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CN116114795A - 饲料添加剂在制备动物饲料中的应用 - Google Patents

饲料添加剂在制备动物饲料中的应用 Download PDF

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CN116114795A
CN116114795A CN202211321116.6A CN202211321116A CN116114795A CN 116114795 A CN116114795 A CN 116114795A CN 202211321116 A CN202211321116 A CN 202211321116A CN 116114795 A CN116114795 A CN 116114795A
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animal
peptide
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任津莹
李守勇
陈鹏
梁廷银
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Beijing Enhalor International Tech Co ltd
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Beijing Enhalor International Tech Co ltd
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Abstract

本申请提供一种饲料添加剂的应用。其中，饲料添加剂为含量≥60mg/g的Surfactin。该饲料添加剂具有稳定性强，耐酶解，可以更好的在动物肠道中发挥作用。且能够极大程度降低料重比，增强动物机体的抗过敏，抗炎和抗菌能力，增强动物机体免疫，从而促进动物机体的生长，降低养殖成本。通过前述的饲料添加剂可以保护抗菌肽，在胰蛋白酶存在的条件下，提高抗菌肽的保留率。

Description

饲料添加剂在制备动物饲料中的应用
技术领域
本申请涉及微生物技术领域，尤其涉及一种饲料添加剂在制备动物饲料中的应用。
背景技术
相关技术中，抗生素广泛应用以及高剂量的使用，其在畜禽体内大量残留，不仅威胁到动物食品安全和影响生态环境，更使许多细菌产生耐药性。近年来，也有研究发现抗生素对有益菌有抑制作用，造成动物体内的菌群紊乱，降低动物机体对各种营养物质的吸收利用率，从而造成其腹泻甚至死亡。目前，饲料生产企业已停止生产含有促生长类药物饲料添加剂(中药类除外)的商品饲料。
因此，亟需一种新型的能够实现绿色健康生态养殖的饲料添加剂。
发明内容
有鉴于此，本申请的目的在于提出一种枯草芽孢杆菌、饲料添加剂及其制备方法和应用。
基于上述目的，本申请实施例提供了饲料添加剂在制备动物饲料中的应用，所述饲料添加剂为含量≥60mg/g的Surfactin。
在其中一些实施例中，所述动物饲料具有不耐酶解的抗菌肽。
在其中一些实施例中，所述不耐酶解的抗菌肽为酵母肽或菌丝霉素。
在其中一些实施例中，所述动物饲料为淡水鱼饲料。
在其中一些实施例中，所述淡水鱼饲料为鲤鱼饲料。
在其中一些实施例中，所述饲料添加剂的添加量为每吨鲤鱼饲料中添加200～300克。
从上面所述可以看出，本申请提供的Surfactin含量≥60mg/g的饲料添加剂具有稳定性强，耐酶解，可以更好的在动物肠道中发挥作用。且能够极大程度降低料重比，增强动物机体的抗过敏，抗炎和抗菌能力，增强动物机体免疫，从而促进动物机体的生长，降低养殖成本。通过前述的饲料添加剂可以保护抗菌肽，在胰蛋白酶存在的条件下，提高抗菌肽的保留率。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本申请进一步详细说明。
需要说明的是，除非另外定义，本申请实施例使用的技术术语或者科学术语应当为本申请所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本申请实施例中使用的“包括”或者“包含”等类似的词语意指出现该词前面的元件或者物件涵盖出现在该词后面列举的元件或者物件及其等同，而不排除其他元件或者物件。“连接”或者“相连”等类似的词语并非限定于物理的或者机械的连接，而是可以包括电性的连接，不管是直接的还是间接的。
针对目前抗生物在畜禽体内的残留，造成的危害等，正在逐渐推行“饲料端全面禁抗，养殖端减抗限抗”等。在饲料生产企业停止生产含有促生长类药物饲料添加剂(中药类除外)的商品饲料。在抗生素退出饲料后，对于保护动物的健康，促进动物的生长亟待解决。为保障饲料行业的健康发展，需要做好安全防范，为保护动物健康研发合适的饲料原料，尤其是能够实现绿色健康生态养殖的代替抗生素的饲料添加剂。
Surfactin主要由枯草芽胞杆菌通过非核糖体途径代谢产生，其分子结构包括疏水端碳链长度为12-16的β-羟基脂肪酸链和亲水端的环状阴离子七肽。
本申请实施例提供了一种饲料添加剂在制备动物饲料中的应用。所述饲料添加剂为含量≥60mg/g的Surfactin。
在一些实施例中，所述动物饲料具有不耐酶解的抗菌肽，例如酵母肽或者菌丝霉素，通过前述的饲料添加剂可以剂可以保护抗菌肽，在胰蛋白酶存在的条件下，提高抗菌肽的保留率。延长抗菌肽在动物肠道中作用时间，能够充分发挥益生作用。
在一些实施例中，所述动物饲料为淡水鱼饲料。所述富含Surfactin的饲料添加剂用于淡水鱼饲料中，可以提高淡水鱼生长性能、降低死亡率、增强机体免疫和降低淡水鱼养殖成本等。
在一些实施例中，所述淡水鱼饲料为鲤鱼饲料。在一些实施例中，在该种饲料中，所述饲料添加剂的添加量为每吨鲤鱼饲料中添加200～300克。这样可以更好地提高淡水鱼生长性能、降低死亡率、增强机体免疫和降低淡水鱼养殖成本等。
下面结合具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1饲料添加剂的制备
(1)制备培养基
发酵培养基：红糖1050g，酵母膏15g，尿素75g，KH2PO4 4.995g，Na2HPO4·12H2O15g，MgSO4·7H2O 2.25g，CaCl2 7mg/L，MnSO4·H2O 6mg/L，FeSO4·7H2O 6mg/L，5％大豆油，30L发酵罐装液量15L，调节pH至7.0，通入蒸汽115℃灭菌20min，冷却至37℃备用。
补糖培养基：红糖525g，尿素37.5g，先溶于1L去离子水中，定容于1.5L，115℃灭菌20min备用。
(2)接种发酵
枯草芽孢杆菌活化，挑取平板中较大的枯草芽孢单菌落接种于LB制成的种子培养基中，37℃，200rpm培养16-18h获得种子液。向步骤(1)装有发酵培养基的30L发酵罐中接种种子液，接种量为种子液占培养基质量的5％，搅拌均匀，通入无菌空气，转速300rpm，控制发酵温度37℃，发酵时间48h。
(3)提纯与浓缩
发酵结束后，对发酵液进行浓缩处理和提纯处理，得到纯的Surfactin。
(4)测试经过步骤(3)所得产物的Surfactin含量和孢子数
孢子数测定方法：称取1g上述样品，加入无菌水定容至100mL，80℃水浴处理10min，对菌液进行10倍梯度稀释并涂布于LB平板上培养，再采用平板菌落计数法计数，所得计数结果即芽孢数。
Surfactin测定方法：采用HPLC定量测定法测定。
HPLC定量测定：
(1)色谱条件：色谱柱岛津C18 ODS-3(4.6mm×250mm，5μm)、流速1.0mL/min、检测波长205nm、柱温常温；流动相：含0.1％TFA的色谱乙腈-0.1％TFA；仪器：岛津L-033型色谱仪；梯度设定：0～7min，A(10％～90％)，B(90％～10％)；7～24min，A(90％)，B(10％)；24～29min，A(90％～10％)，B(10％～90％)；29～36min，A(10％)，B(90％)。
(2)测定方法：在上述色谱条件下检测Surfactin标准品梯度溶液浓度，制作Surfactin标准品浓度与峰面积关系的标准曲线。得到Surfactin标准品峰面积与浓度(mg/mL)的关系函数，Y＝115.96X+5.2147，R2＝0.99774(Y为峰面积，X为浓度)。将步骤(3)所得产物制备的样品，称取0.5g，加入25mL甲醇，密闭超声10min，体系混匀后，过膜处理的清液。将清液按照上述HPLC定量测定方法测定Surfactin含量，并计算每克样品(步骤(3)所得产物)中Surfactin含量，经3次测定取平均值。
最终测定实验结果为：Surfactin含量为60mg/g，芽孢数为7.9×109cfu/g。
测试例1饲料添加剂的抗菌性体外试验
测试原理：采用实施例1所得的Surfactin(即饲料添加剂)进行抗菌性体外试验。
将Surfactin分别以产气荚膜梭菌ATCC13124(购自广东环凯微生物科技有限公司)、嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌(英惠尔微生态实验室从生病草鱼肠道分离获得)为指示菌进行抑菌试验。采用新鲜RCM培养基、37℃厌氧培养产气荚膜梭菌ATCC13124；用LB培养基，37℃摇瓶培养嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌。取新鲜菌液涂布在相应琼脂培养基平板上，利用打孔器打5mm孔，加入100μL Surfactin，37℃恒温箱中培养24h，观察结果，测定抑菌圈大小(表1)。
试验结果：请参见表1
表1Surfactin对几种致病菌的抑制效果
Figure SMS_1
结果分析：根据表1的数据可知，Surfactin的含量≥60mg/g的饲料添加剂与产气荚膜梭菌和嗜水气单胞菌直接接触后，具有良好的抑制效果。
测试例2饲料添加剂的抗过敏性能
测试原理：透明质酸酶是I型过敏反应的参与者，透明质酸酶与炎症、过敏有强相关性，各种肥大细胞释放组胺的药物能调节透明质酸酶活性，一些抗敏药物有强抑制透明质酸酶活性，因此将抑制透明质酸酶活性作为饲料添加剂的抗过敏作用的指标。
测试设计：处理组和对照组分别重复5次，处理组中采用实施例1制备所得的饲料添加剂，对照组采用等量的Surfactin-钠标品(购自麦克林)。采用测定吸光值的方法测试透明质酸酶的含量。
测试方法：如下述表2。其中，处理组和对照组均采用如下表2所示的方法进行测试。处理组与对照组的区别在于，在处理组中，样品为采用实施例1制备所得的饲料添加剂。而对照组中，样品为Surfactin-钠标品。
表2饲料添加剂的抗过敏性能测试方法
Figure SMS_2
Figure SMS_3
试验结果：请参见表3。
表3透明质酸酶体外抑制试验结果
Figure SMS_4
注：透明质酸酶抑制率(％)＝[(C-D)-(A-B)]/(C-D)×100％。
结果分析：如表3，可知，表3数据显示，试验组富含Surfactin的饲料添加剂对透明质酸酶的抑制率≥70％，表现为强抗过敏作用。抑制透明质酸酶活性的物质也具有抗过敏、抗炎作用，该数据结果表明实施例1所制备的富含Surfactin的饲料添加剂在治疗动物炎症、过敏方面有很大的应用潜力。
测试例3饲料添加剂的抗酶解稳定性
测试方法：取适量实施例1中制备得到的Surfactin，调pH＝8.0，液相检测其中Surfactin含量为20g/L。加入0.1％胰蛋白酶，37℃条件下摇床处理，分于4、6、8h取样，检测Surfactin含量变化。
测试结果：如表4。
表4液相检测Surfactin含量变化
Figure SMS_5
结果分析：由表4数据可知，本发明中的枯草芽孢杆菌的发酵液得到的Surfactin可以抵抗胰蛋白酶的水解，有利于其在动物肠道内更好的发挥作用，提高饲料利用率。
测试例4饲料添加剂对于抗菌肽的抗酶解性能的提高
测试方法：将实施例1所得Surfactin(即饲料添加剂)与酵母肽(英惠尔酵母肽产品惠泰康)进行复配，对混合物进行胰蛋白酶处理。取不同处理时长的样品，检测复配体系中酵母肽含量，同时将单独的酵母肽作为对照组，检测酵母肽的含量和保留率。
测试结果：如表5所示。
表5液相检测抗菌肽(同前)含量变化
Figure SMS_6
结果分析：由表5可知，在胰蛋白酶处理条件下，与对照组相比，富含Surfactin的饲料添加剂能够显著提高酶处理条件下酵母肽的含量和保留率，对其起到保护作用。由此，对于不耐酶解的抗菌肽，其与Surfactin连用，可以增加效果，进而在动物肠道中更好的发挥作用，也有利于新型配伍产品的开发。
测试例5饲料添加剂对于菌丝霉素的抗酶解性能的提高
测试原理：金黄色葡萄球菌为菌丝霉素的指示菌，而非Surfactin的指示菌。通过检测金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径可以表征菌丝霉素的含量。
测试方法：将实施例1所制Surfactin饲料添加剂同菌丝霉素进行复配，对混合物进行胰蛋白酶处理，作试验组；菌丝霉素加胰蛋白酶处理作对照组。取不同处理时长的样品，以金黄色葡萄球菌为指示菌，通过打孔法测定抑菌活性，记录抑菌圈直径。
测试结果：如表6所示。
表6不同样品对金黄色葡萄球菌的抑菌直径(mm)
Figure SMS_7
结果分析：由表6数据可知，在胰蛋白酶处理条件下，与对照组相比，Surfactin能够显著提高酶处理条件下菌丝霉素对金黄色葡萄球菌的抑菌效果。由此，对于不耐酶解的菌丝霉素，其与Surfactin连用，可以增加效果，进而在动物肠道中更好的发挥作用。
测试例6饲料添加剂加入饲料后对于淡水鱼生长的影响
测试材料：以进口鱼粉、国产鱼粉、豆粕、菜粕、棉粕、鸡肉粉为蛋白源，面粉为碳源，豆油为脂肪源，并添加适当的矿物质和纤维素等作为鲤鱼复合饲料。具体成分请参见表7。挑选体质健壮，外观正常，尾均体重57±0.25g的鲤鱼为试验用鱼。
表7鲤鱼试验饲料配方和试验设计
Figure SMS_8
Figure SMS_9
注：上述饲料配方表对照组、试验组分别按90、70公斤饲料总量配制，单位：g。
测试方法：设置三个处理组，其中分别按照每公斤复合饲料中添加0.20g、0.25g和0.30g实施例1所制富含Surfactin的饲料添加剂。以不加该饲料样品作为空白对照组。利用循环水养殖系统，分为4个组别，其中，每个处理组和对照组分别设置3个重复，每个重复40尾鱼，共12个养殖桶。温度控制在26-28℃。各组别的养殖桶每天投喂4次，投喂时间分别为8:00、11:00、14:00和17:00，每次饱食投喂，饲喂6周。并设置不加该饲料样品的攻毒预试验组，预试验组设置90尾鱼，共1个暂养桶。
距离养殖结束前两周，从暂养桶中选取两组外观、体重均匀的鲤鱼，每组40尾，进行攻毒预试验，确定攻毒菌株及其半致死剂量。以腹腔注射的方式使鲤鱼分别感染不同浓度嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌。之后不再投喂，计算攻毒后累计7天的死亡率，结果如表8所示，根据该死亡率确定，攻毒剂量为每尾注射0.5mL菌液(4.7×108cfu/mL)。
鲤鱼饲喂期满，在结束养殖试验前24h停止投喂。对各组鲤鱼进行称重后，每个处理组和对照组分别选取外观、体重均匀鲤鱼，各设3个重复，以嗜水气单胞菌进行攻毒试验。
试验结果：如表8和表9所示。
表8攻毒预试验结果
Figure SMS_10
Figure SMS_11
表9鲤鱼养殖试验数据统计
Figure SMS_12
结果分析：由表9可知，与对照组相比，各Surfactin添加组末均重、增重率和特定生长率显著提高；而且，Srf组1、Srf组2、Srf组3的死亡率较对照组分别降低了33.3％、37.0％、29.6％。可见，本发明制备所得的Surfactin饲料添加剂添加到基础日粮中，能够明显提高鲤鱼生长性能，提高机体免疫力，降低死亡率，减少鲤鱼养殖成本。
本申请施例提供的Surfactin饲料添加剂稳定性强，耐酶解，可以更好的在动物肠道中发挥作用；还可以保护菌丝霉素抗菌肽和酵母肽，在胰蛋白酶存在的条件下，提高这两种抗菌肽的保留率。对于抗菌肽在动物肠道中延长作用时间，充分发挥益生作用具有重要意义。且该饲料添加剂的制备通过发酵产生代谢产物Surfactin的生产周期短，且不受季节和气候等外在环境的影响，生产成本大幅降低，可大规模工业化生产。且其本申请实施例Surfactin饲料添加剂用于鲤鱼饲料中，可以提高鲤鱼生长性能、降低死亡率、增强机体免疫、降低鲤鱼养殖成本。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本公开的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本公开实施例的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
尽管已经结合了本公开的具体实施例对本公开进行了描述，但是根据前面的描述，这些实施例的很多替换、修改和变型对本领域普通技术人员来说将是显而易见的。
本公开实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本公开实施例的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种饲料添加剂在制备动物饲料中的应用，其特征在于，所述饲料添加剂为含量≥60mg/g的Surfactin。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述动物饲料具有不耐酶解的抗菌肽。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述不耐酶解的抗菌肽为酵母肽。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述不耐酶解的抗菌肽为菌丝霉素。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述动物饲料为淡水鱼饲料。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述淡水鱼饲料为鲤鱼饲料。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述饲料添加剂的添加量为每吨鲤鱼饲料中添加200～300克。
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