CN116018522A

CN116018522A - 白细胞捕获设备

Info

Publication number: CN116018522A
Application number: CN202180054466.8A
Authority: CN
Inventors: 中村麻子; 高桥健太; 小森隆幸
Original assignee: Nok Corp; Ibaraki University NUC
Current assignee: Nok Corp; Ibaraki University NUC
Priority date: 2020-09-29
Filing date: 2021-09-10
Publication date: 2023-04-25
Also published as: JPWO2022070841A1; US20230364613A1; EP4224170A4; JP7455339B2; EP4224170A1; WO2022070841A1

Abstract

本发明的课题是提供一种白细胞捕获设备，其不需要离心分离机那样的大型装置，所需的血液也为少量在1μl左右。上述课题通过白细胞捕获设备(1)来解决，所述白细胞捕获设备(1)使含血液的液体通过来捕获白细胞，其中，芯片(10)具有平面部(12)和设置于平面部(12)上的许多凸部(14)，该芯片(10)构成为使得从入口(3)进入的含血液的液体在芯片(10)中的平面部(12)的表面上通过且在凸部(14)和与之相邻的另外的凸部(14)之间通过、并从出口(5)排出。凸部(14)在平面部(12)上以层状设置，各层包含多个凸部(14)，并构成为使得通过了入口(3)侧的层的含血液的液体通过与该层相邻的出口(5)侧的层，在各层中形成有在凸部(14)和与之相邻的凸起(14)之间的捕获部和旁路部，且在特定层中的旁路部的出口(5)侧配置有作为与该特定层相邻的另外的层的一部分的捕获部。

Description

白细胞捕获设备

技术领域

本发明涉及一种白细胞捕获设备。

背景技术

DNA会因辐射暴露(radiation exposure)或生活环境的影响而受损。通常认为受损的DNA与癌症等疾病密切相关。以往，为了分析该DNA损伤，采用如下方法：离心分离5ml血液来提取白细胞、染色后在载玻片上进行观察。

另外，以往提出了用于捕获白细胞等微粒的微流路(参见专利文献1)。专利文献1中公开了一种具有过滤功能的微流路设备，其使用具有凹形捕获部的微流路，从固液混合物中仅捕获、分离一定尺寸以上的固体。在专利文献1中，其目的在于一个捕获部收容一个或多个一定尺寸以上的固体、并且在配置有多个捕获部的分离部的终端之前能够完全捕获完一定尺寸以上的固体，未考虑为了易于观察所捕获的白细胞等固体而在一个捕获部仅捕获一个固体。另外，为了防止暂时被捕获部捕获的固体再次浮游而从捕获部流出，需要使固液混合物始终从微流路的入口流向出口。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2009-109232号公报

发明内容

发明要解决的课题

然而，以往方法需要多达5ml的血液，因此具有侵入性。另外，以往方法需要离心分离机等大型装置。因此，难以用于现场分析那样的POCT(Point Of Care Testing，即时检验)。

另外，在目的在于通过捕获部从含血液的液体等固液混合物中分离、载置白细胞等特定尺寸的固体成分并进行现场分析的情况下，对于专利文献1中记载的微流路所具有的凹形捕获部，白细胞等固体成分的捕获效率低。

本发明的目的是解决如上所述的课题。即，本发明的目的是提供一种捕获效率高于现有技术的白细胞捕获设备，其不需要离心分离机那样的大型装置，所需的血液也为少量在1μl左右。

用于解决课题的技术手段

本发明为以下的(1)～(4)。

(1)一种白细胞捕获设备，其特征在于，该白细胞捕获设备具备使含血液的液体通过来捕获上述含血液的液体中所含的白细胞的芯片，

上述芯片具有平面部和设置于平面部上的许多凸部，该芯片构成为使得从入口进入的上述含血液的液体在上述芯片中的上述平面部的表面上通过且在上述凸部和与之相邻的另外的上述凸部之间通过、并从出口排出；

上述凸部在上述平面部上以层状设置，各层包含多个上述凸部，并构成为使得通过了入口侧的层的上述含血液的液体通过与该层相邻的出口侧的层；

在各层中形成有在上述凸部和与之相邻的另外的上述凸部之间的宽度设定为2μm～7.5μm的捕获部、和该宽度设定为8μm～20μm的旁路部；

以构成上述捕获部的两个上述凸部的入口侧的入侧部分的宽度朝向上述捕获部的深处逐渐变窄的方式进行倒角；并且

与特定层中的全部或一部分上述旁路部的出口侧对置地配置有作为与该特定层相邻的另外的层的一部分的上述捕获部。

(2)根据上述(1)所述的白细胞捕获设备，其中，特定层和与之相邻的另外的层之间的宽度为8μm～30μm。

(3)根据上述(1)或(2)所述的白细胞捕获设备，其中，上述旁路部的宽度相对于捕获部的宽度之比大于1且为3以下。

(4)根据上述(1)～(3)中任一项所述的白细胞捕获设备，其中，上述凸部的入口侧的端面中的除上述捕获部以外的部分与层方向平行地延伸，并且上述凸部中的构成上述旁路部的端面沿垂直于层方向的方向延伸。

发明效果

根据本发明，可以提供一种捕获效率高于现有技术的白细胞捕获设备，其不需要离心分离机那样的大型装置，且所需的血液也为少量在1μl左右。

附图说明

图1是优选方式的本发明的白细胞捕获设备中的芯片表面的概要图。

图2是图1中的A部分的放大图。

图3是图1中的B-B线剖面图。

图4是实施例和比较例中使用的芯片的表面的放大照片。

图5是表示实施例1中捕获白细胞的状态的用荧光显微镜进行观察而得到的芯片的放大照片(荧光转暗)。

图6是表示实施例2中捕获白细胞的状态的用荧光显微镜进行观察而得到的芯片的放大照片(荧光转暗)。

图7是现有技术的微流路设备的捕获部和旁路部的概要图。

图8是表示用于捕获判定的捕获部的边界的图。

图9是表示比较评价实验中捕获白细胞的状态的用荧光显微镜进行观察而得到的芯片的放大照片。

具体实施方式

对本发明的白细胞捕获设备进行说明。

本发明的白细胞捕获设备具备使含血液的液体通过来捕获上述含血液的液体中所含的白细胞的芯片，上述芯片具有平面部和设置于平面部上的许多凸部，上述芯片构成为使得从入口进入的上述含血液的液体在上述芯片中的上述平面部的表面上通过且在上述凸部和与之相邻的另外的上述凸部之间通过、并从出口排出；上述凸部在上述平面部上以层状设置，各层包含多个上述凸部，并构成为使得通过了入口侧的层的上述含血液的液体通过与该层相邻的出口侧的层；在各层中形成有上述凸部和与之相邻的另外的上述凸部之间的宽度设定为2μm～7.5μm的捕获部、和上述宽度设定为8μm～20μm的旁路部；以构成上述捕获部的两个上述凸部中的入口侧的入侧部分的宽度朝向上述捕获部的深处逐渐变窄的方式进行倒角；并且，与特定层中的全部或一部分上述旁路部的出口侧对置地配置有上述捕获部，且将该捕获部作为与该特定层相邻的另外的层的一部分。

使用附图对本发明的白细胞捕获设备进行说明。

图1是表示本发明的白细胞捕获设备1的概要图。图2是图1中的A部分的放大图。图3是图1中的B-B线剖面图。

图1中例示的本发明的白细胞捕获设备1具备芯片10、用于向芯片10供给含血液的液体的入口3和排出通过了芯片10的含血液的液体的出口5。本发明的白细胞捕获设备的结构不限定于图1中例示的结构，例如，图1所示的本发明的白细胞捕获设备1的整体也可以被壳体覆盖。

如图1～3所示，本发明的白细胞捕获设备1中的芯片10包含平面部12和设置于平面部12上的许多凸部14。

在这样的本发明的白细胞捕获设备1中，通过泵或流体静压(hydrostaticpressure)、电渗流等，从入口3进入的含血液的液体流向出口5，在该过程中，在芯片10的平面部12的表面上流动、且在凸部14和与之相邻的另外的凸部14之间流动，白细胞被夹在特定的凸部14之间而被捕获。

在此，含血液的液体只要是包含人类血液的液体就没有特别限定，例如可以是在磷酸缓冲液、抗凝固剂、染色液等中加入了人类血液而成的混合液。另外，含血液的液体也可以是人类血液本身。

另外，如图1所示，凸部14以层状设置在平面部12上。

在图1中，将最靠近入口3的层示为第一层，将与第一层相邻的出口侧(下游侧)的层示为第二层。另外，将某层示为第P层，将与第P层相邻的出口侧(下游侧)的层示为第P+1层，进而将与第P+1层相邻的出口侧(下游侧)的层示为第P+2层。

另外，各层包含多个凸部14。图1中示出了各层包含7个凸部14的例子，但各层所包含的凸部14的个数没有特别限定。而且，层的数量也没有特别限定。

从入口3进入至本发明的白细胞捕获设备1的含血液的液体在平面部12的表面上流动，首先通过第一层中的凸部14之间的流路，然后通过第二层中的凸部14之间的流路。然后也同样地构成为：通过第P层中的凸部14之间的流路，然后通过第P+1层中的凸部14之间的流路。

另外，如图2所示，在各层中，形成有在凸部14和与之相邻的凸部14之间的宽度(流路的宽度)L₁设定为2μm～7.5μm的捕获部21、和该宽度L₂设定为8μm～20μm的旁路部23。

在图2的例子中，在第P层、第P+1层、第P+2层的各层中，在多个凸部14之间作为流路交替地形成有捕获部21和旁路部23。然而，在本发明的白细胞捕获设备中，在各层中形成的捕获部和旁路部也可以并非如图2所示那样交替地形成。例如，在层内可以连续存在多个捕获部。

进而，在特定层中的旁路部23的出口侧，作为与该特定层相邻的另外的层的一部分配置有捕获部21。即，在图2的例子中，在第P层中的旁路部23的出口侧(下游侧)配置有第P+1层中的捕获部21。

如图2所例示那样，优选第P层中的旁路部23和第P+1层中的捕获部21沿垂直于层方向的方向排列配置。更具体而言，当绘制与层方向垂直的方向的直线时，优选以该直线通过第P层中的旁路部23和第P+1层中的捕获部21(即，该直线不接触凸部14)的方式配置第P层中的旁路部23和第P+1层中的捕获部21。

在图1、图2所示的例子中，从入口侧(上游侧)流入并到达第P层的含血液的液体所包含的白细胞原则上不能通过捕获部21，因此至少一部分白细胞被第P层的捕获部21捕获。若白细胞被捕获，则该捕获部21闭塞。另一方面，除白细胞以外的成分(红细胞、血小板等)通过第P层的捕获部21而到达第P+1层。另外，到达第P层的含血液的液体所包含的所有成分可以通过旁路部23。因而，未被第P层的捕获部21捕获的白细胞通过第P层的旁路部23而到达第P+1层，其至少一部分被第P+1层中的捕获部21捕获。在此，由于在第P层的旁路部23的出口侧(下游侧)配置有第P+1层中的捕获部21，因此通过了第P层的旁路部23的白细胞容易被第P+1层的捕获部21捕获。

在如图1、图2所示的平面图中，凸部14优选为矩形或大致矩形(以矩形为基础，其四角的一部分角被直线切掉并倒角的形状或矩形的四角中的至少一部分角被削掉而圆化的形状)。在此，优选被直线切掉的倒角部分和为了圆化而削掉的倒角部分的面积小于所捕获的白细胞的面积(投影面积)。

另外，如图2所例示那样，以构成捕获部21的两个凸部14中的入侧部分朝向捕获部21的深处连续地逐渐变窄的方式进行倒角。其原因在于，在该情况下白细胞变得容易被捕获部捕获。另外其原因在于，一旦被捕获部捕获的白细胞发生变形并嵌入倒角部分，因此难以从捕获部流出。

对于倒角形成的直线所成的角度，优选相对于与层方向垂直的方向(从入口向出口的方向)为30度～60度。在此，当倒角为例如勺形倒角或圆形倒角而非线性的情况下，其切线所成的角度的平均值优选为30度～60度。若该角度小于30度，则存在白细胞向旁路部23流入的速度变快、捕获效率降低的倾向。另外，若该角度大于60度，则存在多个白细胞被一个捕获部21捕获的概率变高的倾向。

对于倒角而言，只要入侧部分朝向捕获部21的深处逐渐变窄，则构成捕获部的两个凸部双方的入侧部分被倒角或仅一个入侧部分被倒角都可以，在双方的入侧部分被倒角的情况下，倒角的角度可以相同也可以不同。

在凸部14为矩形或大致矩形的情况下，到达已捕获有微粒的捕获部21的其他白细胞沿着凸部14的端面向层方向移动，从旁路部23向下游侧的相邻的层移动，容易被下游侧的层中的捕获部21捕获。其结果，本发明人发现白细胞的捕获效率提高。

特别是如图2所示的情况那样，当以构成捕获部21的两个凸部14中的入侧部分朝向捕获部21的深处连续地逐渐变窄的方式(优选为线性地)进行倒角、且凸部14的入口侧端面中的除捕获部21以外的部分与层方向平行地延伸、且旁路部23沿垂直于层方向的方向延伸时，该效果变得显著，白细胞的捕获效率进一步提高，因此优选。

在凸部14不是矩形或大致矩形的情况下(例如圆形或椭圆形等的情况下)，由于其外形包含R，因此有可能会使白细胞沿其R移动而不是向下游侧的相邻的层中的捕获部21移动。

捕获部21的宽度L₁为2μm～7.5μm，但优选为3μm～6μm，更优选为4μm～5μm。

另外，旁路部23的宽度L₂为8μm～20μm，但优选为8.5μm～15μm，更优选为9μm～10μm。

需要说明的是，宽度L₁和宽度L₂是指各层中凸部14和与之相邻的凸部14之间的最短距离。

另外，旁路部23的宽度L₂相对于捕获部21的宽度L₁之比(L₂/L₁)优选为大于1且为3以下，更优选为1.5～2.5。这是因为在该情况下可适度地抑制向旁路部23的流动、白细胞容易被捕获部捕获。

另外，第P层与第P+1层之间的宽度L₃优选为8μm～30μm，更优选为9μm～10μm。

需要说明的是，宽度L₃是指第P层与第P+1层之间的最短距离。

另外，捕获部21的入侧的倒角部分的最大宽度L₄优选为10μm～35μm，更优选为15μm～25μm。

图3所示的凸部14的高度h优选为8μm～30μm，更优选为9μm～15μm。

芯片的尺寸或材质没有特别限定。例如，可以由硅酮橡胶、丙烯酸树脂、聚碳酸酯、环状烯烃聚合物、环状烯烃共聚物、聚苯乙烯、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯等树脂形成，优选为树脂被粘贴至玻璃等基板上的形态。

实施例

<白细胞捕获设备的制作>

按照以下所示的步骤制作了具备六种芯片(旁路部和捕获部的宽度为表1所示的值)的白细胞捕获设备。需要说明的是，所有白细胞捕获设备中的特定层和与之相邻的另外的层的宽度(图2中的宽度L₃)均为10μm。

首先，使用旋转器在板状硅酮晶片的表面均匀地涂布感光性树脂(SU-83050，日本化药公司制造)。

接着，通过特定的掩模对感光性树脂照射紫外线。

接着，将暴露于紫外线的硅酮晶片上的感光性树脂在95℃下烘烤。

接着，使用显影剂(SU-8Developer，日本化药公司制造)去除未照射紫外线的部分，制作模具。

接着，将硅酮橡胶(SILPOT184，Dow Corning公司制造)倒入模具中。

接着，在100℃、0.5小时的条件下，对硅酮橡胶进行硫化。

接着，将硅酮橡胶从硅酮晶片上剥离，从而形成了形成有流路的芯片。

接着，在成为入口和出口的位置打孔，制作流体引入部，从而制作成白细胞捕获设备。

<接合>

使用光源(L 12530-01，Hamamatsu Photonics K.K.制造)，对形成了形成有流路的芯片的玻璃基板的双方照射真空紫外光15秒。然后，通过将双方的照射面粘在一起来制作芯片。

用荧光显微镜观察所制作的芯片，将得到的放大照片示于图4。

<实验>

将由成年男性得到的末梢血用PBS(磷酸缓冲液，和光纯药工业公司制造)稀释成2倍。

接着，将1μl～2μl经稀释的血液滴入芯片的入口，通过流体静压输送液体。

接着，静置约1小时后，去除不需要的血液，滴入PBS并输送液体。由此去掉了所捕获的除白细胞以外的物质。

接着，去掉PBS，滴入DNA结合染色液(DAPI)，静置30分钟。

然后，针对6种白细胞捕获设备的各种设备，用荧光显微镜观察芯片，确认是否捕获了白细胞。将结果示于表1。在表1中，在至少1处以上的捕获部可以确认白细胞的1细胞捕获的情况示为“○”，在所有捕获部都不能确认1细胞捕获的情况示为“×”。

另外，针对实施例1和实施例2的芯片，用荧光显微镜进行观察，将得到的荧光变暗的放大照片示于图5和图6。图5的放大倍率与图4的情况相同。图6是设备整体的图像。图5和图6中的白点表示白细胞。从图5和图6可以确认到在实施例1和实施例2中实现了白细胞的1细胞捕获。针对实施例3和实施例4也与实施例1和实施例2同样地用荧光显微镜进行了观察，结果可以确认到实现了白细胞的1细胞捕获。

另一方面，在捕获部和旁路部的宽度过宽的比较例1、比较例2的情况下，无法充分捕获白细胞。

[表1]

	旁路部的宽度(μm)	捕获部的宽度(μm)	捕获结果
				实施例1	10	5	○
实施例2	10	4	○
				实施例3	10	7.5	○
实施例4	15	5	○
				比较例1	50	25	×
比较例2	40	20	×

<比较评价>

为了将本发明的白细胞捕获设备中的白细胞捕获效率与现有技术进行比较，制作了本发明的白细胞捕获设备和专利文献1中所述的现有技术的具有凹形捕获部的微流路设备，实施了比较评价实验。图7示出微流路设备的捕获部和旁路部的概要图。

作为用于评价捕获效率的指标，采用由[式1]和[式2]所示的两个指标。

单个捕获捕获部率(％)＝[单个捕获捕获部数量]/[观察范围内的捕获部的数量]×100…[式1]

单个捕获白细胞率(％)＝[单个捕获白细胞数量]/[在观察范围内存在的白细胞的数量]×100…[式2]

观察范围内的捕获部的数量表示在成为比较评价的对象的白细胞捕获设备或微流路设备设定的观察范围内存在的捕获部的数量。单个捕获捕获部数量表示在观察范围内仅捕获到一个白细胞的捕获部的数量。单个捕获白细胞数量表示在观察范围内被一个捕获部仅捕获一个的白细胞的数量，其等于单个捕获捕获部数量。在观察范围内存在的白细胞的数量表示在观察范围内存在的所有白细胞的数量，不仅包括被捕获部仅捕获一个的白细胞，而且还包括被一个捕获部捕获多个的白细胞和在捕获部外的流路中存在的白细胞。

另外，对于白细胞是否被捕获部捕获，可如下判定：在图8(a)所示的本发明的白细胞捕获设备的捕获部和图8(b)所示的现有技术的微流路设备的捕获部中，如果白细胞的一部分进入各个图中红线所示的、包围构成一个捕获部的一组凸部的最小矩形内，则判定为白细胞被捕获。

采用这些指标作为捕获效率的评价指标的理由如下所述。

在假定为本发明的白细胞捕获设备的使用场景的DNA损伤评价等荧光图像分析中，若考虑通过图像处理程序等自动进行图像分析，则一个捕获部仅捕获一个白细胞的白细胞数量优选在用于分析的荧光显微镜等的一个视野内至少为分析所需的数量以上，尽可能多地存在。另外，若考虑制作图像处理程序的容易性，则优选在完成分离、排列的时刻白细胞未残留于除捕获部外的流路中。

即，为了评价上述所示的优选的两种性质，将单个捕获捕获部率和单个捕获白细胞率这两种指标作为捕获效率的评价指标，其中，单个捕获捕获部率是在观察范围内的捕获部中仅捕获到一个细胞的捕获部的比例，单个捕获白细胞率是在观察范围内被捕获到的细胞中捕获部仅捕获一个的细胞的比例。

<白细胞捕获设备和微流路设备的制作>

通过与上述的实施例1～4的情况相同的步骤，制作本发明的白细胞捕获设备具备的芯片作为实施例5，且通过相同的步骤制作具有凹形捕获部的微流路设备具备的芯片作为比较例3。将各芯片的捕获部和旁路部等的尺寸示于表2。图2的L₁、图7的L₁’分别表示捕获部的宽度，图2的L₂、图7的L₂’分别表示旁路部的宽度，图2的L₃、图7的L₃’分别表示层间的距离，图2的L₄、图7的L₄’分别表示捕获部的入侧部分的最大宽度。

[表2]

<实验>

通过与上述的实施例1～4的情况相同的步骤实施了实验。

对于两种芯片，用荧光显微镜观察芯片，在分别包含相同数量的捕获部的观察范围内，分别计数在观察范围内存在的捕获部数量、在观察范围内存在的白细胞数量、单个捕获白细胞数量(单个捕获捕获部数量)，并通过式1和式2评价捕获效率。将每个芯片的捕获效率示于表3。另外，图9(a)示出在本发明的白细胞捕获设备的芯片的观察对象范围内捕获的白细胞的状态，图9(b)示出现有技术的微流路设备的芯片的观察对象范围内捕获的白细胞的状态。各图中发出荧光的一个一个的粒子是白细胞。

[表3]

如表3所示，通过本比较评价实验可以确认到：实施例5与比较例3相比，显示单个捕获捕获部率高68％、单个捕获白细胞率高53％，与以往方法相比，本发明的白细胞捕获设备捕获白细胞等固体成分的捕获效率非常高。

造成该差异的原因可推测如下：通过以构成本发明的捕获部的两个凸部中的入口侧的入侧部分的宽度朝向上述捕获部的深处逐渐变窄的方式进行倒角，与现有技术中的捕获部那样的凹形结构相比，利用流体静压产生从两侧夹入深入捕获部深处的细胞的效果，不易出现暂时被捕获的细胞脱离或多个细胞被捕获至一个捕获部的情况。

本申请要求基于2020年9月29日提交的日本专利申请特愿2020-163378的优先权，将其全部公开内容援引于此。

附图标记

1本发明的白细胞捕获设备

3 入口

5 出口

10 芯片

12 平面部

14 凸部

21 捕获部

23 旁路部

Claims

1.一种白细胞捕获设备，其特征在于，所述白细胞捕获设备具备使含血液的液体通过来捕获所述含血液的液体中所含的白细胞的芯片，

所述芯片具有平面部和设置于平面部上的许多凸部，所述芯片构成为使得从入口进入的所述含血液的液体在所述芯片中的所述平面部的表面上通过且在所述凸部和与之相邻的另外的所述凸部之间通过并从出口排出；

所述凸部在所述平面部上以层状设置，各层包含多个所述凸部，并构成为使得通过了入口侧的层的所述含血液的液体通过与该层相邻的出口侧的层；

在各层中形成有在所述凸部和与之相邻的另外的所述凸部之间的宽度设定为2μm～7.5μm的捕获部、和所述宽度设定为8μm～20μm的旁路部；

以构成所述捕获部的两个所述凸部中的入口侧的入侧部分的宽度朝向所述捕获部的深处逐渐变窄的方式进行倒角；并且

与特定层中的全部或一部分所述旁路部的出口侧对置地配置有作为与该特定层相邻的另外的层的一部分的所述捕获部。

2.根据权利要求1所述的白细胞捕获设备，其中，特定层和与之相邻的另外的层之间的宽度为8μm～30μm。

3.根据权利要求1或2所述的白细胞捕获设备，其中，所述旁路部的宽度相对于捕获部的宽度之比大于1且为3以下。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的白细胞捕获设备，其中，所述凸部的入口侧的端面中的除所述捕获部以外的部分与层方向平行地延伸，并且所述凸部中的构成所述旁路部的端面沿垂直于层方向的方向延伸。