关的基因和蛋白质标记物之外，本公开的SWAT培养物还执行基础内分泌功能。在本公开的某些实施方案中，可能需要将培养模型中组织和细胞的功能维持为尽可能接近天然组织。在各种实施方案中，SWAT簇保持其天然内分泌功能。原代人体WAT是分泌至少2种激素的内分泌组织，所述激素包括：瘦蛋白和脂连蛋白。基于标准化的定量ELISA测定，如图13A和图13B所示，在培养一(1)和五(5)天后，SWAT培养物以与受试者匹配的WAT相似的水平分泌瘦蛋白和脂连蛋白。参见图13A和图13B。

此外，本文所述的SWAT培养系统响应于外源信号以与原代WAT相似的水平进行脂解。参见图13C。脂解作用是WAT的核心功能，是将储存的脂肪转化为代谢燃料的过程。在体内，脂解以基础速率发生并被儿茶酚胺上调。在体外，脂解可以通过使用常规Bradford总蛋白质测定法测量释放的游离甘油的量并对总蛋白质水平归一化来定量。在本公开的一个具体实施方案中，将SWAT培养物暴露于100μM毛喉素+1μM肾上腺素三(3)小时。在培养1天和5天后，SWAT培养物响应刺激以类似于原代WAT的水平进行脂解。

在另一个示例性实施方案中，本文描述的SWAT培养系统可以在SWAT培养至少十天后维持原生功能性。如图14所示，在SWAT培养十天后收获SWAT培养物并皮下注射到免疫受损的eGFP标记的小鼠(NOD-scid IL2Rγnull)中。已知植入的组织必须招募新的血液供应，即诱导血管形成，或者组织将在48小时内死亡，即坏死并随后由宿主液化。在一个示例性实施方案中，SWAT移植物在皮下注射后10天从它们的小鼠宿主重新收获。目视检查时，注射的SWAT组织很容易被肉眼看到。参见图14(重新收获)。此外，组织学分析显示SWAT移植物保持了WAT的结构特征，并且不表达小鼠宿主的内源性eGFP。参见图14(SWAT和Neg)。这些数据表明SWAT培养物甚至在SWAT培养中十天后可以保留足够的原生功能，以使SWAT组织能够移植。因为招募新的宿主血液供应，即血管形成是一个非常复杂的过程，所以这个数据进一步表明，本文描述的SWAT系统可以是人WAT的稳健的微观生理学模型。

图15A和B显示了说明用肿瘤细胞接种的SWAT模型的图像。这个示例性的实施方案表明，表达荧光蛋白的乳腺癌细胞在人乳腺组织内的培养可以持续到至少14天。图15A显示了表达绿色荧光蛋白的luminal乳腺癌细胞的延时图像，具有有丝分裂和癌细胞运动的迹象。这些细胞行为表明成像的癌细胞正在增殖。图15B显示的是表达红色荧光蛋白的三阴性乳腺癌细胞的延时图像，具有有丝分裂和癌细胞运动的迹象。这些细胞行为表明成像的癌细胞正在增殖。

在另一个示例性的实施方案中，提供了一种转运SWAT模型的方法。图16说明了用于转运SWAT模型的系统1600，其中明胶层1601可以沉积在SWAT模型的顶部和周围。目标组织300可进一步包括其他细胞类型，包括但不限于癌细胞或肿瘤。生产可转运的SWAT模型的方法可包括在培养容器(如皿或多孔板)或其他基质表面的生物相容的、稳定的、非反应性材料上生成SWAT模型，将SWAT浸泡在允许模型的温度达到冻结或接近冻结而不形成冰晶的生物防冻剂(例如Wisconsin移植溶液)中，将温度降低到冻结或接近冻结，以降低细胞的代谢需求，然后将明胶在细胞复合物的顶部成层。明胶可以作为液体层铺在SWAT上，然后明胶在从液体变换到固体时轻微膨胀。这种膨胀在夹心构建体的顶部和侧面成层时会轻微压缩夹心构建体，并防止漂浮组织的细胞从构建体中漂荡出来。虽然明胶层可能已被用于提供将细胞粘附在培养板上的表面，但在这一领域，明胶尚未被用于产生如同在开发这一运输方案时所见的压缩效果。图17示意了图16的系统的另一个实施方案，即系统1700，其中机械装置1701可用于在转运过程中将明胶层固定在原位。机械装置1701可以是柱塞、弹簧机构、橡胶垫或其他合适的装置或手段。

图18是制备用于维持目标漂浮组织(诸如WAT)的夹心构建体的示例性过程1800的流程图。该过程的某些步骤可以按任何顺序进行。为了制备夹心构建体，必须提供至少一个顶部层和一个底部层的支持细胞。底层支持细胞(例如支持细胞层204)可以通过在第一培养容器(例如第二培养皿400)中接种支持细胞，并培养底层支持细胞直到它们在第一培养容器的底部形成汇合层来制备(1802)。底层支持细胞可以在大约体温下进行培养(例如，对于人类细胞来说，温度在36℃和38℃之间，或者在温热的温度下)。顶层支持细胞(例如支持细胞层104)可通过在第二培养容器中接种支持细胞来制备，其中第二培养容器可用温热粘附促进材料(例如聚N-异丙基丙烯酰胺(pNIPAAm))包被(1804)。顶层支持细胞可以在大约体温下培养，直到它们在第二培养容器的底部形成汇合层，其中第二培养容器基底与第一培养容器基底的大小相同。在某些实施方案中，如果需要多个夹心构建体，例如在多孔板如六孔板中，培养容器可以是第一和第二多孔板的单个孔，并对第一或第二板的每个各自的孔实施每个步骤。在某些实施方案中，任一层支持细胞都可以在诸如插入装置、温敏材料、替代生长表面或它们的组合的基质上生长。

可以准备一个插入装置(例如装置100)，用于转移顶层细胞以组装夹心构建体，其中插入装置具有与第二培养容器的基底尺寸相匹配的表面，并且插入装置表面包被有冷粘附促进的材料(例如，明胶)(1806)。可将插入装置插入第二培养容器中，并使得顶层支持细胞在适度的温度如室温(例如，约20℃)下粘附在插入装置的包被的表面(1808)。

第二培养容器连同与顶层支持细胞接触的插入装置可被冷却到低温，例如使用冰水浴(1810)。这可以使温热粘附促进材料失去稳定性，并使得顶层细胞(例如，支持细胞104层)作为一个完整的薄片从第二培养容器的基底解离，同时保持粘附在插入装置上的冷粘附促进材料上(例如，见图5所示的插入装置100)。

可以获得切碎的或吸脂的漂浮目标组织(例如，目标组织300)，并将其转移到容纳底层支持细胞的第一培养容器(例如，第二培养皿400)(1812)。

插入装置(现在携带顶层支持细胞)可被移动到容纳漂浮组织和底层支持细胞的第一培养容器中，以组装一个夹心排列，所述夹心排列包含夹住漂浮组织的双层支持细胞层，并可在漂浮组织的生物体的通常体温下孵育(1814)。这种温热的孵育温度可以促进双层支持细胞层之间的粘附，同时使冷却粘附促进材料失稳或融化。冷却粘附促进材料的失稳可以允许插入物的移除，同时留下顶层支持细胞粘附到漂浮组织和底层支持细胞。(在某些实施方案中，第一培养容器中剩余的任何融化的冷粘附促进材料可以被移除。)第一培养容器现在应容纳了一个完整的夹心构建体，其包含两个支持细胞层和目标组织(例如，夹心构建体800)。

图19是制备用于运输的含有漂浮组织的夹心构建体的示例性过程1900的流程图。对于每个所需的夹心构建体，培养顶部和底部的支持细胞层(1902)。例如，每个支持细胞层可以在一个培养容器上或在一个插入装置的表面上进行培养。培养容器或插入装置可具有温敏性材料涂层或结构，以便于支持细胞层的转移。对于每个所需的夹心构建体，准备一个可以包含一层保护材料(如明胶)的容器(1904)。例如，该容器可以是一个培养容器，如六孔板的一个孔，或一个培养板。第一层支持细胞可以被转移到容器中，以形成夹心构建体的底层，层铺在保护材料的顶部上面(1906)。在某些实施方案中，直接在容器的基底上组装/培养夹心构建体，例如，没有步骤1904的保护材料层，并且，例如，底部/第一层支持细胞是在容器的基底上生长。漂浮组织可以被转移到容器中，覆盖在底部的支持细胞层上(1908)。接下来，第二层、顶层的支持细胞可以被转移到容器中(即，在漂浮组织、底层支持细胞和保护材料上方)，以形成夹心构建体(1910)。在某些实施方案中，每层支持细胞可使用插入装置(如插入装置100)进行转移。在某些实施方案中，整个夹心构建体可以作为一个单元转移到含有保护材料的容器(1912)中，而不是像步骤1906、1908和1910那样逐层转移。在某些实施方案中，在将夹心构建体作为一个单元转移到含有冷粘附促进材料的容器中之前，可以首先处理和冷却夹心构建体。在某些实施方案中，通过将夹心构建体浸泡在防冻剂组合物中处理夹心构建体，并通过将夹心构建体的温度降低到冰点、接近冰点或低于冰点(例如，2℃、1℃、0℃或-80℃)进行冷却。防冻剂组合物可以是，例如，在接近和低于0℃的温度下的水溶液中防止晶体形成的无毒组合物，生物防冻剂的合成版本，或生物防冻剂(例如，威斯康星大学冷藏溶液)。在某些实施方案中，在步骤1910或1912之后，处理并冷却夹心构建体(1914)。第二层保护材料，如明胶，可被应用于处理过的夹心构建体，以在所有侧面封装夹心构建体(1916)。在某些实施方案中，夹心构建体没有用防冻剂组合物处理，只是冷却到冰箱温度，如0℃和5℃之间，或大约2℃、3℃或4℃。在某些实施方案中，夹心构建体下面没有保护材料层，夹心构建体可以直接粘附在容器的底部。在某些实施方案中，封装的夹心构建体另外使用机械装置，如机械装置1701固定在原位以便运输(1918)。如本文所用的，保护性材料可以是在低温(如冰点、接近冰点或低于冰点)下稳定的材料。在某些实施方案中，保护材料可以是明胶或晶胶(cyrogel)。在某些实施方案中，保护材料在从液体转换到固体时略微膨胀；这种膨胀在夹心构建体的顶部和侧面成层时会轻微压缩夹心构建体，并防止漂浮组织的细胞从构建体中漂荡出来。在某些实施方案中，保护材料在室温下如15-25℃也是稳定的。在某些实施方案中，保护材料必须具有低于例如30°、40°或50℃的融点，以避免在作为液体应用时对夹心构建体的热损伤。在某些实施方案中，保护材料可以缓冲振动。在某些实施方案中，保护材料可以是一种冷粘附促进的材料。在某些实施方案中，保护材料可在容器和/或夹心构建体上形成一层涂层。

图20是制备用于评估肿瘤对候选疗法组的敏感性的患者匹配的离体模型的示例性过程2000的流程图。该过程2000可以应用于肿瘤和其他与漂浮细胞类型如WAT相关的癌细胞(例如，乳腺癌)、前列腺癌和本公开中提到的其他癌症。在某些实施方案中，过程2000的步骤可以以不同的顺序进行。可以基于患者自身的组织和肿瘤样品制备夹心构建体。患者可以是人或另一种动物。在过程2000中，可以获得一个或多个患者的健康漂浮组织的样品，并用作夹心构建体的支持细胞和目标组织两者的来源。可以获得患者的肿瘤或其他癌细胞样品，并与患者的健康漂浮组织样品的一部分相结合，作为夹心构建体的目标组织300——即目标组织300可以是组织外植体(tissue explant)。更具体地说，健康漂浮组织的第一样品可以从患者那里获得(2002)。例如，在肿瘤活检过程中，可以从患者获得健康漂浮组织如乳腺组织的单独样品(例如5、10、15或20克)。支持细胞如基质细胞可以从来自患者的健康漂浮组织样品分离出来。例如，可以经由机械和酶解从健康漂浮组织中分离出100-500万，或200-300万支持细胞。支持细胞可以被培养并生长成层(例如，支持细胞层104和205)(2004)。例如，乳腺源性基质细胞(BSC)可以分离自活检相关的健康乳腺组织样品，并生长成BSC细胞片层。

可以获得患者健康漂浮组织的第二样品和活体肿瘤/癌细胞的第三样品，以制备夹心构建体的目标组织(2006)。在某些实施方案中，第二漂浮组织样品和第三肿瘤样品是在比步骤2002的样品更晚的日期获得的，例如几周后。这个时间的推移可以使得准备支持细胞层的时间成为可能。在某些实施方案中，步骤2002的第一漂浮组织样品和步骤2006的第二漂浮组织样品是在同一时间获得的，并且可以从同一样品中划分出。例如，在肿瘤切除时，患者的肿瘤活检数周后，可从同一患者身上获得健康人乳腺组织(如5、10、15或20g)和活体肿瘤(1-2g，或1-5g)的样品。在某些实施方案中，支持细胞层是替代性地源自细胞系或不同个体的漂浮组织样品。在某些实施方案中，对于脂肪组织相关的癌症，健康漂浮组织的第一样品与第二样品取自同一脂肪组织库，并且第一样品取自同一类型的生物体，但不同的个体。在某些实施方案中，健康漂浮组织的第二样品和第三肿瘤样品取自不同的个体。

健康漂浮组织的第二样品和活体肿瘤的第三样品可被分割成小块并混合，以准备作为夹心构建体的目标组织(2008)。例如，两个样品可以被切碎成直径约0.5-1毫米的小块。在某些实施方案中，目标组织300中只包括肿瘤或癌细胞，不混入漂浮组织的第二样品。在某些实施方案中，活体肿瘤的第三样品是被标记的，以便肿瘤材料可以很容易地被看到并被回收以进行分析。肿瘤标记应该是对肿瘤细胞无细胞毒性的。例如，标签可以是CellTracker^TM Green CMFDA Dye(5-氯甲基荧光素二醋酸酯)。

来自第二和第三样品(如目标组织300)的漂浮组织和肿瘤组织的混合物可被布置在夹心的支持细胞层内，并可用于在多孔板中用患者匹配的夹心构建体填充每个孔(2010)。例如，在多孔形式中，人乳腺组织和肿瘤碎片可被夹心在BSC细胞片层之间。在夹心构建体的组织稳定后，可对活体肿瘤平行施用候选疗法(2012)。在经过一段时间让候选疗法生效后，可以从夹心构建体中回收肿瘤并分析确定每种候选疗法对患者肿瘤的有效性(2014)。例如，可以对肿瘤进行评估，以确定对肿瘤的结构和表型稳定性的影响，以及治疗的反应。例如，对于夹心构建体小组中一个或多个肿瘤，可以对肿瘤进行评估：增殖标志物的变化(如Ki67表达的变化)、细胞死亡标志物(如碘化丙啶染色)、肿瘤表型稳定性(如。通过激素受体染色以确定从HR+到HR-的变化)，肿瘤结构的变化(例如，通过苏木精和伊红染色)，或基因组、转录、蛋白质组、乙酰化和甲基化谱的变化。

本公开的示例性实施方案提供了可以允许研究有效的抗肥胖策略的系统。先前了解到，只有棕色脂肪组织能够在被称为产热的过程中燃烧能量。然而，在啮齿动物和diffAds模型中，已知可以诱导白色脂肪细胞成为产热的浅褐色/“brite”脂肪细胞(即，白色和棕色脂肪细胞的混合物，在本文称作brAds)，其可以基于响应升高的细胞内环AMP(cAMP)水平，解偶联蛋白1(UCP1)的上调被生化鉴定。具体而言，UCP1的诱导将WAT转化为产热细胞并导致细胞形态的改变。

形态学上，brAds从与WAT细胞相关的大的单室表型转变为多室表型。brAds的WAT特异性来源已通过啮齿类动物的谱系追踪研究得到证实：brAds是肌源性因子5(Myf5)阴性，而棕色脂肪细胞与骨骼肌细胞共有Myf5+谱系。在啮齿动物中，在大多数皮下和内脏WAT仓库中观察到褐变。在啮齿类动物模型中，褐色的WAT所带来的体重减轻可能是深远的。因此，本文公开的SWAT培养系统可以提供微生理模型系统，用于评估培养原代人WAT的受控褐变作为可行和有效的抗肥胖策略。

本公开的实施方案提供了用于研究在啮齿动物和diffAds模型中鉴定的褐变途径的生物化学的系统和方法，所述模型可以通过以下控制：β-3肾上腺素受体(B3-AR)，冷受体，心利钠肽受体受体，Janus抑制剂激酶3JAK3)和Notch 1。这些内源性生化途径中的每一个为药物干预提供了许多候选靶标。几种化合物在啮齿类动物和diffAds中褐变了WAT。在啮齿类动物中，化学诱导褐变的WAT成功改善了肥胖并治愈了2型糖尿病。因此，本文公开的SWAT培养系统可提供用于评估原代人体WAT组织中候选药物的微生理模型系统。

本公开的示例性实施方案提供了体外系统，其可以允许研究和评估化学化合物(例如药物)对人类WAT和其他漂浮细胞类型的作用。非限制性的示例性候选药物可以包括但不限于：β-3肾上腺素受体的激动剂和拮抗剂，例如1&3-AR；migrabegron，其是FDA批准用于膀胱活动过度综合征的第四代1&3激动剂，但已知它能激活人体内的棕色脂肪组织；CL-316243，其是特异性1&3激动剂(例如1&1,1&2,1&3＝0：1：100,000)，其改善了肥胖的糖尿病黄KK小鼠中的肥胖症；L-796568，其是苯磺酰胺家族特异性1&3激动剂，例如1&1,1&2,1&3＝1：230：660，其改善了能量消耗，但在肥胖的人类男性中不产生显著的抗肥胖作用；BRL26830A，其是1&3激动剂，在双盲试验中显示体重减轻的显著改善。

在其他示例性实施方案中，本文所述的培养系统可以维持培养物中其他漂浮细胞的天然功能。内源性生物化学途径可以通过应用和评估外源性刺激物(例如化学化合物)的影响来评估药物干预。无论组织类型或来源物种如何，任何漂浮的细胞类型都可以是用于本公开的实施方案中的候选物。可用于使用本文公开的装置，系统和方法进行评估的候选者的漂浮组织和细胞类型的示例性实施方案包括但不限于：肝细胞，肾组织和细胞，脑组织和细胞，甲状腺组织和细胞，脾组织和细胞，肝组织和细胞，中枢和外周神经组织和细胞，以及免疫组织和细胞。而且，漂浮细胞可以从任何来源生物获得。示例性的来源生物可以包括但不限于：植物，动物，原生生物，真菌，古细菌和真细菌。使用本文公开的装置，系统和方法进行评估的组织或细胞的另外示例性来源包括但不限于：人，小鼠，大鼠，猴，狗，猫，猪，非人灵长类和鱼。

本公开的示例性实施方案提供了用于研究示例性，非限制性细胞类型的生物学响应的系统和方法。例如，建立的漂浮组织类型可以包括神经元组织。如果例如过量的气泡被引入含水培养基中，神经元组织可能不容易粘附到培养皿的表面。因此，本文公开的漂浮组织培养装置，系统和方法可以直接应用于神经组织的研究。

本公开的实施方案提供用于培养可包括胚胎或成人神经元组织的神经元组织的装置，系统和方法。在一个示例性实施方案中，本公开提供了可用于评估神经发生的模型系统。在其他实施方案中，本公开可提供可评估神经元疾病进展的系统。

在示例性实施方案中，本公开的装置，系统和方法可用于评估导致通常称为阿尔茨海默病(AD)的神经元疾病的生物化学途径以及多种药物干预的影响。例如，AD疾病的中心是正常相对于疾病状态下整合膜蛋白淀粉状蛋白前体蛋白(APP)的差异化加工。在正常状态下，APP首先被α-分泌酶切割以产生sAPP和C83羧基末端片段。sAPP的存在与正常突触信号传导相关并导致突触可塑性，学习和记忆，情绪行为和神经元存活有关。在疾病状态下，APP被α-分泌酶和γ-分泌酶顺序切割以释放称为A 40/42的细胞外片段。这种神经毒性片段经常聚集并导致A 40/42寡聚化和斑块形成。40/42的聚集导致阻断的离子通道，钙稳态的破坏，线粒体氧化应激，受损的能量代谢和异常葡萄糖调节，并最终导致神经元细胞死亡。本公开的微生理系统提供了用于快速和有效评估体外漂浮神经元组织同时维持神经元组织处于天然状态的模型。

本公开的实施方案提供了用于评估涉及心血管疾病的生物化学途径的装置，系统和方法。心血管疾病仍然是美国的主要死因，每年有超过600,000人死亡，每年的直接成本接近3000亿美元。高血压(HTN)和肥胖是心血管疾病的两种最常见和可改变的危险因素。HTN影响29.1％的美国成年人，并且成功地治疗血压将心血管疾病风险降低20-50％。肥胖比HTN更普遍，影响36％的成年美国人，并被认为是全球性流行病。然而，尽管有几类抗高血压药物可用，但没有广泛有效的抗肥胖药物被批准用于患者使用。

在示例性实施方案中，本公开的装置，系统和方法可用于评估涉及心血管疾病和肥胖症的重叠生物化学途径。例如，HTN的发病机制通常涉及肾素-血管紧张肽系统(RAS)的过度激活。RAS过度激活也与肥胖有关，这是一种涉及WAT过度生长的疾病。此外，RAS共享与肥胖生物化学途径重叠的生物化学信号传导途径，如通过以下事实证明：(i)RAS的分子组分存在于脂肪组织中，(ii)WAT分泌血管紧张肽原(AGT)，(iii)血管紧张肽II(Ang II)可诱导分离的脂肪细胞和分化的脂肪细胞(diffAds)中的脂肪形成，(iv)Ang II刺激抑制了离体人脂肪细胞中的脂肪分解，因此有利于脂肪生成。

此外，本公开的实施方案证实SWAT培养物能够维持RAS途径组分表达。例如，使用RT-PCR，确定SWAT培养物保留了关键RAS组分(n＝5)的表达：(i)SWAT AGT表达：原代WAT的62％(范围47-79％)；SWAT ACE表达：原代WAT的58％(范围45-71％)，SWAT AT1R表达：原代WAT的14％(范围6-19％)；SWAT AT2R表达：原代WAT的231％(范围72-617％)，SWAT肾素：无可检测的表达。此外，就内分泌功能而言，如通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定，SWAT分泌AGT，瘦蛋白和脂连蛋白。最后，SWAT分泌77至204ng AGT/mg总蛋白，并且ELISA测试在来自培养的SWAT的培养基中未鉴定到Ang II。总之，这些数据表明RAS过度激活可能以全身和自分泌的方式驱动脂肪生成。在实施方案中，通过现有的经批准的药物疗法的RAS抑制可以改善高血压和肥胖。本公开的实施方案提供了用于研究该系统的装置，系统和方法。

***

上述描述包括对附图的引用，附图是详细描述的一部分。附图通过说明的方式显示了可以实施本发明的具体实施方案。这些实施例在本文也被称为"实例"。这些实例可以包括除所示或所描述之外的元素。这些实施方案是说明性的，并且本发明的范围不限于它们。然而，本发明人也考虑到了其中只提供了所显示或所描述的那些元素的实例。此外，本发明人还考虑了使用所显示或描述的那些元素(或其一个或多个方面)的任何组合或排列的实例，无论是就本文所显示或描述的特定的实例(或其一个或多个方面)而言，还是就其他实例(或其一个或多个方面)而言。此外，本文描述的任何步骤可以以任何期望的顺序执行，并且可以添加或删除任何期望的步骤。

在本文中，术语"a"或"an"的使用，正如在专利文件中常见的那样，包括一个或一个以上，不依赖于"至少一个"或"一个或多个"的任何其他实体或用法。在本文中，术语"或"用于指非排他性的或，如"A或B"包括"A而非B"、"B而非A"以及"A和B"，除非另有说明。在本文中，术语"包括(including)"和"其中(in which)"被用作各自术语"包括(comprising)"和"其中(wherein)"的简单英语等同形式。另外，在以下权利要求中，术语"包括(including)"和"包含(comprising)"是开放式的，换言之，一个系统、设备、物品或过程，如果包括权利要求中此术语之后所列元素之外的元素，仍被视为落入该权利要求的范围。此外，在以下权利要求中，术语"第一"、"第二"和"第三"等仅仅作为标签使用，而不是为了对其对象施加数字要求。

Claims (18)

1.一种用于制备用于转运的漂浮组织培养物的方法，其包括：

在一个容器中形成第一层支持细胞，所述支持细胞粘附到浸没在水性培养基中的容器的表面；

将漂浮组织样品放置到毗连形成的第一层支持细胞的上表面；

在第一层支持细胞和组织样品上方放置第二层支持细胞，以形成浸没在水性培养基中的夹心构建体；

培养漂浮组织样品，其中组织样品包括来自个体的组织外植体；

在夹心构建体上方放置一层保护材料。

2.根据权利要求1的方法，其中的保护材料是明胶。

3.根据权利要求1的方法，其中在将保护材料层放置在夹心构建体上方之前，夹心构建体被冷冻。

4.根据权利要求3的方法，其中通过将所述夹心构建体浸没在生物防冻剂中，并将夹心构建体的温度降低到冰点温度或接近冰点温度来冷冻所述夹心构建体。

5.根据权利要求1的方法，其中所述容器是培养皿或多孔板的孔。

6.根据权利要求1的方法，进一步包括使得所述保护材料层在一段时间内硬化，其中所述保护材料层以液体形式放置。

7.根据权利要求1的方法，其中所述夹心构建体包含组织样品和第一和第二层细胞之间的粘附。

8.根据权利要求1的方法，其中漂浮组织样品包含乳腺肿瘤碎片。

9.根据权利要求1的方法，其中第一层支持细胞源自来自所述个体的第二漂浮组织样品。

10.一种评估个体中肿瘤的候选治疗方法的方法，包括：

从健康漂浮组织的第一样品中分离出健康细胞群，其中基于健康细胞群产生支持细胞群；

培养支持细胞群以形成两层支持细胞；

基于健康漂浮组织的第二样品和活体肿瘤组织的第三样品制备目标组织，其中第二和第三样品来自所述个体并且目标组织包含肿瘤组织群；

在培养容器中组装夹心构建体，其中夹心构建体包含双层结构，其中两层支持细胞夹住目标组织；

将夹心构建体暴露于候选疗法；并且

评估目标组织中的肿瘤组织群的状态响应于候选疗法的变化。

11.根据权利要求10的方法，其中所述夹心构建体是基于所述个体的一批多重(multiplexed)夹心构建体中的一个。

12.根据权利要求10的方法，其中制备目标组织包括将第二和第三样品切碎为直径0.5至1.0mm的碎片，并将这些碎片混合在一起。

13.根据权利要求10的方法，其中所述肿瘤组织群用无细胞毒性标记进行标记。

14.根据权利要求10的方法，其中第一、第二和第三样品来自所述个体。

15.根据权利要求10的方法，其中第一样品来自第二个体。

16.根据权利要求10的方法，其中所述健康漂浮组织是乳腺组织，并且肿瘤是乳腺癌肿瘤。

17.权利要求10的方法，其中候选疗法是新辅助内分泌治疗。

18.权利要求10的方法，其中肿瘤组织群状态的变化是增殖的减少。

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