CN115925563B

CN115925563B - 一种可用于靶向肺部递送核酸的脂质分子及其制备方法与应用

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Publication number: CN115925563B
Application number: CN202310174813.1A
Authority: CN
Inventors: 喻国灿; 戚少龙
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2023-02-28
Filing date: 2023-02-28
Publication date: 2023-05-16
Anticipated expiration: 2043-02-28
Also published as: CN115925563A

Abstract

本发明公开了一种肺部靶向的脂质分子及其制备方法以及含该脂质分子的可实现肺部靶向递送的LNP系统。所述肺部靶向的脂质分子的结构式选自下述式（I）至式（V），式中各基团定义详见说明书。将上述肺部靶向的脂质分子添加到基础LNP体系后，可将原本肝脏靶向的LNP递送体系转化为肺部靶向的LNP递送系统。本发明的肺部靶向成分可通过改变季铵盐种类以及疏水链段的种类和数量对其电荷大小和疏水性进行极大范围的调控，能够充分满足靶向肺部递送mRNA的需要。

Description

一种可用于靶向肺部递送核酸的脂质分子及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于医药生物领域，具体涉及一种可用于靶向肺部递送核酸的脂质分子及其制备方法与应用。

背景技术

近年来，核酸（包括DNA和RNA）作为新型制药技术，短时间内在传染性疾病及肿瘤治疗领域取得了突破性进展。然而，如何将核酸分子安全、高效地递送到特定靶细胞并保护其免于降解是目前开发核酸药物及疫苗面临的主要挑战之一。

理想的递送载体必须是安全的、稳定的和器官特异性的。脂质纳米颗粒（LNP）是临床上最先进的核酸载体。截至2021年6月，所有批准临床使用的mRNA疫苗均采用LNP递送系统。LNP为mRNA递送提供了许多好处，包括制剂简单、模块化、生物相容性好和较大的mRNA有效载荷容量。

遗憾的是，目前已不断有相关报道，肌肉注射接种Pfizer/BioNTech和 Moderna的mRNA疫苗可能会诱导肝损伤及免疫性肝炎。部分人群接种mRNA疫苗后也出现了肝功能异常，肝移植病人接种疫苗后产生了极强的免疫反应。即现有的LNP递送系统会导致严重的肝脏蓄积，可能会导致肝损伤或免疫性肝炎，因此当前的LNP递送系统大多是肝脏靶向的，肝脏以外器官（如肺和肾）的有效递送问题亟待解决。

考虑到肺部首当其冲，因此开发出一种肺靶向mRNA递送系统，将编码刺突蛋白的mRNA直接递送至肺部，激活机体产生对应抗体抵御病毒攻击，或将编码广谱中和抗体或者治疗性蛋白的mRNA直接递送至患者的肺部进行治疗。此外，肺靶向mRNA递送系统还可以广泛应用于各类肺部疾病，如对肺癌、肺炎、肺结核、慢性阻塞性肺疾病、肺血栓栓塞症和肺血管炎等进行预防或治疗。

LNP递送系统的理化性质和化学组成可以改变与体液中蛋白质的相互作用。具体而言，通过调控LNP递送系统的电荷属性、粒径分布以及疏水脂质的比例，可以改变LNP在体内的分布情况，从而实现器官靶向性递送。

发明内容

本发明的目的是提供一种可实现靶向递送的脂质分子、其药学上可接受的盐及其立体异构体。

所述可实现靶向递送的脂质分子选自下述式（A）至式（F）中至少一种：

；

利用上述脂质分子制备基础LNP体系后，可得到肝脏靶向的LNP递送系统。

进一步的，将上述脂质分子形成季铵盐（脂质季铵盐分子）后，可得到能实现肺部靶向递送的脂质分子，具体选自下述式（I）至式（V）中至少一种。

将上述肺部靶向递送的脂质分子加入基础LNP体系后，可得到靶向肺部的LNP递送系统。

上述式（I）至式（V）中：

所述X选自卤素原子，X^-选自卤素阴离子，包括氟离子、氯离子、溴离子和碘离子。

所述B¹、B²和B³可以相同或者不同；所述B¹、B²和B³分别与氧原子或氮原子各自独立地形成碳酸酯基、氨基甲酸酯基、酯基、醚键、脲基/酰胺基或胺基中任一种连接基或上述任意两种连接基的组合。

所述L¹、L²、L³可以相同或不同，各自独立地选自C_1-20脂肪烃基、氢或者各种甾族脂质、维生素A、维生素E和维生素K等疏水化合物，且所述式（I）和式（V）中的L¹、L²至多一个为氢，所述式（Ⅱ）至式（Ⅳ）中的L¹、L²、L³至多一个为氢；

所述R¹各自独立地选自C_1-10脂肪烃基。

进一步的，所述O-B¹-L¹的结构为如以下任一通式所示：

所述O-B²-L²的结构为如以下任一通式所示：

所述NH-B¹-L¹的结构为如以下任一通式所示：

所述NH-B²-L²结构为如以下任一通式所示：

所述O-B³-N的结构为如以下任一通式所示：

其中，n表示亚甲基-CH₂的个数，取值范围为0-20之内的整数。

所述NH-B³-N的结构为如以下任一通式所示：

其中n表示亚甲基-CH₂的个数，取值范围为0-20之内的整数。

本发明在脂质骨架的叔胺上通过季铵盐反应将其转化为季胺，使脂质分子由不带电荷的中性分子转化为季铵盐形式的分子，作为肺部靶向成分实现LNP的肺部递送效果。该类脂质季铵盐分子在被添加到LNP体系后，可通过调节LNP的表面电荷和粒径分布，使LNP经静脉注射后在一定时间内富集到肺部，完成对所载mRNA的肺部靶向递送，并实现对肺部细胞的转染。

对于上述L¹，L²，其可为分支或未分支、环状或非环状的、饱和或者不饱和的C_1-20的脂肪烃基、各种甾族脂质、维生素A、维生素E和维生素K等疏水化合物。

优选地，L¹，L²为分支或未分支、环状或非环状的、饱和或者不饱和的C_10-20的脂肪烃基、胆固醇、维生素A、维生素E和维生素K等疏水化合物。

更优选地，L¹，L²为分支或未分支、环状或非环状的、饱和或者不饱和的C_12-18的脂肪烃基、胆固醇、维生素A和维生素E。

进一步优选地，L¹，L²为分支或未分支、环状或非环状的、不饱和的C_12-18的脂肪烃基、胆固醇和维生素E。

最优选地，L¹，L²为分支或未分支、非环状的、不饱和的C_12-18的脂肪烃基或维生素E。

对于上述L³，优选为甲基、乙基，进一步优选为甲基。

对于上述R¹，其可为分支或未分支、环状或非环状的、饱和或者不饱和的C_1-10的脂肪烃基。

优选地，R¹为分支或未分支、非环状的、饱和或者不饱和的C_1-8的脂肪烃基。

最优选地，R¹为分支或未分支、非环状的、饱和的C_1-5的脂肪烃基。

对于O-B³-N结构，其中，n=1-20之内的整数；优选地，n=1-10之内的整数；更优选地，n=1-5之内的整数。

对于卤素阴离子X^-，其可为氟离子、氯离子、溴离子和碘离子。

优选地，X^-为氯离子、溴离子或碘离子。

更优选地，X^-为溴离子和碘离子。

最优选地，X^-为碘离子。

根据本发明的实施例，所述式(I)所示的肺部靶向脂质分子为式(Y1-1)和式（Y1-2）所示脂质分子；所述式(II)所示的肺部靶向脂质分子为式(Y2)所示脂质分子；所述式(III)所示的肺部靶向脂质分子为式(Y3)所示脂质分子；所述式(IV)所示的肺部靶向脂质分子为式(Y4)所示脂质分子；所述式(V)所示的肺部靶向脂质分子为式(Y5)所示脂质分子：

(Y1-1)

(Y1-2)

(Y2)

(Y3)

(Y4)

(Y5)

第二方面，本发明提供了一种上述式(I)至式（V）所示的脂质分子的制备方法。

本发明所提供的式(I)、式(II)和式(III)所示的脂质分子，其中式(I)和式(II)均以三乙醇胺骨架，式(III)骨架为2-羟甲基-1,3-丙二醇。式(I)、式(II)和式(III)的反应位点均为羟基，所涉及的合成方法相同，以下统一进行说明。当以B（B¹、B²和/或B³）与氧原子形成酯键时的制备方法进行举例，包括下述步骤：

（A1）：首先通过脂肪酸与二氯亚砜在碱1的作用下在溶剂1中以一定温度反应一定时间，得到脂肪酰氯；本步骤中所述脂肪酸与式I中的L¹，L²相对应；

（A2）：将步骤（A1）中所获得的脂肪酰氯与三乙醇胺或2-羟甲基-1,3-丙二醇在碱2的作用下在溶剂2中以一定温度反应一定时间，得到具有不同疏水链段的脂质分子。

操作步骤以三乙醇胺举例，2-羟甲基-1,3-丙二醇也可发生类似反应，下文不再对反应式额外说明。

通过控制投料比例和反应顺序，可获得取代基不同的脂质分子。如先获得L¹取代的三乙醇胺或2-羟甲基-1,3-丙二醇衍生物，再逐步获得L¹，L²双取代的三乙醇胺脂质分子或L¹，L²双取代的2-羟甲基-1,3-丙二醇脂质分子。

本发明所提供的式(I)所示的脂质分子，当B（B¹、B²和/或B³）与氧原子形成醚键时的制备方法，包括下述步骤（以下反应方程仅用于方法示意，不限于以下结构，可通过调节投料比例和顺序得到不同取代基种类和不同取代基数量的脂质分子）：

（A3）：将三乙醇胺或2-羟甲基-1,3-丙二醇在氢化钠的作用下在溶剂1中以一定温度反应一定时间，再加入对应的卤代脂肪烃(X-L¹，X代表卤素，如溴代烃)反应一定时间，得到以醚键作为连接基团的脂质分子。

本方法是采用氢化钠合成醚的方法，同类型的反应不再列举；

本发明所提供的式(I)、式(II)、式(III)所示的脂质分子，当B（B¹、B²和/或B³）与氧原子形成碳酸酯或氨基甲酸酯时的制备方法，包括下述步骤（以下反应方程仅用于方法示意，不限于以下结构，可通过调节投料比例和顺序得到不同取代基种类和不同取代基数量的脂质分子）：

（A4）：将骨架三乙醇胺或2-羟甲基-1,3-丙二醇，与活化试剂N,N'-羰基二咪唑或者对硝基苯基氯甲酸酯混合，在溶剂3中反应一段时间，得到羟基被活化的三乙醇胺或2-羟甲基-1,3-丙二醇衍生物；

（A5）：将步骤（A4）得到的羟基被活化的三乙醇胺衍生物或2-羟甲基-1,3-丙二醇衍生物与含有氨基的脂肪烃（L¹-NH₂）反应一定时间，可以得到对应的连接基团为氨基甲酸酯的脂质分子；

或，将步骤（A4）得到的羟基被活化的三乙醇胺衍生物或2-羟甲基-1,3-丙二醇衍生物与含有羟基的脂肪烃（L¹-OH）在碱性环境下加热反应一定时间，可以得到对应的连接基团为碳酸酯的脂质分子。

本发明所提供的式(II)所示的脂质分子的制备方法，包括下述步骤：

（A6）：将式 (I)所示的脂质分子在催化剂1或活化试剂（活化试剂参考步骤（A4），N,N'-羰基二咪唑或者对硝基苯基氯甲酸酯）以及碱3的作用下，与胺类化合物在溶剂4中反应一段时间，将羟基转化为含有胺类基团的结构。

（A7）：由步骤（A2）中所得到的双取代（L¹, L²相同或不同）的2-羟甲基-1,3-丙二醇衍生物，在催化剂1或活化试剂（活化试剂参考步骤（A4），N,N'-羰基二咪唑或者对硝基苯基氯甲酸酯）以及碱3的作用下，与胺类化合物在溶剂4中反应一段时间，将羟基转化为含有胺类基团的结构。

（A8）当骨架为三（2-氨基乙基）胺时（对应式Ⅳ或式Ⅴ的脂质分子），即以B（B¹、B²和/或B³）与氮原子形成酰胺基或胺基时，反应步骤与步骤（A1）-（A3）类似，将三乙醇胺换成三（2-氨基乙基）胺即可，对反应步骤不再重复说明。

（A9）经（A1）至（A8）步骤获得的具有叔胺结构的三乙醇胺脂质分子或2-羟甲基-1,3-丙二醇脂质分子或三（2-氨基乙基）胺脂质分子即为基础LNP递送体系的可电离脂质分子，由这些脂质分子制备得到的基础LNP递送体系可实现肝脏靶向递送核酸分子。

（A10）经（A1）至（A8）步骤获得的具有叔胺结构的三乙醇胺脂质分子或2-羟甲基-1,3-丙二醇脂质分子或三（2-氨基乙基）胺脂质分子后，将所得叔胺分子与卤代烃溶解于溶剂3中，在一定温度下反应一定时间，反应后旋蒸除去溶剂和卤代烃，可获得季铵盐脂质分子，该分子即可作为肺部靶向成分。

可以理解地，步骤（A1）为使用二氯亚砜与不同脂肪酸反应得到对应的酰氯，该反应是普适的，其反应活性及反应过程几乎不受脂肪烃基的影响，反应均可高效进行；

步骤（A2）为步骤（A1）得到的脂肪酰氯与三乙醇胺或2-羟甲基-1,3-丙二醇的反应，其发生在酰氯与羟基之间，同样几乎不受脂肪烃基的种类影响，可高效获得对应的三乙醇胺酯或2-羟甲基-1,3-丙二醇酯。

步骤（A6）及步骤（A7）为三乙醇胺酯或2-羟甲基-1,3-丙二醇酯上的羟基在催化剂的作用下，或通过活化试剂进行活化后，与含有反应位点的胺类化合物反应，反应几乎不受其他基团影响，可高效获得目标脂质分子。

步骤（A10）为卤代烃与叔胺形成季铵盐的反应，该反应高效，能以接近定量的转化率获得目标产物，且产物易于提纯。

上述制备方法具有普适性，适合于不同的脂肪烃链（包括饱和脂肪烃链或者不饱和脂肪烃链），可以得到不同疏水性的季铵盐式脂质分子。

在一实施方式中，步骤（A1）所述包括如L¹定义的基团的脂肪酸和如L²定义的基团的脂肪酸独立地选自上述对应的可选结构。

本发明所述溶剂1、溶剂2、溶剂3、溶剂4均独立地选自二氯甲烷、甲苯、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或四氢呋喃；

碱1、碱2、碱3均独立地选自吡啶、N，N-二甲基甲酰胺、4-二甲氨基吡啶、三乙胺、二乙胺、异丙胺、碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钠或氢氧化钾。

上述方法，步骤(A1)的反应温度为25-120℃，反应时间为1-24h；步骤(A2)的反应温度为0-100℃，反应时间为1-24h；步骤(A3)的反应温度为0-100℃，反应时间为1-24h。

在一实施方式中，溶剂1选自二氯甲烷、甲苯、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或四氢呋喃；优选地，选自二氯甲烷、甲苯或N，N-二甲基甲酰胺；更优选地，选自二氯甲烷或甲苯。

在一实施方式中，碱1选自吡啶、N，N-二甲基甲酰胺、4-二甲氨基吡啶、三乙胺、二乙胺、异丙胺、碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钠或氢氧化钾；优选地，选自吡啶、N，N-二甲基甲酰胺、4-二甲氨基吡啶、三乙胺、二乙胺或异丙胺；更优选地，选自吡啶，N，N-二甲基甲酰胺、三乙胺或异丙胺。

在一实施方式中，步骤（A1）的反应温度为25-120℃；优选地，为25-80℃；更优选地，为25-60℃。

在一实施方式中，步骤（A1）的反应时间为1-24h；优选地，为2-12h；更优选地，为4-6h。

在一实施方式中，溶剂2选自二氯甲烷、甲苯、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或四氢呋喃；优选地，选自二氯甲烷、四氢呋喃或N，N-二甲基甲酰胺；更优选地，选自二氯甲烷或N，N-二甲基甲酰胺。

在一实施方式中，碱2选自吡啶、N，N-二甲基甲酰胺、4-二甲氨基吡啶、三乙胺、二乙胺、异丙胺、碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钠或氢氧化钾；优选地，选自吡啶、N，N-二甲基甲酰胺、4-二甲氨基吡啶、三乙胺、二乙胺或异丙胺；更优选地，选自吡啶、N，N-二甲基甲酰胺、三乙胺或异丙胺。

在一实施方式中，步骤（A2）中的反应温度为0-100℃；优选地，为25-80℃；更优选地，为25-60℃。

在一实施方式中，步骤（A2）的反应时间为1-48h；优选地，为6-24h；更优选地，为6-12h。

在一实施方式中，溶剂3选自二氯甲烷、甲苯、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或四氢呋喃；优选地，选自二氯甲烷、四氢呋喃或N，N-二甲基甲酰胺；更优选地，选自二氯甲烷或N，N-二甲基甲酰胺。

在一实施方式中，步骤（A6）或步骤（A7）中催化剂1选自二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)和1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDCI)、碳鎓六氟磷酸盐（HATU）、N'N-羰基二咪唑（CDI）、对硝基苯基氯甲酸酯、三乙胺、二甲氨基吡啶中的一种或两种；

优选地，选自二环己基碳二亚胺(DCC)、和1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDCI)、碳鎓六氟磷酸盐（HATU）、N'N-羰基二咪唑（CDI）、对硝基苯基氯甲酸酯、三乙胺、二甲氨基吡啶中的一种或两种；

更优选地，选自1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDCI)、N'N-羰基二咪唑（CDI）、对硝基苯基氯甲酸酯、三乙胺、二甲氨基吡啶中的一种或两种。

在一实施方式中，步骤（A6）或步骤（A7）中的反应温度为0-100℃；优选地，为25-80℃；更优选地，为25-60℃。

在一实施方式中，步骤（A6）或步骤（A7）中的反应时间为1-24h；优选地，为6-24h；更优选地，为6-12h。

在一实施方式中，步骤（A8）中的反应温度为0-100℃；优选地，为25-80℃；更优选地，为50-80℃。

在一实施方式中，步骤（A8）的反应时间为1-24h；优选地，为6-24h；更优选地，为12-24h。

第三方面，本发明要求保护一种含有上述肺部靶向成分脂质分子的脂质体。

本发明所提供的脂质体，其原料以质量百分含量计，包含10%-70%式（A）至式（F）所示的可离子化脂质分子、1%-20%聚乙二醇脂质分子、5%-60%甾族脂质、1%-30%辅助脂质分子以及5%-60%的所述肺部靶向递送的脂质分子。

第四方面，本发明要求保护一种含有上述肝脏靶向成分脂质分子的脂质体。

本发明所提供的脂质体，其原料以质量百分含量计，包含10%-70%所述肝脏靶向递送的脂质分子（式（A）至式（F）所示的可离子化脂质分子）、1%-20%聚乙二醇脂质分子、5%-60%甾族脂质以及1%-30%辅助脂质分子。

第五方面，本发明要求保护一种包载核酸药物的肺靶向脂质纳米粒（LNP）。

所述包载核酸药物的肺靶向脂质纳米粒（LNP），包括本发明上述的肺部靶向递送的脂质分子成分、基础LNP体系和核酸药物。

所述核酸药物包括但不限于DNA，mRNA、siRNA、microRNA，反义核酸，环状RNA等。

所述基础LNP体系包括可离子化脂质分子、辅助脂质分子、聚乙二醇脂质以及甾族脂质。

在本发明的具体实施方式中，所述核酸药物可为mRNA，包括不同序列、不同长度的RNA，具体为Firefly Luciferase mRNA。

第六方面，本发明要求保护一种包载核酸药物的肝脏靶向脂质纳米粒（LNP）。

所述包载核酸药物的肝脏靶向脂质纳米粒（LNP），包括本发明上述的含肝脏靶向脂质分子成分的脂质体和核酸药物。

第七方面，本发明要求保护上述包载核酸药物的肝脏靶向脂质纳米粒（LNP）的制备方法。

本发明提供的包载核酸药物的肝脏靶向脂质纳米粒（即肝脏靶向的基础LNP）的制备方法，具体包括下述步骤：

（A1）将所述肝脏靶向递送的脂质分子（可离子化脂质分子）、辅助脂质分子，聚乙二醇脂质、甾族脂质按比例混合，用溶剂溶解，得到有机相脂质体溶液；

（A2）将核酸药物用适当pH的缓冲溶液溶解，得到水相核酸药物溶液；

（A3）将所述有机相脂质体溶液与所述水相核酸药物溶液按照一定的质量比和体积比，用微流控设备均匀混合，制备出包载核酸药物的肝脏靶向脂质纳米粒。

所述方法还包括：对步骤（A3）得到的包载核酸药物的肝脏靶向脂质纳米粒进行超滤或透析，得到可用于生物实验的包载核酸药物的肝脏靶向脂质纳米粒。

第八方面，本发明要求保护上述包载核酸药物的肺部靶向脂质纳米粒（LNP）的制备方法。

本发明提供的包载核酸药物的肺部靶向脂质纳米粒的制备方法，具体包括下述步骤：

（B1）将所述可离子化脂质分子、辅助脂质分子，聚乙二醇脂质、甾族脂质以及肺部靶向成分按比例混合，用溶剂溶解，得到有机相脂质体溶液；

（B2）将核酸药物用适当pH的缓冲溶液溶解，得到水相核酸药物溶液；

（B3）将所述有机相脂质体溶液与所述水相核酸药物溶液按照一定的质量比和体积比，用微流控设备均匀混合，制备出包载核酸药物的肺部靶向脂质纳米粒。

所述方法还包括：对步骤（B3）得到的包载核酸药物的肺部靶向脂质纳米粒进行超滤或透析，得到可用于生物实验的包载核酸药物的肺部靶向脂质纳米粒。

优选地，步骤（A1）或步骤（B1）中用于溶解脂质分子的溶剂为甲醇、乙醇、四氢呋喃、丙酮、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺。更优选地，步骤（A1）或步骤（B1）中用于溶解脂质分子的溶剂为乙醇、四氢呋喃、丙酮。最优选地，步骤（A1）或步骤（B1）中用于溶解脂质分子的溶剂为乙醇。

优选地，步骤（A1）中肝脏靶向递送的脂质分子（可离子化脂质分子）的比例为10%-70%。更优选地，步骤（A1）中可离子化脂质分子的比例为20%-60%。最优选地，步骤（A1）中可离子化脂质分子的比例为50%。

优选地，步骤（A1）中聚乙二醇脂质的比例为1%-20%。更优选地，步骤（A1）中聚乙二醇脂质体的比例为5%-15%。最优选地，步骤（A1）中聚乙二醇脂质体的比例为10%。

优选地，步骤（A1）中甾族脂质的比例为5%-60%。更优选地，步骤（A1）中胆固醇的比例为10%-40%。最优选地，步骤（A1）中胆固醇的比例为30%。

优选地，步骤（A1）中辅助脂质分子的比例为1%-30%。更优选地，步骤（A1）中DSPC的比例为5%-15%。最优选地，步骤（A1）中辅助脂质分子的比例为10%。

优选地，步骤（B1）中可离子化脂质分子的比例为10%-70%。更优选地，步骤（B1）中可离子化脂质分子的比例为20%-40%。最优选地，步骤（B1）中可离子化脂质分子的比例为30%。

优选地，步骤（B1）中聚乙二醇脂质的比例为1%-20%。更优选地，步骤（B1）中聚乙二醇脂质体的比例为1%-10%。最优选地，步骤（B1）中聚乙二醇脂质的比例为5%。

优选地，步骤（B1）中甾族脂质的比例为5%-60%。更优选地，步骤（B1）中胆固醇的比例为10%-40%。最优选地，步骤（B1）中胆固醇的比例为15%。

优选地，步骤（B1）中辅助脂质分子的比例为1%-30%。更优选地，步骤（B1）中DSPC的比例为5%-15%。最优选地，步骤（B1）中辅助脂质分子的比例为8%。

优选地，步骤（B1）中肺部靶向脂质的比例为5%-60%。更优选地，步骤（B1）中肺部靶向脂质的比例为10%-50%。最优选地，步骤（B1）中肺部靶向脂质的比例为42%。

优选地，步骤（A2）或步骤（B2）中缓冲溶液为醋酸/醋酸钠溶液或柠檬酸/柠檬酸钠溶液；最优选地，步骤（A2）或步骤（B2）中缓冲溶液为柠檬酸/柠檬酸钠溶液。

优选地，步骤（A2）或步骤（B2）中缓冲溶液的pH为3-9；更优选地，步骤（A2）或步骤（B2）中缓冲溶液的pH为4-6；最优选地，步骤（A2）或步骤（B2）中缓冲溶液的pH为5。

优选地，步骤（A2）或步骤（B2）中缓冲溶液的浓度为1 mM-1 M；更优选地，步骤（A2）或步骤（B2）中缓冲溶液的浓度为20 mM-500 mM；最优选地，步骤（A2）或步骤（B2）中缓冲溶液的浓度为100 mM。

优选地，步骤（A3）或步骤（B3）中脂质分子与核酸药物的质量比为5:1-50:1；更优选地，步骤（A3）或步骤（B3）中脂质分子与核酸药物的质量比为10:1-30:1。

所述核酸药物为mRNA，优选的，所述脂质分子与mRNA的质量比为25:1。

优选地，步骤（A3）或步骤（B3）中有机相脂质体溶液与水相核酸药物溶液的体积比为1:1-1:10。更优选地，步骤（A3）或步骤（B3）中有机相脂质体溶液与水相核酸药物溶液的体积比为1:1-1:5。最优选地，步骤（A2）或步骤（B2）中有机相脂质体溶液与水相核酸药物溶液的体积比为1:3。

本发明中，所述肺部靶向脂质纳米粒中可离子化脂质分子可与所述肝脏靶向脂质纳米粒中的可离子化脂质分子相同也可不同，选自：

本发明中，所述聚乙二醇脂质选自下述至少一种：2-[(聚乙二醇)-2000]-N ,N-二十四烷基乙酰胺(ALC-0159)、1 ,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇(PEG-DMG)、1 ,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)](PEG-DSPE)、PEG-二甾醇基甘油(PEG-DSG)、PEG-二棕榈油基、PEG-二油基、PEG-二硬脂基、PEG-二酰基甘油酰胺(PEG-DAG)、PEG-二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(PEG-DPPE)或PEG-1 ,2-二肉豆蔻酰基氧基丙基-3-胺(PEG-c-DMA)。

本发明中，所述甾族脂质选自下述至少一种：燕麦甾醇、β-谷甾醇、菜子甾醇、麦角骨化醇、菜油甾醇、胆甾烷醇、胆固醇、粪甾醇、脱氢胆固醇、链甾醇、二氢麦角骨化醇、二氢胆固醇、二氢麦角甾醇、黑海甾醇、表胆甾醇、麦角甾醇、岩藻甾醇、六氢光甾醇、羟基胆固醇；羊毛甾醇、光甾醇、海藻甾醇、谷甾烷醇、谷甾醇、豆甾烷醇、豆甾醇、胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸、脱氧胆酸和石胆酸。

本发明中，所述辅助脂质分子选自：1 ,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1 ,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱 (DPPC)、1 ,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE)、1 ,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺 (DPPE)、1 ,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺 (DMPE)、2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1 '-rac-甘油) (DOPG)、油酰磷脂酰胆碱（POPC）、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺（POPE）。

第九方面，本发明要求保护上述可离子化的脂质分子（肝脏靶向的脂质分子）、脂质季铵盐分子（肺部靶向的脂质分子）以及含肝脏靶向脂质分子的脂质体、含肺部靶向脂质分子的脂质体在制备药物递送系统中的应用。

所述药物为核酸药物，包括但不限于DNA、mRNA、siRNA、microRNA，反义核酸、环状RNA等。

第十方面，本发明要求保护上述可离子化的脂质分子（肝脏靶向的脂质分子）、脂质季铵盐分子（肺部靶向的脂质分子）以及含肝脏靶向脂质分子的脂质体、含肺部靶向脂质分子的脂质体用于RNA递送的方法及其应用。

其中，RNA种类包括但不限于mRNA、siRNA、microRNA，反义核酸等，具体应用包括但不限于诊断性应用和治疗性应用。

本发明的肺部靶向成分可通过改变季铵盐种类以及疏水链段的种类和数量对其电荷大小和疏水性进行极大范围的调控，能够充分满足靶向肺部递送mRNA的需要。

本发明通过季铵盐反应获得肺部靶向脂质分子，将该靶向成分按照一定比例添加到基础LNP体系内后可实现对LNP的电荷和粒径分布，由此可以实现对肺部的靶向递送mRNA。

现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、与mRNA结合紧密，能够实现对mRNA的高包载率和稳定保护。

2、形成的LNP生物相容性好，更加稳定。

3、静脉注射后，能够实现专一性地富集在肺部，而在其他器官中没有分布。

4、该脂质体适合于不同核酸分子量长度，不同核酸序列的mRNA递送，具有普适性。

5、本发明技术合成简单，原料价格低廉，适合大规模生产。

附图说明

图1示出了实施例1制备的阳离子脂质分子（L1-1）结构式。

图2示出了实施例1制备的阳离子脂质分子（L1-1）的¹H NMR谱图。

图3示出了实施例1制备的阳离子脂质分子（L1-1）的¹³C NMR谱图。

图4示出了实施例1制备的阳离子脂质分子（L1-1）的ESI-TOF MS谱图。

图5示出了实施例1制备的肺靶向脂质分子（Y1-1）结构式。

图6示出了实施例1制备的肺靶向脂质分子（Y1-1）的¹H NMR谱图。

图7示出了实施例1制备的肺靶向脂质分子（Y1-1）的¹³C NMR谱图。

图8示出阳离子脂质分子肺靶向脂质分子（Y1-1）的ESI-TOF MS谱图。

图9示出了实施例2制备的阳离子脂质分子（L1-2）结构式。

图10示出了实施例2制备的阳离子脂质分子（L1-2）的¹H NMR谱图。

图11示出了实施例2制备的肺靶向脂质分子（Y1-2）结构式。

图12示出了实施例2制备的肺靶向脂质分子（Y1-2）的¹H NMR谱图。

图13示出了实施例3制备的以(Y1-1)为肺靶向成分的Y1-1-LNP@mRNA的粒径分布（a）和以(Y1-2)为肺靶向成分的Y1-2-LNP@mRNA的粒径分布（b）。

图14示出了实施例3制备的以(Y1-1)为肺靶向成分的Y1-1-LNP@mRNATEM照片（a）和以(Y1-2)为肺靶向成分的Y1-2-LNP@mRNA的TEM照片（b）。

图15示出了实施例3制备的以L1-1制备的基础LNP递送系统L1-1-LNP，和以(Y1-1)为肺靶向成分的Y1-1-LNP@mRNA递送系统的器官靶向效果对比图；数字表示发光强度。

图16示出了实施例3制备的以(Y1-2)为肺靶向成分的Y1-2-LNP@mRNA的肺部靶向效果生物发光成像图，数字表示发光强度。

图17示出了实施例3制备的以(Y1-1)为肺靶向成分的Y1-1-LNP@mRNA的细胞毒性实验。

图18示出了实施例3制备的以(Y1-1)为肺靶向成分的Y1-1-LNP@mRNA的小鼠血液生化指标。

图19示出了实施例3制备的以(Y1-1和Y1-2)为肺靶向成分的LNP@mRNA处理后的小鼠的主要器官H&E染色结果，其中，a为正常小鼠的主要器官H&E染色结果，b为小鼠注射Y1-1为基础制备的肺靶向LNP@mRNA后主要器官H&E染色结果，c为小鼠注射Y1-2为基础制备的肺靶向LNP@mRNA后主要器官H&E染色结果。

图20示出了实施例7制备的以(Y2)前体制备的基础LNP递送系统，和以(Y2)为肺靶向成分的Y2-LNP@mRNA递送系统的器官靶向效果对比图；以及（Y2）和（Y2）前体的结构式；数字表示发光强度。

图21示出了实施例7制备的以(Y3)前体制备的基础LNP递送系统，和以(Y3)为肺靶向成分的Y3-LNP@mRNA递送系统的器官靶向效果对比图；以及（Y3）和（Y3）前体的结构式；数字表示发光强度。

图22示出了实施例7制备的以(Y4)前体制备的基础LNP递送系统，和以(Y4)为肺靶向成分的Y4-LNP@mRNA递送系统的器官靶向效果对比图；以及（Y4）和（Y4）前体的结构式；数字表示发光强度。

图23示出了实施例7制备的以(Y5)前体制备的基础LNP递送系统，和以(Y5)为肺靶向成分的Y5-LNP@mRNA递送系统的器官靶向效果对比图；以及（Y5）和（Y5）前体的结构式；数字表示发光强度。

图24示出了实施例7制备的以（Y1-1前体，Y1-2前体，Y2前体，Y3前体，Y4前体，Y5前体）为组分的基础LNP@mRNA的mRNA包载效率。

图25示出了实施例7制备的以（Y1-1，Y1-2，Y2，Y3，Y4，Y5）为成分的肺靶向LNP@mRNA的mRNA包载效率。

图26示出了实施例7制备的以（Y2前体，Y3前体，Y4前体，Y5前体）为组分的基础LNP@mRNA的平均粒径。

图27示出了实施例7制备的以（Y1-1，Y1-2，Y2，Y3，Y4，Y5）为成分的肺靶向LNP@mRNA的平均粒径。

图28示出了实施例7制备的以（Y2前体，Y3前体，Y4前体，Y5前体）为组分的基础LNP@mRNA的Zeta电位。

图29示出了实施例7制备的以（Y1-1，Y1-2，Y2，Y3，Y4，Y5）为成分的肺靶向LNP@mRNA的Zeta电位。

具体实施方式

I．定义

在本公开中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本公开，下面提供相关术语的定义和解释。

除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

本公开化合物可以是不对称的，例如，具有一个或多个立体异构体。除非另有说明，所有立体异构体都包括，如对映异构体和非对映异构体。本公开的含有不对称碳原子的化合物可以以光学活性纯的形式或外消旋形式被分离出来。光学活性纯的形式可以从外消旋混合物拆分，或通过使用手性原料或手性试剂合成。外消旋体、非对映异构体、对映异构体都包括在本公开的范围之内。

在本公开中，“

”以及“

”是指取代基键合的位置。

术语“任选”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，该描述包括发生所述事件或情况和不发生所述事件或情况。

本文中的数字范围，是指给定范围中的各个整数。例如，“C₁-C₆”是指该基团可具有1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子、4个碳原子、5个碳原子或6个碳原子；“C₃-C₆”是指该基团可具有3个碳原子、4个碳原子、5个碳原子或6个碳原子。

术语“疏水性脂肪烃基”是指不含羟基、醛基、羧基、和含氮的氨基等亲水性基团的脂肪烃基。

术语“被取代的”是指特定原子或基团上的任意一个或多个氢原子被取代基取代，只要特定原子或基团的价态是正常的并且取代后的化合物是稳定的。当取代基为酮基（即=O）时，意味着两个氢原子被取代。除非另有规定，取代基的种类和数目在化学上可以实现的基础上可以是任意的。

当任何变量（例如R_n）在化合物的组成或结构中出现一次以上时，其在每一种情况下的定义都是独立的。因此，例如，如果一个基团被1-5个R所取代，则所述基团可以任选地至多被5个R所取代，并且每种情况下的R都有独立的选项。此外，取代基和/或其变体的组合只有在这样的组合会产生稳定的化合物的情况下才是被允许的。

术语“脂肪烃基”包括饱和或不饱和，直链或支链的链状或环状烃基，不含杂原子的和含有杂原子的脂肪烃基；所述杂原子指的是氮原子、氧原子、氟原子、磷原子、硫原子、和硒原子。所述脂肪烃基的类型可选自烷基、烯基、炔基等。如术语“C_1-6脂肪烃基”包括：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-甲基乙烯基、1-丁烯基、1-乙基乙烯基、1-甲基-2-丙烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、2-甲基-1-丙烯基、2-甲基-2-丙烯基、1-戊烯基、1-己烯基、乙炔基，1-丙炔基，2-丙炔基，1-丁炔基，1-甲基-2-丙炔基，3-丁炔基，1-戊炔基、1-己炔基、环丙基、环丁基、环戊基和环己基等。

术语“烷基”指饱和脂肪族烃基团，包括直链的或支链的饱和烃基，所述烃基具有所示出的碳原子数。如术语“C_1-6烷基”包括C₁烷基、C₂烷基、C₃烷基、C₄烷基、C₅烷基、C₆烷基，实例包括，但不限于，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、2-戊基、3-戊基、正己基、2-己基、3-己基等。其可以是二价的，例如亚甲基、亚乙基。

术语“取代的”或“取代”是指特定原子或基团上的任意一个或多个氢原子被取代基取代，只要特定原子或基团的价态是正常的并且取代后的化合物是稳定的。当取代基为酮基（即=O）时，意味着两个氢原子被取代。除非另有规定，取代基的种类和数目在化学上可以实现的基础上可以是任意的。取代基可以选自以下的一个、两个或更多个取代基取代：氘、卤素基团、氰基、硝基、-C(=O)R、-C(=O)OR’、-OC(=O)R”、酰亚胺基、酰胺基、羟基、经取代或未经取代的胺基、经取代或未经取代的烷基、经取代或未经取代的环烷基、经取代或未经取代的卤代烷基、经取代或未经取代的烷氧基、经取代或未经取代的烯基、经取代或未经取代的炔基、经取代或未经取代的芳基、经取代或未经取代的芳氧基、经取代或未经取代的杂芳基等，但不限于此。

术语“药物组合物”意指包含本公开所述化合物或其药学上可接受的盐，以及依施用方式和剂型的性质而定的至少一种选自以下药学上可接受的成分的组合物，包括但不限于：载体、稀释剂、佐剂、赋形剂、防腐剂、填充剂、崩解剂、润湿剂、乳化剂、悬浮剂、甜味剂、矫味剂、香味剂、抗菌剂、抗真菌剂、润滑剂、分散剂、温敏材料、温度调节剂、黏附剂、稳定剂、助悬剂等。

本公开的药物或药物组合物可以经肠胃外递送，即，通过静脉内（i.v.）、脑室内（i.c.v.）、皮下（s.c.）、腹膜内（i.p.）、肌内（i.m.）、皮下（s.d.）或皮内（i.d.）施用，通过直接注射，经例如快速浓注或连续输液。用于注射的配制剂可以单位剂型呈现，例如在具有添加的保藏剂的安瓿瓶或多-剂量容器中。所述组合物可以采用赋形剂（excipient）的形状，在油或水性载体中的混悬液、溶液或乳液的形式，并可以包含配制试剂如防沉降剂、稳定剂和/或分散剂。备选地，所述活性成分可以以粉末形式在使用前用适宜的载体（例如无菌无热原水）重构。

术语“炎性疾病”包括所述自身免疫、过敏性病症和炎性病症，例如选自关节炎，强直性脊柱炎，炎性肠病，溃疡性结肠炎，胃炎，胰腺炎，克罗恩氏病，乳糜泻，多发性硬化，全身性红斑狼疮，类风湿性关节炎，风湿热，痛风，器官或移植排斥，急性或慢性移植物抗宿主病，慢性同种异体移植物排斥，贝切特氏病，葡萄膜炎，牛皮癣，皮炎，特异性皮炎，皮肌炎，重症肌无力，格雷夫氏病，桥本甲状腺炎，斯耶格伦综合征，和起泡病症(例如寻常天疱疮)，抗体介导的脉管炎综合征，包括ANCA-相关的血管炎，紫癜，和免疫复合血管炎(癌症或感染一期或二期)。所述过敏性病症可尤其选自接触性皮炎，乳糜泻，哮喘，对屋尘螨的超敏性，花粉和相关的过敏原，铍中毒。所述呼吸病症可尤其选自哮喘，支气管炎，慢性阻塞性肺病(COPD)，囊性纤维化，肺水肿，肺栓塞，肺炎，肺肉瘤病，硅肺病，肺纤维化，呼吸衰竭，急性呼吸窘迫综合征，原发性肺动脉高压和肺气肿等。

术语“病毒感染”包括但不限于逆转录病毒感染、肝炎病毒感染、寨卡病毒感染，登革病毒感染等。

II．具体实施例

下面通过实施例对本发明进行具体描述，本实施例只用于对本发明作进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据上述发明的内容做出的一些非本质的改进和调整，均属本发明保护范围。

实施例1：肺部靶向脂质分子（Y1-1）的制备

将油酸溶在甲苯中与二氯亚砜在60℃反应6h，随后真空除去溶剂和二氯亚砜，得到油酰氯。将油酰氯和三乙醇胺溶解在二氯甲烷中，加入三乙胺，过夜反应。得到的反应液经洗涤、干燥和浓缩后用色谱柱分离纯化。通过控制油酰氯与三乙醇胺的比例，获得双取代油酸三乙醇胺酯（L1-1）（图1）。相关表征包括¹H NMR（图2，测试条件：CDCl₃, 400 M, 298.15K）、¹³C NMR（图3，测试条件：CDCl₃, 400 M, 298.15 K）以及ESI-TOF MS（图4），其[M+H]⁺理论值为m/z = 678.6031，测得m/z = 678.6013。

随后将所得到的双取代油酸三乙醇胺酯（L1-1）与碘甲烷在乙腈中于80摄氏度下反应72小时，反应结束后真空除去溶剂和碘甲烷。得到肺部靶向脂质分子（Y1）（图5）。相关表征包括¹H NMR（图6，测试条件：CDCl₃, 400 M, 298.15 K）、¹³C NMR（图7，测试条件：CDCl₃,400 M, 298.15 K）以及ESI-TOF MS（图8），其[M+H]⁺理论值为m/z = 678.6031，测得m/z =678.6013。

实施例2：肺部靶向脂质分子（Y1-2）的制备

将2-正己基癸酸溶在甲苯中与二氯亚砜在60℃反应6h，随后真空除去溶剂和二氯亚砜，得到2-正己基癸酸酰氯。将2-正己基癸酸酰氯和三乙醇胺溶解在二氯甲烷中，加入三乙胺，过夜反应。得到的反应液经洗涤、干燥和浓缩后用色谱柱分离纯化。通过控制2-正己基癸酸酰氯与三乙醇胺的比例，获得双取代2-正己基癸酸三乙醇胺酯（L1-2）（图9）。相关表征包括¹H NMR（图10，测试条件：CDCl₃, 400 M, 298.15 K），其[M-I+H]⁺理论值为m/z =626.6，测得m/z = 626.2。

随后将所得到的双取代2-正己基癸酸三乙醇胺酯与碘甲烷在乙腈中于80摄氏度下反应72小时，反应结束后真空除去溶剂和碘甲烷。得到肺部靶向脂质分子（Y1-2）（图11）。相关表征包括¹H NMR（图12，测试条件：CDCl₃, 400 M, 298.15 K）。

实施例3:基础LNP@mRNA及肺靶向LNP@mRNA的制备

将L1-1（或L1-2）、DSPE-PEG2000、胆固醇以及DOPE按照30%:5%:15%:8%:42%的质量比混合，溶解在乙醇溶液中。mRNA为Firefly luciferase mRNA，用pH为5.0的柠檬酸钠（100mM）缓冲溶液溶解。有机相溶液和水相溶液体积比为1:3，所含脂质与mRNA质量按25:1的比例混合，得到微白色溶液。随后超滤除去乙醇。得到包载mRNA的肝靶向基础LNP@mRNA。

将L1-1、DSPE-PEG2000、胆固醇、DOPE以及Y1-1（或L1-2、DSPE-PEG2000、胆固醇、DOPE以及Y1-2）按照30%:5%:15%:8%:42%的质量比混合，溶解在乙醇溶液中。mRNA为Fireflyluciferase mRNA，用pH为5.0的柠檬酸钠（100 mM）缓冲溶液溶解。有机相溶液和水相溶液体积比为1:3，所含脂质与mRNA质量按25:1的比例混合，得到微白色溶液。随后超滤除去乙醇。得到包载mRNA的肺靶向LNP@mRNA。

使用动态光散射（DLS）和透射电镜（TEM）对所获得的LNP进行粒径分布表征以及形貌表征。DLS结果显示（图13），基于L1-1和Y1-1制备的肺靶向Y1-1-LNP@mRNA的水合粒径为63.8 nm，基于L1-2和Y1-2制备的肺靶向Y1-2-LNP@mRNA的水合粒径为66.5 nm。TEM结果显示（图14），Y1-1-LNP@mRNA（a）和Y1-2-LNP@mRNA（b）均呈球形，粒径为60-100 nm。

实施例4：LNP@mRNA的器官靶向实验

将由实施例3获得的两种肺靶向LNP@mRNA,Y1-1-LNP@mRNA和Y1-2-LNP@mRNA以及基础LNP@mRNA（以Y1-1前体分子为可离子化脂质体），按照每只小鼠5 ug mRNA的剂量对C57BL/6G小鼠经尾静脉给药。6小时后向小鼠腹腔注射底物，随后使用小动物活体荧光成像系统进行生物发光成像（图15，16）。结果显示，基础LNP体系（以Y1-1前体分子为可离子化脂质体）可实现对肝脏的富集，而其他脏器，包括肺部、肾脏、心脏、脾、肠道、胃、肌肉以及骨骼中均未发现富集或表达，肝脏靶向效果显著。

肺靶向递送体系Y1-1-LNP@mRNA和Y1-2-LNP@mRNA均可实现对肺部的靶向递送、富集和表达，且表达效果优异。而其他脏器，包括肝脏、肾脏、心脏、脾、肠道、胃、肌肉以及骨骼中均为发现富集或表达，肺部靶向效果显著。

实施例5：Y1-1-LNP@mRNA的细胞毒性实验

将HEK293细胞接种在96孔板的DMEM培养基（10％胎牛血清和1％青霉素）中。将细胞在37℃下在含有5％CO₂的气氛中孵育。细胞孵育24小时后更换新鲜培养基。加入不同浓度的肺靶向Y1-1-LNP@mRNA（0-200 μg/mL，实施例3制备），将细胞孵育24小时后，用含有0.5mg/mL的3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑（MTT）培养基替换原培养基。继续孵育4小时后，除去含有MTT的培养基，用PBS小心洗涤3次。然后，加入DMSO（100μL），在BioTekSynergy H4读数器中测量在570 nm的波长下吸光度，计算得到24 h的细胞存活率，验证本发明得到的递送体系的细胞毒性。

由图17可见，孵育24 h 后的细胞存活率均在90%以上，表明本发明的肺靶向核酸递送系统具有较低的细胞毒性，展现出了良好的生物安全性能。

实施例6: LNP@mRNA的生物安全性分析

将BALB/c小鼠分为2组，每组5只，BALB/c小鼠(4-6周龄，雌性，体重约18-20 g)，分别经尾静脉注射PBS和LNP@mRNA（10 μg mRNA，Y1-1-LNP@mRNA或Y1-2-LNP@mRNA），注射5天后取小鼠静脉血，离心取上清液，测定肝肾功能各项指标。对注射5天后的PBS和LNP@mRNA组的小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏进行H&E染色，观察其是否出现病变。

肝肾功能指标检测结果显示（图18），Y1-1或Y1-2组小鼠的各项肝肾功能均未出现明显变化，其指标均与PBS相当。组织切片实验结果显示（图19），经LNP@mRNA处理的小鼠的各主要器官均未出现明显的病变，说明LNP@mRNA纳米粒子具有良好的生物安全性。

实施例7: LNP@mRNA的器官靶向实验

使用合成得到的如式（Y2）至式（Y5）所示的季铵盐脂质分子，及其对应的可电离脂质分子前体，分别制备包载mRNA的肺靶向LNP和基础LNP。按照每只小鼠5 ug mRNA的剂量对C57BL/6G小鼠经尾静脉给药。6小时后向小鼠腹腔注射底物，随后使用小动物活体荧光成像系统进行生物发光成像（图20，21，22，,23）。结果显示，基于可电离脂质分子前体的基础LNP体系均可实现对肝脏的富集和表达，而其他脏器，包括肺部、肾脏、心脏、脾、肠道、胃、肌肉以及骨骼中均未发现富集或表达，肝脏靶向效果显著。

在向基础LNP递送体系中添加肺靶向成分后，Y2-LNP@mRNA、Y3-LNP@mRNA、Y4-LNP@mRNA和Y5-LNP@mRNA均可实现对肺部的靶向递送、富集和表达，且表达效果优异。而其他脏器，包括肝脏、肾脏、心脏、脾、肠道、胃、肌肉以及骨骼中均为发现富集或表达，肺部靶向效果显著。

基础LNP递送体系和肺靶向LNP递送体系都实现了对mRNA的高效包载，包载效率军超过93%（图24，25），证明了这些载体优异的包载能力。动态光散射实验（图26，27）证明了基础LNP@mRNA（以Y1-1前体，Y1-2前体，Y2前体，Y3前体，Y4前体，Y5前体为可离子化脂质体）及肺靶向LNP@mRNA（Y1-1，Y1-2，Y2，Y3，Y4，Y5）具有均一的粒径，且平均粒径小于100 nm。Zeta电位实验（图28，29）证明了基础LNP@mRNA（以Y1-1前体，Y1-2前体，Y2前体，Y3前体，Y4前体，Y5前体为可离子化脂质体）的电位小于0 mV，肺靶向LNP@mRNA（Y1-1，Y1-2，Y2，Y3，Y4，Y5）的电位大于0 mV。

前述对本公开的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本公开限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本公开的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本公开的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择。

Claims

1.肺靶向递送的脂质分子，其结构式选自下述式（I）至式（V）中任意所示：

上述式（I）至式（V）中：

所述X选自卤素原子，X^-选自卤素阴离子；

所述B¹、B²和B³相同或者不同；所述B¹、B²和B³分别与氧原子或氮原子各自独立地形成氨基甲酸酯基、酯基、醚键或酰胺基；

所述L¹、L²、L³相同或不同，各自独立地选自C_1-20脂肪烃基、各种甾族脂质；

所述R¹各自独立地选自C_1-10脂肪烃基。

2.根据权利要求1所述的肺靶向递送的脂质分子，其特征在于：

所述O-B¹-L¹的结构为如以下任一通式所示：

所述O-B²-L²的结构为如以下任一通式所示：

所述NH-B¹-L¹的结构为如以下任一通式所示：

所述NH-B²-L²结构为如以下任一通式所示：

所述O-B³-N的结构为如以下任一通式所示：

其中，n表示亚甲基-CH₂的个数，取值范围为0-20之内的整数；

所述NH-B³-N的结构为如以下任一通式所示：

其中n表示亚甲基-CH₂的个数，取值范围为0-20之内的整数。

3.根据权利要求1或2所述的肺靶向递送的脂质分子，其特征在于：

所述L¹，L²，其为分支或未分支、环状或非环状的、饱和或者不饱和的C_1‒20的脂肪烃基、各种甾族脂质；

所述L³为甲基或乙基；

所述R¹，其为分支或未分支、环状或非环状的、饱和或者不饱和的C_1‒10的脂肪烃基；

所述卤素阴离子X^-，其为氟离子、氯离子、溴离子或碘离子。

4.根据权利要求3所述的肺靶向递送的脂质分子，其特征在于：

所述L¹，L²为分支或未分支、环状或非环状的、饱和或者不饱和的C_10‒20的脂肪烃基、胆固醇；

所述R¹为分支或未分支、非环状的、饱和或者不饱和的C_1-8的脂肪烃基。

5.根据权利要求4所述的肺靶向递送的脂质分子，其特征在于：

所述L¹，L²为分支或未分支、环状或非环状的、饱和或者不饱和的C_12‒18的脂肪烃基、胆固醇；

所述R¹为分支或未分支、非环状的、饱和的C_1-5的脂肪烃基。

6.根据权利要求1或2所述的肺靶向递送的脂质分子，其特征在于：所述肺靶向递送的脂质分子选自下述任意结构式所示的脂质分子：

(Y1-1)

(Y1-2)

(Y2)

(Y3)

(Y4)

(Y5)。

7.靶向递送的脂质分子，选自下述式（A）至式（F）中至少一种：

。

8.一种含有肺部靶向脂质分子的脂质体，其原料以质量百分含量计，包含10%-70%权利要求7所述的脂质分子、1%-20%聚乙二醇脂质分子、5%-60%甾族脂质、1%-30%辅助脂质分子以及20%-60%的权利要求1-6中任一项所述的脂质分子。

9.一种含有肝脏靶向脂质分子的脂质体，其原料以质量百分含量计，包含10%-70%权利要求7所述的脂质分子、1%-20%聚乙二醇脂质分子、5%-60%甾族脂质以及1%-30%辅助脂质分子。

10.根据权利要求8或9所述的脂质体，其特征在于：

所述聚乙二醇脂质分子选自下述至少一种：2-[(聚乙二醇)-2000]-N ,N-二十四烷基乙酰胺、1 ,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇、1 ,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)]、PEG-二甾醇基甘油、PEG-二棕榈油基、PEG-二油基、PEG-二硬脂基、PEG-二酰基甘油酰胺、PEG-二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺和PEG-1 ,2-二肉豆蔻酰基氧基丙基-3-胺；

所述甾族脂质选自下述至少一种：燕麦甾醇、β-谷甾醇、菜子甾醇、麦角骨化醇、菜油甾醇、胆甾烷醇、胆固醇、粪甾醇、脱氢胆固醇、链甾醇、二氢麦角骨化醇、二氢胆固醇、二氢麦角甾醇、黑海甾醇、表胆甾醇、麦角甾醇、岩藻甾醇、六氢光甾醇、羟基胆固醇、羊毛甾醇、光甾醇、海藻甾醇、谷甾烷醇、谷甾醇、豆甾烷醇、豆甾醇、胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸、脱氧胆酸和石胆酸；

所述辅助脂质分子选自下述至少一种：1 ,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1 ,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1 ,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1 ,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1 ,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1 '-rac-甘油)、油酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺。

11.一种包载核酸药物的肺靶向脂质纳米粒，包括权利要求1-6中任一项所述的肺靶向递送的、基础LNP体系和核酸药物；

12.一种包载核酸药物的肝脏靶向脂质纳米粒，包括权利要求9所述的含有肝脏靶向脂质分子的脂质体和核酸药物。

13.根据权利要求11或12所述的脂质纳米粒，其特征在于：所述核酸药物包括DNA，mRNA、siRNA、microRNA，反义核酸，环状RNA。

14.权利要求12所述的包载核酸药物的肝脏靶向脂质纳米粒的制备方法，包括下述步骤：

（A1）将权利要求7所述的脂质分子、辅助脂质分子、聚乙二醇脂质、甾族脂质按比例混合，用溶剂溶解，得到有机相脂质体溶液；

（A3）将所述有机相脂质体溶液与所述水相核酸药物溶液用微流控设备均匀混合，制备出包载核酸药物的肝脏靶向脂质纳米粒；

15.权利要求14所述的包载核酸药物的肺部靶向脂质纳米粒（LNP）的制备方法，包括下述步骤：

（B1）将权利要求7所述的脂质分子、辅助脂质分子、聚乙二醇脂质、甾族脂质以及权利要求1-6中任一项所述的脂质分子按比例混合，用溶剂溶解，得到有机相脂质体溶液；

（B3）将所述有机相脂质体溶液与所述水相核酸药物溶液用微流控设备均匀混合，制备出包载核酸药物的肺部靶向脂质纳米粒；

16.根据权利要求14或15所述的制备方法，其特征在于：

所述步骤（A1）或步骤（B1）中用于溶解脂质分子的溶剂为甲醇、乙醇、四氢呋喃、丙酮、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺；

所述步骤（A1）中，所述脂质分子的比例为10%-70%；

所述步骤（A1）中，所述聚乙二醇脂质的比例为1%-20%；

所述步骤（A1）中，所述甾族脂质的比例为5%-60%；

所述步骤（A1）中，所述辅助脂质分子的比例为1%-30%；

所述步骤（B1）中，所述脂质分子的比例为10%-70%；

所述步骤（B1）中，所述聚乙二醇脂质的比例为1%-20%；

所述步骤（B1）中，所述甾族脂质的比例为5%-60%；

所述步骤（B1）中，所述辅助脂质分子的比例为1%-30%；

所述步骤（B1）中，所述权利要求1-6中任一项所述的脂质分子的比例为5%-60%；

所述步骤（A2）或步骤（B2）中缓冲溶液为醋酸/醋酸钠溶液或柠檬酸/柠檬酸钠溶液；

所述步骤（A2）或步骤（B2）中缓冲溶液的pH为3-9；

所述步骤（A2）或步骤（B2）中缓冲溶液的浓度为1 mM-1 M；

所述步骤（A3）或步骤（B3）中，脂质分子与核酸药物的质量比为5:1-50:1；

所述步骤（A3）或步骤（B3）中，有机相脂质体溶液与水相核酸药物溶液的体积比为1:1-1:10。

17.根据权利要求16所述的制备方法，其特征在于：

所述步骤（A1）或步骤（B1）中用于溶解脂质分子的溶剂为乙醇、四氢呋喃、丙酮；

所述步骤（A1）中，所述脂质分子的比例为20%-60%；

所述步骤（A1）中，所述聚乙二醇脂质的比例为5%-15%；

所述步骤（A1）中，所述甾族脂质的比例为10%-40%；

所述步骤（A1）中，所述辅助脂质分子的比例为5%-15%；

所述步骤（B1）中，所述脂质分子的比例为20%-40%；

所述步骤（B1）中，所述聚乙二醇脂质的比例1%-10%；

所述步骤（B1）中，所述甾族脂质的比例为10%-40%；

所述步骤（B1）中，所述辅助脂质分子的比例为5%-15%；

所述步骤（B1）中，所述权利要求1-6中任一项所述的脂质分子的比例为10%-50%；

所述步骤（A2）或步骤（B2）中缓冲溶液为柠檬酸/柠檬酸钠溶液；

所述步骤（A2）或步骤（B2）中缓冲溶液的pH为4-6；

所述步骤（A2）或步骤（B2）中缓冲溶液的浓度为20 mM-500 mM；

所述步骤（A3）或步骤（B3）中脂质分子与核酸药物的质量比为10:1-30:1；

所述步骤（A3）或步骤（B3）中有机相脂质体溶液与水相核酸药物溶液的体积比为1:1-1:5。