Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

CN116083262B - 有水产病原菌拮抗特性的植物乳杆菌菌株及其制剂的制备及应用 - Google Patents

有水产病原菌拮抗特性的植物乳杆菌菌株及其制剂的制备及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116083262B
CN116083262B CN202210793310.8A CN202210793310A CN116083262B CN 116083262 B CN116083262 B CN 116083262B CN 202210793310 A CN202210793310 A CN 202210793310A CN 116083262 B CN116083262 B CN 116083262B
Authority
CN
China
Prior art keywords
lactobacillus plantarum
culture
fermentation
bacillus
feed
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210793310.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN116083262A (zh
Inventor
高亮
缪凌鸿
于丹
林艳
孙梅
刘军锋
张海涛
陆丽婷
施大林
匡群
钱进
肖国娟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qinhuangdao Beidaihe New Area Marine And Fishery Bureau
Wuxi Zhongshui Fishery Medicine Co ltd
JIANGSU SUWEI MICROBIOLOGY RESEARCH CO LTD
Freshwater Fisheries Research Center of Chinese Academy of Fishery Sciences
Original Assignee
Qinhuangdao Beidaihe New Area Marine And Fishery Bureau
Wuxi Zhongshui Fishery Medicine Co ltd
JIANGSU SUWEI MICROBIOLOGY RESEARCH CO LTD
Freshwater Fisheries Research Center of Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qinhuangdao Beidaihe New Area Marine And Fishery Bureau, Wuxi Zhongshui Fishery Medicine Co ltd, JIANGSU SUWEI MICROBIOLOGY RESEARCH CO LTD, Freshwater Fisheries Research Center of Chinese Academy of Fishery Sciences filed Critical Qinhuangdao Beidaihe New Area Marine And Fishery Bureau
Priority to CN202210793310.8A priority Critical patent/CN116083262B/zh
Publication of CN116083262A publication Critical patent/CN116083262A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN116083262B publication Critical patent/CN116083262B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A23K10/16—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions
    • A23K10/18—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions of live microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
    • A23K50/80—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for aquatic animals, e.g. fish, crustaceans or molluscs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus
    • C12R2001/25—Lactobacillus plantarum

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

有水产病原菌拮抗特性的植物乳杆菌菌株及其制剂的制备及应用，属于微生物技术领域。本发明植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）FF34发酵用碳、氮源广泛，具有淀粉酶活性，能利用淀粉质碳源。亚硝酸盐降解快，对多种水产常见病原菌有拮抗作用，经制备获得FF34单菌菌剂，或与多种芽孢杆菌混合发酵制备FF34复合菌剂。FF34单菌菌剂或复合菌剂用于发酵鱼虾蟹饲料及棉粕等饲料原料，显著改善饲料营养成分，所得发酵饲料富含益生菌、酸溶蛋白及活性小肽，单宁、游离棉酚、植酸等抗营养因子含量降低；在饲料中添加FF34菌剂，促进水产动物肠道组织生长，改善肝脏功能，抗氧化活性提高，提高养殖动物生长性能，降低饲料系数。FF34复合菌剂固定化后投放养殖水体中，可持续改善水质。

Description

有水产病原菌拮抗特性的植物乳杆菌菌株及其制剂的制备及 应用
技术领域
本发明涉及一种具有水产病原菌拮抗特性的植物乳杆菌菌株及其单菌制剂、其与芽孢杆菌的混合发酵培养方法及其复合菌剂的制备方法及应用，属于微生物技术领域。
背景技术
植物乳杆菌是一类革兰氏阳性的乳杆菌，在自然界中广泛存在，是人体胃肠道益生菌群。研究表明，植物乳杆菌对人体具有多种有益功效，如免疫功能调节、慢性代谢性疾病调节、拮抗致病菌感染、调节肠道功能、调节精神和神经功能等。由于植物乳杆菌具有良好的生理特性及益生功能，植物乳杆菌在食品工业生产、医疗保健等领域被广泛应用。近年来，随着饲料禁抗政策的落实推进，鱼粉豆粕减量替代及代粮饲料开发的迫切需求，乳酸菌在动物养殖中的应用研究日益增多，植物乳杆菌作为国家微生物饲料添加剂目录品种，已从最初牛羊等反刍动物青贮饲料发酵应用，扩展至水产养殖领域的有益应用研究。目前研究报道植物乳杆菌在水产养殖中的有益作用主要表现为：(1)通过泼洒植物乳杆菌调节水质；(2)通过拌饵投喂或饲料发酵投喂，改善水产养殖动物胃肠道环境，抑制肠道有害菌的生长，促进饲料营养吸收，增强其对病原菌的抵抗力，促进水产养殖动物的生长。
目前乳酸菌在水产养殖生产实践中还没有得到大规模的应用，植物乳杆菌作为一种有益的乳酸菌在水产养殖中的应用也十分有限，其主要原因是(1)使用成本高。乳酸菌，包括植物乳杆菌在内，为严格厌氧菌或兼性厌氧菌，无芽孢，环境抗逆性差，易失活，菌种增殖生长时对营养要求高，氮源需求量大，高密度菌体培养所用碳源以糖类为主，无法利用小麦次粉等廉价的淀粉质农副产品。此外，大规模高密度纯种培养乳杆菌需要厌氧发酵设备和厌氧环境条件，培养成本高。与枯草芽孢杆菌等好氧菌剂相比，芽孢杆菌的好氧发酵采用通用好氧发酵罐，发酵系统成熟，发酵罐体积可达到50吨以上，而纯种乳杆菌发酵需要专一的厌氧系统，厌氧发酵罐规模小，无法达到好氧发酵的体积规模，因而乳杆菌纯种活菌制剂缺乏规模效应，制造费用高昂，使用成本高。(2)我国水产养殖种类繁多，养殖品种和地域环境复杂，能适用的植物乳杆菌优良菌株十分缺乏，有水产病原菌拮抗特性的菌株不仅来源少而且缺乏低成本规模化的培养方法，不能满足作为抗生素替代用菌剂的需求。(3)缺乏多功能的新型植物乳杆菌。目前水产养殖以高密度集约化的静水养殖模式为主，养殖密度高，投喂高蛋白饲料。由于养殖动物对饲料利用率低，如饲料蛋白的利用率仅在30％左右，饲料中大部分氮磷随着残饵和排泄物排入养殖水体，使养殖水体生态环境恶化，池塘自净与调节能力丧失，水体中氨氮、亚硝酸盐浓度超标，危害养殖动物健康，使其自身免疫能力下降，造成细菌性病害频发，给养殖生产带来极大危害。因此急需开发多功能的新型植物乳杆菌菌种，发挥降低亚硝酸盐等不良水质因子的净化调节功能，拮抗病原菌，提高饲料利用率，促进养殖动物生长。(4)目前鱼粉豆粕减量替代及代粮饲料开发的需求十分迫切，在借助益生菌的生长代谢来改善并提高棉粕、菜籽粕、桑树叶等植物蛋白资源的饲用营养价值方面，芽孢杆菌和乳酸菌均是优良的候选菌种。但目前应用于发酵饲料的菌种较为单一，且菌种之间的相容和协同作用较弱，对于肠道功能修复、水产动物炎症调控作用较差。(5)目前虽巳有植物乳杆菌发酵饲料或在饲料中添加植物乳杆菌能够改善水产养殖动物生长性能的研究报道，但植物乳杆菌对鱼类饲料营养利用和代谢影响等机理方面的研究缺乏，从而影响其推广应用。(6)植物乳杆菌为兼性厌氧菌，以泼洒方式施用时，一般植物乳杆菌对氧的耐受能力差，在含氧的养殖水体环境中极易失活，有效时间短，游离植物乳杆菌在池塘换水时易随水流失，需要重新添加，增加养殖成本。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有水产病原菌拮抗特性的植物乳杆菌菌株(Lactobacillus plantarum)FF34及其单菌培养方法、FF34与芽孢杆菌的复合菌混合培养方法、单菌菌剂及复合菌剂的制备方法及应用。
本发明植物乳杆菌FF34，兼性厌氧，对氧气有耐受能力，可发酵利用碳、氮源广泛，具有淀粉酶活性，能直接利用淀粉质碳源。植物乳杆菌FF34在缺氧条件下快速降解亚硝酸盐，对鳗利斯顿氏菌、爱德华氏菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌及大肠杆菌等水产常见致病菌具有拮抗作用，其中对溶藻弧菌、爱德华氏菌、大肠杆菌和嗜水气单胞菌抑制效果显著。
通过菌种活化、固定化发酵培养和制剂制备获得FF34单菌水剂或粉剂；植物乳杆菌FF34与多种有益芽孢杆菌生物相容性好，如具有水产病原菌拮抗特性的枯草芽孢杆菌AB90008-15或解淀粉芽孢杆菌JSSW-LA或凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1或酪酸梭状芽孢杆菌JSIM-MCB20040312或漳州芽孢杆菌JSSW-BP44，能够分别与这些芽孢杆菌之一进行协同发酵共培养，从而获得FF34复合菌剂。
植物乳杆菌FF34单菌菌剂或复合菌剂用于发酵棉粕、豆粕等饲料原料、桑树叶等新型树叶饲料原料及鱼虾蟹饲料，能够显著改善饲料原料的营养成分和品质，所得发酵饲料富含益生菌、酸溶蛋白及活性小肽，单宁、游离棉酚、植酸等抗营养因子含量降低；在基础日粮或高淀粉饲料中添加植物乳杆菌FF34单菌菌剂或复合菌剂，能够促进水产养殖动物的肠道组织生长，改善肝脏功能，抗氧化活性提高，显著改善水产养殖动物的生长性能，降低饲料系数。植物乳杆菌FF34复合菌剂通过轻石、活性碳或陶粒吸附固定化后，投放在养殖水体中，可降解水体的氨氮、亚硝酸盐、总磷、总氮含量，抑制水产病原菌的生长，持续改善养殖池塘水质。
本发明的技术方案，一种植物乳杆菌FF34，分类命名为植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)，保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号CCTCC NO：M 20211221。
本发明的植物乳杆菌菌株FF34，革兰氏阳性菌，镜检呈杆状，不产生芽孢，该菌株属于非严格厌氧菌，生长温度范围广，15～45℃均能生长。在MRS平板上厌氧培养48h，表面生长的菌落直径为1.0～3.0mm，圆形、表面光滑、湿润、不透明、乳白色，无色素产生。
植物乳杆菌FF34属于非严格厌氧菌，兼性厌氧，氧耐受，同型发酵糖类物质生成益生物质DL-乳酸，能够适应养殖池塘水体及底泥环境，可发酵利用碳、氮源广泛，具有淀粉酶活性，能直接利用淀粉质碳源。植物乳杆菌FF34在缺氧条件下快速降解亚硝酸盐，对鳗利斯顿氏菌、爱德华氏菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌及大肠杆菌等水产常见致病菌具有拮抗作用，其中对溶藻弧菌、爱德华氏菌、大肠杆菌和嗜水气单胞菌抑制效果显著。
植物乳杆菌FF34通过保藏菌种活化、发酵罐高密度固定化发酵培养及制剂制备获得其单菌水剂或粉剂；植物乳杆菌FF34还可以分别与具有水产病原菌拮抗特性的枯草芽孢杆菌AB90008-15或解淀粉芽孢杆菌JSSW-LA或凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1或漳州芽孢杆菌JSSW-BP44或酪酸梭状芽孢杆菌JSIM-MCB20040312之一进行混合发酵共培养，获得功能复合菌剂。植物乳杆菌FF34单菌菌剂或复合菌剂用于发酵棉粕、豆粕等饲料原料、桑树叶等新型树叶饲料原料及鱼虾蟹饲料，能够显著改善饲料原料的营养成分，所得发酵饲料富含益生菌、酸溶蛋白及活性小肽，单宁、游离棉酚、植酸等抗营养因子含量降低；在基础日粮或高淀粉饲料中添加植物乳杆菌FF34单菌菌剂或复合菌剂，能够促进水产养殖动物肠道组织生长，改善肝脏功能，抗氧化活性提高，显著改善水产养殖动物的生长性能，降低饲料系数。植物乳杆菌FF34复合菌剂通过轻石、活性碳或陶粒吸附固定化后，投放在养殖水体中可降解水体的氨氮、亚硝酸盐、总磷、总氮含量，抑制水产病原菌的生长，持续改善养殖池塘水质。
综上所述，植物乳杆菌FF34是一株能够改善饲料营养价值、提高水产养殖动物的生长性能，改善养殖池塘水质的多功能微生物菌株。
所述植物乳杆菌FF34制备具有水产病原菌拮抗特性的单菌菌剂的方法，步骤如下：
(1)菌种活化：
无菌开启植物乳杆菌FF34的冻干保藏菌种，接种于装有MRS肉汤的试管中，于30～35℃静置培养24～48h，然后转接于MRS肉汤三角瓶中，30～35℃培养活化20～48h；反复活化2～3次，镜检，计数，当菌体浓度达109CFU/mL时作为种子液；
MRS肉汤培养基组成以g/L计：酪蛋白酶消化物10，牛肉膏粉10，酵母膏粉4，柠檬酸三铵2，乙酸钠5，硫酸镁0.2，硫酸锰0.05，磷酸氢二钾2，葡萄糖20，吐温-80 1.08，以蒸馏水定容配制，pH 5.7±0.2；
(2)固定化发酵培养：
三角瓶种子培养液制备：将步骤(1)所得种子液以体积比1％～5％接种量接入装有固定化发酵培养基的3L三角瓶，装液量为体积比90％，于30～35℃静置培养24～40h，当菌体浓度达109CFU/mL时，作为三角瓶种子培养液；接入普通好氧发酵罐中进行一级、二级固定化发酵逐级放大扩培，即：3L三角瓶，再500L发酵罐，再10T发酵罐，发酵罐间移种以无菌空气压送方式完成接种；
一级固定化培养：将固定化培养种子液以体积比1％～5％接种量接入500L发酵罐中，发酵罐装液量为体积比80％～90％，无菌空气保持罐压至0.01～0.05Mpa，间歇搅拌，转速80～100r/min，30～35℃培养20～40h，pH为4.5～5.5时，结束培养，得到一级固定化培养液，其中植物乳杆菌FF34菌体被吸附固定在海藻酸钙+二氧化硅形成的凝胶小颗粒中，活菌体浓度≥5×109CFU/mL；
二级固定化培养：将一级固定化培养液用无菌空气压送，以体积比1％～5％接种量接入10T发酵罐中，发酵罐装液量为体积比70％～90％，无菌空气保持罐压至0.01～0.05Mpa，间歇搅拌，转速80～100r/min，30～38℃培养20～40h，当发酵液pH降至4.0～5.5，培养结束，得到二级固定化培养液，其中植物乳杆菌FF34菌体被吸附固定在海藻酸钙+二氧化硅形成的凝胶小颗粒中，菌体浓度≥5×109CFU/mL；
固定化发酵培养基组成以g/L计：碳源10～40，氮源3～15，磷酸氢二钾0.2～5，硫酸镁0～0.2，硫酸锰0～0.05，碳酸钙5～40，海藻酸钠3～10，二氧化硅1～10，以自来水定容配制，pH 6.0～6.5，121℃灭菌30min；其中碳源包括小麦次粉、玉米淀粉、糊精、糖蜜、葡萄糖、果葡糖浆等碳源中的一种或几种组合。氮源包括鱼粉蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、大豆分离蛋白、酵母膏、酵母粉、玉米浆、棉籽粕、菜籽粕、豆粕、花生粕及血粉等氮源中的一种或几种组合；
(3)具有水产病原菌拮抗特性的植物乳杆菌FF34单菌菌剂的制备：
(A)植物乳杆菌FF34单菌水剂的制备：将步骤(2)所得二级固定化培养液进行灌装，获得植物乳杆菌FF34单菌水剂，菌液水剂中FF34活菌浓度≥5.0×109CFU/mL；
(B)植物乳杆菌FF34单菌粉剂的制备：将步骤(2)所得二级固定化培养液经离心收集湿菌体，按质量比为：湿菌体:碳酸钙:糊精:二氧化硅＝1:0.1～2:0.5～2:0.01进行混合，经喷雾干燥或真空干燥得到植物乳杆菌FF34菌粉，菌粉中FF34活菌浓度不低于1×1010CFU/g；
所述植物乳杆菌FF34与芽孢杆菌混合发酵共培养制备复合菌剂的方法，步骤如下：
(1)与菌株FF34混合发酵培养的芽孢杆菌为：好氧芽孢杆菌、兼性好氧芽孢杆菌及厌氧芽孢杆菌，即具有水产病原菌拮抗特性的：
枯草芽孢杆菌AB90008-15，其拮抗特性参见专利号ZL 201911117444.2；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号:CGMCC NO.18684，保藏日期2019年10月15日。
或解淀粉芽孢杆菌JSSW-LA，其拮抗特性参见专利号ZL 201510733305.8；保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:M 2015602，保藏日期为2015年10月12日。
或凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1，其拮抗特性参见专利ZL 201510057403.4，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC NO.10182，保藏日期2014年12月15日。
或酪酸梭状芽孢杆菌JSIM-MCB20040312，参见专利ZL201110083328.0，其抑菌性能参见论文“陈秋红等.益生菌酪酸菌CB-7的生物学特性研究[J].安徽农业科学，2011，39(10)：5922～5925”，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC NO.1647，保藏日期2006年3月10日。
或漳州芽孢杆菌JSSW-BP44参见专利申请号202010066397.X，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号:CCTCC NO：2019989，保藏日期为2019年12月2日。
(2)FF34与上述芽孢杆菌混合发酵分两步进行：第一步发酵是将上述芽孢杆菌经斜面或三角瓶活化培养后，接种于混合发酵培养基中，接种量为体积比1％～10％，培养温度为30～37℃，培养24～48h，镜检菌体中芽孢形成，即第一步发酵结束；第二步发酵是先将第一步发酵所得发酵液用盐酸调整pH至5.0～5.4，然后接入活化后的植物乳杆菌FF34，接种量为体积比1％～10％，培养温度为30～35℃，间歇搅拌，流加浓度为20％(w/v)葡萄糖或30％碳酸钙或氨水，控制发酵液pH4.5～5.0，培养24h左右，获得FF34与芽孢杆菌混合发酵液，镜检可见乳杆菌与芽孢共存，混合发酵液中FF34活菌浓度的≥1.0×109CFU/mL，芽孢杆菌活菌浓度≥5.0×108CFU/mL，芽孢率≥90％；
混合发酵培养基组成以g/L计：小麦次粉0～50，蛋白胨0.1～5，酵母膏0～5，乙酸钠0～3，玉米淀粉0～10，硫酸铵0～2，氯化钠0～5，碳酸钙0～5，磷酸二氢钾0～0.5，硫酸镁0～0.5，硫酸锰0～0.3，海藻酸钠0～5，自来水定容，pH 7.0，121℃灭菌30min；
(3)植物乳杆菌FF34复合菌剂的制备：
(A)将上述(2)步骤获得的植物乳杆菌FF34与芽孢杆菌混合发酵液直接进行灌装，获得植物乳杆菌FF34复合菌水剂，复合菌水剂中FF34活菌浓度≥1.0×109CFU/mL，芽孢杆菌活菌浓度≥5.0×108CFU/mL，芽孢率≥90％；
(B)将上述步骤(2)所得的植物乳杆菌FF34与芽孢杆菌混合发酵液经离心收集湿菌体，按质量比为：湿菌体:碳酸钙:二氧化硅＝1:0.1～3:0.01进行混合，经喷雾干燥或真空干燥得到植物乳杆菌FF34复合菌剂粉剂，复合菌剂粉剂中FF34活菌浓度≥5×109CFU/g，芽孢杆菌活菌浓度≥5.0×109CFU/g。
所述上述步骤制备的植物乳杆菌FF34单菌菌剂及其复合菌剂的应用：
(1)植物乳杆菌FF34单菌菌剂或复合菌剂用于发酵鱼虾蟹饲料或棉粕、豆粕、桑树叶等饲料原料，植物乳杆菌FF34单菌菌剂或复合菌剂按质量百分比0.1％～5％与饲料或饲料原料混合，加水调节物料含水量25％～40％，28～35℃密闭发酵3～5天。上述饲料或饲料原料经植物乳杆菌FF34单菌或复合菌剂发酵后，无霉变，显著改善鱼虾蟹饲料或饲料原料的营养成分，所得发酵饲料富含益生菌、酸溶蛋白及活性小肽，单宁、游离棉酚、植酸等抗营养因子含量降低。
(2)在基础日粮或高淀粉饲料中按质量百分比0.05％～1％添加植物乳杆菌FF34单菌菌剂或复合菌剂，能够促进水产养殖动物的肠道组织生长，改善肝脏功能，提高抗氧化活性，显著改善水产养殖动物的生长性能，降低饲料系数。
(3)植物乳杆菌FF34复合菌剂水剂与质量体积比2％～4％海藻酸钠混匀后，添加轻石、活性碳或陶粒浸润吸附1～4h后取出,再浸泡于2％～3％氯化钙溶液中，4～8℃固化交联1～10h，即制得植物乳杆菌FF34复合菌固定化菌球(块)，菌球(块)中菌体浓度不低于5×108CFU/g。植物乳杆菌FF34复合菌固定化菌球(块)投放在养殖水体中，连续使用20天以上，，可以持续降解水体中的氨氮、亚硝酸盐、总磷、总氮的含量，抑制气单胞菌等水产病原菌的生长，持续改善养殖池塘水质。
植物乳杆菌FF34抑菌性的测定：将致病菌与植物乳杆菌FF34菌液共同接入LB肉汤中，使培养基中FF34起始菌浓度为105～106CFU/mL，致病菌起始菌浓度为105～107CFU/mL，30℃静置培养24h，于0h、24h取样计数，观察FF34对致病菌的拮抗作用。结果显示，对鳗利斯顿氏菌、爱德华氏菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌及大肠杆菌等水产常见致病菌具有拮抗作用，其中对溶藻弧菌、爱德华氏菌、大肠杆菌和嗜水气单胞菌抑制效果显著。
植物乳杆菌FF34降解亚硝酸盐能力的测定：MRS肉汤培养基分装50mL/试管，与2mol/L亚硝酸钠溶液分别在121℃灭菌15min后，在每支装有MRS肉汤培养基的试管中分别添加2mol/L亚硝酸钠溶液0.1mL，，然后接种活化后的植物乳杆菌FF34菌悬液5mL，对照组接入5mL无菌蒸馏水，每组3个平行，35℃静置培养20h，其中0h、7h和20h取样，4000r/min离心10min，取上清液，用美国哈希试剂检测亚硝氮浓度。数据用SPSS18.0统计分析，全部结果均用平均值±标准误表示，独立样本T检验比较检验各组间的差异。在厌氧条件下，20h内能够显著降解亚硝氮，降解率达到96％。
本发明的有益效果：
(1)一般乳杆菌(包括植物乳杆菌)营养要求复杂，缺乏淀粉酶活性，不仅需要葡萄糖、果糖或麦芽糖等单糖或二糖为碳源，而且需要氨基酸、肽、核酸衍生物、盐类、脂肪酸或脂肪酸脂类，且每个种都有特殊的营养要求，这种特性使得有益乳杆菌的规模化培养用原材料的来源受限，导致培养基成本增高。本发明植物乳杆菌FF34具有淀粉酶活性，能直接利用淀粉质碳水化合物，可利用的碳源、氮源广泛，这个特性区别于一般乳杆菌(包括一般植物乳杆菌)，使得植物乳杆菌FF34能够利用的碳源从葡萄糖、果糖或麦芽糖等单糖或二糖扩大至淀粉质碳水化合物，从而使廉价的小麦次粉、棉粕、菜粕、豆粕等农副产品可以作为碳源、氮源直接用于FF34的增殖培养，大大降低培养基成本。
(2)植物乳杆菌FF34是一株兼性乳杆菌，对溶氧耐受性较好，不需要严格厌氧条件即能生长，这一特性使得采用普通好氧发酵罐大规模培养植物乳杆菌FF34成为可能，但好氧发酵罐罐压维持及种子罐与发酵罐之间的采用无菌空气压送移种方式，使得发酵培养过程中依然存在高溶氧的风险，从而抑制FF34的生长。本发明采用高密度低成本的固定化发酵扩培方法，在普通好氧发酵罐中，边发酵边海藻酸钠固定化包裹菌体的培养方法，利用植物乳杆菌FF34生长利用淀粉质或糖类产酸特性，溶解培养基中的碳酸钙释放游离钙离子，与培养基中海藻酸钠形成海藻酸钙凝胶，将菌体包裹在海藻酸钙凝胶小颗粒中，隔绝溶氧传递保护菌体的生长活性，从而获得高浓度的菌体，发酵液中植物乳杆菌FF34菌浓超过5×109CFU/mL；然后通过喷雾干燥获得FF34菌浓超过1×1010CFU/g的高浓度菌粉制剂，从而使得植物乳杆菌FF34水剂及菌粉制剂的使用成本进一步降低，有利于在畜禽渔生态养殖中推广应用植物乳杆菌FF34菌剂。
(3)植物乳杆菌FF34与多种有益芽孢杆菌相容性好，能够进行多菌株混合发酵共培养。植物乳杆菌FF34的生长对营养要求低，可利用碳源和氮源广泛，可直接利用淀粉质碳水化合物。由于小麦次粉等淀粉质碳源是芽孢杆菌适宜的低廉碳源，因此植物乳杆菌FF34能够直接利用淀粉质碳源的特性，使得FF34能够与多种芽孢杆菌混合发酵培养，芽孢杆菌类型覆盖面广，涉及好氧芽孢杆菌、兼性好氧芽孢杆菌及厌氧芽孢杆菌，如具有水产病原菌拮抗特性的枯草芽孢杆菌AB90008-15(好氧菌)或解淀粉芽孢杆菌JSSW-LA(好氧菌)或凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1(兼性好氧菌)或酪酸梭状芽孢杆菌JSIM-MCB20040312(厌氧菌)或漳州芽孢杆菌JSSW-BP44(兼性好氧菌)。FF34与芽孢杆菌在混合发酵培养基中共培养时，首先在这些芽孢杆菌形成芽孢后，通过调整pH，使芽孢处于休眠状态，然后继续接种FF34，充分利用发酵培养基中剩余的营养物质进行FF34增殖培养，最终获得含有高浓度的芽孢杆菌(芽孢率≥90％)+植物乳杆菌FF34的复合菌剂，降低了复合菌剂的发酵成本，减少了发酵废液排放。
(4)植物乳杆菌FF34对鳗利斯顿氏菌、爱德华氏菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌及大肠杆菌等水产常见致病菌具有拮抗作用，其中对溶藻弧菌、爱德华氏菌、大肠杆菌和嗜水气单胞菌抑制效果显著。且植物乳杆菌FF34能够与枯草芽孢杆菌AB90008-15或解淀粉芽孢杆菌JSSW-LA或凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1或酪酸梭状芽孢杆菌JSIM-MCB20040312等多种具有水产病原菌拮抗特性的芽孢杆菌进行混合发酵共培养，获得的复合菌剂则进一步丰富了菌剂拮抗水产病原菌种类，增强水产养殖动物病害防治的有效性，促进水产动物健康生长。
(5)植物乳杆菌FF34单菌或复合菌剂发酵饲料后，无霉变，发酵饲料富含益生菌，显著改善饲料营养成分，可溶性蛋白提高42.38％～116.31％，酸溶蛋白提高118.54％～218.53％，活性小肽提高42.14％～168.41％，并且植酸、单宁、游离棉酚等抗营养因子含量显著降低。本发明对于植物乳杆菌FF34对鱼类饲料营养利用和代谢影响等机理方面的初步研究显示：在基础日粮或高淀粉饲料中按质量百分比0.05％～1％添加植物乳杆菌FF34单菌菌剂或复合菌剂，能够促进水产养殖动物的肠道组织生长，改善肝脏功能，提高抗氧化活性，显著改善水产养殖动物的生长性能，降低饲料系数。
(6)植物乳杆菌FF34复合菌剂通过轻石、活性碳或陶粒吸附固定化后，投放在养殖水体中，与直接泼洒未固定化的菌剂相比，在含氧的养殖水体环境中固定化菌体不易失活，不易流失，有效时间超过20天，可持续降解水体的氨氮、亚硝酸盐、总磷、总氮含量，抑制水产病原菌的生长，改善养殖池塘水质。
生物材料样品保藏
(1)植物乳杆菌FF34，分类命名为植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)，保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号:CCTCC NO：M20211221，保藏日期2021年10月11日。
附图说明
图1植物乳杆菌及高淀粉添加对团头鲂幼鱼肝脏油红0染色切片。A图为15WM组(×200倍)的油红O染色切片，B图为35WM+LAB组(×200倍)的油红O染色切片，C图为35WM组(×200倍)的油红O染色切片。
图2菌株FF-34基于16S rRNA基因序列比对结果以Enterococcus faecalis(Y18293.1)为外枝构建的Neighbor-Joining系统发育树。
具体实施方式
实施例1：菌种的筛选
在无锡市滨湖区马山镇河蟹养殖池塘采集池塘泥水，加入生理盐水，研磨制成匀浆液，取移液枪吸取0.1mL于MRS固体培养基上涂布25～35℃厌氧培养。根据菌落大小选取生长良好的菌落反复接种筛选，直至得到均匀的单个菌落，命名为FF34。
实施例2：菌种鉴定
(1)形态特征：植物乳杆菌菌株FF34，革兰氏染色为阳性，在MRS平板涂布后，35℃厌氧培养48h生长出的菌落凸起，表面光滑，细密，色白，不透明，直径1～3mm，MRS倾注培养的深层菌落呈透镜或菱形，平板底部菌落呈扁平圆形，显微镜(16×100)观察，菌体呈短杆状，两端呈圆形略方形态，成对或短链状排列，(0.9～1.2)μm×(2～4)μm，无鞭毛，能运动。
(2)生化特性：
表1菌株FF-34生理生化特性–酶活、碳源氧化
+：阳性反应；-：阴性反应；W：弱阳性反应
表2菌株FF-34生理生化特性–利用碳源产酸
+：阳性反应；-：阴性反应；W:弱阳性反应
(3)16S rRNA序列分析和系统发育树的构建：
植物乳杆菌菌株FF34的16S rRNA基因序列，如SEQ ID NO.1所示。
植物乳杆菌菌株FF34基因序列测序结果：将菌株所扩增的16S rRNA基因序列在NCBI通过Blast进行同源性检索，结果检索出为乳杆菌属的16S rRNA基因序列，采用邻接法构建菌株系统发育树，分离菌株在系统发育树上与植物乳杆菌Lactobacillus plantarumsubsp.plantarumATCC 14917(登录号：ACGZ01000098)属同一支。结合形态学和生理生化特征将所分离菌株鉴定为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum(见图2)。
实施例3：植物乳杆菌FF34对水产致病菌抑菌能力的测定
将致病菌与植物乳杆菌FF34菌液共同接入LB培养基中，30℃静置培养24h，于0h、24h取样计数，观察植物乳杆菌FF34对致病菌的拮抗作用。测定结果如表3所示：
表3植物乳杆菌FF34与致病菌的共培养测定结果
在共培养条件下，植物乳杆菌FF34对溶藻弧菌和爱德华氏菌的抑制能力最强，对大肠杆菌和嗜水气单胞菌次之，对鳗利斯顿氏菌抑制能力较弱。植物乳杆菌FF34在24h完全抑制了溶藻弧菌的生长，使得爱德华氏菌的增殖减少了约2个数量级，大肠杆菌和嗜水气单胞菌的增殖分别减少了一个数量级。
实施例4：植物乳杆菌FF34降解亚硝酸盐能力的测定
MRS肉汤培养基分装50mL/试管，与2mol/L亚硝酸钠溶液分别在121℃灭菌15min后，在每支装有MRS肉汤培养基的试管中分别添加2mol/L亚硝酸钠溶液0.1mL，然后接种活化后的植物乳杆菌FF34菌悬液5mL，对照组接入5mL无菌蒸馏水，每组3个平行，35℃静置培养20h，其中0h、7h和20h取样，4000r/min离心10min，取上清液，用美国哈希试剂检测亚硝氮浓度。数据用SPSS18.0统计分析，全部结果均用平均值±标准误表示，独立样本T检验比较检验各组间的差异。
表4结果显示植物乳杆菌FF34亚硝酸盐还原酶活性高，在厌氧条件下，能够快速降解亚硝氮，20h内降解极其显著，7h降解率82.30±0.50％，20h降解率达到96.00±0.01％。
表4植物乳杆菌FF34降解亚硝氮能力
分组 对照组 FF34试验组
时间 亚硝氮mg/L 亚硝氮mg/L
0h 135.22±2.34Aa 135.89±2.34Aa
7h 135.69±0.55Aa 24.05±0.99Bb
20h 134.31±0.20Aa 5.22±1.24Cb
20h亚硝氮降解率 1.12±1.37％b 96.00±0.01％a
注：同行不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，同列不同大写字母表示差异显著(P<0.05)。
实施例5具有水产病原菌拮抗特性的植物乳杆菌FF34单菌制剂的制备
1)菌种活化：
无菌开启植物乳杆菌FF34的冻干保藏菌种，接种于装有MRS肉汤的试管中，于30～35℃静置培养24～48h，然后转接于MRS肉汤三角瓶中，30～35℃培养活化20～48h；反复活化2～3次，镜检，计数，当菌体浓度达109CFU/mL时作为种子液；
MRS肉汤培养基组成以g/L计：酪蛋白酶消化物10，牛肉膏粉10，酵母膏粉4，柠檬酸三铵2，乙酸钠5，硫酸镁0.2，硫酸锰0.05，磷酸氢二钾2，葡萄糖20，吐温-80 1.08，以蒸馏水定容配制，pH 5.7±0.2；
(2)固定化发酵培养：
三角瓶种子培养液制备：将步骤(1)所得种子液以体积比1％～5％接种量接入装有固定化发酵培养基的3L三角瓶，装液量为体积比90％，于30～35℃静置培养24～40h，当菌体浓度达109CFU/mL时，作为三角瓶种子培养液，接入普通好氧发酵罐中进行一级、二级固定化发酵逐级放大扩培，即：3L三角瓶，再500L发酵罐，再10T发酵罐，发酵罐间移种以无菌空气压送方式完成接种；
一级固定化培养：将固定化培养种子液以体积比1％～5％接种量接入500L发酵罐中，发酵罐装液量为体积比80％～90％，无菌空气保持罐压至0.01～0.05Mpa，间歇搅拌，转速80～100r/min，30～35℃培养20～40h，pH为4.5～5.5时，结束培养，得到一级固定化培养液，其中植物乳杆菌FF34菌体被吸附固定在海藻酸钙+二氧化硅形成的凝胶小颗粒中，活菌体浓度≥5×109CFU/mL；
二级固定化培养：将一级固定化培养液用无菌空气压送，以体积比1％～5％接种量接入10T发酵罐中，发酵罐装液量为体积比70％～90％，无菌空气保持罐压至0.01～0.05Mpa，间歇搅拌，转速80～100r/min，30～38℃培养20～40h，当发酵液pH降至4.0～5.5，培养结束，得到二级固定化培养液，其中植物乳杆菌FF34菌体被吸附固定在海藻酸钙+二氧化硅形成的凝胶小颗粒中，菌体浓度≥5×109CFU/mL；
固定化发酵培养基组成以g/L计：碳源10～40，氮源3～15，磷酸氢二钾0.2～5，硫酸镁0～0.2，硫酸锰0～0.05，碳酸钙5～40，海藻酸钠3～10，二氧化硅1～10，以自来水定容配制，pH 6.0～6.5，121℃灭菌30min；其中碳源包括小麦次粉、玉米淀粉、糊精、糖蜜、葡萄糖、果葡糖浆等碳源中的一种或几种组合。氮源包括鱼粉蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、大豆分离蛋白、酵母膏、酵母粉、玉米浆、棉籽粕、菜籽粕、豆粕、花生粕及血粉等氮源中的一种或几种组合。
(3)植物乳杆菌FF34单菌制剂的制备：
(A)植物乳杆菌FF34单菌水剂的制备：将步骤(2)所得二级固定化培养液进行灌装，获得植物乳杆菌FF34水剂，菌液水剂中FF34活菌浓度≥5.0×109CFU/mL；
(B)植物乳杆菌FF34单菌粉剂的制备：将步骤(2)所得二级固定化培养液经离心收集湿菌体，按质量比为：湿菌体:碳酸钙:糊精:二氧化硅＝1:0.1～2:0.5～2:0.01进行混合，经喷雾干燥或真空干燥得到植物乳杆菌FF34菌粉，菌粉中FF34活菌浓度不低于1×1010CFU/g。
实施例6：植物乳杆菌FF34与酪酸梭状芽孢杆菌JSIM-MCB20040312(保藏号CGMCCNo.1647)混合发酵共培养及其复合菌剂制备
(1)菌种活化及发三角瓶种子液培养
(A)酪酸梭状芽孢杆菌JSIM-MCB 20040312的菌种活化及三角瓶种子液培养：
无菌开启酪酸梭状芽孢杆菌JSIM-MCB 20040312冻干保藏菌种，接入装有活化培养基的试管，进行静置厌氧培养，30～37℃培养18～24h，然后以体积比1％～10％的接种量转接于新鲜活化培养基，30～37℃培养20～24h，镜检，超过90％菌体形成芽孢时，即成熟，反复活化2～3次，种子菌悬液以体积比1％～10％接种量接入装有种子培养基的数个3L三角瓶中，三角瓶装液量为体积比80％～90％，30～37℃恒温培养箱中静置培养20～24h，镜检，超过90％菌体形成芽孢时，即作为三角瓶种子液；
酪酸梭状芽孢杆菌JSIM-MCB 20040312活化及种子培养基组成以g/L计：
酵母膏3～5，牛肉膏5～20，蛋白胨5～20，葡萄糖5～10，可溶性淀粉1～2，氯化钠5，乙酸钠3～5，盐酸半胱氨酸0.5～1，碳酸钙1～7，用去离子水配制，pH 6.0～7.5；
(B)植物乳杆菌FF34的菌种活化及三角瓶种子液培养
无菌开启植物乳杆菌FF34的冻干保藏菌种，接种于装有MRS肉汤的试管中，于30～35℃静置培养24～48h，然后转接于MRS肉汤小三角瓶中，30～35℃培养活化20～48h；反复活化2～3次，镜检，计数，当菌体浓度109CFU/mL时作为种子液，以体积比1％～5％接种量接入装有MRS发酵培养基的数个3L三角瓶，装液量为体积比90％，于30～35℃静置培养24～40h，当菌体浓度达109CFU/mL时，作为三角瓶种子液；
MRS肉汤培养基组成以g/L计：酪蛋白酶消化物10，牛肉膏粉10，酵母膏粉4，柠檬酸三铵2，乙酸钠5，硫酸镁0.2，硫酸锰0.05，磷酸氢二钾2，葡萄糖20，吐温-80 1.08，以蒸馏水定容配制，pH 5.7±0.2；
(2)混合发酵共培养
FF34与酪酸梭状芽孢杆菌JSIM-MCB 20040312混合发酵分两步进行：第一步发酵：将上述(A)步骤获得的酪酸梭状芽孢杆菌JSIM-MCB 20040312发酵罐种子液以体积比1％～10％接入装有混合发酵培养基的500L发酵罐中，装液量70％～80％(V/V)，30～37℃，静置培养24～48h，镜检菌体中芽孢形成，即第一步发酵结束；第二步发酵先将第一步发酵所得发酵液用盐酸调整pH至5.0～5.4，然后接入上述(B)步骤获得的植物乳杆菌FF34三角瓶种子液，接种量为体积比1％～10％，培养温度为30～35℃，间歇搅拌，流加浓度为20％(w/v)葡萄糖或30％碳酸钙或氨水，控制发酵液pH4.5～5.0，培养24h左右，获得FF34与芽孢杆菌混合发酵液，镜检可见乳杆菌与芽孢共存，混合发酵液中FF34活菌浓度的≥1.0×109CFU/mL，芽孢杆菌活菌浓度≥5.0×108CFU/mL，芽孢率≥90％；
混合发酵培养基组成以g/L计：小麦次粉0～50，蛋白胨0.1～5，酵母膏0～5，乙酸钠0～3，玉米淀粉0～10，硫酸铵0～2，氯化钠0～5，碳酸钙0～5，磷酸二氢钾0～0.5，硫酸镁0～0.5，硫酸锰0～0.3，海藻酸钠0～5，自来水定容，pH 7.0，121℃灭菌30min；
(3)植物乳杆菌FF34复合菌剂的制备：
(A)将上述步骤(2)获得的植物乳杆菌FF34与酪酸梭状芽孢杆菌JSIM-MCB2004031混合发酵液直接进行灌装，获得植物乳杆菌FF34复合菌水剂，复合菌液水剂中FF34活菌浓度的≥1.0×109CFU/mL，芽孢杆菌活菌浓度≥5.0×108CFU/mL，芽孢率≥90％；
(B)将上述步骤(2)所得的植物乳杆菌FF34与酪酸梭状芽孢杆菌JSIM-MCB2004031混合发酵液经离心收集湿菌体，按质量比为：湿菌体:碳酸钙:二氧化硅＝1:0.1～3:0.01进行混合，经喷雾干燥或真空干燥得到植物乳杆菌FF34复合菌剂菌粉，菌粉中FF34活菌浓度≥5×109CFU/g，芽孢杆菌活菌浓度≥5.0×109CFU/g。
实施例7植物乳杆菌FF34与枯草芽孢杆菌AB90008-15(保藏号CGMCC NO.18684)混合发酵共培养及其复合菌剂制备
(1)菌种活化及发三角瓶种子液培养
(A)枯草芽孢杆菌AB90008-15的菌种活化及种子制备：
无菌开启枯草芽孢杆菌AB90008-15冻干管保藏菌种，接种于麸皮营养琼脂，于30～37℃培养24～48h，然后转接麸皮营养琼脂斜面，反复活化2～3次，镜检，当枯草芽孢杆菌90％以上菌体形成芽孢时，即为成熟，刮取菌苔，用无菌水制备菌悬液作为枯草芽孢杆菌种子液；
麸皮营养琼脂斜面培养基组成以g/L计：蛋白胨10，牛肉膏3，NaCl 5，麸皮10，琼脂15-20，以蒸馏水定容配制，pH 7.0～7.2；
(B)植物乳杆菌FF34的菌种活化及三角瓶种子液培养
无菌开启植物乳杆菌FF34的冻干保藏菌种，接种于装有MRS肉汤的试管中，于30～35℃静置培养24～48h，然后转接于MRS肉汤小三角瓶中，30～35℃培养活化20～48h；反复活化2～3次，镜检，计数，当菌体浓度109CFU/mL时作为种子液，以体积比1％～5％接种量接入装有固定化发酵培养基的数个3L三角瓶，装液量为体积比90％，于30～35℃静置培养24～40h，当菌体浓度达109CFU/mL时，作为三角瓶种子液；
MRS肉汤培养基组成以g/L计：酪蛋白酶消化物10，牛肉膏粉10，酵母膏粉4，柠檬酸三铵2，乙酸钠5，硫酸镁0.2，硫酸锰0.05，磷酸氢二钾2，葡萄糖20，吐温-80 1.08，以蒸馏水定容配制，pH 5.7±0.2；
固定化发酵培养基组成以g/L计：碳源10～40，氮源3～15，磷酸氢二钾0.2～5，硫酸镁0～0.2，硫酸锰0～0.05，碳酸钙5～40，海藻酸钠3～10，二氧化硅1～10，以自来水定容配制，pH 6.0～6.5，121℃灭菌30min；其中碳源包括小麦次粉、玉米淀粉、糊精、糖蜜、葡萄糖、果葡糖浆等碳源中的一种或几种组合。氮源包括鱼粉蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、大豆分离蛋白、酵母膏、酵母粉、玉米浆、棉籽粕、菜籽粕、豆粕、花生粕及血粉等氮源中的一种或几种组合。
(2)混合发酵共培养
FF34与枯草芽孢杆菌AB90008-15混合发酵分两步进行：第一步发酵：将上述步骤(A)所得枯草芽孢杆菌种子菌悬液以体积比1％～10％接种量接入装有发酵培养基的500L发酵罐中进行一级种子罐培养，装液量为体积比50％～60％，通气量15m3/h，罐压0.05～0.1Mpa，转速为100～150r/min，30～37℃，通气培养24～48h，镜检菌体中芽孢形成，即第一步发酵结束；第二步发酵先将发酵液用盐酸调整pH至5.0～5.4，然后接入上述(B)步骤获得的植物乳杆菌FF34三角瓶种子液，接种量为体积比1％～10％，培养温度为30～35℃，间歇搅拌，流加浓度为20％(w/v)葡萄糖或30％碳酸钙或氨水，控制发酵液pH4.5～5.0，培养24h左右，获得FF34与芽孢杆菌混合发酵液，镜检可见乳杆菌与芽孢共存，混合发酵液中FF34活菌浓度的≥1.0×109CFU/mL，芽孢杆菌活菌浓度≥5.0×108CFU/mL，芽孢率≥90％；
混合发酵培养基组成以g/L计：小麦次粉0～50，蛋白胨0.1～5，酵母膏0～5，乙酸钠0～3，玉米淀粉0～10，硫酸铵0～2，氯化钠0～5，碳酸钙0～5，磷酸二氢钾0～0.5，硫酸镁0～0.5，硫酸锰0～0.3，海藻酸钠0～5，自来水定容，pH 7.0，121℃灭菌30min；
(3)植物乳杆菌FF34复合菌剂的制备：
(A)将上述步骤(2)获得的植物乳杆菌FF34与枯草芽孢杆菌AB90008-15混合发酵液直接进行灌装，获得植物乳杆菌FF34复合菌水剂，复合菌液水剂中FF34活菌浓度的≥1.0×109CFU/mL，芽孢杆菌活菌浓度≥5.0×108CFU/mL，芽孢率≥90％；
(B)将上述步骤(2)所得的植物乳杆菌FF34与枯草芽孢杆菌AB9008-15混合发酵液经离心收集湿菌体，湿菌体:碳酸钙:二氧化硅＝1:0.1～3:0.01进行混合，经喷雾干燥或真空干燥得到植物乳杆菌FF34复合菌剂菌粉，菌粉中FF34活菌浓度≥5×109CFU/g，芽孢杆菌活菌浓度≥5.0×109CFU/g。
实施例8：植物乳杆菌FF34复合菌剂发酵饲料结果
将实施例7中制备的植物乳杆菌FF34复合菌剂粉剂，按质量百分比0.1～5％的添加量分别与青虾饲料、螃蟹饲料、龙虾饲料及棉粕混合后，加水调节物料含水量25％～40％，分别按1kg/袋分装体积容量为5L的发酵袋(市售)，以不添加菌粉发酵的青虾饲料、螃蟹饲料、龙虾饲料及棉粕为对照，每组3个平行，在发酵袋中28～35℃密闭发酵3～5天，发酵结果如下表5，数据用SPSS18.0统计分析，全部结果均用平均值±标准误表示，独立样本T检验比较各组间的差异。
表5植物乳杆菌FF34复合菌剂虾蟹饲料的结果
注：*表示差异显著(p＜0.05)。
表5中结果显示，青虾饲料、螃蟹饲料、小龙虾饲料经植物乳杆菌FF34复合菌剂发酵后，发酵饲料富含有益乳酸菌和芽孢杆菌，饲料的营养价值提高显著，其中可溶性蛋白含量分别提高116.31％、92.57％、42.38％，酸溶蛋白含量218.53％、155.21％、118.41％，小肽含量分别提高45.20％、76.13％、168.41％。
表6植物乳杆菌FF34复合菌剂发酵棉粕的结果
注：*表示差异显著(p＜0.05)。
表6结果显示：植物乳杆菌FF34复合菌剂发酵棉粕后，富含乳酸菌等益生菌，其中乳酸菌大量增殖，浓度高达109CFU/g，FF34复合菌剂发酵棉粕中芽孢杆菌可达107CFU/g。在发酵棉粕过程中，植物乳杆菌FF34复合菌剂抑制了霉菌的生长，杜绝了棉粕加水后产生的霉变。植物乳杆菌FF34复合菌发酵棉粕后，改善了棉粕的营养成分，显著提高了棉粕的粗蛋白、可溶蛋白、酸溶蛋白和活性小肽含量(p＜0.05)，可溶蛋白提高85.13％，酸溶蛋白提高155.42％，活性小肽提高42.14％，发酵棉粕虽然粗蛋白提高9.02％，但差异不显著(p＞0.05)。此外，植物乳杆菌FF34复合菌剂发酵棉粕后，能显著降低棉粕中植酸、单宁及游离棉酚等抗营养因子的含量(p＜0.05)，植酸下降63.74％，单宁下降50.61％，游离棉酚下降54.17％。
实施例9：饲料中添加植物乳杆菌FF34对团头鲂幼鱼生长和饲料利用的作用
在本实施例中，以鱼粉、豆粕、菜粕和棉粕为蛋白源，豆油为脂肪源，配制2组试验饲料，即常规对照饲料组(CN)和植物乳杆菌FF34添加组LAB，LAB组是在常规对照饲料(CN)中按质量百分比0.01％～1％添加实施例5制备的植物乳杆菌FF34单菌制剂，使得其中FF34菌浓为106cfu/g饲料。各组饲料中粗蛋白含量为32.5％、粗脂肪为6.2％、总能为17.4kJ/Kg。常规对照饲料组成为(质量百分比)：鱼粉6.4％、豆粕25.4％、菜粕16.2％、棉粕15.3％、小麦淀粉16.6％、米糠5.7％、麸皮5.8％、豆油3.1％、磷酸二氢钙1.0％、预混料1.0％、维生素C0.5％、氯化胆碱0.4％、微晶纤维素2.1％、膨润土0.5％。
挑选120尾体质健康、规格均一的团头鲂幼鱼(初重13.5±0.5g)暂养一周后，随机分入6个室外网箱(1m×1m×1m)，每个网箱20尾，分为2组，每组3个重复，每天表观饱食投喂试验饲料3次(8:00，12:00和17:00)，为期8周。养殖期间水温保持28～31℃，溶氧≥7mg/L，氨氮≤0.1mg/L，pH7.3～7.8，采用自然光照周期(12L:12D)，每周测定养殖水质情况。8周养殖试验结束后，禁食24h，测定生长指标、脏器指数和血液指标。
生长性能指标计算如下：
增重率(WGR)(％)＝100×(Wt-W0)/W0；
特定生长率(SGR)(％/d)＝100×(ln Wt-ln W0)/t；
饵料系数(FCR)＝F/(Wt-W0)；
式中：W0为初始重(g)；Wt为终末重(g)；t为饲喂天数(d)；F为摄食饲料总量(风干基础)(g)。
血清血糖(GLU)、胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)含量使用深圳迈瑞全自动生化分析仪(BS-400Q2080,中国深圳)测定，所用的试剂盒均购自深圳迈瑞有限公司。CN对照组和LAB(植物乳杆菌试验组)数据采用SPSS18.0统计分析，全部结果均用平均值±标准误表示，独立样本T检验比较各组间的差异，*表示两组差异显著，检验水平为P＜0.05。结果如表7所示。
表7饲料中添加植物乳杆菌FF34对团头鲂幼鱼生长和血液生理的影响
指标 CN(对照组) LAB(植物乳杆菌试验组)
生长性能指标
WGR，％ 126.87±3.85 155.48±2.69*
SGR，％/d 1.64±0.04 11.88±0.02*
FCR 2.18±0.06 11.89±0.05*
血清生化指标
GLU，mmol/L 9.93±0.56 7.14±0.70*
LDL，mmol/L 0.61±0.06 0.66±0.03
HDL，mmol/L 1.04±0.09 0.64±0.02*
TG，mmol/L 1.43±0.11 11.87±0.07*
TC，mmol/L 5.83±0.20 7.03±0.17*
ALT，mmol/L 4.74±0.37 2.78±0.27*
AST，mmol/L 185.01±13.34 142.32±6.81*
注：*表示差异显著(p＜0.05)。
表7结果显示：添加106cfu/g的植物乳杆菌FF34显著提高了增重率(P＜0.05)和特定生长率(P＜0.05)，显著降低了饲料系数(P＜0.05)，改善了团头鲂幼鱼对饲料的利用和生长性能。丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶是反应肝脏代谢功能的指标，高密度脂蛋白能够输出胆固醇，促进胆固醇代谢。总胆固醇是合成肾上腺素、胆汁酸及维生素D等生理活性物质的重要原料。本应用实例结果说明，添加植物乳杆菌能够显著降低血液中血糖、丙氨酸转移酶、天冬氨酸氨基转移酶的含量(P＜0.05)，提示其具有改善肝脏代谢和解读功能，提高团头鲂血液生理健康。同时，总胆固醇等脂质物质的增加，也提示添加植物乳杆菌FF34能够促进鱼体脂质物质的代谢，为肝脏和机体的脂代谢提供前体物质。
实施例10：高淀粉饲料中添加植物乳杆菌FF34对团头鲂幼鱼高淀粉饲料利用和生长性能的影响
在本实施例中，以鱼粉、豆粕、菜粕和棉粕为蛋白源，豆油为脂肪源，配制2组试验饲料,即高淀粉对照饲料(HWM)组和高淀粉+植物乳杆菌FF34(HWM+LAB)组，在高淀粉对照饲料(HWM)中按质量百分比0.01％～1％添加实施例5制备的植物乳杆菌FF34单菌制剂即为(HWM+LAB)组，其中FF34菌浓为106cfu/g饲料。各组饲料中粗蛋白含量为32.5％、粗脂肪为6.2％、碳水化合物含量为43％、总能为17.4kJ/Kg。常规对照饲料组成为(质量百分比)：鱼粉6.4％、豆粕21.6％、菜粕16.2％、棉粕15.3％、小麦淀粉33.2％、豆油3.9％、磷酸二氢钙1.0％、预混料1.0％、维生素C 0.5％、氯化胆碱0.4％、膨润土0.5％。
挑选120尾体质健康、规格均一的团头鲂幼鱼(初重13.5±0.5g)暂养一周后，随机分入6个室外网箱(1m×1m×1m)，每个网箱20尾，分为2组，每组3个重复，每天表观饱食投喂试验饲料3次(8:00，12:00和17:00)，，为期8周。养殖期间水温保持28～31℃，溶氧≥7mg/L，氨氮≤0.1mg/L，pH7..3～7.8，采用自然光照周期(12L:12D)，每周测定养殖水质情况。8周养殖试验结束后，禁食24h，测定生长指标和脏器指数。
生长性能指标计算如下：
增重率(WGR)(％)＝100×(Wt-W0)/W0；
特定生长率(SGR)(％/d)＝100×(ln Wt-ln W0)/t；
饵料系数(FCR)＝F/(Wt-W0)；
肠体比(VI)＝100×Wi/Wb
式中：W0为初始重(g)；Wt为终末重(g)；t为饲喂天数(d)；F为摄食饲料总量(风干基础)(g)；Wb为每尾鱼终末个体重(g)；Wi为每尾鱼肠道重(g)。
在本实施例中，HWM(高淀粉对照饲料组)和HWM+LAB(高淀粉饲料+FF34试验组)数据采用SPSS18.0统计分析，全部结果均用平均值±标准误 表示，独立样本T检验比较各组间的差异，*表示两组差异显著，检验水平为P＜0.05，结果如表8所示。
表8高淀粉饲料中添加植物乳杆菌FF34对团头鲂幼鱼生长和高淀粉饲料利用的影响
指标 HWM(高淀粉对照饲料组) HWM+LAB(高淀粉饲料+FF34试验组)
末重，g 38.26±0.61 42.60±1.56*
WGR，％ 139.59±7.50 189.48±5.03*
SGR，％/d 1.74±0.06 2.12±0.03*
FCR 2.13±0.12 1.45±0.03*
肠体比 3.02±0.22 3.75±0.18*
注：*表示差异显著(p＜0.05)
团头鲂是我国大宗淡水鱼之一，对碳水化合物的耐受能力和利用能力相对较弱，饲料中过量碳水化合会引起鱼类的糖不耐受现象，导致生长受阻。表8结果显示，高淀粉饲料中添加植物乳杆菌FF34显著改善了团头鲂幼鱼的生长性能和饲料利用效率，其平均个体末重显著提高了11.3％(P＜0.05)，增重率显著提高了35.7％(P＜0.05)，特定生长率显著提高了21.8％(P＜0.05)，且饲料系数显著降低31.9％(P＜0.05)。而且高淀粉饲料中添加植物乳杆菌FF34可提高肠体比指数，促进肠道生长发育，肠道和个体的比重显著提高了24.2％(P＜0.05)。
实施例11：高淀粉饲料中添加植物乳杆菌FF34对团头鲂幼鱼肝脏抗氧化的影响
在本实施例中，以鱼粉、豆粕、菜粕和棉粕为蛋白源，豆油为脂肪源，配制2组试验饲料，即高淀粉饲料(HCH)和高淀粉饲料+植物乳杆菌FF34(HCH+LAB),以高淀粉饲料(HCH)为对照组，在高淀粉饲料(HCH)中按质量百分比0.01％～1％添加实施例5制备的植物乳杆菌FF34单菌制剂即为(HCH+LAB)试验组，其中FF34菌浓为106cfu/g饲料。各试验组粗蛋白含量为33.4％、粗脂肪为6.5％、碳水化合物含量为47％。常规对照饲料组成为：鱼粉7％、豆粕23％、菜粕15％、棉粕12％、小麦淀粉36％、豆油4％、磷酸二氢钙1.0％、预混料1.0％、氯化胆碱0.5％、膨润土0.5％。
挑选120尾体质健康、规格均一的团头鲂幼鱼(初重13.1±0.4g)暂养一周后，随机分入6个室外网箱(1m×1m×1m)，每个网箱20尾，分为2组，每组3个重复，每天表观饱食投喂试验饲料3次(8:00，12:00和17:00)，，为期8周。养殖期间水温保持26～30℃，溶氧≥7mg/L，氨氮≤0.1mg/L，pH6..9～7.5，采用自然光照周期(12L:12D)，每周测定养殖水质情况。8周养殖试验结束后，禁食24h，测定鱼体肝脏抗氧化指标。肝脏总抗氧化能力(TAOC)、过氧化氢酶(CAT)、总超氧化物歧化酶(SOD)、还原性谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)含量测定采用南京建成生物工程研究所的试剂盒进行测定。
在本实施例中，HCH(高淀粉饲料对照饲料组)和HCH+LAB(高淀粉饲料+植物乳杆菌FF34试验组)数据采用SPSS18.0统计分析，，全部结果均用平均值±标准误表示，独立样本T检验比较各组间的差异，*表示两组差异显著，检验水平为P＜0.05，结果如表9所示。
表9高淀粉饲料中添加植物乳杆菌FF34对团头鲂幼鱼肝脏抗氧化的影响
鱼类天生不耐受饲料中的高水平糖，饲料中过量的碳水化合物会降低鱼类生长性能和免疫力，出现糖代谢紊乱，表现出鱼类糖不耐受现象，并引起肝脏抗氧化能力减弱。导致肝脏抗氧化功能受损。表9结果显示：在高淀粉饲料中添加植物乳杆菌FF34显著提高了肝脏GSH、CAT和SOD水平(P＜0.05)，因此推测，植物乳杆菌FF34可以利用饲料中丰富的淀粉提高胆固醇水平来促进胆汁酸循环代谢，激活肝脏抗氧化能力，维持生长和健康。
实施例12：高淀粉饲料中添加植物乳杆菌FF34对团头鲂幼鱼肌肉和肝脏脂肪沉积的影响
在本实施例中，以鱼粉、豆粕、菜粕和棉粕为蛋白源，豆油为脂肪源，配制3组试验饲料，即对照饲料(15WM)、高淀粉饲料(35WM)和高淀粉饲料+植物乳杆菌FF34(35WM+LAB)，在高淀粉饲料(35WM)中按质量百分比0.01％～1％添加实施例5制备的植物乳杆菌FF34单菌制剂即为35WM+LAB试验组，其中FF34菌浓为106cfu/g饲料，饲料配方如表10。
表10本实施例饲料配方组成
挑选180尾体质健康、规格均一的团头鲂幼鱼(初重13.6±0.7g)暂养一周后，随机分入9个室外网箱(1m×1m×1m)，每个网箱20尾，分为3组，每组3个重复，每天表观饱食投喂试验饲料3次(8:00，12:00和17:00)，为期8周。养殖期间水温保持25～30℃，溶氧≥7mg/L，氨氮≤0.1mg/L，pH6.9～7.5，采用自然光照周期(12L:12D)，每周测定养殖水质情况。8周养殖试验结束后，禁食24h，测定鱼体肌肉脂肪含量，分析肝脏中脂滴沉积。肌肉营养成分分析参照国标规定方法进行测定。采用常压干燥法105℃的烘箱中烘至恒重来计算干物质含量；采用凯氏定氮法(GB/T6432-1994)测定粗蛋白质含量；采用索氏抽提法(GB/T6433-1994)测定粗脂肪含量；采用560℃灼烧法(GB/T6438-1992)测定粗灰分含量。将固定于4％多聚甲醛中的肝脏组织块取出，制作肝脏冰冻切片，并采用油红O染色，用Image J软件分析油红O脂滴面积。本实施例中，15WM(对照饲料)、35WM(高淀粉饲料)和35WM+LAB(高淀粉饲料+植物乳杆菌FF34)之间数据比较采用单因素方差分析turkey’s检验，检验水平为P＜0.05，结果如表11所示。
鱼类由于天生不耐受饲料中的高水平糖，饲料中过量的碳水化合物会引起糖脂代谢紊乱，脂质在鱼体内过量沉积，导致氧化应激损伤和抗病力下降。图1中，肝组织切片中脂滴的油红O染色图片显示，摄食35WM组饲料的团头鲂肝组织脂滴沉积显著增加，而摄食的高淀粉饲料中添加植物乳杆菌(35WM+LAB)减少肝脏中脂滴面积。进一步分析团头鲂肌肉脂肪和肝脏脂滴面积(表11)，发现与基础对照组相比(15WM)，高淀粉组(35WM)显著增加了肌肉中粗脂肪量和肝脏脂滴沉积(P＜0.05)。在高淀粉饲料中添加植物乳杆菌FF34(35WM+LAB)能够显著降低团头鲂鱼体肌肉粗脂肪含量(P＜0.05)，与对照组无显著差异；而35WM+LAB组肝脏脂滴沉积虽然高于对照组，但是显著低于高淀粉组(P＜0.05)。
图1植物乳杆菌及高淀粉添加对团头鲂幼鱼肝脏油红0染色切片。A图为15WM组(×200倍)的油红O染色切片，B图为35WM+LAB组(×200倍)的油红O染色切片，C图为35WM组(×200倍)的油红O染色切片。图中红色表示脂滴，蓝色表示细胞核。
表11高淀粉添加植物乳杆菌FF34对团头鲂幼鱼肌肉脂肪含量和肝脏脂滴沉积的影响
分组 15WM 35WM 35WM+LAB
肌肉脂肪含量，％ 4.88±0.61a 6.59±0.35b 4.75±0.48a
肝脏脂滴沉积，％ 2.50±0.64a 28.48±3.01c 20.48±0.92b
注：同行小写字母相同表示差异不显著(p＞0.05),同行不同小写字母表示差异显著(p＜0.05)。

Claims (3)

1.一种植物乳杆菌FF34，分类命名为植物乳杆菌(lactobacillus plantarum），保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址：中国 武汉 武汉大学，保藏编号CCTCC NO：M20211221。
2.利用权利要求1所述菌株制备具有水产病原菌拮抗特性的植物乳杆菌FF34单菌菌剂的方法，其特征在于步骤如下：
（1）菌种活化：
无菌开启植物乳杆菌FF34的冻干保藏菌种，接种于装有MRS肉汤的试管中，于30～35℃静置培养24～48h，然后转接于MRS肉汤三角瓶中，30～35℃培养活化20～48h；反复活化2～3次，镜检，计数，当菌体浓度达109CFU/mL时作为种子液；
MRS肉汤培养基组成以g/L计：酪蛋白酶消化物10，牛肉膏粉10，酵母膏粉4，柠檬酸三铵2，乙酸钠5，硫酸镁0.2，硫酸锰0.05，磷酸氢二钾2，葡萄糖20，吐温-80 1.08，以蒸馏水定容配制，pH 5.7±0.2；
（2）固定化发酵培养：
三角瓶种子培养液制备：将步骤（1）所得种子液以体积比1%～5%接种量接入装有固定化发酵培养基的3L三角瓶，装液量为体积比90%，于30～35℃静置培养24～40h，当菌体浓度达109CFU/mL时，作为三角瓶种子培养液；
放大扩培：三角瓶种子培养液接入普通好氧发酵罐中进行一级、二级固定化发酵逐级放大扩培，即：3L三角瓶，再500L发酵罐，再10T发酵罐，发酵罐间移种以无菌空气压送方式完成接种；
一级固定化培养：将三角瓶种子培养液以体积比1%～5%接种量接入500L发酵罐中，发酵罐装液量为体积比80%～90%，无菌空气保持罐压至0.01～0.05Mpa，间歇搅拌，转速80～100r/min，30～35℃培养20～40h，pH为4.5～5.5时，结束培养，得到一级固定化培养液，其中植物乳杆菌FF34菌体被吸附固定在海藻酸钙和二氧化硅形成的凝胶小颗粒中，活菌体浓度≥5×109CFU/mL；
二级固定化培养：将一级固定化培养液用无菌空气压送，以体积比1%～5%接种量接入10T发酵罐中，发酵罐装液量为体积比70%～90%，无菌空气保持罐压至0.01～0.05Mpa，间歇搅拌，转速80～100r/min，30～38℃培养20～40h，当发酵液pH降至4.0～5.5，培养结束，得到二级固定化培养液，其中植物乳杆菌FF34菌体被吸附固定在海藻酸钙和二氧化硅形成的凝胶小颗粒中，菌体浓度≥5×109CFU/mL；
固定化发酵培养基组成以g/L计：碳源10～40，氮源3～15，磷酸氢二钾0.2～5，硫酸镁0～0.2，硫酸锰0～0.05，碳酸钙5～40，海藻酸钠3～10，二氧化硅1～10，以自来水定容配制，pH 6.0～6.5，121℃灭菌30min；其中碳源包括小麦次粉、玉米淀粉、糊精、糖蜜、葡萄糖、果葡糖浆中的一种或几种组合；氮源包括鱼粉蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、大豆分离蛋白、酵母膏、酵母粉、玉米浆、棉籽粕、菜籽粕、豆粕、花生粕及血粉中的一种或几种组合；
（3）具有水产病原菌拮抗特性的植物乳杆菌FF34单菌菌剂的制备：
（A）植物乳杆菌FF34单菌水剂的制备：将步骤（2）所得二级固定化培养液进行灌装，获得植物乳杆菌FF34单菌水剂，单菌水剂中FF34活菌浓度≥5.0×109 CFU/mL；
（B）植物乳杆菌FF34单菌粉剂的制备：将步骤（2）所得二级固定化培养液经离心收集湿菌体，按质量比为：湿菌体:碳酸钙:糊精:二氧化硅=1:0.1～2:0.5～2:0.01进行混合，经喷雾干燥或真空干燥得到植物乳杆菌FF34菌粉，菌粉中植物乳杆菌FF34活菌浓度不低于1×1010CFU/g。
3.利用权利要求1所述植物乳杆菌FF34与芽孢杆菌混合发酵培养制备复合菌剂的方法，其特征在于步骤如下：
（1）与植物乳杆菌FF34混合发酵培养的芽孢杆菌为：保藏编号为CGMCC NO.18684的具有水产病原菌拮抗特性的枯草芽孢杆菌AB90008-15，或保藏编号为CGMCC NO.1647的酪酸梭状芽孢杆菌JSIM-MCB20040312；
（2）植物乳杆菌FF34与步骤（1）所述芽孢杆菌混合发酵：分两步进行，第一步发酵是将步骤（1）中所述芽孢杆菌经斜面或三角瓶活化培养后，接种于混合发酵培养基中，接种量为体积比1%～10%，培养温度为30～37℃，培养24～48h，镜检菌体中芽孢形成，即第一步发酵结束；第二步发酵是先将第一步发酵所得发酵液用盐酸调整pH至5.0～5.4，然后接入活化后的植物乳杆菌FF34，接种量为体积比1%～10%，培养温度为30～35℃，间歇搅拌，期间流加w/v浓度为20%葡萄糖或30%碳酸钙或氨水，控制发酵液pH 4.5～5.0，培养24h，获得植物乳杆菌FF34与芽孢杆菌混合发酵液，镜检可见植物乳杆菌与芽孢杆菌共存，混合发酵液中植物乳杆菌FF34活菌浓度≥1.0×109 CFU/mL，芽孢杆菌活菌浓度≥5.0×108 CFU/mL，芽孢率≥90%；
混合发酵培养基组成以g/L计：小麦次粉0～50，蛋白胨0.1～5，酵母膏0～5，乙酸钠0～3，玉米淀粉0～10，硫酸铵0～2，氯化钠0～5，碳酸钙0～5，磷酸二氢钾0～0.5，硫酸镁0～0.5，硫酸锰0～0.3，海藻酸钠0～5，自来水定容，pH 7.0，121℃灭菌30min；
植物乳杆菌FF34与芽孢杆菌复合菌剂的制备：
（A）将上述步骤（2）获得的植物乳杆菌FF34与芽孢杆菌的混合发酵液直接进行灌装，获得植物乳杆菌FF34与芽孢杆菌的复合菌水剂，复合菌水剂中植物乳杆菌FF34活菌浓度≥1.0×109 CFU/mL，芽孢杆菌活菌浓度≥5.0×108 CFU/mL，芽孢率≥90%；
（B）将上述步骤（2）所得的植物乳杆菌FF34与芽孢杆菌混合发酵液经离心收集湿菌体，按质量比为：湿菌体:碳酸钙:二氧化硅=1:0.1～3:0.01进行混合，经喷雾干燥或真空干燥得到植物乳杆菌FF34与芽孢杆菌的复合菌粉剂，复合菌粉剂中植物乳杆菌FF34活菌浓度≥5×109CFU/g，芽孢杆菌活菌浓度≥5.0×109 CFU/g。
CN202210793310.8A 2022-07-05 2022-07-05 有水产病原菌拮抗特性的植物乳杆菌菌株及其制剂的制备及应用 Active CN116083262B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210793310.8A CN116083262B (zh) 2022-07-05 2022-07-05 有水产病原菌拮抗特性的植物乳杆菌菌株及其制剂的制备及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210793310.8A CN116083262B (zh) 2022-07-05 2022-07-05 有水产病原菌拮抗特性的植物乳杆菌菌株及其制剂的制备及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN116083262A CN116083262A (zh) 2023-05-09
CN116083262B true CN116083262B (zh) 2025-01-28

Family

ID=86208815

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210793310.8A Active CN116083262B (zh) 2022-07-05 2022-07-05 有水产病原菌拮抗特性的植物乳杆菌菌株及其制剂的制备及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116083262B (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116656376B (zh) * 2023-05-31 2024-01-05 辽宁省微生物科学研究院 一种微生物调理剂的制备方法及应用
CN116998593B (zh) * 2023-09-15 2024-06-28 广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心) 植物乳杆菌在提高鱼糖耐受能力制剂中的应用
CN117126005B (zh) * 2023-10-26 2023-12-22 烟台固特丽生物科技股份有限公司 一种抗逆促生有机肥及其应用
CN117683687B (zh) * 2023-12-19 2024-06-21 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 一株芽孢杆菌Bacillus-W2Z及其应用和饲料
CN118497084B (zh) * 2024-07-12 2024-11-19 海南热带海洋学院 一株海藻多糖降解菌新种菌株及其应用
CN118542886B (zh) * 2024-07-30 2024-10-29 杭州菌吾细研生物科技有限公司 植物乳杆菌mll-6的应用及组合物、复合微生物制剂

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115572691A (zh) * 2022-09-27 2023-01-06 江西好实沃生物技术有限公司 一种含植物乳杆菌的水产发酵剂及其制备方法和应用
CN116515669A (zh) * 2023-01-10 2023-08-01 唐人神集团股份有限公司 一种施氏假单胞菌及其应用施氏假单胞菌的微生物调水菌剂、使用方法
CN116555112A (zh) * 2023-05-10 2023-08-08 金华银河生物科技有限公司 用于防腐保鲜的益生菌及其组合物

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102199590B (zh) * 2011-04-02 2012-07-11 江苏省苏微微生物研究有限公司 一种微胶囊化增殖培养制备酪酸菌菌粉的方法及其应用
CN104480052A (zh) * 2015-01-05 2015-04-01 江苏省苏微微生物研究有限公司 一种含三株菌的复合芽孢杆菌制剂及其制备方法和在生态养殖中的应用
CN105238722B (zh) * 2015-11-03 2018-09-21 江苏省苏微微生物研究有限公司 一株解淀粉芽孢杆菌菌株及其菌粉制剂的制备方法和应用
CN107338198B (zh) * 2017-05-24 2020-02-21 浙江省淡水水产研究所 一种植物乳杆菌及其应用
CN109749957B (zh) * 2019-01-11 2022-07-12 江苏省苏微微生物研究有限公司 一种具有水产病原菌拮抗特性的格氏乳杆菌制剂的制备及应用
PL240450B1 (pl) * 2019-07-02 2022-04-04 Inst Biotechnologii Przemyslu Rolno Spozywczego Im Prof Waclawa Dabrowskiego Sposób wytwarzania farszu z mięsa oddzielonego mechanicznie peklowanego z obniżoną dawką azotynu sodu o poprawionej jakości mikrobiologicznej
CN110699300B (zh) * 2019-11-15 2023-03-07 江苏省苏微微生物研究有限公司 一种具有水产病原菌拮抗特性的复合微生物底质改良剂的制备方法及其应用
CN114540232B (zh) * 2022-02-25 2023-12-29 江苏省苏微微生物研究有限公司 有水产病原菌拮抗特性的鼠李糖乳杆菌及其制剂的制备及应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115572691A (zh) * 2022-09-27 2023-01-06 江西好实沃生物技术有限公司 一种含植物乳杆菌的水产发酵剂及其制备方法和应用
CN116515669A (zh) * 2023-01-10 2023-08-01 唐人神集团股份有限公司 一种施氏假单胞菌及其应用施氏假单胞菌的微生物调水菌剂、使用方法
CN116555112A (zh) * 2023-05-10 2023-08-08 金华银河生物科技有限公司 用于防腐保鲜的益生菌及其组合物

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
饲料中添加植物乳杆菌对花鲈 生长性能、血清生化指标及抗哈维弧菌感染的影响;刘辉等;水生动物营养;20230911;第49-55页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN116083262A (zh) 2023-05-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN116083262B (zh) 有水产病原菌拮抗特性的植物乳杆菌菌株及其制剂的制备及应用
CN101253934A (zh) 奶牛饲料用复合微生物添加剂及其制备方法
CN114540232B (zh) 有水产病原菌拮抗特性的鼠李糖乳杆菌及其制剂的制备及应用
CN115094012B (zh) 凝结芽孢杆菌bc-hyc株菌剂的制备方法及应用
CN108277188B (zh) 一种断奶仔猪用复合微生物发酵剂及其应用
CN111593010B (zh) 一株植物乳杆菌及应用该菌株生产发酵饲料的方法
CN105524855A (zh) 一种具有水产病原菌拮抗特性的凝结芽孢杆菌及其应用
CN112980735A (zh) 丁酸梭菌、菌剂及它们的应用以及菌剂的制备方法
CN116711809A (zh) 枯草芽孢杆菌在促进动物生产中的应用
CN115572691A (zh) 一种含植物乳杆菌的水产发酵剂及其制备方法和应用
CN112961806B (zh) 高产乳酸的凝结芽孢杆菌、生物发酵饲料及其制备方法和应用
CN111676153B (zh) 一株植物乳杆菌及其在水产发酵饲料中的应用
CN114190486B (zh) 一种预防和治疗母猪便秘的微生物发酵饲料及母猪养殖方法
CN111676145A (zh) 一株酿酒酵母及其在水产养殖中的应用
CN114343087B (zh) 一种提高对虾养殖存活率和生长速度的发酵饲料
CN116286514A (zh) 多功能菌剂及其所含的罗伊氏乳杆菌及其应用
CN111642639B (zh) 一种乳仔猪生物发酵饲料
CN114015626A (zh) 一种具有抑菌功能的类植物乳杆菌及其复合制剂及应用
CN107897505B (zh) 发酵菌液、包含其的用于保育猪的产品及产品的制备方法和应用
CN113999787B (zh) 丁酸梭菌、菌剂及其制备方法和应用以及饲料
CN111670999B (zh) 一种水产用微生态复合添加剂及其应用
CN116536205B (zh) 一种丁酸梭菌复合菌剂及其应用
CN112899197B (zh) 复合微生物菌剂及其制备和在饲料添加剂中的应用
CN111109433A (zh) 一种调节母猪肠道健康的复合生物制剂及其制备方法和应用
CN115191523B (zh) 一种水质改良型发酵饲料的生产方法及在水产养殖中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant