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CN115786247A - 一种无血清培养基及其在维持毛囊活性、毛发养护及移植方面的应用 - Google Patents

一种无血清培养基及其在维持毛囊活性、毛发养护及移植方面的应用 Download PDF

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Abstract

本发明具体涉及一种无血清培养基及其在维持毛囊活性、毛发养护及移植方面的应用。所述培养基由添加成份和基础培养基组成，所述添加成份包括营养因子、生长因子、辅助因子和抑制细胞凋亡因子中的至少一种。本发明提供的培养基所有成分明确，无动物来源，对人体无毒副作用；该培养基可较好维持毛囊细胞、皮肤角质细胞的活性，存活率达90％左右，增殖能力极佳；本发明的培养基可提供人体毛囊体外生长所需的所有物质，可维持离体毛囊活性一周以上，可维持干细胞再生来源毛囊的活性长达140天以上；采用本发明的培养基培养的毛囊在移植后，可直接生长，避免毛囊进入休止期。

Description

一种无血清培养基及其在维持毛囊活性、毛发养护及移植方 面的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种无血清培养基及其在维持毛囊活性、毛发养护及移植方面的应用。
背景技术
目前，在社会压力及不良生活方式的双重作用下，脱发群体不断壮大，并呈现年轻化趋势。脱发虽然不会严重影响人的生理健康，但是对个人形象、自尊、情感健康都带来了极大的威胁，从而影响人们的工作和生活。植发手术是解决脱发问题的主要技术手段，植发手术中的毛发与供发部位的毛发性质、生长规律完全一致，并且安全无排异性，无不良反应，种植结束后的毛发密度可接近正常密度，外观真实自然，是目前脱发患者的最佳选择。但是针对供体区没有足够发源的患者，该方法也无能为力。干细胞是人体及各种组织的初始来源，干细胞具有自我更新和不断增殖的能力，以及多向分化的潜能，因此通过干细胞体外培养再生毛囊也是解决脱发问题的潜在方向，目前也有多项基于干细胞再生毛囊的研究。
但是，无论植发手术还是干细胞再生毛囊都存在一个共同问题，即随着体外培养时间的增长，离体毛囊活性逐渐丧失或退化。在植发手术过程中，毛囊离体时间约为4-6小时，离体过程中因为环境和温度改变，以及营养物质的缺乏，导致毛囊中部分细胞发生凋亡，从而毛囊移植后会进入一段时间的休止期。而干细胞诱导毛囊过程中所产生的毛囊结构，也可能随着环境的改变和营养的缺乏，导致毛囊的退化。因此，维持毛囊长时间体外培养的活性是保证毛囊移植存活率的关键。目前这是一个研究难点，而本发明正是要攻破这个难点。
发明内容
有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种无血清培养基及其在维持毛囊活性、毛发养护及移植方面的应用，该培养基可以解决植发过程中毛囊长时间离体所导致的存活率低、干细胞再生毛囊过程中毛囊退化等问题。
为实现上述目的，本发明采取以下的技术方案：
第一方面，本发明提供一种培养基，由添加成份和基础培养基组成，所述添加成份包括营养因子、生长因子、辅助因子和抑制细胞凋亡因子中的至少一种。
进一步的，所述基础培养基为DMEM/F-12培养基或者DMEM/F-12培养基和Neurobasal培养基的混合培养基。
优选的，所述基础培养基为DMEM/F-12培养基和Neurobasal培养基的混合培养基时，所述DMEM/F-12培养基和Neurobasal培养基的混合体积比例为1:(0.6～1.4)。
进一步的，所述营养因子为GlutaMAX培养基添加剂、不含维生素A的B-27补充物、N2补充物或insulin中的至少一种。
优选的，所述营养因子为GlutaMAX培养基添加剂、不含维生素A的B-27补充物、N2补充物和insulin。
优选的，GlutaMAX培养基添加剂在培养基中的终浓度为1×，不含维生素A的B-27补充物在培养基中的终浓度为0.2×-1×，N2补充物在培养基中的终浓度为0.2×-1×，insulin在培养基中的终浓度为1-10μg/mL。
更加优选的，GlutaMAX培养基添加剂在培养基中的终浓度为1×，不含维生素A的B-27补充物在培养基中的终浓度为0.5×-1×，N2补充物在培养基中的终浓度为0.5×-1×，insulin在培养基中的终浓度为1-10μg/mL。
进一步的，所述生长因子为EGF、bFGF、aFGF、VEGFA、TGF-beta、WNT3a、PDGF、KGF中的至少一种，其在培养基中的终浓度为2-50ng/mL。
进一步的，所述辅助因子为hydrocortisone、cholera toxin、triiodothyronine、β巯基乙醇、Normocin、Z-VAD-FMK、HA14-1或肌醇中的至少一种。
优选的，所述辅助因子为hydrocortisone、cholera toxin、triiodothyronine、β巯基乙醇、Normocin、Z-VAD-FMK、HA14-1和肌醇。
优选的，hydrocortisone在培养基中的终浓度为0.2-0.8μg/mL；cholera toxin在培养基中的终浓度0.05-0.15nM；triiodothyronine在培养基中的终浓度为0.1-3ug/mL；β巯基乙醇在培养基中的终浓度为0.05-0.1mM；Normocin在培养基中的终浓度为50-200μg/mL；Z-VAD-FMK在培养基中的终浓度为30-60μM；HA14-1在培养基中的终浓度为20-50μM；肌醇在培养基中的终浓度为60-100mg/L。
进一步的，所述抑制细胞凋亡因子为Y-27632，其在培养基中的终浓度为5-20μM。
进一步地，所述培养基的添加成分还包括激素类药物，如地塞米松、可的松、醋酸泼尼松、倍他米松，用量为0.1-1ug/mL。
优选地，所述激素类药物为氢化可的松，用量为0.2-0.5ug/mL。
第二方面，本发明提供上述培养基的制备方法，按照上述培养基的成份及含量混合均匀。
第三方面，本发明提供上述培养基的应用，将所述培养基用于毛囊体外生长培养产品、毛囊细胞培养产品以及毛囊滋养产品的制备。
进一步的，所述毛囊体外生长培养的毛囊为人体毛囊或人体干细胞体外分化形成的毛囊。
优选的，所述人体毛囊包括但不限于头发毛囊，眉毛毛囊，腿部毛囊以及胸部毛囊。
优选的，所述人体干细胞包括但不限于皮肤来源的成体干细胞、诱导多功能干细胞或胚胎干细胞。
本发明的有益效果为：
本发明提供的培养基所有成分明确，无动物来源，对人体无毒副作用；该培养基可较好维持毛囊细胞、皮肤角质细胞的活性，存活率达90％左右，增殖能力极佳；本发明的培养基可提供人体毛囊体外生长所需的所有物质，可维持离体毛囊活性一周以上，可维持干细胞再生来源毛囊的活性长达140天以上；采用本发明的培养基培养的毛囊在移植后，可直接生长，避免毛囊进入休止期。
附图说明
图1为本发明实施例5中培养基培养的毛囊干细胞细胞状态图；
图2为本发明实施例5中培养基和普通血清培养基分别培养角质细胞Hacat的细胞状态图；
图3为本发明实施例5中培养基培养角质细胞Hacat的存活率测试图；
图4为本发明实施例5中不同的培养基培养来源于毛囊干细胞的毛囊类器官、培养人体来源的毛囊培养图；
图5为本发明实施例5中培养基培养来源于毛囊干细胞的毛囊类器官或人体来源的体外毛囊的小鼠体内移植生长图。
图6为本发明实施例6、对比例1～2以及对照组的细胞增殖测试中细胞形态图，其中图1)对应采用对照组培养基培养的细胞形态图，图2)对应采用对比例1培养基培养的细胞形态图，图3)对应采用对比例2培养基培养的细胞形态图，图4)对应采用实施例6培养基培养的细胞形态图。
图7为本发明实施例6、对比例1～2以及对照组的细胞增殖测试中细胞活性检测结果，其中图(1)对应采用对照组培养基培养第一代的细胞活性检测结果，图(2)对应采用对比例1培养基培养第一代的细胞活性检测结果，图(3)对应采用对比例2培养基培养第三代的细胞活性检测结果，图(4)对应采用实施例6培养基培养第三代的细胞活性检测结果。注：图7中细胞培养3天传代一次。
图8为本发明实施例6和对比例1～2的细胞增殖测试中增值曲线。
图9为本发明实施例6、对比例1～2以及对照组的细胞凋亡测试结果。
图10为本发明实施例6、对比例1～2以及对照组的细胞周期测试结果
图11为本发明实施例6、对比例1～2以及对照组的人体毛囊活性测试-4h的结果。
图12为本发明实施例6、对比例1～2以及对照组的人体毛囊活性测试-8h的结果。
图13为本发明实施例6、对比例1～2以及对照组的人体毛囊活性测试-15h的结果。
图14为本发明实施例6、对比例1～2以及对照组的人体毛囊活性测试-24h的结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案作进一步清楚、完整地描述。需要说明的是，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种无血清培养基，由添加成份和基础培养基组成，所述添加成份为营养因子；所述基础培养基为DMEM/F-12培养基和Neurobasal培养基的混合培养基，DMEM/F-12培养基和Neurobasal培养基的混合体积比例为1：1；所述营养因子为GlutaMAX培养基添加剂、不含维生素A的B-27补充物、N2补充物和insulin；GlutaMAX培养基添加剂在培养基中的终浓度为1X，不含维生素A的B-27补充物在培养基中的终浓度为0.5X，N2补充物在培养基中的终浓度为0.5X，insulin在培养基中的终浓度为5μg/mL。
实施例2
一种无血清培养基，由添加成份和基础培养基组成，所述添加成份为生长因子；所述基础培养基为DMEM/F-12培养基和Neurobasal培养基的混合培养基，DMEM/F-12培养基和Neurobasal培养基的混合体积比例为1：1；所述生长因子为EGF，其在培养基中的终浓度为10ng/mL。
实施例3
一种无血清培养基，由添加成份和基础培养基组成，所述添加成份为辅助因子；所述辅助因子为hydrocortisone、cholera toxin、triiodothyronine、β巯基乙醇、Normocin、Z-VAD-FMK、HA14-1和肌醇；hydrocortisone在培养基中的终浓度为0.4μg/mL，choleratoxin在培养基中的终浓度为0.1nM，triiodothyronine在培养基中的终浓度为2nM，β巯基乙醇在培养基中的终浓度为0.1mM，Normocin在培养基中的终浓度为100μg/mL，Z-VAD-FMK在培养基中的终浓度为50μM，HA14-1在培养基中的终浓度为50μM，肌醇在培养基中的终浓度为100mg/L。
实施例4
一种无血清培养基，由添加成份和基础培养基组成，所述添加成份为抑制细胞凋亡因子；所述基础培养基为DMEM/F-12培养基和Neurobasal培养基的混合培养基，DMEM/F-12培养基和Neurobasal培养基的混合体积比例为1：1；所述抑制细胞凋亡因子为Y-27632，其在培养基中的终浓度为10μM。
实施例5
一种无血清培养基，由添加成份和基础培养基组成，所述添加成份包括营养因子、生长因子、辅助因子和抑制细胞凋亡因子；
所述基础培养基为DMEM/F-12培养基和Neurobasal培养基的混合培养基，DMEM/F-12培养基和Neurobasal培养基的混合体积比例为1：1；
所述营养因子为GlutaMAX培养基添加剂、不含维生素A的B-27补充物、N2补充物和insulin；GlutaMAX培养基添加剂在培养基中的终浓度为1X，不含维生素A的B-27补充物在培养基中的终浓度为0.5X，N2补充物在培养基中的终浓度为0.5X，insulin在培养基中的终浓度为5μg/mL；
所述生长因子为EGF，其在培养基中的终浓度为10ng/mL；
所述辅助因子为hydrocortisone、cholera toxin、triiodothyronine、β巯基乙醇、Normocin、Z-VAD-FMK、HA14-1和肌醇；hydrocortisone在培养基中的终浓度为0.4μg/mL，cholera toxin在培养基中的终浓度为0.1nM，triiodothyronine在培养基中的终浓度为2nM，β巯基乙醇在培养基中的终浓度为0.1mM，Normocin在培养基中的终浓度为100μg/mL，Z-VAD-FMK在培养基中的终浓度为50μM，HA14-1在培养基中的终浓度为50μM，肌醇在培养基中的终浓度为100mg/L；
所述抑制细胞凋亡因子为Y-27632，其在培养基中的终浓度为10μM。
所用的普通血清培养基购自gibco。
将实施例5的培养基用于以下实验测试：
一、毛囊干细胞培养
采用实施例5中的培养基培养人体毛囊分离出的毛囊干细胞，培养方法如下：
将人体毛囊组织放置于含有100U/mL青霉素与100μg/mL链霉素的PBS中，清洗3次，每次10min。随后，将毛囊组织转移到含有实施例5中的培养基的无菌培养皿中，使用无菌的剪刀和镊子，修剪掉毛囊下部周围的粘附性脂肪或结缔组织。通过针头粘附，使毛囊粘附于皿底。然后用右手针将毛囊固定到板上，顺时针旋转针90度，使斜切的边缘朝左，释放针头上的压力，将针头从左向右拖离，并与皿保持接触。此过程可以将毛囊固定在皿上，同时切割毛囊，使得毛囊干细胞以星爆形式从完整的毛囊结构中迁移出来。将上述贴壁的毛囊转移至细胞培养箱中培养，第二天，再次补充实施例5中的培养基，继续在37℃,5％ CO2培养箱中培养。十天后，检查细胞生长状态，之后每隔2-3天更换培养基。毛囊干细胞的生长情况如图1所示。图1中A为离体的人体毛囊，B、C为在不同视野下，毛囊贴壁培养后，毛囊组织中爬出的原代毛囊细胞，D为经过传代培养的毛囊细胞。由图1可知，本发明的培养基可维持毛囊干细胞的活性，高达95％以上。
二、角质细胞Hacat培养
(1)采用实施例5中的培养基培养角质细胞Hacat，培养方法如下：
液氮罐中取出冻存细胞Hacat，37℃水浴快速解冻，将细胞悬液转移至含培养基的15mL离心管中，轻吹混匀，210g离心5分钟，弃除上清。加入培养基重悬细胞，然后转移至培养皿中，37℃、5％CO2培养箱中培养。待细胞汇合率达70-80％时，弃旧培养液，PBS洗涤细胞，胰酶消化5min。消化完成后，弃去胰酶，加入新鲜培养基终止消化，吹打细胞成单细胞悬液，将细胞悬液转移至15mL离心管中，210g离心5分钟，弃除上清。分别加入新鲜培养基和普通血清培养基重悬，并分别转移至新的培养皿中进一步培养。分别培养不同天数的细胞状态图如图2中A图所示。分别取生长良好的细胞，胰酶消化，离心，去上清，加入新鲜适量的培养基或普通血清培养基重悬细胞，使之成为单细胞悬液。准备血球计数板，洗净晾干，吸取一定量的细胞悬液，加样到血球计数板上，显微镜下计数。细胞再培养，准备6孔板，每孔中加入0.4mL的细胞(即1×105个细胞)和0.6mL的培养基或普通血清培养基，轻轻晃动孔板(十字方向晃动)，使细胞分布均匀，并进行常规细胞培养(48h后换液培养)。每过24h取样一次，取样细胞常规胰酶消化，制备单细胞悬液，显微镜下进行细胞计数。计数结果，以时间(d)为横坐标，细胞数为纵坐标，绘制细胞生长曲线，如图2中B图所示。
由图2可知，本发明的培养基可促使角质细胞Hacat的增殖，2-3天汇合率达80-90％，并具备良好的生长能力，与普通血清培养基的增殖能力相比，无显著性差异，甚至后期增殖能力优于普通血清培养基。
(2)取上述培养基培养的生长状态良好的细胞，吸出旧培养液，PBS洗涤，胰蛋白酶消化。消化完成后，加入胰蛋白酶两倍体积的培养基，轻轻吹打细胞，将吹打下的细胞转移到离心管内，1000g离心5分钟，弃上清。收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。取5-10万细胞，1000g离心5分钟，弃上清，加入195μL Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。随后加入5μL Annexin V-FITC，轻轻混匀。加入10μL碘化丙啶染色液，轻轻混匀。室温(20-25℃)避光孵育10-20分钟，随后置于冰浴中，铝箔包裹进行避光。孵育过程中可以重悬细胞2-3次以改善染色效果。10-20min后流式细胞仪检测。Hacat细胞染色如图3中A图所示，Annexin V-FITC为绿色荧光，碘化丙啶(PI)为红色荧光。Hacat经过Annexin-V FITC凋亡检测的流式细胞仪图像如图3中B图所示。
由图3可知，本发明培养基较好的保持了皮肤角质细胞长期培养的存活率，存活率可达90％左右。
三、毛囊培养
(1)来源于毛囊干细胞的毛囊培养
当毛囊类器官在体外培养第12天后，将培养基更换为实施例5的培养基，每孔0.5mL，每三天半换液。45天后，每隔一天使用培养基更换一半的培养基，且保证每周有一次完全去除培养基，到毛囊类器官分化的第80天，将培养基体积增加到1mL。同样隔天半换液，一周全换液的方式继续培养。图4中A图为来源于毛囊干细胞的毛囊培养不同天数的毛囊生长状况(110、112、117、120天)；图4中B图为来源于毛囊干细胞的毛囊培养140天时的Ki67染色的细胞增殖图。
当毛囊类器官在体外培养第12天后，将培养基分别更换为普通血清培养基、实施例5中缺少不含维生素A的B-27补充物的培养基、实施例5中缺少N2补充物的培养基，培养结果分别如图4中C、D、E图所示。由图4C可知，当采用普通血清培养基培养诱导毛囊类器官后，细胞无法聚集成球，随后细胞死亡；由图4中D图可知，当培养基中缺少不含维生素A的B-27补充物后，细胞散落，无法成球培养，状态不佳；由图4中E图可知，当培养基中缺少N2补充物后，虽可培养形成类器官，但边缘细胞逐渐脱落，后期直至死去，培养时间不足一月。
(2)人体毛囊的培养
取植发手术中剥离的毛囊，浸泡在生理盐水中，冰上保存。首先以生理盐水清洗毛囊，去除表面残留血液，随后转移至含青霉素(200U/mL)链霉素(200μg/mL)的D-Hanks缓冲液中冲洗约3min，再转移至含青霉素(100U/mL)链霉素(100μg/mL)的D-Hanks缓冲液中冲洗2次，每次2min，全过程在冰上进行。清洗干净后，将其转移至含有0.5mL/孔毛囊干细胞培养基的24孔板中，每孔1根。将培养板置于37℃，5％CO2的培养箱中培养，每日观察毛囊形态变化并测量毛囊长度。图4中F图为人体毛囊在培养不同天数的毛囊生长状态图(1、2、4、6、8天)；图4中G图为人体毛囊培养后的显微镜图；图4中H图为人体毛囊的Ki67染色的细胞增殖图。
由图4可知，本发明的培养基培养来源于毛囊干细胞的毛囊，可维持其活性长达140天，维持离体人体毛囊的活性可达一周以上。
四、毛囊移植
收集上述来源于毛囊干细胞的毛囊类器官或人体来源的体外毛囊，置于含有实施例5的培养基浸润的纱布上，冰上储存。准备5-6周裸鼠。将裸鼠麻醉后，使用注射器在裸鼠背部皮肤制作小切口(可容纳单根毛囊)，将预先准备的来源于毛囊干细胞的毛囊或人体来源毛囊置于单独的切口部位，毛球面朝内，接触小鼠的肌肉层，毛干朝外，暴露在空气中。将敷料覆盖在小鼠背部的移植区域，并使用绷带缠绕裸鼠的身体收紧移植区域。然后，缝合绷带以保持稳定。手术后，为裸鼠提供卡洛芬湿粮以缓解疼痛。手术后7-9天去除敷料。手术后观察小鼠7或14周。移植效果如图5所示。
图5中A图为来源于毛囊干细胞培养的毛囊类器官，图5中B图为采用毛囊类器官移植后一月后的裸鼠，裸鼠背部出现较短毛发，图5中C图为移植两月后的裸鼠，毛囊长度不断增长；图5中D图为分离的人体来源的体外毛囊，图5E为体外毛囊种植至裸鼠背部，图5中F图为移植2周后的毛囊。由图5可知，在毛囊移植过程中，采用本发明的培养基，不论是来源于毛囊干细胞的毛囊或人体来源毛囊，移植后无毛囊脱落与死亡，即显示毛囊已进入生长期，避免休止期，显著提高移植毛囊的存活率。
实施例6
一种无血清培养基，由添加成份和基础培养基组成，所述添加成份包括营养因子、生长因子、辅助因子、抑制细胞凋亡因子和糖皮质激素类药物；
所述基础培养基为DMEM/F-12培养基；
所述营养因子为GlutaMAX培养基添加剂、不含维生素A的B-27补充物、N2补充物和insulin，GlutaMAX培养基添加剂在培养基中的终浓度为1×；不含维生素A的B-27补充物在培养基中的终浓度为0.2×；N2补充物在培养基中的终浓度为0.2×；insulin在培养基中的终浓度为5μg/mL；
所述生长因子为bFGF，其在培养基中的终浓度为10ng/mL；
所述辅助因子为Triiodothyronine和肌醇，Triiodothyronine在培养基中的终浓度为0.4μg/mL；肌醇在培养基中的终浓度为100mg/L；
所述抑制细胞凋亡因子为Y-27632，其在培养基中的终浓度为5μM；
所述糖皮质激素类药物为氢化可的松，其在培养基中的终浓度为0.4ug/mL。
对比例1
一种无血清培养基，由添加成份和基础培养基组成，所述添加成份包括营养因子、生长因子、抑制细胞凋亡因子；
所述基础培养基为DMEM/F-12培养基；
所述营养因子为GlutaMAX培养基添加剂，GlutaMAX培养基添加剂在培养基中的终浓度为1×；
所述生长因子为bFGF，其在培养基中的终浓度为10ng/mL；
所述抑制细胞凋亡因子为Y-27632，其在培养基中的终浓度为5μM。
对比例2
一种无血清培养基，由添加成份和基础培养基组成，所述添加成份包括营养因子、生长因子、抑制细胞凋亡因子；
所述基础培养基为DMEM/F-12培养基；
所述营养因子为GlutaMAX培养基添加剂、不含维生素A的B-27补充物、N2补充物，GlutaMAX培养基添加剂在培养基中的终浓度为1×；不含维生素A的B-27补充物在培养基中的终浓度为0.2×；N2补充物在培养基中的终浓度为0.2×；
所述生长因子为bFGF，其在培养基中的终浓度为10ng/mL；
所述抑制细胞凋亡因子为Y-27632，其在培养基中的终浓度为5μM。
将实施例6(对应附图及下文中的配方3)、对比例1(对应附图及下文中的配方1)、对比例2(对应附图及下文中的配方2)以及采用生理盐水(对照组)的培养基进行如下测试：
一、细胞增殖测试
细胞增殖测试实验方法与实施例5中二、角质细胞Hacat培养的(1)小节相同。
图6给出了采用实施例6、对比例1～2和对照组的培养基分别培养16h、2天、4天、6天的细胞形态图，其中，采用实施例6的培养基获得的细胞致密性以及增值速度明显优于对比例1～2和对照组细胞。
图7给出了采用实施例6和对比例1～2的培养基培养细胞活性检测结果，其中，对照组培养基培养第一代，对比例1培养基培养第一代，对比例2培养基培养第三代，实施例6培养基培养第三代。并且细胞培养每3天传一代。利用碧云天Calcein AM细胞活性与凋亡检测试剂盒进行染色，共聚焦拍照。Calcein染色为活性细胞，PI染色为凋亡细胞，Merge代表将Calcein染色的活性细胞图和PI染色的凋亡细胞图融合。发现利用生理盐水培养的细胞，第一代细胞即全部凋亡不能连续传代。配方1(对比例1)可维持细胞活性，少许细胞凋亡，但无法连续传代。配方2(对比例2)和配方3(实施例6)均能维持细胞活性，并促进细胞增殖，基本无明显细胞凋亡，可连续传代至少3代。
图8给出了实施例6、对比例1～2和对照组培养基获得的细胞增殖测试中的增殖曲线，配方2,3处理7天后的细胞显示正常的细胞增殖曲线，且配方3相较于配方2更有利于细胞增殖，配方1处理7天后的细胞增殖缓慢，对照组NaCl处理7天后的细胞不增殖，且出现细胞死亡。
根据上述细胞形态观察实验以及增殖实验得出如下结论：
1)对照组中的角质细胞Hacat在培养时基本无法贴壁，全部漂浮，继而死亡。
2)配方1：即最基础培养基中细胞可以正常贴壁，但增殖缓慢，4天后增殖达到平台期，6天后细胞汇合率不足配方二和配方三培养时的四分之一。仅能传一代。
3)配方2：该培养基培养的细胞具有正常的细胞形态，细胞聚集生长，增殖速率与普通培养基(DMEM+10％FBS)相比无明显差别。正常培养情况下，3-4天传代一次，可连续传代。
4)配方3：该培养基培养的细胞形态增殖速率明显优于前面三种培养基以及普通培养基，4天后，细胞数可达到2×106个细胞。正常培养情况下，2天即需传代，可连续传代。
二、细胞凋亡测试
细胞凋亡测试实验方法与实施例5中二、角质细胞Hacat培养的(2)小节相同。
图9给出了采用实施例6、对比例1～2以及对照组处理3天后的细胞凋亡测试结果，配方1,2,3处理3天后的细胞凋亡程度相差不大，配方1<2<3，对照组NaCl处理3天后的细胞出现高达89.83％的细胞出现晚期凋亡和坏死情况。
图10给出了采用实施例6、对比例1～2以及对照组处理3天后的细胞周期测试结果，配方1,2,3处理3天后的周期显示正常，对照处理3天后的细胞处于S期与G2/M期偏多，细胞周期阻滞在该时期，导致细胞增殖异常。
三、人体毛囊活性测试
人体毛囊活性测试实验方法与实施例5中三、毛囊培养的(2)小节：人体毛囊的培养部分相同。
图11给出了实施例6和对比例1～2的人体毛囊活性测试-4h的结果，体外培养4h时，各配方培养基培养的人体毛囊增殖活性无较大差异。
图12给出了实施例6和对比例1～2的人体毛囊活性测试-8h的结果，体外培养8h时，各配方培养基培养的人体毛囊增殖活性无较大差异，对照组活性稍低。
图13给出了实施例6和对比例1～2的人体毛囊活性测试-15h的结果，体外培养15h时，各配方培养基培养的人体毛囊增殖活性开始降低，但组与组之间无较大差异，对照组毛囊活性丧失。
图14给出了实施例6和对比例1～2的人体毛囊活性测试-24h的结果，体外培养24h时，各配方培养基培养的人体毛囊增殖活性降低，配方三处理毛囊活性稍优于配方一和配方二，对照组毛囊活性丧失。
综上，根据上述结果，配方1作为最基础培养基，可以维持细胞的形态与存活率，但增殖缓慢，无法连续传代，不适用于细胞培养。配方2可维持细胞正常形态以及正常的增殖速率，可传3代以上，可用于普通细胞培养。配方3培养的细胞具有优异的增殖速率，可较好的维持细胞活率及人体毛囊的活性，可用于体外毛囊培养。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种无血清培养基，其特征在于，由添加成份和基础培养基组成，所述添加成份包括营养因子、生长因子、辅助因子和抑制细胞凋亡因子中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，所述基础培养基为DMEM/F-12培养基或者DMEM/F-12培养基和Neurobasal培养基的混合培养基。
3.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，所述营养因子为GlutaMAX培养基添加剂、不含维生素A的B-27补充物、N2补充物或insulin中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的无血清培养基，其特征在于，GlutaMAX培养基添加剂在培养基中的终浓度为1×，不含维生素A的B-27补充物在培养基中的终浓度为0.2×-1×，N2补充物在培养基中的终浓度为0.2×-1×，insulin在培养基中的终浓度为1-10μg/mL。
5.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，所述生长因子为EGF、bFGF、aFGF、VEGFA、TGF-beta、WNT3a、PDGF、KGF中的至少一种，其在培养基中的终浓度为2-50ng/mL。
6.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，所述辅助因子为hydrocortisone、cholera toxin、triiodothyronine、β巯基乙醇、Normocin、Z-VAD-FMK、HA14-1或肌醇中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的无血清培养基，其特征在于，hydrocortisone在培养基中的终浓度为0.2-0.8μg/mL；cholera toxin在培养基中的终浓度0.05-0.15nM；triiodothyronine在培养基中的终浓度为0.1-3ug/mL；β巯基乙醇在培养基中的终浓度为0.05-0.1mM；Normocin在培养基中的终浓度为50-200μg/mL；Z-VAD-FMK在培养基中的终浓度为30-60μM；HA14-1在培养基中的终浓度为20-50μM；肌醇在培养基中的终浓度为60-100mg/L。
8.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，所述抑制细胞凋亡因子为Y-27632，其在培养基中的终浓度为5-20μM。
9.根据权利要求1～8任意一项所述的无血清培养基，其特征在于，所述培养基的添加成分还包括激素类药物，用量为0.1-1ug/mL。
10.权利要求1～8任意一项所述的无血清培养基的应用，其特征在于，将所述无血清培养基用于毛囊体外生长培养产品、毛囊细胞培养产品以及毛囊滋养产品的制备。
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Denomination of invention: A serum-free culture medium and its application in maintaining hair follicle activity, hair care, and transplantation

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Pledgee: Agricultural Bank of China Limited Foshan Zumiao Sub-branch

Pledgor: Long peptide biopharmaceutical Co.,Ltd.

Registration number: Y2024980000968

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