CN115887683A - 一种dna四面体及其在抗猪瘟病毒中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种DNA四面体，由DNA单链组成，所述DNA单链包含DNA四面体结构序列，至少一条DNA单链中还包括siRNA结合序列。优选的，在TDN中同时修饰两个不同siRNA，显著增强该分子的抗毒效果，减少因突变引起的病毒逃逸现象，充分展现出了该分子在抗病毒研究中的优势，为病毒的防控提供了新的思路。本发明克服了裸露的siRNA转染效率低，且在细胞中的半衰期极短的缺陷，本发明TDN为siRNA递送载体，显著增强了siRNA的稳定性，提高了siRNA的作用时间。此外，TDN成本低，易合成和改造，便于工业化生产，具有很好的应用前景。

Description

一种DNA四面体及其在抗猪瘟病毒中的应用

技术领域

本发明属于生物材料领域及抗病毒药物领域，尤其涉及DNA四面体及其在抗猪瘟病毒中的应用。

背景技术

猪瘟(CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。CSF可以水平传播，也可以垂直传播，家猪和野猪均极易被感染，猪仔感染CSFV后4周内其死亡率可高达90％，因此CSFV严重威胁着养猪业的经济发展(Blome,S.,et al.,Classical SwineFever-An Updated Review.Viruses,2017.9(4).)。先天性CSFV感染可导致动物持续性感染，使动物体内几乎不产生针对该病毒的特异性抗体，造成诊断上的困难。而持续感染的动物会不断地排出病毒，成为新的猪瘟爆发的潜在源头。此外，受感染的猪肉和猪肉制品也是CSFV的潜在来源。

控制CSFV的策略主要包括系统的预防接种疫苗和非接种疫苗的全部扑杀。2016年，22个国家正式报告了强制疫苗接种运动(OIE WAHIS)。尽管许多国家都在努力消灭CSF，但CSFV仍在南美洲和中美洲的几个国家、东欧部分地区和邻国以及亚洲(包括印度)和非洲部分地区广泛传播。因此，急需制定高效清除CSFV的新方法。随着生物技术的不断发展，转基因猪(TG)的抗毒策略应运而生，此方法可培育出在基因上对CSFV感染有抗性的转基因猪(TG)。2018年，Zicong Xie等人筛选了两个抗病毒shRNA，分别是siRNA-C3和siRNA-C6。随后，通过CRISPR/Cas9介导的敲入策略将这两个shRNA插入猪Rosa26(pRosa26)基因座，产生了抗CSFV的TG猪，最终发现TG猪对病毒感染的抵抗力显著增强(Xie,Z.,et al.,Genetically modified pigs are protected from classical swine fever virus.PLoSPathog,2018.14(12):p.e1007193.)。这一结果说明RNAi技术是抑制病毒复制的有效策略，但转基因猪的生物安全性有待进一步评价(Guzman-Villanueva,D.,et al.,Formulationapproaches to short interfering RNA and MicroRNA:challenges andimplications.J Pharm Sci,2012.101(11):p.4046-66.)。裸露的siRNA在生物系统和液体中通常被一系列核糖核酸酶消化(核糖核酸酶)或由于小而通过肾脏滤过迅速消除，且siRNA具有亲水性和聚阴离子特性，因此细胞对其摄取效率较低(Xue,H.,et al.,DNAtetrahedron-based nanogels for siRNA delivery and gene silencing.Chem Commun(Camb),2019.55(29):p.4222-4225.)，这些特性大大限制了siRNA的应用。因此，迫切需要找到一种合适的递送系统来保护siRNA免受核酸酶的破坏并提高其递送效率。研究发现已经发现多种用于递送siRNA的材料，例如病毒载体，脂质体和聚合物系统，但是这些载体在安全性或尺寸上仍存在一些问题。

DNA四面体(DNA四面体简称TDN，或tFNAs)是一种三维DNA纳米结构，它由四个单链DNA(ssDNA)通过互补碱基配对组装而成，每个ssDNA构成TDN的一个面。在干燥状态下，TDN的高度通常为2-3nm(Kim,K.R.,et al.,Drug delivery by a self-assembled DNAtetrahedron for overcoming drug resistance in breast cancer cells.Chem Commun(Camb),2013.49(20):p.2010-2.)，它的大小适合在动物系统中传递小分子的应用。先前的研究已经报道了DNA纳米结构在生物医学应用中的诸多特性：a)TDN具有出色的生物相容性和生物安全性(Walsh,A.S.,et al.,DNA cage delivery to mammalian cells.ACS Nano,2011.5(7):p.5427-32.)；b)TDN可以通过内吞作用独立渗透细胞膜；c)TDN相对稳定，可以抵抗生物系统中的降解，并在细胞内保持完整至少48小时(Li,J.,et al.,Self-assembledmultivalent DNA nanostructures for noninvasive intracellular delivery ofimmunostimulatory CpG oligonucleotides.ACS Nano,2011.5(11):p.8783-9.)；d)TDN可同时被不同的小分子修饰发挥多重功能(Charoenphol,P.and H.Bermudez,Aptamer-targeted DNA nanostructures for therapeutic delivery.Mol Pharm,2014.11(5):p.1721-5.；Jiang,D.,et al.,Multiple-Armed Tetrahedral DNA Nanostructures forTumor-Targeting,Dual-Modality in Vivo Imaging.ACS Appl Mater Interfaces,2016.8(7):p.4378-84.)。因此，相比于裸露的siRNA，TDN能够更高效稳定的传递siRNA，联合TDN和RNAi技术有潜力成为新型抗病毒策略的候选者。

发明内容

为提高siRNA的稳定性、转染效率、安全性，并增强其作用效果，本发明提供了一种新型递送系统即DNA四面体(TDN，又称tFNAs)。

本发明提供了一种DNA四面体，由DNA单链组成，所述DNA单链包含DNA四面体结构序列，至少一条DNA单链中还包括SiRNA结合序列。

优选的是，所述DNA四面体包含4条DNA单链。每条DNA单链构成分别包含四面体结构序列，每条四面体结构序列用于形成TDN的一个面。所述4条DNA单链中，至少有1条还包括siRNA结合序列。所述siRNA结合序列连接于四面体结构序列的5’或3’端，所述siRNA结合序列用于将siRNA结合于所述DNA四面体。

上述任一项优选的是，所述DNA单链为4条，分别包括Seq ID NO：1、Seq ID NO：2、Seq ID NO：3、Seq ID NO：4所示的DNA四面体结构序列。

上述任一项优选的是，至少两条DNA单链中还包括siRNA结合序列。

上述任一项优选的是，所述siRNA结合序列核苷酸序列如Seq ID NO：5和Seq IDNO：6所示。

上述任一项优选的是，所述DNA四面体由4条DNA单链组成，所述DNA单链的核苷酸序列如Seq ID NO：1、Seq ID NO：2、Seq ID NO：7和Seq ID NO：8所示。

当4条DNA单链如Seq ID NO：1、Seq ID NO：2、Seq ID NO：3、Seq ID NO：4所示的核苷酸序列，4条DNA单链形成DNA四面体，每条DNA单链形成DNA四面体的一个面。当4条DNA单链如Seq ID NO：1、Seq ID NO：2、Seq ID NO：7和Seq ID NO：8所示的核苷酸序列，Seq IDNO：1、Seq ID NO：2以及Seq ID NO：7和Seq ID NO：8包含的DNA四面体结构序列用于形成DNA四面体结构，Seq ID NO：7和Seq ID NO：8包含的siRNA结合序列用于与siRNA结合。

本发明还提供了上述任一项所述的DNA四面体在抗猪瘟病毒中的应用。

本发明还提供了一种用于抗猪瘟病毒的试剂组合，包括权利要求1-5任一项所述的DNA四面体和siRNA。

优选的是，所述siRNA包括siRNA-C3和/或siRNA-C6。

上述任一项优选的是，所述siRNA-C3正义链序列如Seq ID NO：9所示，所述siRNA-C3反义链序列如Seq ID NO：11所示。

上述任一项优选的是，所述siRNA-C6正义链序列如Seq ID NO：10所示，所述siRNA-C3反义链序列如Seq ID NO：12所示。

本发明构建了一种安全、稳定、高效、特异的猪瘟病毒(CSFV)小分子抑制剂，为制备防控CSFV制剂提供有效的候选方案。本发明首先合成结构稳定的DNA四面体(TDN)，并分别修饰一个或同时修饰两个不同的特异靶向CSFV的siRNA，通过检测细胞中病毒的拷贝数或滴度判断处该分子对CSFV的抑制作用。

在本发明一项优选的方案中采用的DNA四面体由表1所示的核酸序列在Tris-HCl(10mM)和MgCl₂·6H₂O(50mM)，pH值调整为8.0的缓冲液中加热至95℃，10分钟，4℃，20分钟退火形成。

表1

本发明具有有益的技术效果：

1)本研究在TDN中同时修饰两个不同siRNA，显著增强该分子的抗毒效果，减少因突变引起的病毒逃逸现象，充分展现出了该分子在抗病毒研究中的优势，为病毒的防控提供了新的思路。

2)裸露的siRNA转染效率低，且在细胞中的半衰期极短，大大限制了其在体内的研究与应用。在本项研究中，本发明以TDN为siRNA递送载体，显著增强了siRNA的稳定性，提高了siRNA的作用时间。此外，TDN成本低，易合成和改造，便于工业化生产，具有很好的应用前景。

附图说明

图1为本发明优选实施例1构建的四面体模式图。

图2为本发明优选实施例1构建的四面体Native-PAGE结果。

图3为本发明优选实施例1构建的四面体分散性。

图4为本发明优选实施例2中qRT-PCR检测t-siRNA转入细胞后的转录水平。

图5为本发明优选实施例2中免疫荧光检测t-C3、t-C6的抗病毒能力。

图6为本发明优选实施例2中qRT-PCR检测PK-15细胞中CSFV的拷贝数。

图7为本发明优选实施例2中免疫荧光检测t-C3-C6的抗病毒能力。

图8为本发明优选实施例2中qRT-PCR检测PK-15细胞中CSFV的拷贝数。

图9为本发明优选实施例2中PK-15细胞中CSFV病毒滴度。

具体实施方式

本发明通过以下实施例进行更加清晰、完整的描述，但所描述的实例仅是本发明一部分实施例，并非全部。所述实施例为帮助理解本发明，不应依此来局限本发明的保护范围。

实施例1

构建siRNA修饰的DNA四面体：

合成如表1所示的ssDNA和siRNA。

合成的ssDNA和siRNA等摩尔溶解于TM缓冲液中(10mmol/L Tris-HCl、50mmol/LMgCl₂,pH 8.0)利用PCR仪加热至95℃，10分钟，4℃，20分钟。Native-PAGE、原子力显微镜(AFM)检测DNA四面体大小和分散性，结果如图1-3所示。

图1为构建连有siRNA-C3、siRNA-C6的DNA四面体(t-C3、t-C6)模式图。如图1所示，实施例1中四面体结构由Seq ID NO：1、Seq ID NO：2以及Seq ID NO：7和Seq ID NO：8构成，siRNA-C3和siRNA-C6连接于所述DNA四面体。其中，Seq ID NO：1、Seq ID NO：2以及Seq IDNO：7和Seq ID NO：8包含的DNA四面体结构序列用于形成DNA四面体结构，Seq ID NO：7和Seq ID NO：8包含的siRNA结合序列用于siRNA-C3和siRNA-C6与所述DNA四面体连接。

图2由Native-PAGE检测TDN大小(其中各泳道中：1:S1(加入1条ssDNA)；2:S1+S2(加入2条ssDNA)；3:S1+S2+S3((加入3条ssDNA))；4:S1+S2+S3L+S4L(加入4条ssDNA，形成完整的DNA四面体)；5:S1+S2+S3L+S4L+siRNA-C3(加入4条ssDNA及1个siRNA，形成连接有一条siRNA-C3的DNA四面体)；6:S1+S2+S3L+S4L+siRNA-C3+siRNA-C6)(加入4条ssDNA及2个siRNA，形成同时连接siRNA-C3和siRNA-C6的DNA四面体)。

图3中，通过原子力显微镜检测TDN的分散性。

实施例2

抗病毒效果检测：

PK-15细胞接种于96孔板中(PK-15，猪肾细胞，为现有技术中公开报道的细胞系，也可购买商业化产品，其培养方法与现有技术中的方法相同)，待细胞融合率为70％左右加入250nmol/L分别连有siRNA-C3、siRNA-C6及siRNA-C3和siRNA-C6的DNA四面体，共孵育24小时后加入200TCID₅₀的CSFV(石门毒株，本发明验证实验所使用的毒株为现有技术中公开报道的毒株)，感染72小时后，细胞用预冷的80％丙酮固定过夜，随后加入1：100稀释后的anti-CSFV的阳性血清(取自CSFV疫苗免疫后猪的外周血制备得到的CSFV抗体，利用免疫后动物的外周血获得血清的方法为现有技术中的常规方法，在此不进行赘述)，最后加入FITC标记的anti-pig IgG，荧光显微镜下观察、拍照。结果如图4-6和图7-9所示。

其中，图4-6显示了t-C3、t-C6的抗CSFV效果检测结果。图4中，qRT-PCR检测t-siRNA转入细胞后的转录水平；图5中，免疫荧光检测t-C3、t-C6的抗病毒能力，带有绿色荧光的细胞为感染CSFV的细胞，与control组相比t-C3、t-C6组带有绿色荧光的细胞数量显著减少，即感染CSFV的细胞显著减少；图6中，qRT-PCR检测PK-15细胞中CSFV的拷贝数。

图7-9显示了t-C3-C6的抗CSFV效果检测结果。图7中，免疫荧光检测t-C3-C6的抗病毒能力，带有绿色荧光的细胞感染CSFV的细胞，与control组相比t-C3-C6组带有绿色荧光的细胞数量显著减少，即感染CSFV的细胞显著减少；图8中，qRT-PCR检测PK-15细胞中CSFV的拷贝数；图9中，PK-15细胞中CSFV病毒滴度。

图中t-siRNA为连接有siRNA的DNA四面体，siRNA为未连接DNA四面体的siRNA，具体的：

t-C3：为序列S1+S2+S3L+S4L+siRNA-C3形成的带有siRNA-C3的DNA四面体。

t-C6：为序列S1+S2+S3L+S4L+siRNA-C6形成的带有siRNA-C6的DNA四面体。

t-C3-C6：为序列S1+S2+S3L+S4L+siRNA-C3+siRNA-C6形成的同时带有siRNA-C3和siRNA-C6的DNA四面体。

t-siNC为序列S1+S2+S3L+S4L+siRNA随机序列形成的，带有随机序列siRNA的DNA四面体，所述随机序列为非猪瘟病毒特异性。随机序列购自苏州吉玛基因股份有限公司普通siRNA oligo/NC。

结果表明，分别连有siRNA-C3、siRNA-C6和同时连有siRNA-C3、siRNA-C6的DNA四面体(TDN)均能降低CSFV对PK-15细胞的感染，但有同时连有siRNA-C3、siRNA-C6的DNA四面体具有更好的抵抗病毒感染的效果。

Claims (10)

1.一种DNA四面体，由DNA单链组成，所述DNA单链包含DNA四面体结构序列，其特征在于，至少一条DNA单链中还包括siRNA结合序列。

2.如权利要求1所述的DNA四面体，其特征在于，所述DNA单链为4条，分别包括Seq IDNO：1、Seq ID NO：2、Seq ID NO：3、Seq ID NO：4所示的DNA四面体结构序列。

3.如权利要求2所述的DNA四面体，其特征在于，至少两条DNA单链中还包括siRNA结合序列。

4.如权利要求3所述的DNA四面体，其特征在于，所述siRNA结合序列核苷酸序列如SeqID NO：5和Seq ID NO：6所示。

5.如权利要求4所述的DNA四面体，其特征在于，所述DNA四面体由4条DNA单链组成，所述DNA单链的核苷酸序列如Seq ID NO：1、Seq ID NO：2、Seq ID NO：7和Seq ID NO：8所示。

6.权利要求1-5任一项所述的DNA四面体在抗猪瘟病毒中的应用。

7.一种用于抗猪瘟病毒的试剂组合，其特征在于，包括权利要求1-5任一项所述的DNA四面体和siRNA。

8.如权利要求7所述的试剂组合，其特征在于，所述siRNA包括siRNA-C3和/或siRNA-C6。

9.如权利要求8所述的试剂组合，其特征在于，所述siRNA-C3正义链序列如Seq ID NO：9所示，所述siRNA-C3反义链序列如Seq ID NO：11所示。

10.如权利要求8所述的试剂组合，其特征在于，所述siRNA-C6正义链序列如Seq IDNO：10所示，所述siRNA-C3反义链序列如Seq ID NO：12所示。

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