CN115820632B

CN115820632B - 抑制ascc3表达的小干扰rna及其在抑制膀胱癌转移中的应用

Info

Publication number: CN115820632B
Application number: CN202210974321.6A
Authority: CN
Inventors: 张思铭; 沈爱国; 朱颖; 顾春燕
Original assignee: Nantong Tumor Hospital
Current assignee: Nantong Tumor Hospital
Priority date: 2022-08-15
Filing date: 2022-08-15
Publication date: 2023-07-18
Anticipated expiration: 2042-08-15
Also published as: CN115820632A

Abstract

本发明提供了抑制ASCC3表达的小干扰RNA及其在抑制膀胱癌中的应用，属于分子生物技术与基因工程领域。通过在细胞中转染该小干扰RNA，能调控和干扰ASCC3基因表达，降低细胞克隆形成能力，抑制细胞伤口愈合和侵袭；通过抑制ASCC3基因表达的小干扰RNA，可以降低ASCC3的表达，有效抑制膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭，为膀胱癌治疗提供了一个新的药物靶点，具备很高的实际临床应用的价值。

Description

抑制ASCC3表达的小干扰RNA及其在抑制膀胱癌转移中的应用

技术领域

本发明涉及分子生物技术与基因工程领域，具体而言，涉及抑制ASCC3基因表达的小干扰RNA及其在抑制膀胱癌转移中的应用。

背景技术

膀胱癌是世界范围内的主要公共卫生问题，也是最具侵袭性的恶性肿瘤之一。尽管近年来已经取得了相当大的诊断和治疗进展，但由于转移和侵袭率高，膀胱癌患者的预后仍然很差。研究转移和侵袭相关基因对膀胱癌细胞增殖和转移的作用，对改善膀胱癌患者的预后都有重要理论意义和应用价值。有研究发现应用RNAi技术可以特异性地向哺乳动物和人类的细胞中导入小干扰RNA来降低靶基因的表达，进而引起靶蛋白的表达下降，达到高效特异性的基因治疗作用。然而如何应用RNAi技术来抑制ASCC3基因的表达还鲜有报道。

发明内容

本发明的目的在于提供了抑制ASCC3基因表达的小干扰RNA及其在抑制膀胱癌转移中的应用，本发明提供干扰ASCC3基因表达的小干扰RNA，通过在细胞中转染该小干扰RNA，能调控和干扰ASCC3基因表达，降低细胞克隆形成能力，抑制细胞伤口愈合和侵袭等。

具体的，本发明的技术方案如下：

本发明第一个方面公开了一种干扰ASCC3基因表达的小干扰RNA，所述小干扰RNA包括小干扰RNA1、小干扰RNA2和小干扰RNA3中的一种或任意组合；所述小干扰RNA1、RNA2和RNA3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示。

在本发明的一些优选实施例中，小干扰RNA1的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，SEQID NO.1：5’ GCCTGACATGGAAGAAGATAA 3’。阴性对照序列为：3’ TTCTCCGAACGTGTCACGT5’（SEQ ID NO.4）。

小干扰RNA2的碱基序列如SEQ ID NO.2所示, SEQ ID NO.2 ：5’GAAGAAGTGGCTGACTTAAAG 3’。阴性对照序列为： 3’ TTCTCCGAACGTGTCACGT5’ （SEQ IDNO.5）。

小干扰RNA3的碱基序列如SEQ ID NO.3所示，SEQ ID NO.3 ：5’GCGATCTAAACTTCATGAACA 3’。阴性对照序列为： 3’ TTCTCCGAACGTGTCACGT 5’ （SEQ IDNO.6）。

本发明第二个方面公开了上述的干扰ASCC3基因表达的小干扰RNA在干扰ASCC3基因表达中的应用。

本发明第三个方面公开了上述的干扰ASCC3基因表达的小干扰RNA具有如下应用：a）在制备降低细胞克隆形成能力产品中的应用；

b）在制备抑制细胞伤口愈合产品中的应用；

c）在制备抑制细胞侵袭相关基因表达产品中的应用。

本发明第四个方面公开了一种抑制ASCC3基因表达或用于抑制癌症转移的药物，所述药物包括权利要求1所述的小干扰RNA。

优选的，所述癌症为膀胱癌。

本发明第五个方面公开了上述的小干扰RNA在用于制备治疗用于抑制癌症转移中的应用。

本发明第六个方面公开了一种干扰ASCC3基因表达的方法，包括以下步骤：

S1：用不含血清的培养基稀释如权利要求1所述的干扰ASCC3基因表达的小干扰RNA，得到小干扰RNA溶液；用不含血清的培养基稀释脂质体，得到脂质体溶液；将所述小干扰RNA溶液和所述脂质体溶液混合，得到脂质体-小干扰RNA复合物溶液；

S2：在培养板中进行细胞培养，当细胞覆盖40％-60％的板底时，吸弃培养基，用无血清的DMEM培养基清洗；加入无血清培养基和所述脂质体-小干扰RNA复合物溶液培养转染；吸弃所述无血清培养基，加入含有胎牛血清的DMEM培养基培养；

S3：收集细胞并检测ASCC3基因表达。

优选的，在培养板中进行细胞培养时，所述细胞的密度为0.5×10⁵-2×10⁵个/mL。

优选的，将所述小干扰RNA溶液和所述脂质体溶液混合的时间为10-20min。

优选的，加入所述脂质体-小干扰RNA复合物溶液培养转染的时间为18-48h，转染温度为35-38℃。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明发现了一种新的可用于抑制ASCC3基因表达的小干扰RNA，通过降低ASCC3的表达，可以有效抑制膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭，为膀胱癌治疗提供了一个新的药物靶点，具备很高的实际临床应用的价值。

附图说明

图1为本发明实施例中小干扰RNA对ASCC3基因表达影响的蛋白表达量结果示意图。

图2为本发明实施例中细胞克隆数的示意图。

图3为本发明实施例中细胞迁移和侵袭的示意图。

图4为本发明实施例中划痕实验的结果示意图。

图5为本发明实施例中流式细胞仪检测的结果示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。

实施例1

一、ASCC3小干扰片段的构建及其鉴定方法，包括：

1：细胞培养条件及培养基：膀胱癌5637细胞株用含 10％胎牛血清的 RPMI 1640（HyClone SH30809.01）培养在 5％CO₂， 37℃的培养箱中。

2：细胞转染：按说明书将 RNAoligo 稀释成20uM溶液待用；将细胞消化后，铺在 6孔板中，当细胞密度汇合到 30-50%时进行转染；准备三个无菌1.5mL 的 EP 管，分别在三个 EP 管中加入 OPTI-MEM 200ul 和对应的siRNA-1、 siRNA-2、siRNA-3及阴性对照 RNA溶液 5μL，快速涡旋 10s 使其完全混匀；再分别向3个EP 管中加入 6μL siRNA-Mate 转染试剂，室温静置 10min，使siRNA 和转染试剂形成转染复合物，再加入 6 孔板对应的孔中，轻晃摇匀；2天后，免疫印迹法验证敲低效率以及进行细胞功能实验。如图1所示。

3：免疫印迹实验证明ASCC3小干扰片段在蛋白水平的抗肿瘤效应

将si-control组，si-ASCC3组两组细胞吸去培养液后置于冰上。加入1ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。然后将六孔板置于冰上，用移液管反复清洗两次。按1ml裂解液加10μL PMSF（100 mM）摇匀置于冰上。在细胞培养板每个孔中加入150μL含PMSF的裂解液，然后于冰上裂解5 分钟之后，使用刮板来回刮细胞，使细胞充分裂解。

BCA 定量法测定蛋白含量，使用前面已经标记提取好的细胞蛋白，然后在4度离心机下离心，弃去下层沉淀后重新标记每管。从负20度冰箱拿出loading buffer，使其在室温融化，然后向每管标记好的细胞蛋白溶液加入loading buffer 50μL。提前使恒温干式煮蛋白机器加热至100度，将混匀的细胞蛋白溶液于恒温干式煮蛋白机器孵育10分钟使其变性。应用标准曲线计算待测样本的浓度，测量三次后取其平均值。

SDS－PAGE 电泳，将配胶使用的玻璃板清洗干净，然后验漏5分钟。按照一定比例配置10%的下层胶。然后使用移液枪灌胶，在此过程中注意不要有气泡，然后用乙醇进行封压，凝30分钟。用自来水轻轻洗去封压的乙醇，清洗不掉的使用吸水纸吸去乙醇，按照一定比例配置上层胶，然后使用移液枪注上层胶，此过程注意也不要有气泡，然后插梳子，凝30分钟。胶凝固之后取胶，注意动作要轻柔，防止板子碎裂，加少量水之后放入袋子中4℃冰箱保存备用，最好是现配现用。

电泳需要提前按照一定比例配置好电泳液（最好现配现用），后将SDS-PAGE胶放入电泳槽中，加足够的电泳液。用移液枪贴壁吸取样品，将si-control，si-ASCC3组两组样品吸出。使其每个孔道加入总量200μg的蛋白量，将移液枪调至相应体积的刻度，然后加样器针头插入样品中吸取蛋白至加样孔中缓慢加入样品。先把电压设置80V，开始跑胶，当把样品跑至分离胶后把电压增120V，电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。

按照一定比例配置好转膜液，然后在加有转膜液的盘里放入转膜用的剪刀，刮板，夹子及海绵垫。然后准备好PVDF膜，将PVDF膜依次放入甲醇，ddH₂O，转膜液中，滤纸浸入转膜液中。在夹子两面放入各放一张海绵垫，然后将两片滤纸再分别放在海绵垫上面。将板子放入转膜液中，然后使用刮板轻轻撬开两边的玻璃板，然后将上层胶除去不要，轻轻的将胶置于靠黑面的海绵垫上，注意动作一定要轻柔，防止胶破碎，然后将PVDF膜置于胶上，这时可以做好膜正面的标记，之后使PVDF膜和胶对齐，使用刮板轻轻擀去气泡。将夹子放入转膜槽中（转膜的时候会产热，使转膜槽放入冰盆中），使槽的黑面对着夹子的黑面，使槽的红面对着夹子的白面。使用300mA转90分钟。

将转好的PVDF膜（注意此时可以看到膜上的maker）移至含有牛奶的玻璃皿中，室温下在摇床上摇动封闭2h。TBST洗4次。每次5分钟。将膜按照所需要的目标蛋白所处位置剪切下来并做好标记，加入目标蛋白抗体，然后用封口膜封好之后在4℃过夜。第二天取出膜之后在室温下孵育1～2 h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗3次，每次15分钟。同上方法准备目标蛋白ASCC3所对应的二抗放入膜中，β-tublin作内参，在室温下孵育2 h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗3次，每次15 分钟，显影时将A液和B液两种试剂在离心管中等体积混合，注意避光。取适量显影液于显影仪台面上，将膜用镊子夹起来正反面充分和显影液接触，注意切角在左上，即正面朝上。

蛋白表达量的结果如图1所示，可以看出，与对照组比较，转染小干扰RNA1(siR1)、小干扰RNA2(siR2)和小干扰RNA3(siR3)的实验组的ASCC3蛋白的表达量都降低，从蛋白的相对表达量能清楚得看出，转染小干扰RNA1的实验组对ASCC3蛋白表达的干扰最大，效果最好。因此可以将干扰ASCC3基因表达的小干扰RNA在干扰ASCC3基因表达中的应用。

具体序列如下：

小干扰RNA1的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，SEQ ID NO.1：5’GCCTGACATGGAAGAAGATAA 3’。阴性对照序列为：3’ TTCTCCGAACGTGTCACGT5’（SEQ IDNO.4）。

二、ASCC3小干扰片段抑制膀胱癌转移和侵袭的检测细胞学实验

1：克隆形成实验证明ASCC3小干扰片段细胞水平的抗肿瘤效应

将500个细胞/孔的细胞悬液放入6cm的培养皿中。在37℃孵箱中用3ml培养液培养细胞。培养细胞培养2周后，用PBS溶液温和地洗涤，福尔马林固定，0.1%结晶紫染色，测定克隆形成率。如图2所示。

结果表明，ASCC3小干扰RNA干扰的实验组与NC组相比，细胞克隆数显著降低(p＜0.05)，表明ASCC3能够促进膀胱癌5637细胞株克隆形成，即通过小干扰RNA1转染膀胱癌5637细胞株干扰ASCC3基因，能抑制细胞的克隆形成。

三、Transwell分析实验证明ASCC3小干扰片段细胞水平的抗肿瘤效应

先准备 24 孔板，将小室移至 24 孔板内；细胞侵袭实验，基质胶需要提前一天从-20℃放入 4℃冰箱，24 孔板、枪头、小室都需要提前预冷，所有操作都需在冰上进行；将转染后的细胞从 6 孔板中消化下来，离心后，弃去上清，留细胞沉淀；加入 1ml PBS 重悬，离心；再加入 1ml PBS 重悬，离心，弃上清；加入少些基培重悬，然后取 200μL 体积内含 5× 10⁵个细胞，置于孔径为 8μm 的 Transwell 室中，进行或不进行 Matrigel 处理，并在下部隔室中装入 1640 含 10％FBS（胎牛血清）的培养基 500μL。温育 24 小时后，移去上腔室细胞悬液，用 4％多聚甲醛将下腔室膜上的细胞固定 30min，然后用结晶紫染色5min。用显微镜随机选择 5 个视野来计数迁移或侵袭细胞。如图3所示。

结果表明，ASCC3小干扰RNA干扰的实验组与NC组相比，迁移和侵袭的细胞数显著降低(p＜0.05)，表明ASCC3能够促进膀胱癌5637细胞株迁移和侵袭，即通过小干扰RNA1转染膀胱癌5637细胞株干扰ASCC3基因，能抑制细胞的迁移和侵袭。

四、划痕实验证明ASCC3小干扰片段在细胞水平的抗肿瘤效应

每组细胞接种于约90%融合的6孔板中。用一个200μL 的吸管尖端划痕制造了对称的伤口。用PBS洗涤两次后，用无血清DMEM培养液孵育24h。分别于拔除伤口后0h和24h拍摄移行照片。如图4所示。

流式细胞仪检测，用 PBS 重悬洗涤 3 次，离心，弃掉 PBS，用 70%乙醇重悬，置于-20°C 固定至少 24 小时。检测前，离心收集的细胞，弃乙醇，用 PBS洗涤 3 次，并用含1% Triton X-100 的 PBS，4°C 通透，每管 200 μL。后加入RNase A，避光 4°C 反应，每管300-400 μL。加入 200μL PI 染色剂，避光 4°C 染色 20 min，每管 200 μL，流式细胞仪检测。如图5所示。

综上所述，本发明实施例提供的抑制ASCC3基因表达的小干扰RNA及其应用于靶向药物，通过小干扰RNA抑制ASCC3基因表达，能调控细胞活力、细胞增殖，抑制细胞迁移和侵袭等，对临床开发膀胱癌靶向药物具有较好的应用前景。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种干扰ASCC3基因表达的小干扰RNA具有如下应用：

a）在制备降低膀胱癌细胞克隆形成能力产品中的应用；

b）在制备抑制膀胱癌细胞侵袭产品中的应用；

c）在制备抑制膀胱癌细胞转移产品中的应用；

所述小干扰RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。