CN115737530B - 基于光动力灭菌且兼具抗氧化作用的微针及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了基于光动力灭菌且兼具抗氧化作用的微针及其制备和应用，属于医用生物材料领域。该微针的制备方法包括：(1)微针针尖前体溶液的配制；(2)微针衬底溶液的制备；(3)微针的制备。与传统经皮递送系统相比，本发明的微针通过本身的物理结构，进行深层递送药物，杀灭皮肤内部细菌；避免了抗生素滥用及耐受机制的产生，利用Cur@ZIF‑8的光动力作用，实现微针在蓝光照射下产生ROS有效的灭菌，而通过微针衬底的ROS响应后，释放出抗炎、促进皮肤修复的药物消除ROS；能够精确把控给药剂量，确保杀死细菌的同时，减少对机体本身的潜在损伤，促进皮肤伤口的愈合；同时，微针针尖本身的透明质酸和胶原都能很好的促进皮肤的再生。
Description
技术领域
本发明属于医用生物材料领域，涉及微针贴片皮肤敷料，尤其涉及一种基于光动力灭菌且兼具抗氧化作用的微针及其制备和应用。
背景技术
经皮给药系统，如喷雾剂、膏剂、巴布剂等，以其提高患者依从性、连续给药、避免首过效应等优点，被视为潜在的最佳给药方式。而微针，作为一种近年来新型的经皮给药系统，目前在基础实验中，已被广泛的用于多种化学药物和生物药物的透皮递送，但目前上市的产品基本上是在美容领域，进行美白、祛斑等。
传统皮肤敷料，如巴布剂、软膏剂等，在皮肤伤口部位长时间使用会导致产生皮肤过敏等不耐受反应，且很难控制给药的剂量；如凝胶，则很容易在有伤口渗出液的情况下变得可移动，治疗效果较差；再如固体敷料纱布，它对伤口本身的愈合没有任何积极作用，同时也会面临更换不便的问题。而喷雾剂、气雾剂由于对药物的要求较为苛刻，且成本较高，也限制了其发展。除此之外，一般敷料因其只作用于皮肤表面，而由于皮肤结构的阻碍，有效成分很难渗透进入，故效果也较差。
目前，在微针领域已有其抗菌功能的广泛研究，其中，以金、银、铜纳米粒子为代表的无机金属材料被视为改善抗生素耐受细菌感染的有效治疗物质，已经被广泛应用于微针抗菌，但是这些材料本身的毒性以及在伤口的蓄积限制了在人体上的长期应用。同时，这些普通抗菌微针，往往是单层结构，即使成功抵抗细菌感染，但其本身对伤口修复也只能依靠机体本身的功能，且仍面临再次感染的风险。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供一种基于光动力灭菌且兼具抗氧化作用的微针及其制备和应用，该微针是一种具有级联反应的ROS响应性双层精确给药微针贴片产品，主要用于抗菌修复皮肤创面。
为了实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
本发明的目的之一是提供一种基于光动力灭菌且兼具抗氧化作用的微针的制备方法，包括：
(1)微针针尖前体溶液的配制
将光动力纳米颗粒与透明质酸溶液和胶原溶液共混，配制成微针针尖前体溶液；
(2)微针衬底溶液的制备
在聚乙烯醇(PVA)溶液中加入还原型谷胱甘肽，搅拌共混，得乳白色溶液，再向其中加入TSPBA溶液，得ROS响应性的TSPBA-PVA@GSH水凝胶微针衬底溶液；
(3)微针的制备
将微针针尖前体溶液浇铸于PDMS模板上，离心，让溶液充分填充模板的空腔，离心结束后刮掉PDMS模具表面多余的溶液，然后加入适量的TSPBA-PVA@GSH水凝胶微针衬底溶液，完全覆盖住针尖，再次离心，干燥，脱模即得成品。
进一步地，步骤(1)中，所述光动力纳米颗粒为负载姜黄素的沸石咪唑骨架-8(Cur@ZIF-8)，光动力纳米颗粒在蓝光动力作用下诱导细菌内部产生活性氧。
作为优选，步骤(1)中，采用Cur@ZIF-8与2～6％(w/v)的透明质酸溶液和2～6％(w/v)的胶原溶液共混配制成姜黄素实际含量为1～5mg/mL的微针针尖前体溶液，透明质酸溶液和胶原溶液的用量比为2:1～3。
更优选的，步骤(1)中，采用Cur@ZIF-8与4％(w/v)的透明质酸溶液和4％(w/v)的胶原溶液共混配制成姜黄素实际含量为2.4mg/ml的微针针尖前体溶液，透明质酸溶液和胶原溶液的用量比为1:1。
进一步地，步骤(2)中，称取0.35gPVA在95℃下溶于10mL的RO水中，待溶液变得澄清透明，得到PVA溶液，加入10mg的还原型谷胱甘肽，搅拌共混30mins，得澄清溶液，称取TSPBA0.35g溶于1mLRO水中配制成TSPBA溶液，在TSPBA溶液中加入澄清溶液，得ROS响应性的TSPBA-PVA@GSH水凝胶微针衬底溶液，其中，TSPBA溶液与澄清溶液混合的体积比为2:1。
进一步地，步骤(3)中，所述离心的转速为1000～50000r/min、时间为5～10mins。优选地，所述离心的转速为3000r/min、时间为5mins。
进一步地，步骤(3)中，所述干燥是在干燥箱中于温度20～30℃、相对湿度控制为3～4％条件下干燥处理12～48h。优选地，所述干燥是在干燥箱中于温度25℃、相对湿度控制为3.5％条件下干燥处理24h。
本发明的目的之二是提供一种基于光动力灭菌且兼具抗氧化作用的微针，通过上述制备方法制备得到。
进一步地，所述基于光动力灭菌且兼具抗氧化作用的微针包括圆锥形的微针针尖，微针针尖的高度为1450μm，微针针尖按10*10个阵列分布在微针衬底一侧。
作为优选，所述微针针尖的底面半径为580μm，微针针尖的尖端行间距为1250μm，微针衬底的厚度为300μm。
本发明的目的之三是提供一种基于光动力灭菌且兼具抗氧化作用的微针在医用皮肤创面敷料方面的应用。
本发明的基于光动力灭菌且兼具抗氧化作用的微针的作用机理：通过将本发明的微针针尖插入细菌感染的皮肤后，微针针尖基质成分(透明质酸和胶原)会在短时间内溶解，释放出包裹的定量的姜黄素，此时在体外进行蓝光照射，姜黄素会诱导细菌内部产生活性氧(ROS)，细菌由内自外的裂解死亡，实现抗菌的效果；但此时细菌感染的伤口表面就会有大量不利于皮肤修复的ROS存在，高量的ROS使微针衬底的成分TSPBA和PVA间的交联键断裂，释放微针衬底搭载的还原型谷胱甘肽药物，便能够通过微针衬底响应性的清除ROS，从而促进伤口的愈合，同时也能减少炎症的影响。
本发明的有益技术效果：
1.与传统经皮递送系统相比，本发明的微针通过本身的物理结构，进行深层递送药物，杀灭皮肤内部细菌。
2.本发明的微针避免了抗生素滥用及耐受机制的产生，利用Cur@ZIF-8的光动力作用，实现微针在蓝光照射下产生ROS有效的灭菌。
3.本发明能够精确把控给药剂量，确保杀死细菌的同时，减少对机体本身的潜在损伤；通过首先在体外进行验证Cur@ZIF-8的实际抗菌效果，从而通过计算，确定每片微针中需要加载Cur@ZIF-8的含量。
4.本发明的微针促进皮肤伤口的愈合，在细菌的杀灭过程中以及炎症会使得皮肤表面有大量ROS的产生，而通过微针衬底的ROS响应后，释放出抗炎、促进皮肤修复的药物消除ROS；同时，微针针尖本身的透明质酸和胶原都能很好的促进皮肤的再生。
附图说明
图1是本发明实施例制备的微针的光学图；
图2是本发明实施例制备的微针的SEM图；
图3是本发明实施例制备的微针中Cur@ZIF-8纳米粒子的SEM图；
图4是本发明实施例制备的微针的荧光图；
图5是本发明实施例制备的微针中Cur@ZIF-8纳米粒子的释放情况；
图6是本发明的抗菌性能实验中不照射蓝光时大肠杆菌的存活情况；
图7是本发明的抗菌性能实验中照射蓝光时大肠杆菌的存活情况。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明，显然所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明的保护的范围。
实施例一种基于光动力灭菌且兼具抗氧化作用的微针的制备
(1)Cur@ZIF-8的制备
取六水合硝酸锌(80mg，0.27mmoL)溶解在3mL超纯水中，2-甲基咪唑(176mg，2.14mmoL)和姜黄素2.67mg溶解在6ml无水甲醇中；将两种溶液超声溶解4min后，将六水合硝酸锌溶液快速地加入到2-甲基咪唑和姜黄素的混合溶液中，搅拌8min，溶液呈橙黄色悬浊液即合成Cur@ZIF-8。使用前，需要将该悬浊液用甲醇10000rpm离心下清洗2次，再用去离子水溶解备用。
(2)微针针尖前体溶液的配制
为了实现经皮给药系统的精确给药，确保每片微针的给药剂量，通过对PDMS模具的精确计算，得到针尖的总体积。我们将4.8mg的Cur@ZIF-8纳米颗粒与4％(w/v)的透明质酸溶液2mL和4％(w/v)的胶原溶液2mL共混配制成姜黄素实际含量为2.4mg/mL的微针针尖前体溶液。
(3)TSPBA的合成
将4.6mmol/L4-(溴甲基)苯硼酸(1g)和1.5mmol/LTMPA(0.2g)溶于40mL DMF中，将溶液在60℃下搅拌24h后，将混合物倒入100mL四氢呋喃中过滤，并用四氢呋喃洗涤3次，将产物冷冻干燥过夜，获得纯TSPBA约0.6g。
(4)微针衬底溶液的制备
称取0.35gPVA在95℃下溶于10mL的RO水中，待溶液变得澄清透明，得到PVA溶液，加入10mg的还原型谷胱甘肽，搅拌共混30mins，得澄清溶液，称取TSPBA0.35g溶于1mLRO水中配制成TSPBA溶液，在TSPBA溶液中加入澄清溶液，得ROS响应性的TS PBA-PVA@GSH水凝胶微针衬底溶液，其中，TSPBA溶液与澄清溶液混合的体积比为2:1。
(5)微针的制备
通过高速离心两步模板法制备，具体是将微针针尖前体溶液浇铸于PDMS模板上，在转速为3000r/min下离心5min，让溶液充分填充模板的空腔，离心结束后，刮掉PDMS模具表面多余的微针针尖前体溶液；然后加入适量的TSPBA-PVA@GSH水凝胶微针衬底溶液，完全覆盖住针尖，同样在转速为3000r/min下离心5min，最后在干燥箱中于温度25℃、相对湿度控制为3.5％条件下干燥24h，脱模即得。如图1-5所示，我们可以看到本发明的微针制备成功。
使用方法：将制备好的微针针尖侧插入细菌感染的皮肤，微针基质(透明质酸和胶原)会在短时间内溶解，释放出微针针尖包裹的定量的姜黄素，此时，在体外进行蓝光照射，姜黄素会诱导细菌内部产生ROS，细菌由内自外的裂解死亡。但此时，细菌感染的伤口表面就会有大量的ROS存在，因此，微针衬底产生ROS响应效果，释放搭载的还原型谷胱甘肽这种药物，便能够响应性的清除ROS，从而促进伤口的愈合，同时也能减少炎症的影响。
实验例1抗菌性能
取两组液体培养基，均加入100μL106CFU的大肠杆菌和100μL106CFU的金黄色葡萄球菌，其中一组为载药微针组，溶解1ml本发明的微针，另一组为空白微针组，两组液体培养基避光条件下孵育40mins。然后分别进行涂板，涂完板后，加入本发明的微针的固体培养基再分为两组，分别进行蓝光照射30min和不照射蓝光处理，不加入本发明的微针的固体培养基也进行蓝光照射30mins处理，将所有固体培养基放入细菌培养箱培养12h后，取出。
结果发现：如图6和7所示，加入本发明的微针且照射蓝光的固体培养基组表面无细菌生长，而加入本发明的微针但未照蓝光的固体培养基组和不加入本发明的微针但照了蓝光的固体培养基组均有明显的菌落生长。
实验例2抗菌机制的验证
采用H2DCFDA(DCFH-DA)探针法，验证光动力杀菌的机制。通过荧光显微镜下观察，发现了大量活性氧物质的存在，说明在蓝光照射下，Cur@ZIF-8诱导细菌内部产生ROS，从而细菌裂解死亡。
实施例3ROS响应机制的验证
TSPBA-PVA@GSH水凝胶微针衬底在0.25mmol/L的过氧化氢下会逐渐溶解，而在PBS中不会溶解；且进行蓝光抗菌实验组中，照射蓝光后，TSPBA-PVA@GSH水凝胶微针衬底会溶解，而不照射蓝光的TSPBA-PVA@GSH水凝胶微针衬底均无明显溶解。
实施例4级联机制的验证
将本发明的微针和不载药的空白微针(无Cur@ZIF-8)分别置于接种了106CFU的大肠杆菌和106CFU的金黄色葡萄球菌的12孔板中，避光条件下孵育40mins。40mins后，观察到空白微针完全溶解，而本发明的微针针尖溶解，微针衬底仍不溶解。之后进行1h的蓝光持续照射，此时微针衬底由于细菌死亡释放出的ROS而响应性的使其结构破坏，进而溶解。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.基于光动力灭菌且兼具抗氧化作用的微针的制备方法，其特征在于，包括：
(1)微针针尖前体溶液的配制
将光动力纳米颗粒与透明质酸溶液和胶原溶液共混，配制成微针针尖前体溶液；所述光动力纳米颗粒为负载姜黄素的沸石咪唑骨架-8纳米颗粒Cur@ZIF-8，光动力纳米颗粒在蓝光动力作用下诱导细菌内部产生活性氧；
(2)微针衬底溶液的制备
在聚乙烯醇PVA溶液中加入还原型谷胱甘肽，搅拌共混，得乳白色溶液，再向其中加入TSPBA溶液，得ROS响应性的TSPBA-PVA@GSH水凝胶微针衬底溶液；
(3)微针的制备
将微针针尖前体溶液浇铸于PDMS模板上，离心，让溶液充分填充模板的空腔，离心结束后刮掉PDMS模具表面多余的溶液，然后加入适量的TSPBA-PVA@GSH水凝胶微针衬底溶液，完全覆盖住针尖，再次离心，干燥，脱模即得成品。
2.根据权利要求1所述的基于光动力灭菌且兼具抗氧化作用的微针的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，采用Cur@ZIF-8与2～6％w/v的透明质酸溶液和2～6％w/v的胶原溶液共混配制成姜黄素实际含量为1～5mg/mL的微针针尖前体溶液，透明质酸溶液和胶原溶液的用量比为2:1～3。
3.根据权利要求1所述的基于光动力灭菌且兼具抗氧化作用的微针的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，称取0.35g PVA在95℃下溶于10mL的RO水中，待溶液变得澄清透明，得到PVA溶液，加入10mg的还原型谷胱甘肽，搅拌共混30mins，得澄清溶液，称取TSPBA 0.35g溶于1mL RO水中配制成TSPBA溶液，在TSPBA溶液中加入所述澄清溶液，得ROS响应性的TSPBA-PVA@GSH水凝胶微针衬底溶液，其中，TSPBA溶液与所述澄清溶液混合的体积比为2:1。
4.根据权利要求1所述的基于光动力灭菌且兼具抗氧化作用的微针的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述离心的转速为1000～50000r/min、时间为5～10mins。
5.根据权利要求1所述的基于光动力灭菌且兼具抗氧化作用的微针的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述干燥是在干燥箱中于温度20～30℃、相对湿度控制为3～4％条件下干燥处理12～48h。
6.基于光动力灭菌且兼具抗氧化作用的微针，其特征在于，通过权利要求1-5任一项所述的制备方法制备得到。
7.根据权利要求6所述的基于光动力灭菌且兼具抗氧化作用的微针，其特征在于：所述的微针包括圆锥形的微针针尖，微针针尖的高度为1450μm，微针针尖按10*10个阵列分布在微针衬底一侧。
8.根据权利要求7所述的基于光动力灭菌且兼具抗氧化作用的微针，其特征在于：所述微针针尖的底面半径为580μm，微针针尖的尖端行间距为1250μm，微针衬底的厚度为300μm。
9.如权利要求6-8任一项所述的基于光动力灭菌且兼具抗氧化作用的微针在制备医用皮肤创面敷料方面的应用。
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