CN115804843B

CN115804843B - Skor1基因作为靶点在2型糖尿病和/或炎症治疗中的应用

Info

Publication number: CN115804843B
Application number: CN202111080091.0A
Authority: CN
Inventors: 王颖; 徐寒梅; 陈林
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2021-09-15
Filing date: 2021-09-15
Publication date: 2024-07-26
Anticipated expiration: 2041-09-15
Also published as: CN115804843A

Abstract

本发明公开了SKOR1基因作为靶点在2型糖尿病和/或炎症治疗中的应用，属于生物医药领域。抑制SKOR1基因的表达水平或抑制SKOR1蛋白活性，可以使肝细胞的葡萄糖生成量显著减少，脂肪细胞的葡萄糖摄取量显著增加，炎症因子分泌显著减少，改善胰岛素抵抗和/或炎症的状态。同时本发明提供了miR‑1249‑3p作为SKOR1mRNA干扰剂，靶向结合SKOR1mRNA从而抑制抑制SKOR1基因的表达水平，此外本发明还提供了miR‑1249‑3p模拟物以及NK细胞外泌体，均可以制备治疗2型糖尿病和/或炎症的药物，与miR‑1249‑3p达到相同的效果，同时解决miR‑1249‑3p作为单链不稳定的问题。

Description

SKOR1基因作为靶点在2型糖尿病和/或炎症治疗中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及SKOR1基因作为靶点在2型糖尿病和/或炎症治疗中的应用。

背景技术

2型糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢性疾病，其显著的病理生理学特征为胰岛素抵抗，病因和发病机制目前尚不明确。胰岛素抵抗是指脂肪细胞、肌细胞和肝细胞对正常浓度的胰岛素反应敏感性降低，出现胰岛素受体后信号传导障碍，从而影响糖、脂肪和蛋白质的代谢。免疫反应和代谢调节功能相互依赖，2型糖尿病患者会出现亚临床全身低度炎症反应，白细胞群的数量和激活状态发生改变，并影响脂肪组织、肝脏、胰岛、下丘脑和心血管系统等多种组织，从而诱发慢性并发症。根据国际糖尿病联盟(IDF)发布的《IDF全球糖尿病概览(第九版)》，2019年全球共有4.63亿人患有糖尿病，预计到2030年，糖尿病患者会达到5.78亿人。尽管已经开发出一些降糖药物，比如胰岛素、二甲双胍，但对于越来越庞大的2型糖尿病患者人群而言，仅有的这些降糖药物显然不能满足需求，因此科学家们一直致力于寻找其他有效的降糖新药。

外泌体(Exosome)是一种直径约50～150nm的囊泡样小体，是由细胞内膜向内萌芽形成的多囊泡体，与细胞膜融合后释放的小泡。不同细胞来源的外泌体表面携带相似的保守蛋白，如膜转运和结合相关蛋白syntenin-1、多囊泡体产生相关蛋白TSG101、分子伴侣HSP90、整合素和四跨膜蛋白超家族CD63、CD9等，外泌体内则含有与其来源细胞相关的特异性蛋白质、核酸和脂质成分。外泌体中的核酸成分种类丰富，包括miRNA、mRNA、lncRNA、circRNA等，外泌体可以使这些在细胞外液中易失活或降解的组分在体内循环，安全转移至邻近和远端的靶细胞，通过这些核酸完成细胞间基因信息交流参与调节。

产生胰岛素的胰岛β细胞与胰岛素敏感组织，如大脑、肝脏、脂肪和肌肉等，分泌的外泌体能够转移至其他代谢器官、免疫细胞以及内皮细胞中，通过免疫反应、氧化应激、血管生成等方式，维持葡萄糖稳态或加重胰岛素抵抗。

发明内容

1.发明目的

本发明的目的之一在于提供一种可用于2型糖尿病和/或炎症治疗的靶点——SKOR1基因，或其表达的SKOR1蛋白，抑制小鼠体内SKOR1基因的表达水平或抑制SKOR1蛋白的活性，可以改善胰岛素抵抗和炎症的状态；本发明的目的之二在于提供一种miR-1249-3p，该miRNA存在于NK细胞所分泌的外泌体中，可以靶向与SKOR1 mRNA结合，降低SKOR1基因的表达水平，可用于2型糖尿病和/或炎症的治疗；本发明的目的之三在于提供一种miR-1249-3p模拟物，该miR-1249-3p模拟物为双链结构，可以靶向与SKOR1 mRNA结合，降低SKOR1基因的表达水平，可用于2型糖尿病和/或炎症的治疗；本发明的目的之四在于提供一种NK细胞外泌体，该外泌体含有miR-1249-3p，高表达miR-1249-3p的外泌体可用于2型糖尿病和/或炎症的治疗。

2.技术方案

为了达到上述发明目的，本发明所采用的技术方案如下：

本发明提供了SKOR1基因或其表达的SKOR1蛋白作为靶点在治疗2型糖尿病和/或炎症中的应用，抑制SKOR1基因的表达水平或抑制SKOR1蛋白活性，可以使肝细胞的葡萄糖生成量显著减少，脂肪细胞的葡萄糖摄取量显著增加，炎症因子分泌显著减少，改善胰岛素抵抗和/或炎症的状态。

优选地，上述抑制SKOR1基因的表达水平通过敲除或敲低SKOR1基因、添加SKOR1基因抑制剂或添加SKOR1 mRNA干扰剂等一种或多种方式进行，降低SKOR1基因的基因水平或表达水平。

优选地，上述抑制SKOR1蛋白活性通过添加SKOR1蛋白抑制剂或SKOR1蛋白的特异性抗体等一种或多种方式进行，降低SKOR1蛋白活性，封闭该蛋白的作用。

优选地，上述SKOR1 mRNA干扰剂为miR-1249-3p，所述miR-1249-3p的核苷酸序列为SEQ ID NO.1：ACGCCCUUCCCCCCCUUCUUCA(5’-3’)，SKOR1基因是miR-1249-3p调控葡萄糖代谢和炎症的下游信号分子，miR-1249-3p可以与SKOR1 mRNA靶向结合并抑制SKOR1蛋白的表达水平，进而使得肝细胞的葡萄糖生成量显著减少，脂肪细胞的葡萄糖摄取量显著增加，炎症因子分泌显著减少，说明对SKOR1蛋白的抑制能够促进葡萄糖的代谢以及炎症因子的分泌。

优选地，上述SKOR1 mRNA干扰剂为表达或形成miR-1249-3p的构建物。

优选地，上述表达或形成miR-1249-3p的构建物包括含有SEQ ID NO.1所述序列核苷酸的过表达质粒载体、转基因细胞系或慢病毒。

优选地，上述表达或形成miR-1249-3p的构建物包括一种miR-1249-3p模拟物，其正义链(Sense)序列为：ACGCCCUUCCCCCCCUUCUUCA(5′-3′)，反义链(Antisense)序列为：AAGAAGGGGGGGAAGGGCGUUU，该模拟物的正义链序列与miR-1249-3p序列相同，能够与SKOR1mRNA靶向结合并抑制SKOR1蛋白的表达水平；同时该模拟物为双链结构，增加了运输过程中稳定性。

优选地，上述表达或形成miR-1249-3p的构建物包括一种NK细胞外泌体，该外泌体含有miR-1249-3p，外泌体可以使在细胞外液中易失活或降解的miR-1249-3p在体内循环，安全转移至邻近和远端的靶细胞，如其他代谢器官、免疫细胞以及内皮细胞，通过这些核酸完成细胞间基因信息交流参与调节，通过免疫反应、氧化应激、血管生成等方式，维持葡萄糖稳态或加重胰岛素抵抗。

优选地，上述NK细胞外泌体通过差速离心法等方法获得。

优选地，上述NK细胞来源于脾脏。

优选地，上述应用包括静脉注射有效量的上述NK细胞外泌体。

本发明还提供了一种用于治疗2型糖尿病和/或炎症的药物组合物，包括治疗有效量的miR-1249-3p、miR-1249-3p模拟物或NK细胞外泌体，以及药学上可接受的载体。

本发明还提供了一种2型糖尿病和/或炎症诊断的分子标志物miR-1249-3p，其序列为SEQ ID NO.1：ACGCCCUUCCCCCCCUUCUUCA(5’-3’)。

本发明还提供了一种检测2型糖尿病和/或炎症的试剂盒，试剂盒中包括检测miR-1249-3p表达量的试剂，所述miR-1249-3p的序列为SEQ ID NO.1：ACGCCCUUCCCCCCCUUCUUCA(5’-3’)。

3.有益效果

本发明的有益效果在于：

(1)本发明提供了SKOR1基因或其表达的SKOR1蛋白作为靶点在治疗2型糖尿病和/或炎症中的应用，是一种新的2型糖尿病和/或炎症的治疗方式，以SKOR1基因或其表达的SKOR1蛋白作为靶点，抑制SKOR1基因的表达水平或抑制SKOR1蛋白活性，可以使肝细胞的葡萄糖生成量显著减少，脂肪细胞的葡萄糖摄取量显著增加，炎症因子分泌显著减少，改善胰岛素抵抗和/或炎症的状态。并且抑制SKOR1基因的表达水平可以通过敲除或敲低SKOR1基因、添加SKOR1基因抑制剂或添加SKOR1 mRNA干扰剂等一种或多种方式进行，抑制SKOR1蛋白活性可以通过添加SKOR1蛋白抑制剂或SKOR1蛋白的特异性抗体等一种或多种方式进行，可应用性强。

(2)本发明提供了miR-1249-3p作为SKOR1 mRNA干扰剂抑制SKOR1基因的表达水平，SKOR1基因是miR-1249-3p调控葡萄糖代谢和炎症的下游信号分子，miR-1249-3p可以与SKOR1 mRNA靶向结合并抑制SKOR1蛋白的表达水平，进而使得肝细胞的葡萄糖生成量显著减少，脂肪细胞的葡萄糖摄取量显著增加，炎症因子分泌显著减少，说明对SKOR1蛋白的抑制能够促进葡萄糖的代谢以及炎症因子的分泌。

(3)本发明提供了miR-1249-3p模拟物作为SKOR1 mRNA干扰剂抑制SKOR1基因的表达水平，模拟物的正义链序列与miR-1249-3p序列相同，能够与SKOR1 mRNA靶向结合并抑制SKOR1蛋白的表达水平；同时该模拟物为双链结构，能够克服miR-1249-3p单链结构不稳定的问题，增加了运输过程中稳定性。

(4)本发明提供了NK细胞外泌体作为SKOR1 mRNA干扰剂抑制SKOR1基因的表达水平，使在细胞外液中易失活或降解的miR-1249-3p在体内循环，安全转移至邻近和远端的靶细胞，如其他代谢器官、免疫细胞以及内皮细胞，通过这些核酸完成细胞间基因信息交流参与调节，通过免疫反应、氧化应激、血管生成等方式，维持葡萄糖稳态或加重胰岛素抵抗。将外泌体尾静脉注射至2型糖尿病模型小鼠体内，检测发现2型糖尿病模型小鼠的血糖水平、胰岛素耐量和胰岛素抵抗水平均显著缓解；在体外，将正常小鼠脾脏NK细胞分泌的外泌体分别与肝细胞和脂肪细胞共孵育后检测发现，正常小鼠NK细胞外泌体能够抑制肝细胞的葡萄糖生成能力，促进脂肪细胞的葡萄糖的摄取能力，并且降低肝脏细胞和脂肪细胞分泌的炎症因子水平，说明正常小鼠NK细胞外泌体能够在体内和体外调节2型糖尿病相关的葡萄糖代谢以及炎症反应。

附图说明

图1显示了NK细胞外泌体标志蛋白表达情况。

图2显示了通过透射电镜鉴定外泌体形态的结果。

图3显示了NCD鼠NK细胞外泌体可以改善HFD鼠的胰岛素抵抗。

图4显示了尾静脉注射的NK细胞外泌体主要分布在小鼠内脏脂肪组织(VAT)和肝脏(Liver)。

图5显示了NCD鼠外泌体尾静脉注射给HFD鼠后，小鼠内脏脂肪组织和肝脏处的炎症因子分泌减少。

图6显示NCD鼠外泌体可以增加脂肪细胞3T3-L1的葡萄糖摄取，减少肝脏细胞AML12的葡萄糖生成。

图7显示了NCD鼠外泌体可以增加细胞中胰岛素相关信号通路蛋白。

图8显示了NCD鼠外泌体可以减少细胞的炎症因子分泌。

图9显示了NCD鼠外泌体和HFD鼠外泌体表达差异最大的十种miRNA。

图10显示了miR-1249-3p可以通过外泌体转运到细胞。

图11显示了miR-1249-3p可以增加3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖摄取能力，抑制肝脏细胞AML12的葡萄糖生成能力。

图12显示了miR-1249-3p可以减少细胞的炎症因子分泌。

图13显示了SKOR1可以与miR-1249-3p靶向结合并抑制SKOR1蛋白的表达。

图14显示了SKOR1可以促进3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖摄取能力，抑制肝脏细胞AML12的葡萄糖生成能力。

图15显示了SKOR1的敲低可以抑制细胞的炎症因子分泌。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

以下实施例在以本发明为技术方案为前提下进行实施，给出了详细实施方案和过程，但本发明的包含范围不限于下述的实施例。下述的实施例未注明的条件和方法等均按常规进行。

实施例1

本实施例提供小鼠脾脏NK细胞外泌体及其分离方法，具体如下所述：

选择HFD(highfat diet，高脂肪饮食)和NCD(normal chow diet，正常饮食)小鼠，从小鼠脾脏中分离和培养脾脏NK细胞(NK cell)，采用差速超速离心法分离NK细胞分泌的外泌体(Exosomes)。

首先，将NK细胞的条件培养基以10000×g的速度离心10分钟以去除其他碎片，然后收集上清液并以100000×g的速度离心70分钟，收集沉淀即为外泌体，放在-80℃保存。

外泌体和NK细胞离心后加入50μL细胞裂解液冰上裂解10min抽提总蛋白，然后加入5×loading buffer及DTT至终浓度均为1×，煮沸10min后-20℃保存。分离胶浓度为12％，浓缩胶5％，制胶后上样，恒压140V电泳90min。甲醇活化PVDF膜后转移至转膜液中，然后按蛋白Marker条带分子量指示放到相应位置的胶上，恒流350mA转膜80min。转膜完成后将PVDF膜置于5％脱脂奶粉中封闭2h，加入一抗TSG101，1:1000；HSP70，1:1000；CD63，1:1000；CD9，1:1000；GRP94，1:1000孵育过夜，HRP标记的羊抗兔(1:10000)二抗孵育2h。1×TBST溶液室温洗膜3次，底物化学发光ECL显色，拍照。

使用透射电镜观察外泌体的形态，具体步骤为：将透射电镜所用的铜网平放到称量纸上，滴加20μL上述外泌体溶液，于红外灯下烘烤10min；烘干后再滴加2滴磷钨酸，继续烘烤10min，吸走多余液体，于透射电镜下观察外泌体结构。

结果：外泌体标志蛋白表达情况如图1所示，透射电镜鉴定外泌体结构如图2所示，表明小鼠脾脏NK细胞外泌体分离成功。

实施例2

本实施例提供正常小鼠脾脏NK细胞外泌体(NK-Exos)对小鼠胰岛素抵抗的影响。

胰岛素抵抗是2型糖尿病区别于1型糖尿病最为显著的特征，其检测方法按设计原理主要分为三类：开环法、闭环法和基础状态法，本实施例选择闭环法中的口服葡萄糖耐量试验(OGTT)和胰岛素耐量试验研究NK细胞外泌体对小鼠胰岛素抵抗的影响，具体为：在分组喂食后的50、52和54天，将空白脂质体、NCD鼠外泌体(NCD-Exos)和HFD鼠外泌体(HFD-Exos)分别尾静脉注射给正常鼠(NCD-鼠)和2型糖尿病模型鼠(HFD-鼠)，每次注射量为10μg蛋白含量的外泌体，检测小鼠空腹血糖(BG)的变化，共分为六个小组：

G1：空白脂质体注射给2型糖尿病模型鼠；

G2：HFD-Exos注射给2型糖尿病模型鼠；

G3：NCD-Exos注射给2型糖尿病模型鼠；

G4：空白脂质体注射给正常鼠；

G5：HFD-Exos注射给正常鼠；

G6：NCD-Exos注射给正常鼠。

结果分析：

如图3(A)所示，G3组(即注射NCD-Exos的糖尿病模型鼠)空腹血糖逐渐下降，在第2次注射后血糖极显著低于G1组的对照鼠(***p<0.001)，其血糖水平恢复到正常水平，表明NCD-Exos可以极大地缓解2型糖尿病模型鼠的高血糖症状。

如图3(B)所示，OGTT试验显示仅有NCD-Exos对HFD鼠的糖耐量结果产生影响，在给与葡萄糖后外周血血糖升高幅度较小，且葡萄糖的摄取消耗较快，机体恢复葡萄糖稳态的速度接近正常鼠。

如图3(C)所示，ITT试验结果与OGTT试验的趋势一致，回输NCD-Exos后HFD鼠注射胰岛素后各时间点血糖均显著低于回输空白脂质体的对照组，血糖下降较快，且胰岛素作用时间更长，胰岛素抵抗现象得到了缓解。

如图3(D)所示，G3组(即注射NCD-Exos的糖尿病模型鼠)的胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)明显低于回输空白脂质体的对照组及注射HFD-Exos的糖尿病模型鼠，缓解小鼠胰岛素抵抗。

实施例3

本实施例提供尾静脉注射的外泌体在小鼠体内的分布。

NK-Exos采用PKH26标记，具体方法参照市售试剂盒PKH26 Red Fluorescent CellLinker Kits进行。将PKH26染色液及稀释液C于室温放置一段时间后放入超净工作台；向装有50μL稀释液C的EP管中加入0.2μL PKH26染色液，混匀；向10μL外泌体溶液中加入50μL稀释液C，缓慢吹吸混匀；立即向上述外泌体稀释液中加入染色液稀释液，迅速吹吸混匀，然后定期混匀反应液，孵育3min；加入0.2mL血清孵育1min停止染色，然后加入0.3mL PBS稀释，PKH26标记了NK-Exos。

将PKH26标记的NK-Exos通过尾静脉回输小鼠体内24h后进行成像；处死小鼠，按顺序取小鼠肝脏(Liver)、胰岛(Islet)、内脏脂肪组织(SAT)、皮下脂肪组织(VAT)、骨骼肌组织(Muscle)，进行组织离体成像。用Image J软件打开图片文件；将图片转成灰度图Image>Type>8-bit；黑白反转Edit>Invert；校正光密度Analyze>Calibrate；选择测量域值Image>Adjust>Threshold，调整域值使组织荧光区域被选中，点击“Set”；依次将各组织所在区域圈住，数据中的IntDen即为光密度总和。

尾静脉注射的外泌体在小鼠内的分布情况如图4所示，尾静脉注射的外泌体主要分布在小鼠内脏脂肪组织和肝脏，说明外泌体可以进入脂肪组织和肝脏，进入脂肪组织可以促进脂肪细胞的葡萄糖摄取量，进入肝脏可以降低肝细胞的葡萄糖生成量，改善胰岛素抵抗和/或炎症的状态。

实施例4

本实施例提供NCD-Exos对HFD鼠肝脏和内脏脂肪组织的炎症反应的影响。

处死注射NCD-Exos和HFD-Exos的HFD小鼠，剪下肝左右叶，钝性分离附睾脂肪组织，用预冷的生理盐水清洗后，将肝脏组织和内脏脂肪组织剪碎，通过Trizol法提取组织中RNA，使用qRT-PCR法检测小鼠IL-6、IL-1β、TNF-α基因的表达水平。

结果分析：

如图5(A)和5(B)所示，HFD小鼠的炎症因子IL-6、IL-1β及TNF-α基因的表达水平在脂肪组织和肝脏中均显著高于NCD小鼠。

如图5(C)所示，注射NCD-Exos的HFD小鼠，其脂肪组织中炎症因子IL-6、IL-1β及TNF-α基因的表达水平显著低于对照组，而注射HFD-EXOs的HFD小鼠，其炎症因子IL-6、IL-1β及TNF-α基因的表达水平与对照组相比没有明显变化。

如图5(D)所示，注射NCD-Exos的HFD小鼠，其肝脏中炎症因子IL-6、IL-1β及TNF-α基因的表达水平显著低于对照组，而注射HFD-EXOs的HFD小鼠，其炎症因子IL-6、IL-1β及TNF-α基因的表达水平与对照组相比没有明显变化。

由此可知，尾静脉回输了NCD-Exos，可以缓解HFD小鼠肝脏和内脏脂肪处的炎症反应。

实施例5

本实施例提供NCD外泌体对3T3-L1脂肪细胞和AML12肝细胞糖代谢的影响。具体如下：

(1)NCD外泌体对3T3-L1脂肪细胞糖代谢的影响

首先诱导3T3-L1脂肪细胞分化成熟。选择处于对数生长期的3T3-L1前脂肪细胞，用胰酶消化，加入新鲜培养基制成细胞悬液，调整细胞密度为5×10³个/mL后接种于12孔板中。待细胞接触抑制2d后，换成诱导培养基A分化诱导4d，然后换成诱导培养基B继续诱导分化2d，最后使用DMEM完全培养基培养4d。

诱导分化成熟后，弃去旧培养液，共分为四组，分别为：

(1)Basal：不加100nM胰岛素；

(2)Insulin：加100nM胰岛素；

(3)NCD-Exos：加100nM胰岛素，再加入2μg NCD小鼠NK细胞外泌体；

(4)HFD-Exos：加100nM胰岛素，再加入2μg HFD小鼠NK细胞外泌体；

上述四组处理48h，随后加入含有100μL 0.2M葡萄糖培养液孵育2h后收集培养基，采用葡萄糖测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，货号F006-1-1)测定其中葡萄糖含量。将R1和R2试剂等量混合均匀得到工作液，空白孔加入200μL工作液和2μL蒸馏水，校准孔加入200μL工作液和2μL校准品，样品孔加入200μL工作液和2μL培养基，充分混匀后置于37℃水浴15min，显色后在波长505nm处以空白调零，读取校准和样品的OD值。各孔葡萄糖浓度(mmol/L)＝样品孔吸光度/校准孔吸光度×校准液浓度。各给药组细胞葡萄糖消耗量＝空白孔含糖量-加药孔含糖量。

(2)NCD外泌体对AML12肝细胞糖代谢的影响

将AML12细胞以5×10⁵个/孔接种于12孔板，DMEM完全培养基培养2d，更换无血清DMEM培养液饥饿过夜。用温热的PBS 2mL/孔清洗两次，加入1mL葡萄糖生成缓冲液。分为四组，分别为：

(1)Basal：不加100nM胰岛素；

(2)Insulin：加100nM胰岛素；

(3)NCD-Exos：加100nM胰岛素，再加入2μg NCD小鼠NK细胞外泌体；

(4)HFD-Exos：加100nM胰岛素，再加入2μg HFD小鼠NK细胞外泌体；

37℃处理24h，收集培养基，采用葡萄糖测定试剂盒测定其中葡萄糖含量。各给药组细胞葡萄糖生成量＝加药孔含糖量-空白孔含糖量。

结果分析：

3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖摄取量如图6(A)所述，说明胰岛素能够促进成熟3T3-L1细胞对葡萄糖的摄取能力，而在给予NCD-Exos作用48h后，3T3-L1细胞对葡萄糖的摄取能力相较于胰岛素组显著增高，具有统计学差异(**p<0.01)，而HFD-Exos无显著效果。

AML12肝细胞的葡萄糖生成量如图6(B)所示，说明胰岛素能够抑制AML12细胞生成葡萄糖的能力，在给予NCD-Exos作用24h后，相较于胰岛素组，AML12细胞生成葡萄糖的能力被显著抑制，具有统计学差异(*p<0.05)，而HFD-Exos无显著效果。

由此可知，NCD外泌体可以增加3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖摄取，减少AML12肝细胞的葡萄糖生成。

实施例6

本实施例提供NCD外泌体对3T3-L1脂肪细胞和AML12肝细胞中胰岛素信号通路关键蛋白表达和炎症反应的影响。

(1)NCD外泌体对3T3-L1脂肪细胞和AML12肝细胞中胰岛素信号通路关键蛋白表达的影响

采用胰蛋白酶消化3T3-L1脂肪细胞和AML12肝细胞，然后用PBS清洗，100μL细胞裂解液冰上裂解细胞10min抽提总蛋白，然后加入5×loading buffer及DTT至终浓度均为1×，煮沸10min后-20℃保存。

Western Blot操作见实施例1，一抗稀释比为GAPDH，1:5000；pAkt，1:500；PPARγ，1:500；GLUT4，1:500。用Image J软件打开图片文件；将图片转化为条带Edit>Invert；依次将条带所在区域圈住，数据中的IntDen即为灰度值。

胰岛素信号通路相关蛋白表达情况如图7所示，两种细胞中胰岛素信号通路关键蛋白，3T3-L1中p-Akt、PPARγ及GLUT4和AML12中p-Akt及PPARγ白表达量均升高。

(2)NCD外泌体对3T3-L1脂肪细胞和AML12肝细胞中炎症反应的影响

通过Trizol法提取细胞中RNA，使用qRT-PCR法检测小鼠IL-6、IL-1β、TNF-α基因的表达水平。3T3-L1脂肪细胞和AML12肝细胞中IL-6、IL-1β及TNF-α基因的表达水平如图8所示，在两种细胞中，添加NCD-Exos培养的其炎症因子IL-6、IL-1β及TNF-α基因的表达水平显著低于对照组，而添加HFD-Exos培养的，其炎症因子IL-6、IL-1β及TNF-α基因的表达水平与对照组相比没有明显变化。

由此可知，NCD外泌体可以增加3T3-L1脂肪细胞和AML12肝细胞细胞中胰岛素信号通路关键蛋白表达，减少细胞的炎症因子分泌。

实施例7

本实施例提供NCD外泌体和HFD外泌体miRNA差异表达分析。

由北京博奥晶典生物技术有限公司对NCD外泌体和HFD外泌体进行miRNA表达芯片研究，并对差异表达miRNA进行分析。

miRNA表达芯片结果表明，小鼠miRNA-1249-3p在NCD-Exos中高表达(如图9)，其序列为SEQ ID NO.1：ACGCCCUUCCCCCCCUUCUUCA(5’-3’)。

实施例8

本实施例提供miRNA-1249-3p的转运与摄取，由于miRNA-1249-3p单链结构不稳定，通过构建miRNA-1249-3p模拟物(miRNA-1249-3pmimic)来进行模拟，该模拟物的正义链序列与miR-1249-3p序列相同，能够脱解为单链，增加了稳定性。构建miR-1249-3p模拟物为双链结构，其序列为：

正义链：5’-ACGCCCUUCCCCCCCUUCUUCA-3’(SEQ ID NO.2)；

反义链：5’-AAGAAGGGGGGGAAGGGCGUUU-3’(SEQ ID NO.3)。

按照转染试剂说明书(购自abm公司)将cy3标记的miR-1249-3p的模拟物(由苏州吉玛基因股份有限公司合成)转染入NK细胞，置于小室上层，下层放置3T3-L1或AML12细胞，培养24小时后，荧光显微镜下观察3T3-L1或AML12细胞中有无cy3荧光。

接着使用外泌体miRNA提取试剂盒(购自QIAGEN)提取小室下层细胞的RNA，用NanoDrop ND-1000核酸定量仪定量所提取的RNA的纯度和浓度。采用abm^TM公司的miRNAcDNA Synthesis Kit,with Poly(A)Polymerase Tailing试剂盒对提取的总RNA反转录合成cDNA。采用abm^TM公司EvaGreen miRNA qPCR MasterMix试剂盒进行PCR反应。通过QuantStudio 3 Real-Time PCR system完成测试分析，所用引物序列：

正向引物：5′-ACACTCCAGCTGGGACTTCTTCCCCCCCTT-3′(SEQ ID NO.4)

反向引物：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTGCGGGAA-3′(SEQ IDNO.5)

结果：小室共孵育后的荧光成像结果及细胞中miR-1249-3p表达水平如图10所示，显示NK细胞中的miR-1249-3p可以经由外泌体转运到3T3-L1与AML12细胞中。

实施例9

本实施例提供miRNA-1249-3p对3T3-L1脂肪细胞和AML12肝细胞糖代谢的影响，同样通过构建miRNA-1249-3p模拟物(miRNA-1249-3pmimic)进行。

构建miR-1249-3p模拟物(mimic)、miR-1249-3p模拟物阴性对照(negativecontrol)、miR-1249-3p抑制剂(inhibitor)、miR-1249-3p抑制剂阴性对照(negativecontrol)，均由苏州吉玛基因股份有限公司合成，具体序列为：

miR-1249-3p模拟物(miR-1249-3p mimic)序列：

正义链：5’-ACGCCCUUCCCCCCCUUCUUCA-3’(SEQ ID NO.2)；

反义链：5’-AAGAAGGGGGGGAAGGGCGUUU-3’(SEQ ID NO.3)。

miR-1249-3p模拟物阴性对照(miR-NC)序列：

正义链5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’；

反义链5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。

miR-1249-3p抑制剂(miR-1249-3p inhibitor)序列：

5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’(SEQ ID NO.6)。

miR-1249-3p抑制剂阴性对照(inh-NC)序列：

5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’(SEQ ID NO.7)。

将上述miR-1249-3p模拟物、miR-1249-3p模拟物阴性对照、miR-1249-3p抑制剂、miR-1249-3p抑制剂阴性对照序列转染进3T3-L1与AML12细胞中，转染方法如实施例8所示。

转染后检测3T3-L1细胞的葡萄糖消耗能力和AML12细胞的葡萄糖生成能力，方法如实施例5所述。

结果如图11所示，miR-1249-3p模拟物的转染可以增加脂肪细胞3T3-L1的葡萄糖摄取，减少肝脏细胞AML12的葡萄糖生成，miR-1249-3p inhibitor转染则产生相反的效果。

实施例10

本实施例提供miR-1249-3p模拟物对3T3-L1脂肪细胞和AML12肝细胞中炎症反应的影响。

将上述miR-1249-3p模拟物、miR-1249-3p模拟物阴性对照、miR-1249-3p抑制剂、miR-1249-3p抑制剂阴性对照转染进3T3-L1与AML12细胞中，转染序列如实施例9所示。转染后，使用ELISA试剂盒检测细胞的IL-6，IL-1β，TNF-α表达水平，方法如实施例4所示。

结果如图12所示，miR-1249-3p模拟物的转染可以减少细胞的炎症因子分泌，miR-1249-3p inhibitor转染则有相反的效果。

实施例11

本实施例提供miR-1249-3p对SKOR1mRNA的影响。

委托广州辉园苑医药科技有限公司完成的双荧光素酶报告基因实验显示，将SKOR1 mRNA与miR-1249-3p的结合位点进行突变获得突变型SKOR1 MUT，miR-1249-3p不能使插入SKOR1 MUT的荧光素酶报告基因载体中的荧光素酶失活，而可以使插入SKOR1 WT的载体中的荧光素酶失活，说明野生型SKOR1mRNA可以与miR-1249-3p结合，结果如图13(A)所示。

通过转染miR-1249-3p mimic或inhibitor(由通用生物合成)来过表达或敲低miR-1249-3p的表达水平。转染后WB检测3T3-L1和AML12细胞中的SKOR1蛋白，结果如图13(B)和13(C)所示：miR-1249-3p高表达时，SKOR1蛋白表达水平降低，miR-1249-3p低表达时，SKOR1蛋白表达水平显著更高。

上述表明miR-1249-3p靶向结合SKOR1 mRNA分子，从而抑制SKOR1蛋白的表达。

实施例12

本实施例提供SKOR1蛋白对3T3-L1脂肪细胞和AML12肝细胞糖代谢的影响。

通过转染靶向SKOR1的短发夹状RNA(shRNA)质粒(sh-SKOR1质粒)或带有flag标签的过表达SKOR1质粒(flag-SKOR1质粒)(由通用生物合成)敲低或者过表达SKOR1基因的水平，转染方法如实施例8所示。转染后检测3T3-L1细胞的葡萄糖消耗能力和AML12细胞的葡萄糖生成能力，方法如实施例5所述。

结果：与对照组相比，sh-SKOR1的转染可以增加脂肪细胞3T3-L1的葡萄糖摄取，减少肝细胞AML12的葡萄糖生成，flag-SKOR1的转染则产生相反的效果(如图14)。

实施例13

本实施例提供SKOR1蛋白对3T3-L1脂肪细胞和AML12肝细胞中炎症反应的影响。

通过转染sh-SKOR1或flag-SKOR1质粒(由通用生物合成)敲低或者过表达SKOR1基因的水平。转染后，使用ELISA试剂盒检测细胞的IL-6，IL-1β，TNF-α表达水平。方法如实施例4所示。

结果：细胞因子分泌水平的结果如图15所示，sh-SKOR1转染可以减少细胞的炎症因子分泌，flag-SKOR1转染则有相反的效果。

序列表

<110> 中国药科大学

<120> SKOR1基因作为靶点在2型糖尿病和/或炎症治疗中的应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 3

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acgcccuucc cccccuucuu ca 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acgcccuucc cccccuucuu ca 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aagaaggggg ggaagggcgu uu 22

<210> 4

<211> 30

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acactccagc tgggacttct tccccccctt 30

<210> 5

<211> 44

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgagtgcg ggaa 44

<210> 6

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

caguacuuuu guguaguaca a 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

caguacuuuu guguaguaca a 21

Claims

1.抑制SKOR1基因的表达水平的试剂在制备治疗2型糖尿病药物中的应用；

所述抑制SKOR1基因的表达水平的试剂为SKOR1 mRNA干扰剂；

所述SKOR1 mRNA干扰剂为miR-1249-3p，所述miR-1249-3p的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO.1；或所述SKOR1 mRNA干扰剂为表达或形成miR-1249-3p的构建物；

所述表达或形成miR-1249-3p的构建物为一种miR-1249-3p模拟物，其正义链序列为：ACGCCCUUCCCCCCCUUCUUCA（5′-3′），反义链序列为：AAGAAGGGGGGGAAGGGCGUUU（5′-3′）；或

所述表达或形成miR-1249-3p的构建物为一种NK细胞外泌体，该外泌体含有miR-1249-3p。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述NK细胞来源于脾脏，和/或所述NK细胞外泌体通过差速离心法方法获得。