CN115855928A - 基于核酸宏阵列和双功能分子的汞离子检测方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于核酸宏阵列和双功能分子的汞离子检测方法，包括：提供核酸宏阵列和信号探针，核酸宏阵列中的固定探针能够特异性地捕获汞离子，信号探针包括金纳米粒子以及修饰在其表面的双功能分子，双功能分子能够特异性地结合汞离子并具有拉曼特征光谱；以固定探针捕捉汞离子；使信号探针与被捕获的汞离子特异性结合，形成汞离子检测体系；通过测试颜色和/或拉曼光谱，实现汞离子的检测。本发明提供的汞离子检测方法利用修饰于金纳米粒子表面的双功能分子既能结合汞离子，又产生拉曼信号的特性，通过核酸固定探针与双功能分子对汞离子的捕获与识别，进而进行显色和/或拉曼检测，对于汞离子的检测更加便捷和灵敏。

Description

基于核酸宏阵列和双功能分子的汞离子检测方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及重金属检测技术领域，尤其涉及一种基于核酸宏阵列和双功能分子的汞离子检测方法及试剂盒。

背景技术

汞离子（Hg²⁺）广泛存在于自然界，是环境中毒性最强的重金属元素之一，即使在低浓度的情况下，对人体的健康也会造成严重的危害。水溶性的汞是一种最常见的且较稳定的存在形式，由于其具有高毒性和生物蓄积性而造成严重的汞污染。所以，具有高灵敏度和高选择性的Hg²⁺微量检测方法实时地检测水生生态系统中Hg²⁺含量对控制环境的污染及保护人类健康具有重大的意义。

有研究人员提出了一种基于巯基DNA修饰的金纳米棒检测Hg²⁺的方法，其原理在于，巯基DNA修饰的金纳米棒能够与Hg²⁺形成T-Hg²⁺-T夹心式结构，从而构建出Cy5核苷酸-金纳米棒荧光共振能量转移体系，最终达成对Hg²⁺的检测。但是本发明人发现，这种方法需要对金纳米粒子表面进行核酸修饰，制备较为困难，且这种方法对于Hg²⁺检测的灵敏度还有待改善。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种核酸宏阵列和双功能分子的汞离子检测方法及试剂盒。

本发明的目的是提供一种快速检测新方法，利用既能络合汞离子，又能作为拉曼信号分子的双功能分子，结合核酸固定探针与汞离子的特异性结合作用，通过形成特定的检测体系达到对汞离子可视化定性检测和表面增强拉曼增敏的定量检测的目的。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

本发明提供一种基于核酸宏阵列和双功能分子的汞离子检测方法，包括：

提供核酸宏阵列和信号探针，所述核酸宏阵列包括以阵列形式排列的多个固定探针，所述固定探针为能够特异性地捕获汞离子的寡核苷酸链，所述信号探针包括金纳米粒子以及修饰于金纳米粒子表面的双功能分子，所述双功能分子为拉曼信号分子并能够与汞离子特异性地结合；

将所述核酸宏阵列与待检测样本接触，以使固定探针捕捉待检测样本中的汞离子；

将捕获汞离子的所述核酸宏阵列与所述信号探针接触，以使所述核酸宏阵列捕获的汞离子与所述信号探针特异性结合，形成汞离子检测体系；

通过测试所述汞离子检测体系的颜色和/或拉曼光谱，实现对所述待检测样本中汞离子的检测。

在一些优选实施方式中，本发明进一步提供改进方案：在对所述汞离子检测体系进行颜色和/或拉曼光谱测试之前，对所述汞离子检测体系进行银染增敏处理；其中，所述银染增敏处理具体包括：

提供银染溶液，所述银染溶液含有1.2 - 1.8 mol/L银离子和0.1 - 0.3 g/mL还原剂；

将所述银染溶液与所述汞离子检测体系接触并进行银沉积反应，从而在所述汞离子检测体系表面沉积银纳米材料。

另一方面，本发明还提供了能够便于应用上述检测方法的试剂盒，包括：

核酸宏阵列，包括以阵列形式排列在固相载体表面的多个固定探针，所述固定探针为能够特异性地捕获汞离子的寡核苷酸链；

信号探针，包括金纳米粒子以及修饰于金纳米粒子表面的双功能分子，所述双功能分子为拉曼信号分子并能够与汞离子特异性地结合。

基于上述技术方案，与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：

本发明提供的汞离子检测方法利用修饰于金纳米粒子表面的双功能分子既能结合汞离子，又产生拉曼信号的特性，通过核酸固定探针与双功能分子对汞离子的识别与捕获进行显色和/或拉曼检测，避免了现有的基于“T-Hg²⁺-T”结构检测汞离子的方法中需要在金纳米粒子表面修饰核酸的缺点，对于汞离子的检测更加便捷和灵敏、准确度更高。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够使本领域技术人员能够更清楚地了解本申请的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。

附图说明

图1是本发明一些典型实施方案提供的汞离子检测方法的原理示意图；

图2是本发明典型实施方案提供的两种汞离子检测方法的检测结果对比示意图；

图3是本发明典型实施方案提供的利用拉曼检测不同浓度汞离子的对应拉曼光谱图；

图4是本发明典型实施方案提供的系列样品根据拉曼信号强度与汞离子浓度建立的标准曲线。

具体实施方式

鉴于现有技术中的不足，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施，因此，本发明的保护范围并不受下面公开的具体实施例的限制。

而且，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个与另一个具有相同名称的部件或方法步骤区分开来，而不一定要求或者暗示这些部件或方法步骤之间存在任何这种实际的关系或者顺序。

参见图1，本发明实施例提供一种基于核酸宏阵列和双功能分子的汞离子检测方法，包括：

提供核酸宏阵列和信号探针，所述核酸宏阵列包括以阵列形式排列的多个固定探针，所述固定探针为能够特异性地捕获汞离子的寡核苷酸链，所述信号探针包括金纳米粒子以及修饰于金纳米粒子表面的双功能分子，所述双功能分子为拉曼信号分子并能够与汞离子特异性地结合。

将所述核酸宏阵列与待检测样本接触，以使固定探针捕捉待检测样本中的汞离子。

将捕获汞离子的所述核酸宏阵列与所述信号探针接触，以使所述核酸宏阵列捕获的汞离子与所述信号探针特异性结合，形成汞离子检测体系。

通过测试所述汞离子检测体系的颜色和/或拉曼光谱，实现对所述待检测样本中汞离子的检测。

现有技术提供了一些利用两个寡核苷酸链配合汞离子形成夹心结构来进行检测的相关技术方案，其中的两个寡核苷酸链的分子量都比较大，具有空间位阻效应，不利于制备以及检测；同时，除了寡核苷酸链引起的空间位阻之外，还有如下的劣势：1. 金纳米粒子表面修饰的核酸与本发明示例所提供的修饰的双功能分子相比，分子量比较大，故双功能分子在金纳米粒子表面修饰的摩尔比例相对较大，在检测过程中与目标物汞离子发生结合的概率也远远大于与核酸中T碱基结合的概率；2. 利用T-Hg²⁺-T的夹心式结构，涉及两段核酸序列的设计，为了避免假阳性的出现以及保证汞离子对于T-Hg²⁺-T结构的有效形成，两段核酸探针中T碱基的数目以及排序的把控比较困难，而本发明中只涉及一段富含T碱基的核酸序列的设计，降低了设计难度，且不易出现假阳性。

上述技术方案中，核酸宏阵列技术是一种将已知序列的寡核苷酸链作为固定探针，固定在一定的固相载体表面制成阵列形式排列的核酸探针，利用碱基互补原理使其与待测样品进行杂交反应，以荧光分子、贵重金属纳米粒子、量子点等作为显色标记物，从而得到需要的分析信号。其中的固相载体并不受任何限制，只要是能够实现阵列式固定探针的载体均可，例如下述实施例中常用的硝酸纤维素膜，且不限于此。且所述阵列是指固定探针阵列排布于载体表面，其排布的图案可以是单独的一片区域，也可以像下述实施例一样，在宏观上排布多块区域，以便于进行系列测试或平行试验。

而一些双功能分子，例如4-巯基吡啶（4-MPY）作为一种拉曼信号分子，其中含有的巯基可以与金纳米粒子通过共价结合，从而稳定地修饰到金纳米粒子表面将其功能化；另一方面，其中的吡啶基团中的N可以通过多价N键与Hg²⁺配位形成Hg-(吡啶)₂络合物，故可以应用于表面增强拉曼方法的汞离子检测中。同时作为固定探针的富含胸腺嘧啶（T）碱基的单链DNA，在Hg²⁺存在时，可以捕获Hg²⁺，最终可以形成T-Hg²⁺-4-MPY的结构，该结构如图1的右上部分所示，此结构稳定性好且特异性强。

其中的金纳米粒子可作为拉曼增强效果的基底，金纳米粒子由于其本身光学特性能够显色，并且可作为表面增强拉曼基底，使双功能分子的拉曼信号大幅度提高。

在Hg²⁺存在时，通过形成稳定的T-Hg²⁺-4-MPY的结构，使固定探针和双功能分子通过汞离子结合，将修饰4-MPY的金纳米粒子捕获在固相载体上，产生以金纳米粒子为显色标记的信号，该信号可以通过肉眼观察或拉曼光谱得以定性或定量的表征测定。

由此，在一些实施方案中，所述双功能分子可以具有吡啶基团以及多个巯基；所述固定探针包含多个T碱基。

在一些实施方案中，所述双功能分子可以包括4-巯基吡啶、2-巯基吡啶、2-巯基-3-吡啶醇中的任意一种或两种以上的组合，当然并不局限于此，满足具有拉曼特征光谱，同时具有配位功能基团，例如吡啶基团以及具有连接金纳米颗粒的功能基团例如巯基的功能分子均可以实现本发明的技术效果。

在一些实施方案中，所述固定探针的核酸序列可以为：5’（Bio）-ttcgcctctctttgtgtttttgctttgtt-3’，也可以为下述实施例所示例的：5’（Bio-ttctcctctctttgtgttattgctttgtt-3’，本发明对固定探针的核酸序列不作限制，现有技术中提供了多种可选择的固定探针的核酸序列，均可以实现对汞离子的选择性吸附，也基于同样的原理，可以实现汞离子的检测，而非限定于本发明所具体列举的几种具体序列。

在一些实施方案中，所述固定探针包含多个T碱基和/或，所述信号探针是通过使含有金纳米粒子和双功能分子的偶联反应体系在2-8 ℃下进行偶联反应5.5 - 6.5 h后获得，所述金纳米粒子的平均粒径可以为25 -30nm，所述金纳米粒子与双功能分子的质量比可以为0.4:1~0.5:1。

而如图1的右侧部分所示，本发明人发现，通过银染增敏处理，在金纳米粒子催化和氢醌的还原作用下的，催化Ag⁺还原为Ag原子在金纳米粒子表面成核，可以增强显色强度和拉曼信号，从而提高检测灵敏度。因而在一些实施方案中，所述汞离子检测方法还可以包括：在进行颜色和/或拉曼光谱的测试前，对所述汞离子检测体系进行银染增敏处理的步骤；所述银染增敏处理使银纳米材料沉积于所述汞离子检测体系的表面。

在一些实施方案中，所述银染增敏处理具体可以包括：使包含银离子以及还原剂的银染溶液与所述汞离子检测体系接触，进行银沉积反应，并可以选择通过洗涤去除所述银染溶液中止所述银沉积反应，以精准的控制反应时间。

在一些实施方案中，其较佳的银染增敏处理的条件优选为：所述银染溶液中的银离子浓度可以为1.2 -1.8 mol/L，还原剂浓度可以为0.1-0.3 g/mL；所述银沉积反应的时间可以为2 -3 min，温度一般在常温下进行，例如15-40℃，优选可以是15-37℃。

在一些实施方案中，所述银染溶液的配制方法可以包括：

将还原剂溶液和还原缓冲溶液在银染增敏处理前25 - 35 min以（2.5 - 3.5）：1的体积比混合后保持35-40℃温育，获得混合溶液，所述原剂溶液中含有浓度为0.05 -0.06 g/mL的氢醌，所述还原缓冲溶液中含有浓度为0.25 - 0.30 g/mL的柠檬酸和浓度为2.3 - 2.4 g/mL的柠檬酸钠；进行所述银染增敏处理时，将混合溶液与硝酸银溶液充分混合后立即使用。

其中，所述的立即使用，表示当混合后观察无不均匀现象，或经过充分震荡判断其混合均匀后，在数秒钟内，例如十秒钟以下，即将配制好的银染溶液与所述汞离子检测体系接触，接触的方式包括但不限于浸泡、喷洒、涂覆等，使其发生银沉积反应。

上述技术方案在前期制备的汞离子检测体系的基础上，通过继续进行沉积一层银层，可实现进一步增敏。通过继续沉积一层银层，一方面使汞离子检测体系上的颜色加深，肉眼观察的检测灵敏度提高；另一方面，由于银纳米材料表面增强拉曼效应比金纳米粒子更强，所以对双功能分子例如4-MPY的拉曼信号进一步地增强，使本检测方法的汞离子定量检测灵敏度也相应提高。

在一些实施方案中，所述信号探针的制备方法具体可以包括：

使胶体金分散液与双功能分子的溶液混合构成偶联反应体系。

在2-8℃下使所述偶联反应体系发生偶联反应5.5 -6.5 h，获得所述信号探针。

在一些实施方案中，所述汞离子检测方法还可以包括：

在将捕获汞离子的所述核酸宏阵列与所述信号探针接触之前，使用洗脱液将未被所述固定探针捕获的游离汞离子洗脱的步骤。

在一些实施方案中，基于颜色的所述汞离子检测方法的定性检测限为0.4 -0.6nmol/L；基于拉曼光谱的所述汞离子检测方法的定性检测限为0.04 -0.06 nmol/L，定量检测限为0.02 -0.03 nmol/L。

作为上述示例性概括的技术方案的一些典型的应用实例，上述汞离子检测方法可以经过如下的具体步骤而得以实施：

（1）核酸宏阵列的制备：

将硝酸纤维素膜（NC膜）裁切成约1.5×1.5 cm大小的片状备用。取3 μL100 μM5’端由生物素修饰固定探针向其中加入3 μL5 mg/mL链霉亲和素和14 μL10mMPBS（PH7.4）混匀后，在室温下，摇床孵育2 h后，用移液枪以0.3 μL每个点的量，点在上述制备好的NC膜片上，每片点五个点均匀对称，之后将点好的阵列放入37℃的烘箱孵育3 h，使固定探针稳固的固定在阵列上，所用固定探针序列为:5’（Bio）-ttcgcctctctttgtgtttttgcttgt-3’。

（2）胶体金与4-巯基吡啶偶联：

每个1.5 mL离心管中分别加入1 mL制备好的胶体金溶液和30 μL浓度为0.1 mol/L的碳酸钾溶液和10 μL浓度为0.1mol/L的4-巯基吡啶溶液，在孵育器上旋转孵育15 min后，取下放置到4℃冰箱内老化6 h，使其充分偶联；偶联完成后将混合物于9000 rpm离心10min，弃上清用灭菌水恢复至原体积的1/10，构成金纳米粒子-4-巯基吡啶复合物，4℃保藏备用。

（3）检测重金属汞离子：

在核酸宏阵列核酸阵列表面分别滴加100 μL各个浓度的Hg²⁺溶液，使得固定探针捕获汞离子，充分反应半小时后，使用洗脱液洗脱去溶液中游离的汞离子，再加入100μL金纳米粒子-4-巯基吡啶复合物反应10 min后用双蒸水冲洗核酸阵列三次即可肉眼观察到显色效果。

（4）对反应后核酸阵列进行银染增敏处理：

在避光的环境下。取上述反应后得到的汞离子检测体系进行银染，所用溶液有AgNO₃、氢醌、柠檬酸，分别为：

a.0.5 gAgNO₃/2 mLH₂O。

b.1.7 g氢醌/30 mLH₂O。

c.2.55 g柠檬酸/2.35 g柠檬酸三钠/10mLH₂O。

b液和c液以3：1的体积比混合，银染时，加入120 μLAgNO₃迅速混匀，立即加入各培养皿中，每个培养皿2 mL，反应一段时间后，直入超纯水，终止反应，并用超纯水反复冲洗，最终得到银染后的核酸宏阵列。

其中，所用固定探针序列可以为：5’（Bio）-ttcgcctctctttgtgtttttgctttgtt-3’；固定探针可以捕获Hg²⁺；胶体金可以偶联4-巯基吡啶；洗脱液的组成可以为10 mMTris-HCl+1%PEG + 1%Tween-20，并可保证洗脱溶液中游离的汞离子；银染增敏处理时，其中的b液和c液两种溶液需新鲜配制，确保无结晶析出且无色，b液和c液以（3000 μL：1000 μL）的体积混合，混合后应在银染前30 min保持37℃温育。

在上述应用实例中，固定于硝酸纤维膜上的探针，最终通过“T-Hg²⁺-4-MPY”的结构，将修饰了4-MPY的金纳米粒子捕获并固定到硝酸纤维膜表面，在汞离子浓度较高、捕获金属纳米粒子量较多情况下实现显色，从而通过肉眼观察可实现定性检测。待目标物浓度较低时，捕获金纳米粒子数目较少，肉眼无法识别，但依赖表面增强拉曼的高灵敏特性，通过在阵列上对4-MPY的拉曼信号进行采集，实现灵敏度的提升与定量检测。

且需说明的是，本发明的重点技术手段在于核酸宏阵列与信号探针（包括其中的双功能分子以及金纳米粒子）的配合，以及进一步地通过银染增敏处理来提高信号强度，而上述核酸宏阵列的制备方法，以及信号探针的具体制备方法，仅作为便于本领域技术人员理解本发明并参照实施所示例性阐述的内容，而并非本发明的关键技术手段，不应理解为对本发明保护范围的限制。

相应的，为便于实现上述检测方法，本发明实施例还可以提供对应于上述方法中所需试剂的试剂盒。

试剂盒相关的试剂种类以及浓度等于上述方法一一对应，在此不再赘述。

可以理解的，本领域技术人员完全可以参照现有技术所公开的多种制备方法，适应性地采取不同于此的制备方法甚至直接商购以获得具有同样功能的核酸宏阵列和/或双功能分子，基于结构决定功能的认知，只要形成了与本发明所提供的技术方案中相同的核酸宏阵列和/或双功能分子的结构，即可具有同样的功能，而不限于具体的制备方法。

以下通过若干实施例并结合附图进一步详细说明本发明的技术方案。然而，所选的实施例仅用于说明本发明，而不限制本发明的范围。

实施例1

本实施例示例一基于核酸宏阵列和双功能分子的汞离子检测过程，其中包含了核酸宏阵列和信号探针的制备过程，具体如下所示：

（1）NC膜上捕获探针的固定：

将购买的硝酸纤维素膜（NC膜）裁切成约1.5×1.5 cm大小的片状备用。固定探针的5’端由生物素修饰，与链霉亲和素（SAV）偶联过程如下：取3 μL100 μM固定探针向其中加入3 μL5 mg/mL链霉亲和素和14 μL10 mMPBS（pH值7.4）混匀后，在室温（室温通常是指25-35℃，下同）下，摇床孵育2 h后，然后充分振荡混匀，即可用于制备核酸宏阵列。将上述制备好的固定探针与链霉亲和素的混合溶液用移液枪以0.3 μL每个点的量，点在上述制备好的NC膜片上，每片点五个点均匀对称，形成阵列形式，之后将点好的阵列放入37℃的烘箱孵育3 h，使固定探针稳固的固定在阵列上。然后，取出放于室温，待用。

所用固定探针的序列为:

5’（Bio）-ttcgcctctctttgtgtttttgctttgtt-3’。

（2）胶体金分散液的制备：

所用的玻璃仪器都先用强酸浸泡，双蒸水清洗干净后，烘箱烘干备用；锥形瓶中装入约三分之二的去离子水和搅拌子，在加热磁力搅拌器上煮沸，然后，倒出里面的沸水，待瓶子冷却后，反复几次后即可制备金纳米粒子。制备时，向洁净的锥形瓶中加入150 mL双蒸水和2.55 mL质量分数为0.5%的氯金酸溶液，中速搅拌，加热至微微沸腾时加入质量浓度为1%的柠檬酸三钠溶液3 mL，边加热维持沸腾边搅拌，溶液颜色最终变为酒红色，当颜色不再变化后关闭加热搅拌5 min使反应充分完全；最后制得胶体金分散液，4℃保藏。

（3）信号探针的制备：

每个1.5 mL离心管中分别加入1 mL制备好的胶体金分散液和30 μL浓度为0.1mol/L的碳酸钾溶液混合均匀，再加入10 μL浓度为0.1 mol/L的4-巯基吡啶溶液再次搅拌均匀，在孵育器上旋转孵育15 min后，取下放置到4℃冰箱内老化6 h，使其充分偶联；偶联完成后将混合物于9000 rpm离心10min，弃上清用灭菌水恢复至原体积的1/10，构成金纳米粒子-4-巯基吡啶复合物，4℃保藏备用。

（4）重金属汞离子的检测：

Hg²⁺标准样品制备：从安瓿瓶中准确量取10 mL浓样水质汞于250 mL容量瓶中，用3%硝酸稀释定容至刻度得到11.7 ng/mL的Hg²⁺标准溶液，再用水将标准溶液稀释到各个待检测浓度以备用于检测；在核酸宏阵列核酸阵列表面分别滴加100 μL各个浓度的Hg²⁺溶液，使得固定探针捕获汞离子，充分反应半小时后，使用洗脱液（10 mM Tris-HCl+1%PEG+1%Tween-20）洗脱去除溶液中游离的汞离子，再加入100 μl金纳米粒子-4-巯基吡啶复合物反应10 min后用双蒸水冲洗核酸阵列三次即可肉眼观察到显色效果，其变色效果如图2中的第一行所示。

激光器照射阵列上显色阵列，采集4-MPY相应的拉曼信号图谱，如图3所示，分析其特征峰处拉曼信号强度与对应汞离子浓度关系，并建立线性关系，完成定量检测。重点检测其中的4-巯基吡啶的特征峰强度，绘制标准曲线，如图4所示，然后测定将待测样品采取步骤（4）中同样的方法进行测试，然后即可基于上述标准曲线来计算样品中的汞离子含量。

实施例2

本实施例在实施例1的基础上，进一步示例一种灵敏性更强的汞离子检测方法，具体如下所示：

在实施例1的步骤（4）之后，进一步增加下述步骤：

（5）银染增敏：

在避光的环境下。取上述反应后得到的检测体系进行银染，所用溶液有三种：

a.0.5 gAgNO₃/2 mL H₂O;

b.1.7 g氢醌/30 mL H₂O;

c.2.55 g柠檬酸/2.35 g柠檬酸三钠/10 mL H₂O。

后两种溶液需现配现用，确保无结晶析出且无色，b液和c液以（3000 μL：1000 μL）的体积混合，混合后应在银染前30 min保持37℃温育，银染时，加入120 μLAgNO₃迅速混匀，立即加入各培养皿中，每个培养皿2 mL，反应150秒后，置入超纯水，终止反应，并用超纯水反复冲洗，最终得到银染增敏处理后的检测体系。

（6）拉曼检测：

激光器照射检测体系上的显色区域，采集4-MPY相应的拉曼信号图谱，分析其特征峰处拉曼信号强度与对应汞离子浓度关系，并建立线性关系，完成定量检测。

并且，本实施例中，肉眼可见的变色效果如图2中的第二行所示，明显可以知晓，经过银染增敏处理后，不仅拉曼测试的灵敏度得以显著提升，肉眼可见的颜色特征也具有显著提升。

实施例3

本实施例与实施例1大体相同，区别仅在于：

将双功能分子替换为2-巯基-3-吡啶醇。

将固定探针的序列替换为5’（Bio）-ttctcctctctttgtgttattgctttgtt-3’。

将硝酸纤维素膜替换为Whatman定性滤纸。

由此制备得到的核酸宏阵列和信号探针采用实施例1中的步骤（4）同样的方法进行汞离子的检测，依然具有同样的变色能力和拉曼光谱的响应性，只不过由于双功能分子的替换，其拉曼光谱的曲线形状发生了改变以及特征峰发生了位移而已。

实施例4

本实施例在实施例3的基础上，进一步示例一种灵敏性更强的汞离子检测方法，具体如下所示：

采用与实施例2同样的步骤（5）和步骤（4），继续在实施例3的基础上进一步银染增敏处理。

与实施例2相似，在实施例3的基础上进一步银染增敏处理后，其颜色变化更加明显，且其拉曼光谱的特征峰的强度也更高，这意味着即使采用了不同分子结构的固定探针和双功能分子，只要其具有一致的结构特征和功能性特征，经过银染增敏处理后的检测灵敏度同样能够得以提升。

实施例5

本实施例亦示例一种汞离子的检测方法，与实施例3大体相同，区别仅在于：

在制备信号探针过程中，增大了双功能分子的浓度，使用浓度为0.2 mol/L。

由此制备得到的信号探针，由于胶体金表面活性位点有限，即使使用更高浓度的双功能分子，胶体金表面标记的双功能分子不会有明显的增加，继续采用实施例3中的步骤（4）同样的方法进行汞离子的检测，依然具有同样的变色能力和拉曼光谱的响应性，并且相同条件下，拉曼信号不会有明显的增强，说明采用浓度为0.1 mol/L的信号分子已经完全满足需求，更高的浓度仍然可以实现本发明的技术效果，只是会造成一定的浪费而已。

实施例6

本实施例在实施例5的基础上，进一步示例一种灵敏性更强的汞离子检测方法，具体如下所示：

采用与实施例4同样的步骤（5）和步骤（4），继续在实施例5的基础上进一步银染增敏处理。

与实施例4相似，在实施例5的基础上进一步银染增敏处理后，其颜色变化更加明显，且其拉曼光谱的特征峰的强度也更高，这意味着即使提高了双功能分子的浓度，也不会影响银染增敏处理后的检测灵敏度。

实施例7

本实施例仍然示例一汞离子的检测方法，与实施例6大体相同，区别仅在于：

步骤（4） 中，汞离子标准品替换为含有相同浓度汞离子的自来水样本。

在该检测环境下，由于汞离子与T碱基以及双功能信号分子的特异性结合，不受自来水中其他成分的干扰，仍旧能够实现同样的变色能力和拉曼光谱的响应性。

实施例8

本实施例在实施例7的基础上，进一步示例一种灵敏性更强的汞离子检测方法，具体如下所示：

采用与实施例4同样的步骤（5）和步骤（4），继续在实施例7的基础上进一步银染增敏处理。

与实施例4相似，在实施例7的基础上进一步银染增敏处理后，其颜色变化更加明显，且其拉曼光谱的特征峰的强度也更高，这意味着即使被测样品为成分较复杂的汞离子样本，经过银染增敏处理后的检测灵敏度同样能够得以提升。

对比例1

本对比例与实施例1大体相同，区别主要在于：

步骤（2）和步骤（3）中，信号探针并未由胶体金分散液参与反应，而是直接以同样浓度的4-巯基吡啶溶液作为信号探针的溶液。

即：本实施例缺失了金纳米粒子对于拉曼信号强度的增强作用。

与此同时，没有了金纳米颗粒的显色作用，显然，无法通过肉眼观察颜色改变来确定是否含有汞离子了。

并且，按照同样的方法，在同样的汞离子浓度下，本对比例所测得的拉曼信号的特征峰强度仅仅为实施例1的1/10⁵，该信号强度显著弱于实施例1，这说明金纳米粒子对于拉曼信号的增强具有非常重要的作用。

对比例2

本对比例与实施例1大体相同，区别主要在于：金纳米粒子表面未设置双功能分子。

在此条件下，没有了双功能分子的桥梁作用，胶体金不能被捕获到膜表面，膜表面无法显色，显然，不能通过肉眼观察颜色改变来确定是否含有汞离子了。

并且，按照同样的方法，在同样的汞离子浓度下，本对比例中没有信号分子，所以也测不到相应的拉曼图谱，说明双功能分子对于信号的产生具有关键的作用。

对比例3

本对比例与实施例1大体相同，区别主要在于：未包括固定探针。

在没有固定探针的条件下，膜表面失去了捕获汞离子的能力，进而无法捕获修饰了双功能分子的胶体金，膜表面不能显色，不能通过肉眼观察判定被测样本中是否含有汞离子，也测不到拉曼光谱，所以，固定探针对于本方案中汞离子的检测至关重要。

对比例4

本对比例与实施例1大体相同，区别主要在于：用银纳米粒子代替胶体金与双功能分子结合。

步骤（2）中，玻璃仪器洗干净后，首先将30 mL 1mmol/L硝酸银水溶液、0.04 g柠檬酸钠、0.02 g聚乙烯吡咯烷酮和30 mL聚乙二醇加入装有磁力搅拌子的玻璃器皿，在40℃水浴中加热搅拌30 min，使药品充分混合。随后，边搅拌，边慢慢滴加30 mL 2 mmol/L的硼氢化钠，最后溶液逐渐由乳白色逐渐变为土黄色，获得所需银纳米粒子溶液，放置在4 ℃进行保存备用。随后采用与实施例1中同样的步骤（3）和步骤（4），并在步骤（3）中将胶体金替换为制备的银纳米粒子。

直接利用银纳米粒子的条件下，依旧可以进行显色，并能够实现同样的变色能力和拉曼光谱的响应性。但是，银纳米粒子易氧化，制备过程中容易导致不规则的颗粒的形成，影响信号探针制备的均一性；此外，已经制备完成的银纳米粒子由于其不稳定性，容易影响检测的重复性，所以，优选稳定的金纳米粒子制备信号探针。

对比例5

本对比例与实施例1大体相同，区别主要在于步骤（5）银染增敏所需的体系替换为传统的银镜反应体系：

a液：硝酸银 3.5 g

氢氧化铵适量在（滴加至由浑浊到透明即可）

氢氧化钠 2.5 g/100 Ml

蒸馏水60 mL

b液：葡萄糖 45 g

酒石酸4 g

乙醇100 mL

蒸馏水1000 mL

使用时，按a:b=1:1混合，反应温度为10~15℃，反应150秒后，置入超纯水，终止反应，并用超纯水反复冲洗，最终得到银染增敏处理后的检测体系。

利用这种传统化学镀银的方法，反应过程中没有像实施例1中c液（2.55 g柠檬酸/2.35 g柠檬酸三钠/10 mL H₂O）提供稳定的缓冲体系，并且葡萄糖还原性较强使还原反应进行比较快速，不能保证还原反应特异性发生在具有较高活性的胶体金表面，加之膜基质具有较强的吸附性能，会使银层非特异性地镀在整个膜上，而非特异性沉积在阵列上，使得整个膜上都沉积一层银，而非阵列形式，所以最终导致难以对汞离子进行精确检测。

测试例1

采用实施例1-实施例8及对比例1-对比例5的方法对于一种含汞废水进行检测，结果如下表1所示。

表1实施例1-实施例8及对比例1-对比例5方法对含汞废水的检测结果

基于上述实施例以及对比例，可以明确，本发明实施例提供的汞离子检测方法利用修饰于金纳米粒子表面的双功能分子既能结合汞离子，又产生拉曼信号的特性，通过核酸固定探针与双功能分子对汞离子的识别与捕获进行显色和/或拉曼检测，避免了传统的基于“T-Hg²⁺-T”结构检测汞离子的方法中金纳米粒子表面核酸的修饰，对于汞离子的检测更加便捷和灵敏。

应当理解，上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于核酸宏阵列和双功能分子的汞离子检测方法，其特征在于，包括：

提供核酸宏阵列和信号探针，所述核酸宏阵列包括以阵列形式排列的多个固定探针，所述固定探针为能够特异性地捕获汞离子的寡核苷酸链，所述信号探针包括金纳米粒子以及修饰于金纳米粒子表面的双功能分子，所述双功能分子为拉曼信号分子并能够与汞离子特异性地结合；

将所述核酸宏阵列与待检测样本接触，以使固定探针捕捉待检测样本中的汞离子；

将捕获汞离子的所述核酸宏阵列与所述信号探针接触，以使所述核酸宏阵列捕获的汞离子与所述信号探针特异性结合，形成汞离子检测体系；

通过测试所述汞离子检测体系的颜色和/或拉曼光谱，实现对所述待检测样本中汞离子的检测。

2.根据权利要求1所述的汞离子检测方法，其特征在于：所述固定探针包含多个T碱基；和/或，所述信号探针是通过使含有金纳米粒子和双功能分子的偶联反应体系在2-8 ℃下进行偶联反应5.5 - 6.5 h后获得，其中金纳米粒子与双功能分子的质量比为0.4:1~0.5:1；和/或，所述金纳米粒子的粒径为25 - 30 nm；和/或，所述双功能分子包括4-巯基吡啶、2-巯基吡啶、2-巯基-3-吡啶醇中的任意一种或两种以上的组合。

3.根据权利要求1所述的汞离子检测方法，其特征在于还包括：在将捕获汞离子的所述核酸宏阵列与所述信号探针接触之前，使用洗脱液将未被所述固定探针捕获的游离汞离子洗脱。

4.根据权利要求1所述的汞离子检测方法，其特征在于，还包括：在对所述汞离子检测体系进行颜色和/或拉曼光谱测试之前，对所述汞离子检测体系进行银染增敏处理；其中，所述银染增敏处理具体包括：

提供银染溶液，所述银染溶液含有1.2 - 1.8 mol/L银离子和0.1 - 0.3 g/mL还原剂；

将所述银染溶液与所述汞离子检测体系接触并进行银沉积反应，从而在所述汞离子检测体系表面沉积银纳米材料。

5.根据权利要求4所述的汞离子检测方法，其特征在于；所述银沉积反应的温度为15-40℃、时间为2 - 3 min。

6.根据权利要求4所述的汞离子检测方法，其特征在于包括：

提供还原剂溶液和还原缓冲溶液，所述还原剂溶液含有浓度为0.05-0.06 g/mL的氢醌，所述还原缓冲溶液含有浓度为0.25-0.30 g/mL的柠檬酸和浓度为2.3 -2.4 g/L的柠檬酸钠；

在进行所述银染增敏处理之前的25-35 min内，将所述还原剂溶液和还原缓冲溶液以（2.5-3.5）：1的体积比混合后保持35-40℃温育，获得混合溶液；

在需要进行所述银染增敏处理时，将所述混合溶液与硝酸银溶液充分混合以形成所述银染溶液。

7.根据权利要求1所述的汞离子检测方法，其特征在于，具体包括：

若通过测试所述汞离子检测体系颜色的方式对所述待检测样本中的汞离子进行检测，则相应的定性检测限为0.4-0.6 nmol/L；

而若通过测试所述汞离子检测体系的拉曼光谱的方式对所述待检测样本中的汞离子进行检测，则相应的定性检测限为0.04 -0.06 nmol/L、定量检测限为0.02 -0.03 nmol/L。

8.一种基于核酸宏阵列和双功能分子的检测试剂盒，其特征在于包括：

核酸宏阵列，包括以阵列形式排列在固相载体表面的多个固定探针，所述固定探针为能够特异性地捕获汞离子的寡核苷酸链；

信号探针，包括金纳米粒子以及修饰于金纳米粒子表面的双功能分子，所述双功能分子为拉曼信号分子并能够与汞离子特异性地结合。

9.根据权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于：所述固定探针包含多个T碱基和/或，所述信号探针是通过使含有金纳米粒子和双功能分子的偶联反应体系在2-8 ℃下进行偶联反应5.5 - 6.5 h后获得，其中金纳米粒子与双功能分子的质量比为0.4:1~0.5:1；和/或，所述金纳米粒子的粒径为25 - 30 nm；和/或，所述双功能分子包括4-巯基吡啶、2-巯基吡啶、2-巯基-3-吡啶醇中的任意一种或两种以上的组合。

10.根据权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括银染溶液，所述银染溶液含有1.2 - 1.8 mol/L银离子和0.1 - 0.3 g/mL还原剂。

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