CN115814099B - 一种人凝血因子ix的干热处理稳定剂及其制剂与制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种人凝血因子IX的干热处理稳定剂，每单位体积的干热处理稳定剂包括如下组分：枸橼酸钠5～15mmol，氯化钠25～100mmol，甘露醇20～60g，盐酸精氨酸40～70mmol，盐酸赖氨酸40～70mmol，肝素钠0.006～0.018IU。本发明干热处理稳定剂既能有效维持人凝血因子IX的活性，又不会影响干热处理对病毒的灭活作用，成本低廉，以该干热处理稳定剂制得的人凝血因子IX制剂外观和可见异物符合规定，在常规保存条件和高温条件下的稳定性好，活性高，是一种新的、安全有效，成本低廉的人凝血因子IX制剂，具有良好的工业应用前景。

Description

一种人凝血因子IX的干热处理稳定剂及其制剂与制备方法

技术领域

本发明属于血浆制品领域，具体涉及一种人凝血因子IX的干热处理稳定剂及其制剂与制备方法。

背景技术

人凝血因子Ⅸ是一种糖蛋白，与凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅹ同属维生素K依赖因子，在体内由肝细胞合成并分泌到血液中，健康人血浆中浓度约5μg/ml，在血液中以丝氨酸蛋白酶原的形式存在，经人凝血因子Ⅺ或人凝血因子Ⅶ和组织因子复合物激活后形成具有蛋白酶活性的活化人凝血因子Ⅸ即FⅨa，参与凝血途径。由于人凝血因子IX来源于血浆，有传播病毒的危险，因此，在制备过程中需采用有效的病毒灭活和去除措施。常用的病毒灭活方式有巴氏法，有机溶剂/去污剂，纳米过滤，光照法和干热法等。人凝血因子IX稳定性差，不耐热处理，其稳定性受血浆蛋白、抗体、蛋白水解、自身降解等多种因素的影响，需在最终配制时加入保护剂，使产品能耐受冻干及干热处理，又不影响干热处理的病毒灭活效果。

长期以来，研究人员对于人凝血因子IX制剂的稳定剂、保护剂已进行了诸多探索。例如，2009年公告的中国专利(公告号为CN100482272C)公开了一种人凝血因子IX的干热处理稳定剂，该稳定剂为蔗糖或/和精氨酸或其盐，还可含有甘氨酸、NaCl、柠檬酸三钠、肝素中的一种或几种，其中蔗糖或/和精氨酸或其盐浓度分别为0.1～10％和0.1-5％。又如，公开号为CN110257358A的中国专利申请报道了一种人凝血因子IX的活性保护剂，即蔗糖2-5％，赖氨酸1-3％，精氨酸1-3％，甘氨酸1-3％，枸橼酸钠20mmol/L。然而，后续研究表明，含蔗糖的凝血因子类冻干制剂经干热处理后，制品颜色变黄，复溶外观差，有蛋白絮状物析出，因此目前各血液制品厂家已不倾向于采用蔗糖作为保护剂。而且从中国专利申请CN110257358A的成品报告可以看出，该配方制剂复溶后外观还存在少量颗粒，有少量可见异物析出。

因此，进一步对保护剂的配方进行改进，使其能够有效保护人凝血因子IX制剂产品耐受冻干及干热处理，保证制剂稳定性，具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的人凝血因子IX的干热处理稳定剂以及新的人凝血因子IX制剂及其制备方法。

本发明提供了一种人凝血因子IX的干热处理稳定剂，每单位体积的干热处理稳定剂包括如下组分：

枸橼酸钠5～15mmol，氯化钠25～100mmol，甘露醇20～60g，盐酸精氨酸40～70mmol，盐酸赖氨酸40～70mmol，肝素钠0.006～0.018IU。

进一步地，每单位体积的干热处理稳定剂包括如下组分：

枸橼酸钠10mmol，氯化钠50mmol，甘露醇30g，盐酸精氨酸60mmol，盐酸赖氨酸55mmol，肝素钠0.012IU。

进一步地，上述干热处理稳定剂为液体，所述组分的含量为：

枸橼酸钠10mM，氯化钠50mM，甘露醇30g/L，盐酸精氨酸60mM，盐酸赖氨酸55mM，肝素钠12IU/ml。

更它的溶剂是注射用水。

本发明还提供了上述的干热处理稳定剂在制备人凝血因子IX制剂中用途。

本发明还提供了一种人凝血因子IX制剂，它包括上述的干热稳定剂和人凝血因子IX。

进一步地，上述制剂为液体制剂，其中人凝血因子IX的浓度为50-70IU/ml。

本发明还提供了一种制备上述人凝血因子IX制剂的方法，包括如下步骤：

(1)使用含有所述枸橼酸钠、氯化钠、甘露醇、盐酸精氨酸、盐酸赖氨酸的缓冲液对分离纯化后的人凝血因子IX洗脱液进行超滤透析，然后加入所述肝素钠；

(2)除菌、冻干，干热处理，即得。

进一步地，步骤(2)所述干热处理的温度为60～100℃，时间为10分钟～72小时。

更进一步地，上述干热处理的温度为100℃，时间为30分钟。

本发明的有益效果：本发明人凝血因子IX(FIX)的干热处理稳定剂既可有效维持人凝血因子IX的活性，又不影响干热处理的病毒灭活效果。使用本发明干热处理稳定剂制备的FIX制剂，FIX活性收率高，成品的外观、可见异物、复溶时间均符合药典规定。本发明人凝血因子IX制剂的稳定性好，活性高，安全有效，成本低廉，具有良好的临床应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

说明书附图

图1为人凝血因子IX的制备工艺流程。

具体实施方式

本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。

本发明所用的分离纯化后的人凝血因子IX(FIX)洗脱液，是以新鲜冰冻血浆为原料，经过血浆融化、离心去除冷沉淀，并经过一系列纯化洗脱步骤以及SD病毒灭活步骤获得的，可以由本领域技术人员根据目前公知的FIX分离纯化方法，通过其掌握的常规技术手段制备得到。例如，可以按照如下步骤制备(仅为举例，不构成对本发明范围的限制)：

(1)以新鲜冰冻血浆为原料，经血浆融化，离心去除冷沉淀，得上清，上清经DEAESephadex A50离子交换层析纯化，缓冲液为5mM的枸橼酸钠缓冲液，通过改变缓冲液的氯化钠离子强度，收集得到含人凝血因子IX的洗脱液；

(2)洗脱液在超滤透析后加入Tween-80和磷酸三丁酯使其最终浓度分别为1％和0.3％，25℃±1℃处理6小时，完成第一次病毒灭活(即SD病毒灭活)；

(3)SD病毒灭活后制品，经Diamond DEAE离子交换层析纯化，缓冲液为5mM的磷酸盐缓冲液，通过改变层析缓冲液的氯化钠离子强度，收集得到含人凝血因子IX的洗脱液；

(4)Diamond DEAE离子交换层析纯化洗脱液再经Heparin Bestarose FF亲和层析纯化，缓冲液为10mM的枸橼酸钠缓冲液，通过改变层析缓冲液的氯化钠离子强度，收集得到含人凝血因子IX的洗脱液。

(5)Heparin Bestarose FF亲和层析纯化洗脱液经20nm过滤后，收集过滤液。

实施例1、本发明人凝血因子IX制剂的制备

(1)用含枸橼酸钠5mM，氯化钠100mM，甘露醇20g/L，盐酸精氨酸40mM，盐酸赖氨酸70mM的缓冲液(溶剂为注射用水)对经分离纯化的FIX洗脱液进行超滤透析，制得的溶液的成分为人凝血因子IX、枸橼酸钠、氯化钠、甘露醇、盐酸精氨酸、盐酸赖氨酸，超滤完成后，加入肝素钠，使得肝素钠含量为6IU/ml；

(2)再进行除菌、分装、冻干，冻干结束后，作100℃30分钟的干热处理，即得。

整个工艺流程的示意图如图1所示。

实施例2、本发明人凝血因子IX制剂的制备

(1)用含橼酸钠10mM，氯化钠50mM，甘露醇30g/L，盐酸精氨酸60mM，盐酸赖氨酸55mM的缓冲液对经分离纯化的FIX洗脱液进行超滤透析，制得的溶液的成分为人凝血因子IX、枸橼酸钠、氯化钠、甘露醇、盐酸精氨酸、盐酸赖氨酸，超滤完成后，加入肝素钠，使得肝素钠含量为12IU/ml；

(2)再进行除菌、分装、冻干，冻干结束后，作100℃30分钟的干热处理，即得。

实施例3、本发明人凝血因子IX制剂的制备

(1)用含枸橼酸钠15mM，氯化钠25mM，甘露醇60g/L，盐酸精氨酸70mM，盐酸赖氨酸40mM的缓冲液对经分离纯化的FIX洗脱液进行超滤透析，制得的溶液的成分为人凝血因子IX、枸橼酸钠、氯化钠、甘露醇、盐酸精氨酸、盐酸赖氨酸，超滤完成后，加入肝素钠，使得肝素钠含量为18IU/ml；

(2)再进行除菌、分装、冻干，冻干结束后，作100℃30分钟的干热处理，即得。

以下通过实验例证明本发明的有益效果。

实验例1、本发明稳定剂的筛选试验

1、实验方法

参照实施例1的制备方法，使用含有如表1所示的除肝素钠以外的成分的缓冲液进行超滤透析，超滤完成后加入肝素钠。再进行除菌、分装、冻干，冻干结束后，作100℃30分钟的干热处理，即得产品。

然后对产品的优劣进行判定，判定指标为：1.效价回收率；2.外观；3.复溶时间。

2、实验结果

相应的检测结果如表1所示。

表1

由表1可以看出，在人凝血因子IX超滤液中，加入本发明实施例的干热稳定剂后，再进行100℃、30min干热处理，得到的人凝血因子IX外观、可见异物均符合《中国药典》2020版规定，而且FⅨ活性收率高，均在90％以上；配方1～配方3(即本发明实施例)的复溶时间为≤1min，远低于国内文献报道的复溶时间。用本发明最优选的干热处理稳定剂(如配方1所示)，成品外观、可见异物和复溶时间均符合药典规定，FⅨ活性回收率可达到98％，可保证FⅨ活性基本无损失。而用本发明干热稳定剂之外的配方则FⅨ活性收率低，甚至产品外观、可见异物或复溶时间不符合药典规定。

实验例2、干热灭活过程对该制剂配方配制的样品的病毒灭活效果

取实施例2制备的人凝血因子IX制剂，进行干热病毒灭活效果检测，结果见表2。

表2病毒灭活验证结果(n＝3)

由表2可以看出，本发明人凝血因子IX制剂的病毒灭活效果大于>4.0log，完全能达到国家规定的标准。

实验说明本发明干热处理稳定剂在保护制品质量的同时，不会影响干热处理对病毒的灭活作用。

实验例3、本发明干热处理稳定剂的稳定性

取实施例2制备的人凝血因子IX制剂。分别考察了本制剂配方样品在2-8℃(常规保存条件)和25℃(加速稳定性)保存条件下的稳定性。

根据药典规定，人凝血因子IX制剂的效价应为标示量的80％～140％。

结果见表3，表4，表5：

表3 2-8℃稳定性试验结果(n＝3)

由表3可知，2-8℃条件下，人凝血因子IX制剂保存3个月，其效价一直保持在比较高的水平上。

实验说明，在人凝血因子IX制剂常规保存条件下，人凝血因子IX的有效期长，本发明干热处理稳定剂可以长时间维持人凝血因子IX的活性。

表4 25℃加速稳定性试验结果(n＝3)

由表4可知，25℃条件下，人凝血因子IX的效价在3个月一直保持在比较高的水平上。

实验说明，在25℃保存条件下，人凝血因子IX制剂的有效期至少为6个月，说明在较高温度下，本发明干热处理稳定剂仍然可以有效维持人凝血因子IX的活性。

综上，本发明干热处理稳定剂既能有效维持人凝血因子IX的活性，又不会影响干热处理对病毒的灭活作用，成本低廉，显著优于现有凝血因子IX制剂的干热处理稳定剂。本发明基于该干热处理稳定剂制得的人凝血因子IX制剂外观和可见异物符合规定，在常规保存条件和高温条件下的稳定性好，活性高，是一种新的、安全有效，成本低廉的人凝血因子IX制剂，具有良好的工业应用前景。

Claims (3)

1.一种制备人凝血因子IX制剂的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）用含枸橼酸钠5mM，氯化钠100mM，甘露醇20g/L，盐酸精氨酸 40mM，盐酸赖氨酸70mM的缓冲液，对经分离纯化的FIX洗脱液进行超滤透析，制得的溶液的成分为人凝血因子IX、枸橼酸钠、氯化钠、甘露醇、盐酸精氨酸、盐酸赖氨酸，超滤完成后，加入肝素钠，使得肝素钠含量为6IU/ml，其中缓冲液溶剂为注射用水；

（2）再进行除菌、分装、冻干，冻干结束后，作100℃ 30分钟的干热处理，即得。

2.一种制备人凝血因子IX制剂的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）用含橼酸钠10mM，氯化钠50mM，甘露醇30g/L，盐酸精氨酸 60mM，盐酸赖氨酸 55mM的缓冲液对经分离纯化的FIX洗脱液进行超滤透析，制得的溶液的成分为人凝血因子IX、枸橼酸钠、氯化钠、甘露醇、盐酸精氨酸、盐酸赖氨酸，超滤完成后，加入肝素钠，使得肝素钠含量为12IU/ml，其中缓冲液溶剂为注射用水；

（2）再进行除菌、分装、冻干，冻干结束后，作100℃ 30分钟的干热处理，即得。

3.一种制备人凝血因子IX制剂的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）用含枸橼酸钠15mM，氯化钠25mM，甘露醇60g/L，盐酸精氨酸 70mM，盐酸赖氨酸40mM的缓冲液对经分离纯化的FIX洗脱液进行超滤透析，制得的溶液的成分为人凝血因子IX、枸橼酸钠、氯化钠、甘露醇、盐酸精氨酸、盐酸赖氨酸，超滤完成后，加入肝素钠，使得肝素钠含量为18IU/ml，其中缓冲液溶剂为注射用水；

（2）再进行除菌、分装、冻干，冻干结束后，作100℃ 30分钟的干热处理，即得。