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CN115724986B - 三特异性抗体及其用途 - Google Patents

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CN115724986B CN202210822959.8A CN202210822959A CN115724986B CN 115724986 B CN115724986 B CN 115724986B CN 202210822959 A CN202210822959 A CN 202210822959A CN 115724986 B CN115724986 B CN 115724986B
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Abstract

本发明涉及特异性结合CD19、CD3和CD28的三特异性抗体，所述三特异性抗体包含源自IgD铰链区的片段作为接头。本发明还涉及所述三特异性抗体用于治疗肿瘤如恶性血液肿瘤的用途。

Description

三特异性抗体及其用途
技术领域
本发明属于抗体药物领域。本发明提供了一种特异性结合CD19、CD3和CD28的三特异性抗体，其包含源自IgD铰链区的片段作为接头序列。所述抗体特别适合用作肿瘤治疗药物，特别是用于治疗复发或难治型B细胞恶性肿瘤(relapsed or refractory B-cellmalignancies)。
背景技术
抗体类免疫治疗药物是肿瘤治疗领域的热门药物。肿瘤免疫治疗通过激活体内的免疫细胞和增强机体抗肿瘤免疫应答，特异性地清除肿瘤微小残留病灶、抑制肿瘤生长。由于其副作用小、治疗效果明显，正逐渐成为未来肿瘤治疗的发展方向。免疫检查点阻断(Immune Checkpoint Blockage；ICB)可以诱导多种实体瘤类型的持久反应，被认为是目前最为成功的免疫疗法，但依然有大部分癌症患者对治疗无响应。在这些患者中，肿瘤免疫原性和固有的MHC抗原提呈功能是有缺陷的。因此，需要开发能够促进免疫细胞介导的肿瘤细胞杀伤的其他方法。
双特异性T细胞衔接器(Bispecific T-cell Engagers，BiTE)分子由两条单链可变结构域片段(scFv)组成，其中一个scFv靶向T细胞上T细胞受体(TCR)的CD3ε链，并与靶向肿瘤相关抗原(TAA)的另一个scFv相连，由此能够以MHC非依赖性方式诱导多克隆T细胞定向裂解癌细胞。双特异性T细胞衔接器类药物的有效剂量比典型抗体低超过10,000倍，但也具有一些局限性，例如剂量限制性毒性、不良的药代动力学特性和疗效的持久性问题等。
初始T淋巴细胞从静止到完全激活需要两个活化信号的协同作用。其中，抗原/MHC复合物被TCR识别后，通过CD3传导的是第一信号，该信号不足以完全激活T细胞，需要共刺激分子产生的信号作为补充。缺乏共刺激信号易导致T细胞失能或活化诱导的T细胞凋亡(Schietinger A and Greenberg PD.Tolerance and exhaustion：defining mechanismsof T cell dysfunction.Trends in Immunology.2014；35：51-60)。
在目前发现的T细胞共激活分子中，CD28和B7家族是最重要的一类共刺激分子，可与配体CD80(B7-1)及CD86(B7-2)结合并放大TCR/CD3传导的第一信号，维持T细胞生存，促进细胞因子诱导的T细胞增殖与分化。CD28是一个二聚体跨膜糖蛋白，在大约80％的人类CD4+T细胞及50％的CD8+T细胞表面表达，因此被认为是T细胞活化的良好靶点(Jeong S andPark SH.Co-stimulatory receptors in cancers and their implications for cancerimmunotherapy.Immune Netw.2020；20(1)：e3；Esensten JH，Helou YA，Chopra G，etal.CD28 costimulation：from mechanism to therapy.Immunity.2017；44：973-988)。
CD28共刺激信号可通过外源和内源两种机制延长T细胞的生存期。外源机制主要为促进细胞因子的释放，尤其是在T细胞生长过程中起关键作用的细胞因子IL-2。内源机制体现在可以增强抗凋亡蛋白Bcl-XL的表达(Boise LH，Minn AJ，Noel PJ，June CH，Accavitti MA，Lindsten T，Thompson CB.CD28costimulation can promote T cellsurvival by enhancing the expression of Bcl-xL.Immunity.2010；3：87-98)。在仅有CD3信号或仅有CD28信号时，Bcl-XL表达较弱，而在双信号存在的情况下，Bcl-XL表达显著增强(Watts TH.Staying alive：T cell costimulation，CD28，and Bcl-xL.JImmunol.2010；185：3785-3787)。此外，CD28共刺激信号能够促进效应T细胞及记忆性T细胞的增殖，其中记忆性T细胞能够在机体再次遇到同样的肿瘤细胞时被快速激活，从而有效清除肿瘤细胞。
共激活信号对于T细胞激活的重要性也在嵌合抗原受体T细胞(Chimeric antigenReceptor T Cell，CAR-T)类药物的发展历程中得到明显的体现(Pettitt D，Arshad Z，Smith J，et al.CAR-T cells：a systematic review and mixed methods analysis ofthe clinical trial landscape.Molecular Therapy.2018；26：342-353.；Ma S，Li XC，Wang XY，et al.Current Progress in CAR-T cell therapy for solid tumors.Int JBiol Sci.2019；15：2548-2560.)。第一代CAR分子的结构仅由胞外靶向肿瘤相关抗原的scFv及胞内用于T细胞激活的CD3ζ链组成，由于负载该种CAR分子的T细胞扩增能力有限且药理作用持续性差，在临床上没有验证成功。第二代和第三代CAR分子进一步引入了共刺激信号(如CD28，4-1BB，OX40等)结构域，使负载该种CAR分子的CAR-T细胞的活化效果及药理学作用的持续性显著增强，且目前基于第二代CAR设计出的细胞疗法已经成功应用在某些血液瘤的治疗(Savoldo B，Ramos CA，Liu E，et al.CD28 costimulation improvesexpansion and persistence of chimeric antigen receptor-modified T cells inlymphoma patients.Immunology.2011；121：1822-1826.；Guedan S，Posey Jr.，AD，ShawC，et al.Enhancing CAR T cell persistence through ICOS and 4-1BBcostimulation.Immunology.2018；3(1)：e96976.)。
本发明在BiTE的基础上，将双信号激活T细胞的原理用于多功能抗体的设计中，开发了双靶点分别靶向T细胞的CD3和CD28的scFv结构域，并加入靶向肿瘤细胞相关抗原(TAA)的scFv结构域形成三特异性抗体，以同时实现对肿瘤细胞的靶向和T细胞的双信号激活。
本发明人在先的申请CN106589129A中公开了一种同时结合CD19、CD3和CD28三特异性抗体。在该申请的三特异性抗体中，使用了长达81个氨基酸的IgD铰链区序列作为第二和第三结构域之间的接头，并且利用该接头序列中所含的半胱氨酸使三特异性抗体能够形成二聚体。该申请在体外实验中验证了三特异性抗体的单体和二聚体的表达、抗原结合活性、细胞衔接实验f抗体使CD19阳性的靶细胞与CD3/CD28阳性的效应细胞衔接在一起成团的能力)以及细胞杀伤能力(通过将抗体与淋巴瘤细胞和CIK细胞共同培养，观察靶细胞的死亡情况)。然而，该申请没有通过任何体内实验验证这种抗体作为肿瘤治疗药物的功效。
事实上，这样的三特异性抗体分子尽管从原理上能够实现更好的效果，但由于分子结构的复杂性，如何保证其每个结合结构域都能发挥预期的效果，本领域仍然需要大量的创造性工作来改进三特异性抗体分子的结构和功能，从而提供一种安全、有效的新型抗肿瘤药物。
发明内容
发明人在先前工作的基础上，进一步开发了一种新的T细胞衔接器(T-cellengager)类抗体，其可同时结合CD19、CD3和CD28，并且设计了一种全新的接头序列用于连接第二和第三结构域，由此完成了本发明。
因此，第一方面，本发明涉及一种三特异性抗体，其包含：
(1)特异性结合CD19的第一结合结构域；
(2)第一接头序列；
(3)特异性结合CD3的第二结合结构域；
(4)第二接头序列；和
(5)特异性结合CD28的第三结合结构域。
在优选的实施方案中，所述第一接头序列为柔性接头。在具体的实施方案中，所述第一接头序列为(G4S)n、(G4S)nG4、(SG4)n、G4(SG4)n、(G2S)n、(G2S)nG2、(SG2)n或G2(SG2)n接头序列。
在优选的实施方案中，所述第二接头序列的氨基酸序列中不含半胱氨酸，因而所述三特异性抗体不会形成二聚体。在优选的实施方案中，所述第二接头序列的氨基酸序列中不含糖基化位点。在具体的实施方案中，所述第二接头序列源自IgD铰链区的氨基酸序列或为包含(EAAAK)n的氨基酸序列。
第二方面，本发明提供分离的核酸分子，其编码第一方面的三特异性抗体的核苷酸序列。
第三方面，本发明提供包含第二方面的分离的核酸分子的表达载体。
第四方面，本发明提供包含第三方面的表达载体的宿主细胞。
第五方面，本发明提供制备第一方面的多特异性抗体的方法。
第六方面，本发明提供第一方面的三特异性抗体在制备药物中的用途，所述药物用于治疗B细胞相关疾病，特别是B细胞相关肿瘤，包括B细胞白血病和B细胞淋巴瘤。特别地，所述B细胞相关肿瘤是难治型或复发型B细胞相关肿瘤。所述B细胞淋巴瘤可以是非霍奇金淋巴瘤(NHL)或霍奇金淋巴瘤(HL)。所述B细胞相关疾病的实例包括但不限于：经典霍奇金淋巴瘤(classic Hodgkin lymphoma)、结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-celllymphoma)、滤泡性淋巴瘤(Follicular lymphoma，FL)、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)、小淋巴细胞淋巴瘤(small lymphocytic lymphoma，SLL)、慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)、套细胞淋巴瘤(mantlecell lymphoma，MCL)、伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、急性淋巴母细胞白血病(acutelymphoblastic leukemia，ALL)、慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphatic leukaemia，CLL)、B-幼淋巴细胞白血病(B cell prolymphocytic leukemia，B-PLL)、前体B细胞淋巴细胞白血病(precursor B-cell lymphoblastic leukemia)、毛细胞白血病(hairy cellleukemia，HCL)、脾B细胞淋巴瘤/白血病、脾边缘区淋巴瘤(Splenic marginal zonelymphoma，SMZL)。
第七方面，本发明涉及治疗肿瘤的方法，所述方法包括使用第一方面的三特异性抗体。
第八方面，本发明涉及药物组合物，其包含本发明的三特异性抗体和药学上可接受的载体。
第九方面，本发明涉及本发明的三特异性抗体与另外的治疗或药物的联用。
第十方面，本发明涉及源自IgD铰链区的氨基酸片段作为接头序列用于融合蛋白中的用途。
本发明的三特异性抗体至少具有如下优势。
(1)双信号机制提供的长效T细胞激活
本发明的三特异性抗体可以同时激活CD3和CD28两种T细胞刺激信号，这样的“双信号”活化机制可更好地调节TCR/CD3信号，使机体产生长期有效的免疫反应，即通过诱导激活的T细胞而非药物本身在机体发挥作用，从而即使在药物半衰期较短(相对于含有Fc区的抗体而言)的情况下也可以减少给药频率，不需通过频繁的连续输注来维持药物对T细胞的长期激活。
与同属于T细胞衔接器型的CD19/CD3双特异性抗体(Blinatumomab)比较，本发明的三特异性抗体在给药方式上会有较大的便利。Blinatumomab由于缺乏共刺激信号易导致T细胞失能或活化诱导的T细胞凋亡，因而需要频繁的连续输注来维持药物对T细胞激活的持久性。
另外，与CAR-T细胞疗法(如CD19CAR-T)相比较，本发明的三特异性抗体可以通过类似单克隆抗体的生产工艺和途径实现工业化生产且能广泛应用于不同个体。相反，已获批的CAR-T产品和绝大多数CAR-T临床试验都是使用自体型CAR-T，即以患者自身的T细胞为起始材料，这种“私人订制”疗法的生产成本较高，高昂的价格限制了其市场潜力。另外CAR-T疗法质量稳定性也比较差，患者自身的T细胞通常都存在质量与数量的缺陷，不同批次产品之间质量的差异较大，难以达到大规模的工业化生产及标准化的质量控制。需要针对不同病人进行个体化制备和给药。
(2)更接近天然状态下的免疫突触的形成
在生理状态下，T细胞上的TCR识别肿瘤细胞的MHC提呈的抗原肽，由此形成免疫突触(immune synapse；IS)，这是T细胞活化过程的关键步骤。生理状态下的免疫突触的形成后，T细胞与肿瘤细胞的距离通常约为15nm。有些双特异性抗体虽然能够同时结合T细胞和肿瘤细胞，但由于自身结构和所识别抗原结合表位所限，无法将肿瘤细胞与T细胞拉近到约15nm的距离。本申请的三特异性抗体经过结构优化设计，能够使T细胞与肿瘤细胞之间形成的免疫突触更接近于天然状态下的距离，使其在介导多克隆T细胞杀伤肿瘤的过程中具有极高的效力(Dickopf S，Georges GJ，Brinkmann U.Format and geometries matter：Structure-based design defines the functionality of bispecificantibodies.Computational and Structural Biotechnology Journal 18(2020)1221-1227.)。
(3)基于scFv结构的便利性
由scFv形成的三特异性抗体还具有分子量小、肿瘤穿透能力强等优点。虽然与带有Fc结构的抗体相比，scFv结构的抗体半衰期较短，但“双信号”活化机制使三特异性抗体介导激活的T细胞具有持续性，不易走向活化后的细胞凋亡。另外利用“双信号”活化机制的三特异性抗体能够在极低药物浓度的情况下充分活化T细胞，增强T细胞的生存，并且通过诱导分化出记忆性T细胞群来实现对靶细胞长效的杀伤。
(4)诱导记忆T细胞以实现长效免疫应答
已有的临床前研究数据显示本发明的三特异性抗体可显著增强免疫记忆，诱导分化出具有自我更新及复制能力、在体内存活时间长、可持久杀伤肿瘤细胞的记忆T细胞群，主要表现为效应记忆T细胞(TEM)及中央记忆T细胞(TCM)数量与比例的增加，因而可以维持机体内长效的免疫应答，防止肿瘤的复发。
(5)新型接头序列带来的优势
本发明使用了一种新的接头序列连接第二和第三结合结构域。该接头序列是衍生自IgD的铰链区的片段，通过修饰移除IgD铰链区中的糖基化位点，移除可能导致二聚体形成的半胱氨酸，和/或缩短铰链区的整体长度等修饰而获得。通过这些修饰，获得的接头序列在用于三特异性抗体中时，能够获得更均质的抗体产物，形成更少的结构异构体，或聚体的产生，并且减少非靶点激活的可能性。
附图说明
图1是本发明的三特异性抗体的结构示意图。
图2A-B是实施例2中经纯化后的LMOAME的SDS-PAGE(银染法)(A)和SEC-HPLC(B)的分析结果。
图3是实施例2中经纯化后的LMOAME的质谱图。
图4A-B是亲和层析捕获后的LMOAME(A)与作为对照的三特异性抗体(BLMOAM)(B)通过SEC-HPLC的分析结果。
图5是亲和层析捕获后的LMOAME与作为对照的三特异性抗体(BLMOAM)SDS-PAGE的分析结果(考马斯亮蓝染色)。
图6是实施例2中经纯化后的MLMOF的SEC-HPLC图谱。
图7是实施例3中测定的LMOAME与hCD19及hCD28抗原的结合曲线图。
图8A-B是实施例5中测定的LMOAME和Blinatumomab在T细胞激活活性方面的结果。(A)CD4+细胞群；(B)CD8+细胞群。
图9是实施例6中测定的LMOAME和Blinatumomab在介导效应细胞增殖方面的结果。
图10是实施例7中测定的两个批次的LMOAME和Blinatumomab在介导效应细胞分化方面的结果。
图11是实施例8中测定的两个批次的LMOAME和Blinatumomab在介导对靶细胞的杀伤活性方面的结果。
图12A-B是实施例10中的动物实验测定的给药后小鼠体重随时间变化曲线(平均值±SEM，g)(A)以及肿瘤体积随时间变化曲线(平均值±SEM，mm3)(B)。各组肿瘤体积与G1统计学分析以Dunnett’s multi-comparison进行，*：P＜0.05，**：P＜0.01代表有显著性差异。
图13A-B是实施例10中的动物实验测定的给药终点(第21天)时小鼠及肿瘤照片(A)给药终点时小鼠照片；(B)给药终点时剥取肿瘤照片。
图14是实施例11中的动物实验测定的给药终点(第28天)时各组小鼠平均瘤重结果。肿瘤瘤重以平均值±SEM表示。以独立样本T检验对不同组别之间的瘤重进行统计学分析，其中与G1比较时，*：P＜0.05，**：P＜0.01，***：P＜0.001代表有显著性差异；G2与G6比较，以及G3与G7比较时，^：P＜0.05代表有显著性差异。
图15A-B是实施例12中动物实验测定的给药后小鼠体重随时间变化曲线(平均值±SEM，g)(A)以及肿瘤光子数随时间变化曲线(平均值±SEM，p/sec/cmm2/sr)(B)。各给药组肿瘤光子数与G1组统计学分析以Dunnett’smulti-comparison进行，*：P＜0.05；**：0.001≤P＜0.01；***：P＜0.001代表有显著性差异。
图16是实施例12中动物实验测定的给药后各组小鼠的生存曲线。
发明详述
定义
“抗体”在本发明的上下文中以较宽的含义解释，即不仅包含传统的IgG类抗体，还包含抗体类似物和衍生物，如scFv。例如，IgG类抗体是免疫系统响应外来物质如病原体而产生的、具有Y型结构的免疫球蛋白。经典结构的抗体为一种同型二聚体，每个单体包含通过二硫键连接的一条重链(heavy chain)和一条轻链(light chain)。轻链由一个可变区(VL)和一个恒定区(CL)组成，而重链由一个可变区(VH)和三个恒定区(CH1、CH2和CH3)组成。每个可变区含有三个“互补决定区(CDR)”，组成负责与抗原互补的抗原结合位点。VL、CL、VH和CH1组成的抗原结合片段被称为“Fab”。剩余的部分，即Y型结构下方的“树干”部分，被称为“Fc”区，由抗体重链的恒定区CH2和CH3结构域组成。“铰链区”是IgG、IgA和IgG类免疫球蛋白分子中位于CH1和CH2之间的部分，其连接着Fab和Fc区。
“scFv”指单链可变区片段(single chain fragment variable)，有时也简称为单链抗体，其是一种由抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)组成的融合蛋白。在scFv中，VH和VL的连接顺序可以调换，可以将VH置于N端，也可以将VL置于N端。VH和VL之间可以通过“接头”序列连接。单链可变区片段也可包括重链可变区片段(Single variable domain ona heavy chain(VHH))，或简称纳米抗体。由于没有轻链，纳米抗体仅有3个属于重链的抗原识别区域(CDR区)。分子量是传统抗体的十分之一左右，是抗原结合片段(scFV，VH-VL)的二分之一左右。
“IgD”是免疫球蛋白的同种型之一，其与IgG一样具有Y字型结构。本发明中利用IgD的铰链区的片段作为接头序列。
“多特异性抗体”指能够同时并特异性结合多个靶标的抗体或抗体类似物。
“三特异性抗体”指能够同时并特异性结合三个靶标的抗体或抗体类似物。在本发明的上下文中，三特异性抗体具体指一种单链融合蛋白，其通过三个对不同抗原靶标具有结合特异性的结构域串联形成，如通过三个不同的scFv串联形成。
“特异性结合”或“与……特异性结合”意指与其他蛋白质相比，抗体表现出对特定靶标的优先结合，但这种特异性不需要是绝对的结合特异性。如果抗体的结合可测定样品中靶蛋白的存在，例如不会产生不希望的结果，例如假阳性，则认为抗体对其预期靶标具有“特异性”。相较于与非靶蛋白的亲和力，本发明的抗体或其抗原结合片段将以至少2倍高，优选至少10倍高，更优选至少20倍高，且最优选至少100倍高的亲和力结合靶蛋白。作为替代或在此基础上，本发明的抗体或其抗原结合片段将具有对其靶蛋白的结合亲和力，如由低于1x10-7M、1x10-8M、低于1x10-9M(1nM)，低于1x10-10M，低于1x10-11M，或甚至低于1x10-12M(1pM)的KD值所代表。如本申请的抗体与包含给定氨基酸序列(例如人CD19、人CD3、人CD28)的多肽结合但不与缺乏该序列的蛋白质结合，则称其为特异性结合包含所述给定氨基酸序列的多肽。
“结合结构域”或“抗原结合结构域”在本文涉及多特异性抗体的上下文中指能够特异性识别并结合靶标的多肽结构，有时也简称为“结构域”。
“接头序列”在本发明的上下文中指用于连接两个结合结构域的肽段，也指在一个结合结构域中用于连接VH和VL的肽段。“第一接头序列”具体指用于连接第一结合结构域和第二结合结构域的接头，且“第二接头序列”具体指用于连接第二结合结构域和第三结合结构域的接头。所述第一接头序列和第二接头序列均为用于连接不同结合结构域的接头，因此也统称为“结构域间接头”。如果一个结构域中包含的VH和VL之间也存在接头，则将其称为“结构域内接头”。
“T细胞衔接器类抗体”指在能够通过特异性结合两种细胞而将这两种细胞拉近从而以预期的方式“衔接”在一起的抗体。
“CD19×CD3×CD28抗体”在本文指包含特异性结合CD19的结合结构域、特异性结合CD3的结合结构域和特异性结合CD28的结合结构域的三特异性抗体。
“G4S”指Gly-Gly-Gly-Gly-Ser，即由四个甘氨酸和一个丝氨酸组成的五肽单元，一个或多个这样的单元是重组融合蛋白中常用的接头序列。同理，“G2S”指Gly-Gly-Ser。
“刚性”和“柔性”在本文中用于描述分子构象的刚性或柔性。具体而言，在用于描述某个肽接头序列时，“柔性接头”指允许被连接的两段多肽或功能域能够在一定程度上改变相对位置或进行相互作用的肽接头，而“刚性接头”则通常不具有类似效果，提供更为固定的构象。
“百分比同源性”或“％同源性”在本发明的上下文中用于描述两条核苷酸序列或两条氨基酸序列之间的相似性程度，与“百分比同一性”的含义相同。两条序列的百分比同源性可以如下计算，在将两条序列对齐(alignment)之后，用残基相同的位置数除以对齐后的序列总长度再乘以100％。比对两条氨基酸序列或核苷酸序列的方法和工具是本领域公知的，例如NCBI网站上提供的BLAST套件(Altschul，S.F.et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403-410)。
氨基酸的“保守取代”是本领域众所周知的，并且通常指将一个氨基酸残基改变为具有结构或功能上相似的侧链的另一个氨基酸残基。例如，下表中提供了示例性的保守取代列表。
原始氨基酸残基 保守取代 原始氨基酸残基 保守取代
Ala Gly；Ser Leu Ile；val
Arg Lys；His Lys Arg；His
Asn Gln；His Met Leu；Ile；Tyr
Asp Glu；Asn Phe Tyr；Met；Leu
Cys Ser；Ala Pro Ala
Gln Asn Ser Thr
Glu Asp；Gln Thr Ser
Gly Ala Trp Tyr；Phe
His Asn；Gln Tyr Trp；Phe
Ile Leu；Val Val Ile；Leu
“交叉反应性”是指特异性结合一种抗原的抗体与另一种抗原结合的能力。如果这两种抗原来自同一物种，则可以将这种交叉反应性称为“物种内交叉反应性”或“靶标间交叉反应性”。如果这两种抗原来自不同的物种，则将这种交叉反应性称为“物种间交叉反应性”。在没有特殊说明的情况下，本发明上下文中的抗体的“交叉反应性”指物种间交叉反应性，亦即与源自其他物种的同源或直系同源蛋白反应的能力。
“核苷酸”在本发明的上下文中包括DNA和RNA。
在术语“分离的核酸分子”中，“分离的”意指已经进行了去除想要的成分之外的因子的操作，并且所述分离的核酸分子不再以其天然存在的状态存在，如不再存在于染色体基因组中。
“表达构建体”或“表达盒”指包含目的基因和基因表达调控序列的一段核苷酸序列。所述表达调控序列包括但不限于启动子、增强子、终止子、多聚腺苷酸化序列等。
“载体”指能够将外源基因携带至细胞内的运载体DNA分子。载体的实例包括但不限于质粒、病毒载体、粘粒、人工染色体。用于将外源转基因引入细胞中并促成该转基因表达的载体称为“表达载体”。
“宿主细胞”在本文中指包含外源重组DNA如表达载体的细胞，也指包含由重组DNA表达所获得的多肽或蛋白的细胞。可将这样的宿主细胞用于进行本发明的三特异性抗体的生产。在一个实施方式中，作为宿主细胞，只要是能够用于多肽序列例如本发明的三特异性抗体的表达的宿主细胞即可，没有特别的限制。
“肿瘤”以其最宽的含义理解，指非正常过度生长的组织，与“异常新生物”同义。“癌”或“癌症”指恶性肿瘤，包括肉瘤、癌瘤、淋巴瘤、白血病和胶质瘤。
“B细胞相关肿瘤”指以癌变的B细胞为特征的肿瘤，也可以称为“B细胞白血病”或“B细胞淋巴瘤”。
“受试者”在本发明中指接受施用的动物，优选脊椎动物，更优选哺乳动物，如啮齿动物，例如小鼠、大鼠；灵长类动物，例如猴；最优选人。
“治疗”指疾病或其症状得到改善、缓解或消除(即治愈)。在一些情况中，治疗包括预防性治疗。
抗原结合结构域
本发明提供一种T细胞衔接器类抗体，其可同时结合CD19、CD3和CD28，在本文也称为三特异性抗体或CD19×CD3×CD28抗体。
具体而言，本发明的三特异性抗体包含三个结合结构域，分别为包括能够特异性结合CD19的第一结合结构域、能够特异性结合并激活T细胞表面CD3分子的第二结合结构域和能够特异性结合并激活T细胞表面CD28分子的第三结合结构域。另外，所述三特异性抗体还包含位于第一和第二结合结构域之间的第一接头，以及位于第二和第三结合结构域之间的第二接头。
人类CD19抗原是大小为95kDa的跨膜糖蛋白，是免疫球蛋白超家族成员。除表达于正常B淋巴细胞表面，CD19也高表达于B细胞恶性肿瘤，抗CD19单克隆全长抗体已被批准用于治疗B细胞淋巴瘤。在没有特别说明的情况下，本发明上下文中的第一结合结构域特异性结合的CD19是人CD19。
CD3是一种跨膜蛋白，其跨膜区通过盐桥与TCR两条肽链的跨膜区连接，形成TCR-CD3复合体，共同参与T细胞对抗原的识别和将产生的活化信号转导至T细胞内。在没有特别说明的情况下，本发明上下文中的第一结合结构域特异性结合的CD3是人CD3。
CD28是一种二聚体跨膜糖蛋白，在大约80％的人类CD4+T细胞及50％的CD8+T细胞表面表达。CD28是一种T细胞共刺激分子，可与配体CD80(B7-1)及CD86(B7-2)结合并放大TCR/CD3传导的第一信号，维持T细胞生存，促进细胞因子诱导的T细胞增殖与分化。在没有特别说明的情况下，本发明上下文中的第三结合结构域特异性结合的CD28是人CD28。
因此，对于B细胞相关肿瘤而言，本发明的三特异性抗体中的第一个结合结构域能够特异性结合肿瘤细胞表面相关抗原CD19，第二和第三结合结构域能够分别结合T细胞表面受体CD3和CD28，由此将肿瘤B细胞与免疫T细胞“衔接”到一起，并同时激活T细胞的CD3信号途径以及CD28共刺激信号途径，由此激活的免疫细胞能够对靶细胞发挥杀伤作用。
在优选的实施方案中，本发明的三特异性抗体是一种单链融合蛋白，其包含：特异性结合CD19的scFv作为第一结合结构域；特异性结合CD3的scFv作为第二结合结构域；和特异性结合CD28的scFv作为第三结合结构域。
作为第一、第二和第三结合结构域的scFv序列可以分别衍生自本领域已知的抗CD19、抗CD3和抗CD28抗体或抗体类似物、衍生物。例如，各个结合结构域可以是包含衍生自已知的对应抗体的VH和VL的scFv。所述抗体可以是动物源抗体如鼠源抗体，嵌合抗体如人鼠嵌合抗体，或是人抗体或人源化抗体。
在优选的实施方案中，所述特异性结合CD19的scFv包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中
(a)所述VH包含如SEQ ID NO：11所示的重链CDR 1、SEQ ID NO：12所示的重链CDR2和SEQ ID NO：13所示的所示的重链CDR3，且所述VL包含如SEQ ID NO：14所示的轻链CDR 1、SEQ ID NO：15所示的轻链CDR2和SEQ ID NO：16所示的所示的轻链CDR3；或
(b)所述VH包含如SEQ ID NO：46所示的重链CDR 1、SEQ ID NO：47所示的重链CDR2和SEQ ID NO：48所示的所示的重链CDR3，且所述VL包含如SEQ ID NO：49所示的轻链CDR 1、SEQ ID NO：50所示的轻链CDR2和SEQ ID NO：51所示的所示的轻链CDR3。
在上述实施方案的进一步优选的实施方案中，所述特异性结合CD19的scFv包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中
(a)所述VH包含如SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(如至少85％同源性，优选至少90％同源性，更优选至少95％同源性，甚至更优选至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性)并且所有氨基酸差异均在非CDR区的氨基酸序列，或由这样的氨基酸序列组成；并且
所述VL包含如SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(如至少85％同源性，优选至少90％同源性，更优选至少95％同源性，甚至更优选至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性)并且所有氨基酸差异均在非CDR区的氨基酸序列，或由这样的氨基酸序列组成；或者
(b)所述VH包含如SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(如至少85％同源性，优选至少90％同源性，更优选至少95％同源性，甚至更优选至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性)并且所有氨基酸差异均在非CDR区的氨基酸序列，或由这样的氨基酸序列组成；并且
所述VL包含如SEQ ID NO：54所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：54所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(如至少85％同源性，优选至少90％同源性，更优选至少95％同源性，甚至更优选至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性)并且所有氨基酸差异均在非CDR区的氨基酸序列，或由这样的氨基酸序列组成。
在进一步优选的实施方案中，所述特异性结合CD19的scFv包含如SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(如至少85％同源性，优选至少90％同源性，更优选至少95％同源性，甚至更优选至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性)并且所有氨基酸差异均在非CDR区的氨基酸序列；或由这样的氨基酸序列组成。
优选地，上述氨基酸差异是氨基酸的保守取代。
在一个实施方案中，在所述特异性结合CD19的scFv中，VH位于VL的C端或N端。在优选的实施方案中，在所述特异性结合CD19的scFv中，VH位于VL的C端，即按照VL-接头序列-VH的顺序连接。
在一些实施方案中，在所述特异性结合CD19的scFv中，VH和VL之间通过结构域内接头连接或直接连接。所述结构域内接头是含有(GGGGS)n或(GGS)n的接头，或者是(GGGGS)n或(GGS)n，并且n为1-10的整数，优选1-5的整数，例如1、2、3、4或5。在具体的实施方案中，在所述特异性结合CD19的scFv中，VH和VL之间的结构域内接头选自SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：3，优选SEQ ID NO：1。
在优选的实施方案中，所述特异性结合CD3的scFv包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中
(a)所述VH包含如SEQ ID NO：22所示的重链CDR 1、SEQ ID NO：23所示的重链CDR2和SEQ ID NO：24所示的重链CDR3，且所述VL包含如SEQ ID NO：25所示的轻链CDR 1、SEQ IDNO：26所示的轻链CDR2和SEQ ID NO：27示的所示的轻链CDR3；或
(b)所述VH包含如SEQ ID NO：57所示的重链CDR 1、SEQ ID NO：58所示的重链CDR2和SEQ ID NO：59所示的所示的重链CDR3，且所述VL包含如SEQ ID NO：60所示的轻链CDR 1、SEQ ID NO：61所示的轻链CDR2和SEQ ID NO：62所示的所示的轻链CDR3。
在上述实施方案的进一步优选的实施方案中，所述特异性结合CD3的scFv包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中
(a)所述VH包含如SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(如至少85％同源性，优选至少90％同源性，更优选至少95％同源性，甚至更优选至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性)并且所有氨基酸差异均在非CDR区的氨基酸序列，或由这样的氨基酸序列组成；并且
所述VL包含如SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(如至少85％同源性，优选至少90％同源性，更优选至少95％同源性，甚至更优选至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性)并且所有氨基酸差异均在非CDR区的氨基酸序列，或由这样的氨基酸序列组成；或者
(b)所述VH包含如SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(如至少85％同源性，优选至少90％同源性，更优选至少95％同源性，甚至更优选至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性)并且所有氨基酸差异均在非CDR区的氨基酸序列，或由这样的氨基酸序列组成；并且
所述VL包含如SEQ ID NO：65所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：65所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(如至少85％同源性，优选至少90％同源性，更优选至少95％同源性，甚至更优选至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性)并且所有氨基酸差异均在非CDR区的氨基酸序列，或由这样的氨基酸序列组成。
在进一步优选的实施方案中，所述特异性结合CD3的scFv包含如SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：67所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：67所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(如至少85％同源性，优选至少90％同源性，更优选至少95％同源性，甚至更优选至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性)并且所有氨基酸差异均在非CDR区的氨基酸序列；或由这样的氨基酸序列组成。
优选地，上述氨基酸差异是氨基酸的保守取代。
在一个实施方案中，在所述特异性结合CD3的scFv中，VH位于VL的C端或N端。在优选的实施方案中，在所述特异性结合CD3的scFv中，VL位于VH的C端，即按照VH-接头序列-VL的顺序连接。
在一些实施方案中，在所述特异性结合CD3的scFv中，VH和VL之间通过结构域内接头连接或直接连接。所述结构域内接头是含有(GGGGS)n或(GGS)n的接头，或者是(GGGGS)n或(GGS)n，并且n为1-10的整数，优选1-5的整数，例如1、2、3、4或5。在具体的实施方案中，在所述特异性结合CD3的scFv中，VH和VL之间的结构域内接头选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3，优选SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3。
在优选的实施方案中，所述特异性结合CD28的scFv包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含如SEQ ID NO：33所示的重链CDR 1、SEQ ID NO：34所示的重链CDR2和SEQ ID NO：35所示的所示的重链CDR3，且所述VL包含如SEQ ID NO：36所示的轻链CDR 1、SEQ ID NO：37所示的轻链CDR2和SEQ ID NO：38示的所示的轻链CDR3。
在上述实施方案的进一步优选的实施方案中，所述特异性结合CD28的scFv包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含如SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(如至少85％同源性，优选至少90％同源性，更优选至少95％同源性，甚至更优选至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性)并且所有氨基酸差异均在非CDR区的氨基酸序列，或由这样的氨基酸序列组成；并且所述VL包含如SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(如至少85％同源性，优选至少90％同源性，更优选至少95％同源性，甚至更优选至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性)并且所有氨基酸差异均在非CDR区的氨基酸序列，或由这样的氨基酸序列组成。
在进一步优选的实施方案中，所述特异性结合CD28的scFv包含如SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(如至少85％同源性，优选至少90％同源性，更优选至少95％同源性，甚至更优选至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性)并且所有氨基酸差异均在非CDR区的氨基酸序列；或由这样的氨基酸序列组成。
优选地，上述氨基酸差异是氨基酸的保守取代。
在一个实施方案中，在所述特异性结合CD28的scFv中，VH位于VL的C端或N端。在优选的实施方案中，在所述特异性结合CD28的scFv中，VL位于VH的C端，即按照VH-接头序列-VL的顺序连接。
在一些实施方案中，在所述特异性结合CD28的scFv中，VH和VL之间通过结构域内接头连接或直接连接。所述结构域内接头是含有(GGGGS)n或(GGS)n的接头，或者是(GGGGS)n或(GGS)n，并且n为1-10的整数，优选1-5的整数，例如1、2、3、4或5。在具体的实施方案中，在所述特异性结合CD28的scFv中，VH和VL之间的结构域内接头选自SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：3，优选SEQ ID NO：1。
本领域技术人员能够理解，CDR区的确定可以使用Kabat、IMGT、Chothia抗体编号系统中的任何一种编号方式来确定。在使用不同的编号方式时，针对同一可变区的氨基酸序列可能会划定不同的CDR区。无论使用哪一种编号方式确定的CDR区，都落入本发明的保护范围。除非另行声明，否则本申请中记载的具体CDR区的氨基酸序列是按照Kabat抗体编号系统确定的。
在一些实施方案中，本申请的第一结合结构域、第二结合结构域和第三结合结构域中的一种或多种与其他物种中的对应抗原具有交叉反应性。所述其他物种可以是实验室动物，例如猴，如食蟹猴(Macacafascicularis)。例如，本申请的第一结合结构域在特异性结合人CD19的基础上，还与猴CD19具有交叉反应性，即也能够与猴CD19特异性结合。例如，本申请的第二结合结构域在特异性结合人CD3的基础上，还与猴CD3具有交叉反应性，即也能够与猴CD3特异性结合。例如，本申请的第三结合结构域在特异性结合人CD28的基础上，还与猴CD28具有交叉反应性，即也能够与猴CD28特异性结合。与对应的猴抗原的交叉反应性会为抗体研发带来便利。
接头序列
在确定了结合结构域的基础上，如何设计用于连接各个结合结构域的接头，以及用于连接每个结合结构域中的VH和VL的接头，对于三特异性抗体的结构和功能而言也至关重要，特别是前者。一方面，接头序列与功能性结构域一同构成了三特异性抗体分子的整体，接头序列会影响整个三特异性抗体分子的结构稳定性。另一方面，接头序列的长短、柔性会影响各个结合结构域之间的空间位置关系，进而影响各个结构域与其靶标的结合。除此之外，接头序列中的某些氨基酸是否容易形成进一步的修饰，例如二聚体化、糖基化，也会对三特异性抗体分子的整体性质有所影响。
本发明的接头序列可以来自于天然存在的序列或其经修饰的变体，或者可以是从头设计的人工序列。所述接头序列可以来自天然存在的多结构域蛋白，例如，可以是天然的多结构域蛋白中所含的接头序列或其变体。来自于天然存在的序列的接头序列的实例是来自IgD铰链区的接头序列，其可以在本申请作为第二接头序列。人工接头序列的实例例如基于(GGGGS)n、(GGGGS)nGGGG、(SGGGG)n、GGGG(SGGGG)n、(GGS)n、(GGS)nGG、(SGG)n或GG(SGG)n的接头序列，其在本发明中可作为第一结构域间接头，或者作为结构域内接头。人工接头序列的另一个实例是包含(EAAAK)n的接头序列，如A(EAAAK)nA、A(EAAAK)nALEA(EAAAK)nA，其在本发明中可作为第二接头序列。
接头的刚性/柔性是一个需要考虑的因素。具有柔性的接头允许两端所连接的多肽序列能够在一定范围移动。柔性接头通常由尺寸较小的氨基酸如甘氨酸(G)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)组成，也正是这些小尺寸的氨基酸赋予了接头柔性。在希望为接头两端的结构域保留产生一些相对移动的可能性的情况下，优选使用柔性接头。然而，在一些情况下，柔性接头由于无法固定两端连接的结构域，使得多结构域分子无法正确地表达或发挥功能。从这方面考虑，对于多功能分子，例如需要结合三个靶标的三特异性抗体而言，刚性接头或许能够比柔性接头提供更好的结构、功能的稳定性。
具体到本发明的三特异性抗体，其第一结构域靶向肿瘤细胞，而第二、第三结构域靶向免疫细胞，也就是说相邻的第一和第二结构域必然会结合到不同的细胞上。在这种情况下，希望第一结构域和第二结构域之间具有一定的相对运动的能力，在与不同细胞结合时可以通过调整位置使结合更容易。因此，在优选的实施方案中，本发明的第一接头序列是柔性接头，例如由甘氨酸(G)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和赖氨酸(K)中一种或多种组成的接头，如富含GS的接头，如含有(GGGGS)n、(SGGGG)n、(GGS)n、(SGG)n的接头，例如(GGGGS)n、(GGGGS)nGGGG、(SGGGG)n、GGGG(SGGGG)n、(GGS)n、(GGS)nGG、(SGG)n或GG(SGG)n，其中n为正整数，优选1-10。在每个结合结构域中用于连接VH和VL的接头也优选是这样的柔性接头。
另一方面，作为衔接器抗体，希望将衔接的两种细胞尽量拉近，如此一来细胞之间形成的免疫突触的距离会更接近生理状态下自然形成的免疫突触的距离，更有利于免疫细胞发挥杀伤作用。两种细胞被拉近的距离受到第一接头序列长度的影响。例如，所述第一接头序列的长度不超过30个氨基酸，优选不超过25个氨基酸，更优选不超过20个氨基酸，还更优选不超过15个氨基酸。例如，如果所述第一接头序列是(GGGGS)n、(SGGGG)n、GGGG(SGGGG)n中的任一，那么优选n为不超过6的正整数，优选不超过5的正整数，例如1、2、3、4或5；如果所述第一接头序列是(GGS)n、(SGG)n或(GGS)nGG中的任一，那么优选n为不超过10的正整数，优选不超过7的正整数，例如1、2、3、4、5、6或7。在具体的实施方案中，所述第一接头序列是(GGGGS)3(SEQ ID NO：1)、GGGGS(SEQ ID NO：2)或(GGS)4GG(SEQ ID NO：3)，优选SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
第二接头序列连接第二和第三结构域，这两个结构域均会结合到T细胞表面的受体。为了防止在其中一个结构域结合之后，产生的空间位阻效应影响另一个结构域结合到同一T细胞上，稍长一些的第二接头序列是更理想的。因此，在优选的实施方案中，第二接头序列比第一接头序列更长。例如，第二接头序列的长度是第一结构序列的长度的至少1.25倍，至少1.5倍，至少2倍，至少2.25倍，至少2.5倍或更长。例如，第二接头序列的长度为至少15个氨基酸、至少20个氨基酸、至少25个氨基酸、至少30个氨基酸、至少35个氨基酸、至少40个氨基酸或更长。
此外，偏向于刚性的接头也可以作为第二接头序列的优选。更具刚性的接头也有利于避免空间位阻效应。例如，第二接头的一个实例是包含(EAAAK)n的接头序列。这种接头中的Glu-Ala-Ala-Ala-Lys结构能够形成刚性的a螺旋结构。“包含(EAAAK)n的接头序列”是因为这类接头通常还含有其它氨基酸残基，例如在EAAAK重复两侧含有丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、谷氨酸(E)中的一种或多种，具体的实例包括A(EAAAK)nA、LEA(EAAAK)nALE、LEA(EAAAK)nALEA(EAAAK)nALE等，其中n可以是1-10的任意整数，优选2-6。可以视需要接头序列长度来选择接头类型和/或调整n的取值。
在一个具体的实施方案中，本发明的接头序列之一，例如第二接头序列，是来自免疫球蛋白IgD的铰链区的片段或其变体。
接头序列中存在的潜在糖基化位点也可能影响三特异性抗体分子的性质和表现。例如，如果接头序列含有糖基化位点，糖基化形成的糖链可能会以不符合预期的方式掩蔽活性部位，降低抗体的活性。在细胞中生产抗体时，可能形成不同组成、长度的糖链，造成抗体产物的均一性下降。常见的糖基化类型包括N联糖基化和O联糖基化。N联糖基化是糖链连接到氨基酸如天冬酰胺和精氨酸侧链的氮原子上的糖基化类型，O联糖基化是糖链连接到氨基酸如丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸的侧链羟基氧原子上的糖基化类型。当接头序列来源于天然序列，例如来源于免疫球蛋白铰链区时，可以通过对所述天然序列进行包括缺失、取代、截短等突变来去除序列中的潜在糖基化位点，如苏氨酸。
在具体的实施方案中，使用IgD铰链区的片段作为接头序列，例如第二接头序列。已知IgD铰链区中包括多个O联糖基化位点，例如第109位的丝氨酸(S109)和四个苏氨酸(T126、T127、T131和T132)。本申请提供的81个氨基酸的长接头中包含了这些位点，该接头序列的氨基酸序列如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：8所示，其中上述例举的一个丝氨酸和四个苏氨酸分别位于第20、37、38、42和43位。在优选的实施方案中，本发明的IgD铰链区片段不包含糖基化位点，例如不包含上述五个糖基化位点。在一个实施方案中，可以通过截短方式截取不包含糖基化位点的IgD铰链区片段，例如将至少上述五个糖基化位点截去。例如，可以将最后一个苏氨酸之前(包括该苏氨酸在内)的全部片段去除，仅保留其C端的全部或部分序列。作为另一种替代方式，也可以通过修饰将这五个糖基化位点处的氨基酸取代为其他氨基酸。
单链抗体可以通过接头区中所含的半胱氨酸形成二聚体的形式。三特异性抗体的二聚体包含双倍的抗原结合结构域。有研究显示，由于CD28天然状态下以二聚体形式存在，因此包含两个特异性结合CD28的结构域的二价抗体(例如IgG型的抗体)的效力要高于单价抗体(例如单链抗体)。类似地，CD28抗体在发生交联时或聚集度更高时，会具有更高的效力。但是三特异性抗体需要同时正确结合三个靶标才能发挥预期的作用。如果三特异性抗体仅仅结合了T细胞上的一个或两个靶标(CD3和/或CD28)，而没有结合B细胞肿瘤上的CD19，则可能导致在在远离肿瘤靶细胞处发生T细胞激活，即造成“非靶点T细胞激活”。在这种情况下，二聚体形式存在的三特异性抗体将会更加危险，因为其结合T细胞受体CD28的能力更强、效力更高，而且易发生交联反应，会产生更难应对的非靶点激活作用及增加细胞因子风暴发生的风险。因此，本发明不希望三特异性抗体在制备和/或使用时形成二聚体，并为此对接头序列特别是基于IgD铰链区的第二接头序列进行了改造，以去除其中会造成二聚体形成的氨基酸残基，例如半胱氨酸(Cys；C)残基。
在一个优选的实施方案中，本发明的接头序列不含能够形成二聚体的氨基酸位点，例如不含半胱氨酸(C)。在具体的实施方案中，第二接头序列源自IgD铰链区并且去除了其中的半胱氨酸(C161)。例如，通过将第161位的半胱氨酸用其他氨基酸取代来去除接头序列中的半胱氨酸。例如，通过将第161位的半胱氨酸用丝氨酸或甘氨酸进行取代(C161S或C161G取代)来去除接头序列中的半胱氨酸。
在优选的实施方案中，本发明的三特异性抗体的第一接头序列是含有(GGGGS)n或(GGS)n的接头，或者是(GGGGS)n或(GGS)n，并且n为不超过6的整数，优选不超过5的整数，例如1、2、3、4或5。在具体的实施方案中，所述第一接头序列是SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。在更具体的实施方案中，所述第一接头序列是SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
在优选的实施方案中，本发明的三特异性抗体的第二接头序列源自IgD铰链区，并且具有如下特征中的一项或多项：
(1)与SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列相比，缺乏半胱氨酸；
(2)与SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列相比，缺乏糖基化位点；
(3)与SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列相比，具有更短的长度。
在优选的实施方案中，所述第二接头序列与SEQ ID NO：10相比，对应于第72位的半胱氨酸突变为其他氨基酸，优选丝氨酸或甘氨酸。在具体的实施方案中，所述第二接头序列是SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9的氨基酸序列。
在优选的实施方案中，所述第二接头序列是SEQ ID NO：4中不包含糖基化位点的部分片段，例如是SEQ ID NO：4中不包含糖基化位点的N末端部分片段或C末端部分片段，优选由SEQ ID NO：4的氨基酸序列中位于C末端38个氨基酸组成的部分片段；所述糖基化位点至少包含对应于第20位的丝氨酸以及对应于第37、38、42和43位的苏氨酸。在具体的实施方案中，所述第二接头序列是SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。
在最优选的实施方案中，本发明的三特异性抗体的第二接头序列是如SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。
在另一个优选的实施方案中，本发明的三特异性抗体的第二接头序列是包含(EAAAK)n的接头序列，如A(EAAAK)nA、LEA(EAAAK)nALE、LEA(EAAAK)nALEA(EAAAK)nALE，其中n为1-10的任意整数，优选2-6，更优选2-4。具体而言，第二接头序列是包含如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的接头序列，例如包含如SEQ ID NO：7作为重复单元的接头序列，其中所述重复单元重复出现1-10次。
在优选的实施方案中，本发明的三特异性抗体中每个结合结构域中用于连接VH和VL的接头序列，即结构域内接头，是含有(GGGGS)n或(GGS)n的接头，或者是(GGGGS)n或(GGS)n，并且n为不超过10的正整数，优选不超过5的正整数，例如1、2、3、4或5。在一些实施方案中，每个结合结构域中用于连接VH和VL的接头序列相同。在一些实施方案中，每个结合结构域中用于连接VH和VL的接头序列不同。例如所述结构域内接头序列是(GGGGS)n、(SGGGG)n、GGGG(SGGGG)n中的任一，其中优选n为不超过6的正整数，优选不超过5的正整数，例如1、2、3、4或5。例如所述结构域内接头是(GGS)n、(SGG)n或(GGS)nGG中的任一，其中优选n为不超过10的正整数，优选不超过7的正整数，例如1、2、3、4、5、6或7。
在具体的实施方案中，结构域内接头选自如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：3中所示的序列。在更具体的实施方案中，每个结合结构域用于连接VH和VL的接头均为SEQ ID NO：1所示的(GGGGS)3。在更具体的实施方案中，三个结构域内接头分别为如SEQ IDNO：1所示的(GGGGS)3、如SEQ ID NO：3所示的(GGS)4GG和如SEQ ID NO：1所示的(GGGGS)3。
三特异性抗体
在确定了各个抗原结合结构域的抗原特异性以及排列顺序的情况下，对于各个结合结构域的具体序列没有特别的限定。三个结合结构域可以源自本领域已知的对应抗体或抗体类似物。
在优选的实施方案中，本发明的三特异性抗体能够特异性结合人CD19、人CD3和人CD28，并且包含如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9的序列作为接头序列。优选地，所述SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9的氨基酸序列是连接特异性结合CD3的结合结构域和特异性结合CD28的结合结构域的接头序列。
在具体的实施方案中，本发明的三特异性抗体是氨基酸序列如SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：68所示的三特异性抗体或其变体；所述变体与SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：68所示的氨基酸序列具有至少80％同源性，并且能够特异性结合CD19、CD3和CD28，并且包含如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9的序列作为接头序列。优选地，所述变体的氨基酸序列与SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：68所示的氨基酸序列具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性。
制备方法
本发明还涉及制备所述三特异性抗体的方法。所述方法可以是分子生物学方法。例如，所述方法包括制备编码所述三特异性抗体这种单链融合蛋白的一条或多条核苷酸序列，将所述一条或多条编码核苷酸序列构建到一个或多个表达载体中，并在适当的细胞中表达所述表达载体来制备。
本领域技术人员可以理解，在三特异性抗体的氨基酸序列确定的前提下，由于存在密码子简并性，可以使用不同的编码核苷酸序列，也可以对编码核苷酸序列进行优化。进行编码序列密码子优化的方法是本领域技术人员已知的，包括针对宿主的类型将密码子调整为宿主的偏好密码子，降低GC含量和/或减少富含GC的区域，提高mRNA稳定性，从而提高目标核苷酸在特定宿主中的表达效率。
在具体的实施方案中，所述编码核苷酸序列包含编码如本发明所述的特异性结合CD19的第一结合结构域的核苷酸序列。
在具体的实施方案中，所述第一结合结构域的编码核苷酸序列可以包含：(1)如SEQ ID NO：18所示的编码VH的核苷酸序列，或与其具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性并且编码如SEQ ID NO：17所示的VH的氨基酸序列的核苷酸序列；和/或(2)如SEQ ID NO：20所示的编码VL的核苷酸序列，或与其具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性并且编码如SEQ ID NO：19所示的VL的氨基酸序列的核苷酸序列。在具体的实施方案中，所述第一结合结构域的编码核苷酸序列可以包含：(1)如SEQ ID NO：53所示的编码VH的核苷酸序列，或与其具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性并且编码如SEQ ID NO：52所示的VH的氨基酸序列的核苷酸序列；和/或(2)如SEQ ID NO：55所示的编码VL的核苷酸序列，或与其具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性并且编码如SEQ ID NO：54所示的VL的氨基酸序列的核苷酸序列。在具体的实施方案中，所述第一结合结构域的编码核苷酸序列进一步包含编码如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示的接头序列的核苷酸序列。
在具体的实施方案中，所述编码核苷酸序列包含编码如本发明所述的特异性结合CD3的第二结合结构域的核苷酸序列。所述第二结合结构域的编码核苷酸序列可以包含：(1)如SEQ ID NO：29所示的编码VH的核苷酸序列，或与其具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性并且编码如SEQ IDNO：28所示的VH的氨基酸序列的核苷酸序列；和/或(2)如SEQ ID NO：31所示的编码VL的核苷酸序列，或与其具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性并且编码如SEQ ID NO：30所示的VL的氨基酸序列的核苷酸序列。在具体的实施方案中，所述第一结合结构域的编码核苷酸序列可以包含：(1)如SEQ IDNO：64所示的编码VH的核苷酸序列，或与其具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性并且编码如SEQ ID NO：63所示的VH的氨基酸序列的核苷酸序列；和/或(2)如SEQ ID NO：66所示的编码VL的核苷酸序列，或与其具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性并且编码如SEQ ID NO：65所示的VL的氨基酸序列的核苷酸序列。在具体的实施方案中，所述第二结合结构域的编码核苷酸序列进一步包含编码如SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：3所示的接头序列的核苷酸序列。
在具体的实施方案中，所述编码核苷酸序列包含编码如本发明所述的特异性结合CD28的第三结合结构域的核苷酸序列。所述第三结合结构域的编码核苷酸序列可以包含：(1)如SEQ ID NO：40所示的编码VH的核苷酸序列，或与其具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性并且编码如SEQ IDNO：39所示的VH的氨基酸序列的核苷酸序列；和/或(2)如SEQ ID NO：42所示的编码VL的核苷酸序列，或与其具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性并且编码如SEQ ID NO：41所示的VL的氨基酸序列的核苷酸序列。在具体的实施方案中，所述第三结合结构域的编码核苷酸序列进一步包含编码如SEQID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示的接头序列的核苷酸序列。
在具体的实施方案中，编码本发明的三特异性抗体的核苷酸序列包含如SEQ IDNO：45所示的核苷酸序列，或与其具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性并且编码如SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列的核苷酸序列。在具体的实施方案中，编码本发明的三特异性抗体的核苷酸序列包含如SEQID NO：69所示的核苷酸序列，或与其具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性并且编码如SEQ ID NO：68所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
合适的生产细胞是本领域技术人员已知的。在一些实施方案中，使用哺乳动物细胞，例如293T、CHO或其衍生细胞系作为生产细胞。在一些实施方案中，使用微生物细胞例如细菌细胞或真菌细胞作为生产细胞，例如大肠杆菌或酵母。在一些实施方案中，使用昆虫细胞作为生产细胞，例如Sf9。可以针对具体的生产细胞系对编码本发明的三特异性抗体的核苷酸序列进行密码子优化。
优选对产生的三特异性抗体进行纯化。三特异性抗体的纯化可以通过抗体生产领域的常规方法进行，所述方法可以包括过滤、层析等步骤。所述过滤步骤可以选自深层过滤、超滤、渗滤、纳米过滤中的一种或多种。所述层析步骤可以选自亲和层析、阳离子层析、阴离子层析、大小排阻层析、疏水层析、羟基磷灰石层析中的一种或多种。
本发明的抗体可以被制备成液体或固体的制剂，例如注射剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂。例如，可以通过常规方法例如冷冻干燥制备成冻干粉针剂，然后在施用之前通过复溶临场配制为注射剂用于施用。
肿瘤治疗
本发明的三特异性抗体可以用于治疗或诊断应用，例如癌症的治疗。
作为一种衔接器抗体，本发明的三特异性抗体的第一结合结构域负责靶向并结合肿瘤相关抗原。当所述第一结合结构域特异性结合CD19时，本发明的三特异性抗体特别适合于靶向表达CD19的靶细胞，例如与疾病相关的CD19+B细胞。
因此，本发明的三特异性抗体特别适合治疗涉及与B细胞相关的疾病，如B细胞相关肿瘤，包括B细胞淋巴瘤和B细胞白血病。特别地，所述B细胞相关肿瘤是复发或难治型B细胞恶性肿瘤(relapsed or refractory B-cell malignancies)，也就是所述受试者经历过在先的相关治疗并获得治疗收益之后复发，或者对于在先的相关治疗没有产生预期的应答。
所述B细胞淋巴瘤可以是非霍奇金淋巴瘤(NHL)，例如侵袭性或惰性非霍奇金淋巴瘤，或是霍奇金淋巴瘤。所述B细胞相关疾病的是实例包括但不限于：经典霍奇金淋巴瘤、结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、急性淋巴母细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、B-幼淋巴细胞白血病、前体B细胞淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、脾B细胞淋巴瘤/白血病、脾边缘区淋巴瘤。
非霍奇金淋巴瘤(NHL)是全世界最常见的癌症之一，代表了一类异质性的恶性淋巴肿瘤。主要的亚型是B细胞衍生的，包括弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-celllymphoma，DLBCL)和滤泡性淋巴瘤(follicular lymphoma，FL)。目前B细胞衍生的非霍奇金淋巴瘤的治疗策略包括抗CD20利妥昔单抗以及利妥昔单抗联合化疗的R-CHOP方案(利妥昔单抗，环磷酰胺，阿霉素，长春新碱，泼尼松)。尽管在某些亚型的NHL患者中，单药利妥昔单抗或与化疗联合使用的治疗效果有所改善，但仍然有部分患者R-CHOP治疗失败，而使病情进入复发/难治阶段。患者再次使用抗CD20单克隆抗体很难得到满意效果。利妥昔单抗对B细胞淋巴瘤的治疗效果取决于肿瘤细胞CD20表达水平，而肿瘤细胞的CD20表达存在异质性，CD20低表达患者对利妥昔单抗不敏感，具有先天耐药性；另外，对利妥昔单抗敏感的CD20高表达患者，经过治疗CD20表达下降甚至呈现阴性，而导致获得性耐药。Blinatumomab是一种双特异性T细胞激活剂(BiTE)抗体，可选择性地与B细胞表面抗原CD19和T细胞受体(TCR)的不变CD3部分结合，在复发或难治性B-NHL的早期概念验证临床试验中被报道具有抗淋巴瘤活性。Blinatumomab需要连续28天的静脉输注，这种困难的给药方式是应用Blinatumomab治疗NHL的一个重要障碍。不同于Blinatumomab，本发明的三特异性抗体能够以更低的频率施用，并提供相当或更佳的肿瘤抑制效果。在一个具体的实施方案中，本发明的三特异性抗体用于治疗非霍奇金淋巴瘤。
前体B细胞急性淋巴细胞白血病(Precursor B-cell acute lymphoblasticleukemia，B-ALL)是一种未成熟B细胞前体的肿瘤，通常影响6岁以下的儿童，但在青少年和成人群体中也会发生。目前B-ALL的主要治疗策略是化学疗法和造血干细胞移植(HSCT)，小儿B-ALL的总生存率(OS)达到80-90％，成人B-ALL的OS率为30-50％。然而，复发或治疗难治性ALL的预后在这两个年龄组都非常差。本发明的三特异性抗体为复发或治疗难治性ALL提供了一种新的治疗方案选择。在一个具体的实施方案中，本发明的三特异性抗体用于治疗前体B细胞急性淋巴细胞白血病，特别是复发或难治性的前体B细胞急性淋巴细胞白血病。
给药方法
本发明的三特异性抗体可以通过常规方法进行递送，优选进行系统性施用，例如通过静脉输注进行施用。
本发明的抗体可以以治疗有效量施用。“治疗有效量”是指当向受试者施用以治疗疾病，或疾病或病症的至少一种临床症状时，足以使对所述疾病、病症或症状的此类治疗生效的抗体的量。“治疗有效量”可以随抗体，所述疾病、病症和/或疾病或病症的症状，所述疾病、病症和/或疾病或病症的症状的严重程度，待治疗的受试者的年龄，和/或待治疗的受试者的体重而变化。
在本申请的一个优选实施方案中，抗体的给药量(mg/kg)基于受试者的体重。例如，本发明的三特异性抗体的单次给药剂量可以在约1ng/kg体重至约5mcg/kg体重的范围，优选5ng/kg体重至约2.5mcg/kg体重的范围，更优选0.1mcg/kg体重至约1mcg/kg体重的范围。例如，可以按照约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1mcg/kg体重的剂量进行给药。
本发明的三特异性抗体的一个优势在于能够高效、完全激活T细胞，且不易发生激活后细胞凋亡，另外可以诱导记忆T细胞以提供持续的免疫应答，由此可以以相对较低的给药间隔进行给药。在优选的实施方案中，在通过静脉输注进行施用时，本发明的三特异性抗体两次给药之间的间隔可以不少于1天、不少于3天，不少于5天，或者甚至相隔一周。例如，本发明的三特异性抗体可以每周给药7次、每周给药5次、每周给药3次、每周给药两次或每周给药一次。本发明的三特异性抗体可以以2-4周例如3周为一周期给药，并且给药一个周期或多个周期。本发明的三特异性抗体在按照每周给药一次的频率给药时，在同等剂量下(如相同摩尔剂量下)，能够比其他抗体如CD19xCD3双特异性抗体如Blinatumomab产生更好的肿瘤抑制效果。
药物联用
本发明的三特异性抗体可以和其他抗肿瘤治疗或药物进行联用。
在一些实施方案中，本发明的三特异性抗体可以与另外的抗体类药物联用。所述另外的抗体可以是靶向靶细胞如B细胞上的不同抗原的抗体类药物。所述另外的抗体类药物可以是特异性结合CD20、CD22、CD79a、CD38等的抗体类药物。具体的实例包括但不限于美罗华、奥英妥珠单抗。
在一些实施方案中，本发明的三特异性抗体可以与靶向疗法联用。所述靶向疗法例如酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，包括但不限于伊马替尼(imatinib)、吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼(erlotinib)、舒尼替尼(sunitinib)、拉帕替尼(lapatinib)、来那替尼(neratinib)和吡罗替尼(pyrotinib)。
在一些实施方案中，本发明的三特异性抗体可以与小分子化疗剂，如环磷酰胺(cyclophosphamide)、硫酸长春新碱(vincristine sulfate)、盐酸多柔比星(doxorubicinhydrochloride)、地塞米松(dexamethasone)等进行联用。
本发明还涉及如下各项：
1.一种特异性结合CD19、CD3和CD28的三特异性抗体，其包含：
(1)特异性结合CD19的第一结合结构域；
(2)第一接头序列；
(3)特异性结合CD3的第二结合结构域；
(4)第二接头序列，其为选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：8或SEQ ID NO：9的氨基酸序列；和
(5)特异性结合CD28的第三结合结构域。
2.根据项1所述的三特异性抗体，其是单链融合蛋白。
3.根据项1或2所述的三特异性抗体，其中所述第一接头序列包含(G4S)n或(G2S)n，或所述第一接头序列为(G4S)n或(G2S)n，其中n为1-6的整数，优选1-3。
4.根据项3所述的三特异性抗体，其中所述第一接头序列选自SEQ ID NO：1、SEQID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸序列。
5.根据项1-4中任一项所述的三特异性抗体，所述第一结合结构域是包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的特异性结合CD19的单链抗体，其中
(a)所述VH包含如SEQ ID NO：11所示的重链CDR 1、SEQ ID NO：12所示的重链CDR2和SEQ ID NO：13所示的所示的重链CDR3，且所述VL包含如SEQ ID NO：14所示的轻链CDR 1、SEQ ID NO：15所示的轻链CDR2和SEQ ID NO：16所示的所示的轻链CDR3；或
(b)所述VH包含如SEQ ID NO：46所示的重链CDR 1、SEQ ID NO：47所示的重链CDR2和SEQ ID NO：48所示的所示的重链CDR3，且所述VL包含如SEQ ID NO：49所示的轻链CDR 1、SEQ ID NO：50所示的轻链CDR2和SEQ ID NO：51所示的所示的轻链CDR3。
6.根据项5所述的三特异性抗体，其中：
(a)所述VH包含如SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(如至少85％同源性，优选至少90％同源性，更优选至少95％同源性，甚至更优选至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性)并且所有氨基酸差异均在非CDR区的氨基酸序列，或由这样的氨基酸序列组成；并且
所述VL包含如SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(如至少85％同源性，优选至少90％同源性，更优选至少95％同源性，甚至更优选至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性)并且所有氨基酸差异均在非CDR区的氨基酸序列，或由这样的氨基酸序列组成；或者
(b)所述VH包含如SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(如至少85％同源性，优选至少90％同源性，更优选至少95％同源性，甚至更优选至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性)并且所有氨基酸差异均在非CDR区的氨基酸序列，或由这样的氨基酸序列组成；并且
所述VL包含如SEQ ID NO：54所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：54所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(如至少85％同源性，优选至少90％同源性，更优选至少95％同源性，甚至更优选至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性)并且所有氨基酸差异均在非CDR区的氨基酸序列，或由这样的氨基酸序列组成。
7.根据项6中所述的三特异性抗体，所述第一结合结构域包含如SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(如至少85％同源性，优选至少90％同源性，更优选至少95％同源性，甚至更优选至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性)并且所有氨基酸差异均在非CDR区的氨基酸序列；或由这样的氨基酸序列组成。
8.根据项1-7中任一项所述的三特异性抗体，所述第二结合结构域是包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的特异性结合CD3的单链抗体，其中：
(a)所述VH包含如SEQ ID NO：22所示的重链CDR 1、SEQ ID NO：23所示的重链CDR2和SEQ ID NO：24所示的所示的重链CDR3，且所述VL包含如SEQ ID NO：25所示的轻链CDR 1、SEQ ID NO：26所示的轻链CDR2和SEQ ID NO：27示的所示的轻链CDR3；或
(b)所述VH包含如SEQ ID NO：57所示的重链CDR 1、SEQ ID NO：58所示的重链CDR2和SEQ ID NO：59所示的所示的重链CDR3，且所述VL包含如SEQ ID NO：60所示的轻链CDR 1、SEQ ID NO：61所示的轻链CDR2和SEQ ID NO：62所示的所示的轻链CDR3。
9.根据项8所述的三特异性抗体，其中
(a)所述VH包含如SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(如至少85％同源性，优选至少90％同源性，更优选至少95％同源性，甚至更优选至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性)并且所有氨基酸差异均在非CDR区的氨基酸序列，或由这样的氨基酸序列组成；并且
所述VL包含如SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(如至少85％同源性，优选至少90％同源性，更优选至少95％同源性，甚至更优选至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性)并且所有氨基酸差异均在非CDR区的氨基酸序列，或由这样的氨基酸序列组成；或者
(b)所述VH包含如SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(如至少85％同源性，优选至少90％同源性，更优选至少95％同源性，甚至更优选至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性)并且所有氨基酸差异均在非CDR区的氨基酸序列，或由这样的氨基酸序列组成；并且
所述VL包含如SEQ ID NO：65所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：65所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(如至少85％同源性，优选至少90％同源性，更优选至少95％同源性，甚至更优选至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性)并且所有氨基酸差异均在非CDR区的氨基酸序列，或由这样的氨基酸序列组成。
10.根据项9所述的三特异性抗体，所述特异性结合CD3的scFv包含如SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：67所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：67所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(如至少85％同源性，优选至少90％同源性，更优选至少95％同源性，甚至更优选至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性)并且所有氨基酸差异均在非CDR区的氨基酸序列；或由这样的氨基酸序列组成。
11.根据项1-10中任一项所述的三特异性抗体，所述第三结合结构域是包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的特异性结合CD28的单链抗体，其中所述VH包含如SEQ IDNO：33所示的重链CDR 1、SEQ ID NO：34所示的重链CDR2和SEQ ID NO：35所示的所示的重链CDR3，且所述VL包含如SEQ ID NO：36所示的轻链CDR 1、SEQ ID NO：37所示的轻链CDR2和SEQ ID NO：38示的所示的轻链CDR3。
12.根据项11所述的三特异性抗体，其中
所述VH包含如SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(如至少85％同源性，优选至少90％同源性，更优选至少95％同源性，甚至更优选至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性)并且所有氨基酸差异均在非CDR区的氨基酸序列，或由这样的氨基酸序列组成；并且
所述VL包含如SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(如至少85％同源性，优选至少90％同源性，更优选至少95％同源性，甚至更优选至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性)并且所有氨基酸差异均在非CDR区的氨基酸序列，或由这样的氨基酸序列组成。
13.根据项12所述的三特异性抗体，所述第三结合结构域包含如SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(如至少85％同源性，优选至少90％同源性，更优选至少95％同源性，甚至更优选至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性)并且所有氨基酸差异均在非CDR区的氨基酸序列；或由这样的氨基酸序列组成。
14.根据项1-13任一项所述的三特异性抗体，其中每个结合结构域中包含用于连接重链可变区和轻链可变区的接头序列，所述接头序列包含(G4S)n或(G2S)n，其中n为1-1O的整数，优选1-5，更优选1-3。
15.根据项14所述的三特异性抗体，所述用于连接重链可变区和轻链可变区的接头序列的氨基酸序列选自如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。
16.根据项1-15任一项所述的三特异性抗体，其包含如SEQ ID NO：44或SEQ IDNO：68所示的氨基酸序列，或由如SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：68所示的氨基酸序列组成；或包含与如SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：68所示的氨基酸序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性的氨基酸序列，或由与如SEQ IDNO：44或SEQ ID NO：68所示的氨基酸序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性的氨基酸序列组成。
17.一种分离的核酸分子，其编码如项1-16中任一项的三特异性抗体。
18.如项17所述的分离的核酸分子，其中所述第一结合结构域的编码核苷酸序列包含如下核苷酸序列：
(1)如SEQ ID NO：18所示的编码VH的核苷酸序列，或与其具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性并且编码如SEQ ID NO：17所示的VH的核苷酸序列；和/或
(2)如SEQ ID NO：20所示的编码VL的核苷酸序列，或与其具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性并且编码如SEQ ID NO：19所示的VL的核苷酸序列。
19.如项17所述的分离的核酸分子，其中所述第一结合结构域的编码核苷酸序列包含如下核苷酸序列：
(1)如SEQ ID NO：53所示的编码VH的核苷酸序列，或与其具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性并且编码如SEQ ID NO：52所示的VH的核苷酸序列；和/或
(2)如SEQ ID NO：55所示的编码VL的核苷酸序列，或与其具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性并且编码如SEQ ID NO：54所示的VL的核苷酸序列。
20.如项17-19所述的分离的核酸分子，其中所述第二结合结构域的编码核苷酸序列包含如下核苷酸序列：
(1)如SEQ ID NO：29所示的编码VH的核苷酸序列，或与其具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性并且编码如SEQ ID NO：28所示的VH的核苷酸序列；和/或
(2)如SEQ ID NO：31所示的编码VL的核苷酸序列，或与其具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性并且编码如SEQ ID NO：30所示的VL的核苷酸序列。
21.如项17-19所述的分离的核酸分子，其中所述第二结合结构域的编码核苷酸序列包含如下核苷酸序列：
(1)如SEQ ID NO：64所示的编码VH的核苷酸序列，或与其具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性并且编码如SEQ ID NO：63所示的VH的核苷酸序列；和/或
(2)如SEQ ID NO：66所示的编码VL的核苷酸序列，或与其具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性并且编码如SEQ ID NO：65所示的VL的核苷酸序列。
22.如项17-21任一项所述的分离的核酸分子，其中所述第三结合结构域的编码核苷酸序列包含如下核苷酸序列：
(1)如SEQ ID NO：40所示的编码VH的核苷酸序列，或与其具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性并且编码如SEQ ID NO：39所示的VH的核苷酸序列；和/或
(2)如SEQ ID NO：42所示的编码VL的核苷酸序列，或与其具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性并且编码如SEQ ID NO：41所示的VL的核苷酸序列。
23.如项17-22任一项所述的分离的核酸分子，其包含：
(1)编码第一结合结构域的核苷酸序列，其包含如SEQ ID NO：18所示的编码VH的核苷酸序列，或与其具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性并且编码如SEQ ID NO：17所示的VH的核苷酸序列；和如SEQ ID NO：20所示的编码VL的核苷酸序列，或与其具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性并且编码如SEQ ID NO：19所示的VL的核苷酸序列；
(2)编码第二结合结构域的核苷酸序列，其包含如SEQ ID NO：29所示的编码VH的核苷酸序列，或与其具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性并且编码如SEQ ID NO：28所示的VH的核苷酸序列；和如SEQ ID NO：31所示的编码VL的核苷酸序列，或与其具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性并且编码如SEQ ID NO：30所示的VL的核苷酸序列；和
(3)编码第三结合结构域的核苷酸序列，其包含如SEQ ID NO：40所示的编码VH的核苷酸序列，或与其具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性并且编码如SEQ ID NO：39所示的VH的核苷酸序列；和如SEQ ID NO：42所示的编码VL的核苷酸序列，或与其具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性并且编码如SEQ ID NO：41所示的VL的核苷酸序列。
24.如项17-22任一项所述的分离的核酸分子，其包含：
(1)编码第一结合结构域的核苷酸序列，其包含如SEQ ID NO：53所示的编码VH的核苷酸序列，或与其具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性并且编码如SEQ ID NO：52所示的VH的核苷酸序列；和如SEQ ID NO：55所示的编码VL的核苷酸序列，或与其具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性并且编码如SEQ ID NO：54所示的VL的核苷酸序列；
(2)编码第二结合结构域的核苷酸序列，其包含如SEQ ID NO：64所示的编码VH的核苷酸序列，或与其具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性并且编码如SEQ ID NO：63所示的VH的核苷酸序列；和如SEQ ID NO：66所示的编码VL的核苷酸序列，或与其具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性并且编码如SEQ ID NO：65所示的VL的核苷酸序列；和
(3)编码第三结合结构域的核苷酸序列，其包含如SEQ ID NO：40所示的编码VH的核苷酸序列，或与其具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性并且编码如SEQ ID NO：39所示的VH的核苷酸序列；和如SEQ ID NO：42所示的编码VL的核苷酸序列，或与其具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性并且编码如SEQ ID NO：41所示的VL的核苷酸序列。
25.如项17-24任一项所述的分离的核酸分子，其包含编码接头序列的核苷酸序列。
26.如项17-25任一项所述的分离的核酸分子，其包含如SEQ ID NO：45或SEQ IDNO：69所示的核苷酸序列，或由如SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：69所示的核苷酸序列组成。
27.一种表达载体，其包含项17-26中任一项所述的分离的核酸分子。
28.一种宿主细胞，其包含项17-26中任一项所述的分离的核酸分子或项27的表达载体。
29.项28的宿主细胞，其选自细菌细胞、真菌细胞、昆虫细胞或动物细胞。
30.项29的宿主细胞，所述动物细胞为哺乳动物细胞，并选自293T细胞、CHO细胞或它们的衍生细胞系。
31.一种制备三特异性抗体的方法，包括：
(a)提供项17-26中任一项所述的分离的核酸分子或项27的表达载体，
(b)将(a)中所述的分离的核酸分子或所述表达载体引入宿主细胞，
(c)培养(b)中获得的宿主细胞以表达所述三特异性抗体，和
(d)从所述细胞的培养物中回收所述三特异性抗体。
32.一种制备三特异性抗体的方法，包括：
(a)提供项28或29所述的宿主细胞，
(b)培养所述宿主细胞以表达所述三特异性抗体，和
(c)从所述细胞的培养物中回收所述三特异性抗体。
33.项31或32的方法，进一步包括对回收的三特异性抗体进行纯化。
34.通过项31-33任一项的方法获得的三特异性抗体。
35.项1-16或34中任一项的三特异性抗体在制备药物中的用途。
36.项35所述的用途，所述药物用于治疗B细胞相关肿瘤。
37.项36所述的用途，所述B细胞相关肿瘤是B细胞淋巴瘤。
38.项36所述的用途，所述B细胞相关肿瘤是B细胞白血病。
39.项37所述的用途，所述B细胞相关肿瘤是难治型或复发型B细胞肿瘤。
40.项37或39的用途，所述B细胞淋巴瘤是侵袭性或惰性非霍奇金淋巴瘤。
41.项38或39的用途，所述B细胞白血病是B细胞急性淋巴细胞白血病。
42.一种在有需要的受试者中治疗B细胞相关肿瘤的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的项1-16或34中任一项的三特异性抗体。
43.项42所述的方法，所述B细胞相关肿瘤是难治型或复发型B细胞肿瘤。
44.项42或43的方法，所述B细胞相关肿瘤是B细胞淋巴瘤或B细胞白血病。
45.项42-44中任一项的方法，所述B细胞相关肿瘤是侵袭性或惰性非霍奇金淋巴瘤。
46.项42-44中任一项的方法，所述B细胞相关肿瘤是B细胞急性淋巴细胞白血病。
47.项42至46中任一项的方法，所述三特异性抗体以每周3次、每周2次或每周1次的频率给药。
48.项42至47中任一项的方法，所述三特异性抗体以约1ng/kg体重至约5mcg/kg体重，优选10ng/kg体重至约2.5mcg/kg体重，更优选0.1mcg/kg体重至约1mcg/kg体重的剂量给药。
49.一种药物组合物，其包含项1-16或34中任一项的三特异性抗体，和药学上可接受的载体。
50.一种药物组合，其包含项1-16或34中任一项的三特异性抗体，和另一种治疗剂。
51.项50的药物组合，所述另一种治疗剂是用于治疗B细胞相关肿瘤的治疗剂。
52.一种接头序列，其源自IgD的铰链区的氨基酸序列，长度为20-85个氨基酸，并且至少具有如下特征中的一种或两种：
(1)不含半胱氨酸；
(2)不含糖基化位点。
53.项52的接头序列，其相对于IgD的铰链区的氨基酸序列，将半胱氨酸用其他氨基酸取代。
54.项53的接头序列，其中用丝氨酸或甘氨酸取代半胱氨酸。
55.项53或54的接头序列，其中被取代的半胱氨酸是第161位的半胱氨酸。
56.项52至55中任一项的接头序列，其中所述糖基化位点为第109位的丝氨酸以及对应于第126、127、131、132位的苏氨酸。
57.项52至56中任一项的接头序列，其相对于IgD的铰链区的氨基酸序列，通过氨基酸取代或截短来去除糖基化位点。
58.项52至57中任一项的接头序列，其具有如下特征中的一项或多项：
(1)与SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列相比，缺乏半胱氨酸；
(2)与SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列相比，缺乏糖基化位点；
(3)与SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列相比，具有更短的长度。
59.项52至58中任一项的接头序列，其具有如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9的中所示的氨基酸序列。
60.一种融合蛋白，其包含项52至59中任一项的接头序列。
61.项60所述的融合蛋白，其为多特异性抗体。
62.项61所述的融合蛋白，其中所述接头序列用于连接具有不同抗原特异性的结构域。
64.项52至59中任一项的接头序列在融合蛋白中用于连接不同结构域的用途。
实施例
为了更全面地理解和应用本发明，下文将参考实施例和附图详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。
实施例1.表达三特异性抗体LMOAME和MLMOF的真核表达载体的构建
本实施例示例性地描述了两种三特异性抗体LMOAME和MLMOF的制备方法，特别是构建表达三特异性抗体的表达载体。
LMOAME或MLMOF的氨基酸序列分别如下文的SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：68所示，其中各个VH和VL序列用普通字体表示；三个结合结构域之内用于连接各自的VH和VL的三条接头序列用下划线标出；各个结合结构域之间用于连接不同结合结构域的两条接头序列用方框标出。
LMOAME的完整氨基酸序列(SEQ ID NO：44)
MLMOF的完整氨基酸序列(SEQ ID NO：68)
如上所示，LMOAME和MLMOF中的CD19结合结构域和CD3结合结构域中使用了不同的单链抗体序列，其中MLMOF的CD19结合结构域和CD3结合结构域与对应猴抗原具有交叉反应性。LMOAME和MLMOF中的CD28结合结构域是相同的，并且该CD28结合结构域与对应猴抗原具有交叉反应性。在LMOAME和MLMOF中，用于连接VH和VL的六个结构域内接头中有五个为(G4S)3(SEQ ID NO：1)，只有LMOAME的第二结合结构域(CD3结合结构域)中用于连接VH和VL的接头为(G2S)3G2(SEQ ID NO：3)。LMOAME和MLMOF使用了完全相同的结构域间接头，包括用于连接CD19结合结构域和CD3结合结构域的第一接头序列G4S(SEQ ID NO：2)，以及用于连接CD3结合结构域和CD28结合结构域的第二接头序列RNTGRGGE EKKKEKEKEE QEERETKTPESPSHTQPLGV(SEQ ID NO：6)。
为了在哺乳动物细胞中表达上述两种三特异性抗体，首先对编码包含CD19结合结构域、CD3结合结构域和CD28结合结构域的三特异性分子的核苷酸序列进行了密码子优化，优化后的完整三特异性抗体的编码核苷酸分别如SEQ ID NO：45(LMOAME)和SEQ ID NO：69(MLMOF)所示。分别合成了这两条编码抗体全长氨基酸序列的核苷酸序列，然后将合成的序列作为插入子克隆至pWNP15(Novoprotein)表达载体中，以形成抗体表达构建体pWNP15-LMOAME和pWNP15-MLMOF。其中，通过化学合成法使所述插入子两端具有EcoRI和SalI酶切位点，用于将合成得到的所述插入子克隆到经EcoRI和SalI线性化处理的表达载体pWNP15上。对获得的重组质粒进行测序鉴定。测序正确的重组质粒将用于CHO-DG44(Thermo Fisher/Life Technologies，批号55463WCB2)表达稳定株的构建。将构建好的重组质粒以PyuI线性化后，用PEI介导的方法转染到CHO-DG44中，并通过细胞扩增及氨甲蝶呤(MTX)加压筛选、细胞有限稀释方法筛选出了两种构建体的单克隆细胞稳转株，分别称为CHO-DG44-LMOAME和CHO-DG44-MLMOF。
实施例2.三特异性抗体LMOAME和MLMOF的表达和纯化
本实施例继续描述制备两种示例性三特异性抗体的方法。
2.1 LMOAME的表达和纯化
取实施例1中得到的包含编码LMOAME重组质粒的CHO-DG44稳转株细胞通过一系列摇瓶培养放大，反应器细胞培养及蛋白表达分泌至培养上清液，收获上清液并进行澄清过滤后按照以下方法对培养上清中得到的抗体产物进行了纯化。
采用Capto L填料(购自Cytiva公司)对目标蛋白进行捕获，首先用亲和清洗液处理层析柱3-4个柱体积。用亲和平衡液平衡至少4个柱体积。将澄清后的细胞收获液一次性上样。上样完毕用亲和平衡液平衡3-4个柱体积。然后用亲和冲洗液冲洗至少4个柱体积。冲洗完毕用亲和洗脱液洗脱蛋白，当紫外吸收值升至10-50mAU/2mm时收集蛋白，当紫外吸收值降至10-50mAU/2mm时结束收集。搅拌混匀洗脱蛋白并称重，测定蛋白浓度。
经亲和层析捕获的目标蛋白再经过低pH病毒灭活、疏水层析、阴离子层析、UF/DF、纳滤等一系列纯化步骤获得纯化后的蛋白。
经多个步骤纯化的LMOAME蛋白经SDS-PAGE和SEC-HPLC分析。SDS-PAGE和SEC-HPLC的分析结果如图2A-B所示，其中5个不同批次的样品均获得了分子量正确的条带。
如图2A所示，在非还原SDS-PAGE条件下，本实施例制备得到的LMOAME蛋白呈现单一电泳条带。LMOAME重组蛋白的理论分子量为83.8kDa，结果显示纯化得到的蛋白的分子量与单体理论分子量一致。另外从图2B SEC-HPLC上可见，经本实施例的方法和步骤进行纯化后，LMOAME纯度＞95％，观察不到细胞培养液中存在明显的因错误折叠或聚合形成的蛋白质。
采用反相超高效液相-四级杆-飞行时间质谱(XEVO G2-XS-QToF，Waters)对纯化后的LMOAME进行了质谱分析，结果示于图3。如图3所示，纯化得到的LMOAME只有一个主要的成分，且为其分子量与单体理论分子量一致，无糖基化修饰。
进一步对纯化的LMOAME样品进行了N末端序列分析，结果表明所表达的重组蛋白读框无误。
为方便比较不同接头的设计对三特异性抗体理化性质的影响，使用发明人对先前开发的另一三特异性抗体BLMOAM作为对照(参见中国专利申请公开号CN106589129A)，与LMOAME一起进行了一步亲和层析捕获纯化，纯化结果如图4A-B，及图5所示。BLMOAM也是特异性结合CD19、CD3和CD28的三特异性抗体，但是在第一和第二结合结构域之间使用了G4S作为接头(连接片段1)，并在第二和第三结合结构域之间使用了一个长达81个氨基酸且包含半胱氨酸的接头(连接片段2，该申请中的SEQ ID NO：29)。结果表明与BLMOAM相比较，LMOAME的成分均一，含有的二聚体或者多聚体的组份较低，说明LMOAME不容易形成二聚体或多聚体。
2.2MLMOF的纯化
采用与2.1实验相似的方法和步骤对包含编码MLMOF的重组质粒转染后的细胞培养上清中的抗体产物进行纯化，结果如图6所示，得到与LMOAME类似的纯度，经N末端序列分析，结果表明所表达的重组蛋白读框无误。
实施例3.ELISA检测三特异性抗体LMOAME的抗原结合活性
本实施例采用了ELISA分析来评估LMOAME与重组人CD19抗原(rhCD19)和重组人CD28抗原(rhCD28)的结合活性。
将重组人CD19抗原(CD19(C-Fc)，Novoprotein，Cat#：C572)，和CD28抗原(CD28(C-Fc)，Novoprotein，Cat#：C81)用蛋白包被液稀释至2μg/mL，每孔100μL，2-8℃包板过夜。次日洗板后，用1％Casein+3％BSA的封闭液(PBS+2％BSA(V/W))封闭。
以PBS将实施例2纯化得到的LMOAME进行系列稀释至指定浓度范围(rhCD19结合检测：0.0016-30μg/mL；rhCD28结合检测：0.0006-10μg/mL)。将稀释后的抗体分别添加到包被了抗原的96孔平底板中，37℃孵育1h。PBST(PBS+0.05％Tween-20(V/V))洗板后，用HRP-protein L(GenScript，Cat#：M00098)及TMB(KPL SureBlueTM，Cat#：5120-0075)进行检测。
以GraphPad Prism软件分析数据，利用半数最大效应浓度EC50值表示LMOAME对rhCD19和rhCD28抗原的结合能力。结果如图7显示。
结果显示，LMOAME与rhCD19及rhCD28抗原的结合能力较强，EC50值的范围分别在0.3607-0.6853及0.0571-0.0758μg/mL之间。
实施例4.体外细胞结合法评估三特异性抗体LMOAME与膜结合抗原的结合活性
本实施例采用体外细胞结合法评估了LMOAME与膜结合抗原hCD19、hCD3ε、hCD28的结合活性。
按每孔1×105个细胞的密度向96孔板中加入表达靶抗原的检测用细胞(A549-CD19，CHO-CD28或H9)，并以不表达靶点蛋白的阴性细胞为对照。具体而言，针对各个抗原进行检测所用的细胞和阴性对照如下。
为了检测与hCD19的结合活性，使用了A549-CD19细胞系，其为表达CD19的A549稳转株，表型为CD19+CD3-CD28-；并以不表达CD19的A549细胞系(购自CCTCC，GDC0063)作为阴性对照。
为了检测与hCD3的结合活性，使用了H9细胞系(购自CCTCC，GDC0031)，其为表达CD3的人T淋巴瘤细胞，表型为CD19-CD3+CD28-；并以不表达CD19，CD3及CD28的CHO细胞系作为阴性对照。
为了检测与hCD28的结合活性，使用了CHO-CD28细胞系，其为表达CD28的CHO细胞稳转株，表型为CD19-CD3-CD28+；并以不表达CD19，CD3及CD28的CHO细胞系作为阴性对照。
将实施例2纯化得到的LMOAME用染色缓冲液STB(含0.5％vol FBS的PBS)稀释后加入到上述96孔板中，终浓度分别为30，10，3，1，0.3，0.1，0.03及0.01μg/mL，与检测用细胞在4℃条件下共同孵育1h。离心去除未结合的抗体。通过Biotin-protein L(GenScript，Cat#：M00097)及APC-Streptavidin(Biolegend，Cat#：405207)检测结合LMOAME抗体的细胞，以Thermo Fisher Attune NxT流式细胞仪记录平均荧光强度(MFI)。
以GraphPad Prism软件分析数据，利用半数最大效应浓度EC50值表示LMOAME对膜结合抗原hCD19、hCD3ε和hCD28的结合能力。
结果显示，LMOAME与膜结合抗原hCD19、hCD28和hCD3ε的结合的EC50值分别为约0.15-0.17μg/mL、约0.27-0.32μg/mL和约5.1-7.5μg/mL。结果同时显示，LMOAME与不表达靶点蛋白的阴性细胞系之间不具有可检测的结合活性。
实施例5.体外评估三特异性抗体介导的效应细胞激活
5.1评估LMOAME诱导T细胞激活的作用
本实施例以人PBMC为评估体系，在体外实验中测试了LMOAME抗体介导效应细胞激活的能力。
将不同浓度的LMOAME与PBMC共孵育后，检测PBMC中T细胞活化标记物CD25、CD69和GrB表达的情况，由此观测LMOAME对T细胞的激活作用。
具体地，以Ficoll-Paque Plus(GE，Cat#：17-1440-02)提取三名健康志愿者的PBMC，按2×105个细胞/孔的密度加入到96孔U底细胞培养板。将实施例2纯化得到的LMOAME和商购的CD19xCD3双特异性抗体(BiTE)Blinatumomab(泰州市百英生物科技有限公司，#20210330T001)用RPMI1640完全培养基(Gibco，Cat#：C11875500CP)进行系列稀释：LMOAME的终浓度设置为0.001，0.01，0.03，0.1，0.3，1，3，10，100ng/mL；Blinatumomab的终浓度设置为0.00065，0.0065，0.0195，0.065，0.195，0.65，1.95，6.5，65ng/mL。以RPMI1640完全培养基的溶媒对照组作为阴性对照。将LMOAME和Blinatumomab分别加入到96孔U底细胞培养板，并与PBMC在37℃条件下孵育48h或120h，用STB洗板后，利用检测抗体对细胞进行染色。具体使用了如下检测抗体：
PerCP/Cyanine5.5抗人CD4抗体：BioLegend，Cat#：317428
FITC抗人CD8抗体：BioLegend，Cat#：301006
PE抗人CD25抗体：BioLegend，Cat#：356104
BV605抗人CD69抗体：BioLegend，Cat#：310938
APC抗人/小鼠Granzyme B抗体：BioLegend，Cat#：372204。
然后以Thermo Fisher Attune NxT流式细胞仪检测96孔板各孔中以下各种目标细胞亚群的比例和数量：CD4+、CD4+CD25+、CD4+CD69+、CD4+Granzyme B+、CD8+、CD8+CD25+、CD8+CD69+和CD8+Granzyme B+细胞。
采用GraphPad Prism软件进行数据统计。如果单因素方法分析(One-way ANOVA)具有统计学意义(P＜0.05)，则进一步进行比较分析。采用Dunnett′s Multiple Test分析LMOAME或者Blinatumomab与溶媒对照的差异；用Tukey′s Multiple Test分析相同摩尔浓度的LMOAME和Blinatumomab之间的差异。
结果如图8A、8B显示。与溶媒对照相比，LMOAME与PBMC共孵育48h或120h后，表达CD25+、CD69+及GrB+的CD4+和CD8+的细胞比例均显著增加，且与LMOAME的浓度呈现剂量相关性。
另外，结果显示，与PBMC共孵育48h或120h后，LMOAME与Blinatumomab相比，表达CD25+、CD69+及GrB+的CD4+和CD8+的细胞群比例更高。
综上可见，本发明提供的三特异性抗体LMOAME与PBMC共孵育后，能够显著增加CD4+或CD8+效应细胞表面CD25和CD69的表达，以及显著增加效应细胞胞内GrB的表达，充分激活PBMC中的效应细胞。同时结果还显示，本发明提供的三特异性抗体LMOAME对PBMC中效应细胞的激活作用显著高于Blinatumomab。
5.2评估LMOAME、MLMOF、BLMOAM诱导T细胞激活的作用(Jurkat细胞体系)
以体外细胞生物学实验检测不同三特异性抗体介导的效应细胞激活。检测的三特异性抗体包括本发明实施例1和2中制备的LMOAME和MLMOF，以及申请人在先申请中的 BLMOAM。以RPMI 1640完全培养基的溶媒对照组作为阴性对照。
具体流程包括：(1)取Jurkat细胞(ATCC，TIB-152)，用实验培养基配制成2.5×106个细胞/mL的细胞悬液后，以每孔40μL接种于96孔细胞培养板中；(2)再取Nalm-6细胞的GFP稳转株(Novoprotein)，用实验培养基配制成2.5×105个细胞/mL的细胞悬液后，以每孔40μL接种于96孔细胞培养板中；(3)分别加入梯度稀释的供试品溶液，每孔20μL；(4)混匀后于37℃、5％CO2条件下培养24h；(5)1％FBS-PBS洗板后，将荧光染料7AAD(Biolegend，Cat#420404)和Anti-CD69-APC(Biolegend，Cat#310910)稀释后加入96孔板中，混匀后2℃～8℃避光静置孵育30min；(6)用1％FBS-PBS洗板，加入200μL/孔1％FBS-PBS混匀后用流式细胞仪检测APC阳性细胞群所占比值。应用GraphPad Prism软件进行数据分析，利用50％最大效应浓度EC50值表示不同的三特异性抗体的T细胞激活活性。结果显示LMOAME、MLMOF和BLMOAM诱导T细胞激活的EC50值分别为0.624、0.871和1.505ng/mL。该结果说明本发明的两种三特异性抗体相较于先前使用不同接头序列的三特异性抗体BLMOAM而言，能够以更低的用量诱导T细胞激活，意味着具有更强的T细胞激活能力。此外，LMOAME的T细胞激活能力比MLMOF稍高。
实施例6.体外评估三特异性抗体LMOAME介导的效应细胞增殖
本实施例评估了LMOAME介导的效应细胞增殖的效应，其中以人PBMC为评估体系，将不同浓度的LMOAME与PBMC共孵育后，检测PBMC中CD4+、CD4+CFSEdim、CD8+及CD8+CFSEdim细胞的比例和数量，从而考察LMOAME诱导T细胞的增殖作用。
具体地，以Ficoll-Paque Plus提取三名健康志愿者的PBMC，与2μM羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)在37℃条件下孵育30min后，按2×105个细胞/孔的密度加入96孔U底细胞培养板。将实施例2纯化得到的LMOAME和商购的Blinatumomab分别以RPIM 1640完全培养基进行系列稀释：LMOAME终浓度设置为0.001，0.01，0.03，0.1，0.3，1，3，10，100ng/mL；Blinatumomab的终浓度设置为0.00065，0.0065，0.0195，0.065，0.195，0.65，1.95，6.5，65ng/mL。以RPMI 1640完全培养基的溶媒对照组作为阴性对照。将LMOAME和Blinatumomab分别加入到96孔U底细胞培养板，并与PBMC在37℃条件下孵育120h后，用Pacific Blue抗人CD4抗体(BioLegend，Cat#：317429)和APC抗人CD8抗体(BioLegend，Cat#：344722)染色；以Thermo Fisher Attune NxT流式细胞仪检测检测各孔PBMC中CD4+、CD4+CFSEdim、CD8+和CD8+CFSEdim细胞的比例和数量。
各细胞亚群增殖倍数的计算公式如下：
CD4+细胞增殖倍数＝样本孔CD4+细胞数/溶媒对照孔CD4+细胞数；
CD4+CFSEdim细胞增殖倍数＝样本孔CD4+CFSEdim细胞数/溶媒对照孔CD4+CFSEdim细胞数；
CD8+细胞增殖倍数＝样本孔CD8+细胞数/溶媒对照孔CD8+细胞数；
CD8+CFSEdim细胞增殖倍数＝样本孔CD8+CFSEdim细胞数/溶媒对照孔CD8+CFSEdim细胞数。
其中，样本孔指LMOAME或Blinatumomab与PBMC共孵育孔；溶媒对照孔指溶媒对照与PBMC共孵育孔。
计量数据以平均值±标准误差来表示，采用GraphPad Prism软件进行数据统计。如果单因素方法分析(One-way ANOVA)具有统计学意义(P＜0.05)，则进一步进行比较分析。采用Dunnett′s Multiple Comparison Test分析LMOAME或者Blinatumomab和溶媒对照的差异。用Tukey′s Multiple Comparison Test分析LMOAME和Blinatumomab之间的差异。结果如图9显示。
如图所示，LMOAME可诱导显著的T细胞增殖，且T细胞的增殖倍数与加入的LMOAME浓度呈剂量依赖性。
结果还显示，在相同试验条件下，LMOAME组中CD4+及CD8+T细胞增加的数量均高于等摩尔浓度的Blinatumomab组。LMOAME对CD4+、CD4+CFSEdim、CD8+及CD8+CFSEdim细胞的最大增殖倍数分别为3.58、798.13、5.37及8639.48，等摩尔浓度的Blinatumomab对上述细胞的最大增殖倍数分别为1.35、104.00、1.84及1975.62。这些结果说明本发明的三特异性抗体LMOAME与双特异性抗体Blinatumomab相比，具有更强的促进效应细胞增殖的能力。
实施例7.体外评估三特异性抗体LMOAME介导的效应细胞分化
本实施例评估了LMOAME诱导效应细胞分化的能力，以取自三名健康志愿者的PBMC为评估体系，将不同浓度的LMOAME与PBMC共孵育后，检测CD4+与CD8+T细胞中TCM、TEM、TEffector及TNaive细胞群的比例和数量，从而考察LMOAME诱导T细胞分化的功能。
具体地，以Ficoll-Paque Plus提取三名健康志愿者的PBMC，按2×105个细胞/孔的密度加入96孔U底细胞培养板。将LMOAME或Blinatumomab用RPIM 1640完全培养基进行系列稀释：LMOAME终浓度设置为0.001，0.01，0.03，0.1，0.3，1，3，10，100ng/mL；Blinatumomab的终浓度设置为0.00065，0.0065，0.0195，0.065，0.195，0.65，1.95，6.5，65ng/mL，然后分别加入到上述96孔U底细胞培养板，并与PBMC在37℃条件下孵育48h或120h。利用检测抗体对细胞进行染色。
其中所用的细胞表型检测抗体具体如下：
Pacific Blue抗人CD4抗体：BioLegend，Cat#：317429
FITC抗人CD8a抗体BioLegend，Cat#：301006
PE抗人CD45RO抗体：BioLegend，Cat#：304206
APC抗人CCR7抗体：BioLegend，Cat#：353214
以Thermo Fisher Attune NxT流式细胞仪检测目标细胞亚群的比例和数量。结果示于图10。
结果显示，LMOAME与hPBMC共孵育48h后，CD4+TCM的数量显著增加；LMOAME组与Blinatumomab组相比，CD4+TCM的数量显著增加(P＜0.05)。在共孵育120h后，LMOAME诱导CD4+和CD8+记忆型T细胞TCM和TEM细胞群的数量显著增加，并与加入的LMOAME呈“钟形曲线”的关系。与Blinatumomab组相比，LMOAME诱导分化成CD4+和CD8+记忆型T细胞群的能力远高于Blinatumomab。
实施例8.体外评估三特异性抗体LMOAME介导的对靶细胞的杀伤活性
本实施例评估LMOAME介导的对靶细胞的杀伤活性，其中以人PBMC作为效应细胞，以B细胞淋巴瘤细胞株Raji-GFP、Ramos及Daudi，以及前体B细胞白血病细胞系Nalm-6作为靶细胞，通过将不同浓度的LMOAME与PBMC及靶细胞共孵育后，检测体系中GFP+或CD20+细胞的比例与数量，由此评估LMOAME介导PBMC中效应细胞对不同靶细胞的杀伤活性。
具体的，本实施例以Ficoll-Paque Plus提取3名健康志愿者的PBMC，将效应细胞和靶细胞按10∶1的比例加入到96孔U底细胞培养板(PBMC：2×105个细胞/孔，靶细胞：2×104个细胞/孔)。将LMOAME用RPIM 1640完全培养基进行系列稀释：LMOAME的终浓度设置为0.001，0.01，0.03，0.1，0.3，1，3，10，100ng/mL，然后加入到上述96孔U底细胞培养板。在37℃孵育72h后洗板并用7-AAD或FITC抗人CD20抗体(BD Pharmingen，Cat#：555622)染色，使用Thermo Fisher Attune NxT流式细胞仪检测各孔中GFP+或CD20+细胞的比例和数量并计算杀伤效率，杀伤效率计算公式如下：
以GraphPad Prism软件分析数据，LMOAME介导PBMC杀伤靶细胞的活性用50％最大效应浓度EC50值表示。结果示于图11。
结果显示，LMOAME可剂量依赖性地介导PBMC对不同B细胞淋巴瘤或B细胞白血病细胞系的杀伤(效靶比为10：1)。其中，LMOAME介导的对不同靶细胞杀伤的EC50值分别为1.738-2.071pM(Raji-GFP)、约0.265-0.286pM(Nalm-6)、0.690-0.864pM(Ramos)和0.172-0.173pM(Daudi)。
实施例9.体外检测三特异性抗体LMOAME介导的溶血或凝聚反应
本实施例采用体外试管法将不同浓度的LMOAME与2％的新西兰兔红细胞混悬液进行孵育，并通过肉眼观察法评估该过程中是否存在溶血或凝聚反应。试验设立0.9％氯化钠注射液组作为阴性对照，去离子水组作为阳性对照，将LMOAME的观察结果与对照组进行比较。
具体地，采集雄性新西兰兔的颈静脉或耳中央动脉血约5mL，提取红细胞并用0.9％氯化钠注射液制备成2％(v/v)混悬液。分别向各试验组中加入2.5mL红细胞混悬液及0.1-0.5mL实施例2纯化得到的LMOAME(0.14mg/mL)，并用0.9％氯化钠注射液调整反应体系至5mL。试验组和对照组在37℃±1℃的条件下孵育3h，第1h每隔15min观察一次，之后每隔1h观察一次，拍照并记录试管中上层溶液颜色及红细胞沉降的变化，以及是否有絮状沉淀的产生。
结果显示，终浓度为0.0028-0.014mg/mL的LMOAME不会引起兔红细胞的溶血反应，表现为随孵育时间的延长，试管中可见不同程度的红细胞沉降且上层溶液均呈无色透明状。同时，结果显示，试管中无红棕色或棕红色絮状沉淀产生，表明无药物引起的凝集反应。
实施例10.LMOAME在NPG小鼠Raji-luc/人PBMC共移植皮下荷瘤模型中的抑癌作用
本实施例检测了三特异性抗体LMOAME在NPG小鼠Raji-luc/人PBMC共移植皮下荷瘤模型的抑癌作用。
在每只约21克左右的雌性免疫缺陷的NPG小鼠(北京维通达动物饲养有限公司)的右侧皮下混合接种5×106个Raji-luc细胞及2.5×106个人PBMC细胞。用于本试验的Raji-luc细胞系以添加10％FBS的RPMI-1640培养基培养于含5％CO2的37℃培养箱。将5×106个细胞混悬在50μL PBS中，与等体积的2.5×106PBMC细胞混匀后，再与等体积Matrigel混匀，接种于每只小鼠的右侧背部皮下，接种体积为200μL。动物操作程序通过澎立生物试验动物管理和使用委员会(IACUC)审批。
接种后的第6天，选择32只小鼠，根据体重和肿瘤体积随机分为4组(8只/组)，包括溶媒对照组(G1)及实施例2纯化得到的LMOAME的20、80、150μg/kg剂量组(G2-G4)。
各组小鼠每周静脉给药2次(第1天和第4天)，持续3周(定义为给药期D1-D21)，共给药6次。每周两次测量并记录小鼠体重和肿瘤体积，并计算以下指标：肿瘤体积(V)、肿瘤生长抑制率(TGI)、相对肿瘤体积(RTV)和肿瘤重量抑制率(IRTW％)。各指标计算方法如下：
V＝(长×宽2)/2
RTV＝Vt/V0，Vt为时间点t时测定的肿瘤体积，V0为治疗开始时的肿瘤体积。
TGI＝(1-T/C)×100％，其中T和C分别为试验组和溶媒对照组在某一特定时间点的RTV。
IRTW％＝(溶媒对照组平均瘤重-试验组平均瘤重)/溶媒对照组平均瘤重×100％。
结果如图12A、12B、13所示。
小鼠体重
与溶媒对照(G1)相比，LMOAME的20、80、150μg/kg剂量组(G2-G4)小鼠体重从D1到D21天均无显著差异(P＞0.05)。
肿瘤体积(V)、相对肿瘤体积(RTV)和肿瘤生长抑制率(TGI)
在D8-D21天，与溶媒对照(G1)相比，LMOAME的20、80、150μg/kg剂量组(G2-G4)均具有显著的抑瘤作用(P＜0.001)，且肿瘤体积的减少随LMOAME浓度的增加呈剂量依赖性。给药结束时，LMOAME的150μg/kg剂量组(G4)中8只小鼠均检测到肿瘤的完全清除。
在研究终点时剥取肿瘤，称瘤重并计算肿瘤重量抑制率(IRTW％)，结果显示G2-G4组在给药终点时的IRTW％值分别为87.21％、95.35％和100％。
实施例11.三特异性抗体LMOAME在huHSC-NCG小鼠Raji-luc皮下荷瘤模型中的抑癌作用和毒性评价
本实施例检测了三特异性抗体LMOAME在huHSC-NCG小鼠Raji-luc皮下荷瘤模型中的抑癌作用和毒性。
huHSC-NCG小鼠是通过移植人造血干细胞(HSC)的方式在重度免疫缺陷小鼠NCG体内重建人免疫系统。在雌性huHSC-NCG小鼠的右侧皮下接种5×106个Raji-luc细胞。当平均肿瘤体积达到59.99mm3时，选取54只小鼠根据小鼠外周血中hCD45％×hCD3％的流式数据、小鼠体重及肿瘤体积，随机分成如下9组(6只/组)：溶媒对照组G1；Blinatumomab对照组G2-G3，给药剂量为100μg/kg；以及LMOAME给药组G4-G9，其中G4-G5组的给药剂量为50μg/kg，G6-G7组的给药剂量为150μg/kg，G8-G9组的给药剂量为500μg/kg。其中，给药剂量为100μg/kg的Blinatumomab组与给药剂量为150μg/kg的LMOAME组摩尔浓度相同。
组别为G1、G2、G4、G6、G8各组小鼠每周静脉给药2次(第1天和第4天)，持续4周，共给药8次。组别为G3、G5、G7、G9各组小鼠每周静脉给药1次，持续4周，共给药4次。
分组的日期定义为D1，给药期为D1-D28。每周两次测量并记录小鼠体重和肿瘤体积，根据测定的肿瘤体积计算肿瘤体积抑制率(TGITV)。在研究终点时剥取肿瘤，称瘤重并计算肿瘤重量抑制率(TGITW)。药物作用以肿瘤生长抑制率(Tumor Growth Inhibition，TGI)表示，包括肿瘤体积抑制率(TGITV)及肿瘤重量抑制率(TGITW)。
TGITV计算公式如下：
Vnt：编号为n的小鼠第T天的肿瘤体积；
Vn0：编号为n的小鼠第0天的肿瘤体积；
RTVn：编号为n的小鼠第T天的相对肿瘤体积；
meanRTVtreat：给药组RTV的平均值；
meanRTVvehicle：溶媒对照组RTV的平均值。
TGITW计算公式如下：
meanTWtreat：在研究终点给药组肿瘤重量的平均值；
meanTWvehicle：在研究终点溶媒对照组肿瘤重量的平均值。
根据肿瘤生长抑制率、小鼠体重、24h摄食/饮水量等临床观察指标，以及主要组织脏器HE染色、人CD3抗原IHC染色(肿瘤组织、脾脏和脑组织)、小鼠外周血流式数据分析的结果，对LMOAME进行药效学与毒理学评价。动物操作程序通过集萃药康生物科技试验动物管理和使用委员会(IACUC)审批。
给药期间各组肿瘤体积抑瘤率(TGITV)的变化如表1所示。从表1中的数据可知，LMOAME可剂量依赖性地抑制肿瘤生长，并且每周给药两次比每周给药一次的小鼠体现出更高的肿瘤抑制率。另外，通过流式细胞仪检测小鼠外周血hCD19+及hCD20+的细胞数表明，不同剂量LMOAME(50μg/kg，150μg/kg和500μg/kg)及100μg/kg Blinatumomab均能够通过抑制本小鼠肿瘤模型中模型hCD19+及hCD20+的细胞增殖从而发挥肿瘤抑制作用。
表1.给药期间(D1-D28)不同组别肿瘤体积抑瘤率的变化(TGITV)
在研究终点时剥取肿瘤，称瘤重并计算肿瘤重量抑制率(TGITW)，结果如表2及图14所示。在给药频率由一周两次(BIW)改为一周一次(QW)的情况下，G7组LMOAME的抑瘤率高于相同摩尔浓度及给药频率的Blinatumomab(G3)组。
表2.终点瘤重及各给药组肿瘤重量抑制率(TGITW)
注：肿瘤瘤重以平均值±SEM表示；以独立样本T检验对不同组别之间的抑瘤率进行统计学分析，vs G1(*：P＜0.05，**：P＜0.01，***：P＜0.001)；G2 vs G6，以及G3 vs G7(^：P＜0.05)。
给药期间，各给药组小鼠的耳温、摄食摄水无异常发现。与溶媒对照组相比，各给药组小鼠的体重无显著差异。G2、G4、G8组小鼠的脾脏重量有明显降低，由于脾脏富含淋巴细胞，而Blinatumomab与LMOAME有显著的B淋巴细胞清除的作用，因此给药组小鼠脾脏重量的降低被认为是与供试品的药理作用相关。组织病理学研究没发现与药物相关的病理反应。hCD3的IHC染色发现hCD3阳性主要集中在脾脏和肿瘤组织，脑组织无hCD3阳性染色。
实施例12.三特异性抗体LMOAME在huHSC-NCG小鼠Nalm6-luc尾静脉荷瘤模型中的抑癌作用
对雌性huHSC-NCG小鼠通过尾静脉接种1×106个Nalm6-luc细胞。当平均光子数值达到5.25×104p/sec/cm2/sr时，根据外周血中hCD45％×hCD3％细胞的流式数据、小鼠体重以及肿瘤光子数值，将32只小鼠随机分为4组(8只/组)，包括溶媒对照组(G1)及实施例2纯化得到的LMOAME的50、120、300μg/kg剂量组(G2-G4)。
各组小鼠每周静脉给药2次(第1天和第4天)，持续4周(定义为给药期D1-D28)，共给药8次。每周两次测量并记录小鼠体重、肿瘤光子数；根据测定的光子数计算肿瘤生长抑制率(TGI)，TGI的计算公式如下：
Rnt：编号为n的小鼠在第t天的肿瘤光子数；
Rn0：编号为n的小鼠在第0天的肿瘤光子数；
RRn：编号为n的小鼠在第t天的肿瘤相对光子数；
meanRRtreat：给药组RR的平均值；
meanRTVvehicle：溶媒对照组RR的平均值。
动物操作程序通过集萃药康生物科技试验动物管理和使用委员会(IACUC)审批。
12.1小鼠体重
如图15A所示，各组小鼠体重均出现下降，肿瘤生长被认为是造成体重下降的主要原因。
12.2生存曲线及死亡情况统计
研究期间无小鼠接受安乐死。不同组别小鼠的存活情况见表3和图16。G1组自D15开始出现小鼠死亡，D20天时仅一只小鼠存活，截至D21，G1组小鼠全部死亡。对于G2-G4组，从D20天开始出现小鼠死亡，截至研究终点，G2-G4组存活小鼠数量分别为4、3和7只。结合肿瘤荧光成像数据，小鼠的死亡被认为是由肿瘤负荷导致。可见，相比溶媒对照，不同剂量的LMOAME均可显著延长小鼠的平均生存期(P＜0.001***)。
表3.不同组别小鼠生存期统计(天)
注：数据以平均值±SEM表示。检验方法为Log-rank(Mantel-Cox)检验，***：P＜0.001。
N/A：观测周期内小鼠存活只数超过一半，无法确认中位生存期。
12.3肿瘤光子数值及肿瘤生长抑制率(TGI)
各组小鼠的平均肿瘤光子数值示于表4和图15B，肿瘤生长抑制率TGI值示于表5。
表4.研究期间不同组别小鼠平均肿瘤光子数值(p/sec/cm2/sr)
注：数据以平均值±SEM表示。“-”表示由于小鼠死亡无统计数据。
表5.不同组别小鼠肿瘤抑制率(TGI)
组别 D0 D5 D10 D15
G2 0.00％ 67.12％ 83.86％ 66.77％
G3 0.00％ 76.18％ 86.11％ 79.12％
G4 0.00％ 86.08％ 94.38％ 92.86％
从表4和表5中可见，LMOAME的50、120、300μg/kg剂量组(G2-G4)均可在D5、D10及D15天观察到肿瘤抑制作用，并显著延长了小鼠的生存期。G2-G4组在D5的TGI值分别为67.12％、76.18％和86.08％，在D10的TGI值分别为83.86％、86.11％和94.38％，在D15的TGI值分别为66.77％、79.12％和92.86％。
12.4小鼠外周血中人免疫细胞流式数据分析
在D3和D28天采集小鼠外周血进行流式分析，检测其中mCD45、hCD45、hCD19、hCD20、hCD3、hCD4和hCD8细胞的比例和数量。数据显示，在LMOAME的50、120、300μg/kg剂量组(G2-G4)中，小鼠外周血中的hCD19+和hCD20+细胞数均比D3天时的水平显著降低，证明LMOAME可靶向清除人B细胞。
实施例13.LMOAME的I期临床研究
本实施例描述了涉及本发明的三特异性抗体的I期临床研究，其中将LMOAME三特异性抗体制备为冻干粉针剂，并检测其在复发/难治型(relapsed and refractory；r/r)B细胞相关肿瘤受试者中的安全性、药代动力学(PK)及免疫原性。所述B细胞相关肿瘤具体包括表达CD19的B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)和B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)。患者必需是在接受过当前可用的、已知能够产生临床收益的已获批或已确立疗法之后出现了疾病进展者。
13.1入组人群
复发/难治型B-ALL及B细胞淋巴瘤。
13.2研究目的
主要研究目的：
评估LMOAME的安全性，并根据剂量限制性毒性(DLT)评估，确定LMOAME在成人患者中的II期推荐剂量(RP2D)。
次要研究目的：
-评估LMOAME药物相关毒性、与LMOAME的剂量和PK的相关关系。
-评估LMOAME在表达CD19的B细胞恶性肿瘤患者中的药代动力学(PK)参数和免疫原性。
-确定安全的、具有生物活性的给药剂量和治疗方案，用于2期临床试验。
-评估LMOAME在B细胞相关肿瘤的任何客观肿瘤反应率。
探索性研究目的：
-探讨PK参数与B细胞耗竭、血清细胞因子水平、CRS的关系以及与临床疗效的相关性。
-对外周血进行免疫分型，包括CD4+和CD8+T细胞的激活、CD19、CD20的百分比等。
-使用多参数流式细胞仪评估达到CR/CRi的ALL患者的MRD状态。
13.3方案设计
本研究为临床I期、多中心、开放式(open-label)、剂量爬坡设计。研究分为两个阶段。第一阶段患者的纳入和样本量遵循Simon R，et al.的方案，第二阶段遵循传统3+3剂量爬坡设计。
第I阶段：加速滴定设计
第I阶段的主要目的是确定引导剂量(Priming dose)的水平。其他目的包括安全性、PK和免疫原性。
共设定了如下5个剂量组：0.3mcg，0.6mcg，1.2mcg，2.4mcg，4.8mcg；每个剂量组1个病人。
剂量限制毒性(Dose-Limiting Toxicity；DLT)评估时间为21天。
在第一个给药周期中，第1周每周给药一次，第2周和第3周每周给药2次，DLT观察期为21天。
从第二个给药周期起，每周给药2次，周期长度为3周，持续至疾病进展(progressivedisease；PD)或不耐受。
全部5个剂量组为加速剂量爬坡(accelerated dose escalation)；如果在21天期间出现一例DLT或出现≥2级的不良反应(AE)，则将该剂量组扩大至3名病人，并且将剂量爬坡改为3+3设计。
如果在给定剂量水平下发生单个≥3级细胞因子释放综合征(CRS)或两个2级CRS，则将在每个剂量水平的第一个周期中添加第二个引导剂量，称为“中间”引导剂量。中间引导剂量将比确定的初始引导剂量水平高1个剂量水平。DLT期将延长至28天，以包括引导剂量方案(初始引导剂量和中间引导剂量各一周)和2周的爬坡剂量水平。引导剂量安排(初始和中间剂量)的确定和优化将基于所有可用数据，包括安全性、有效性、PK、PD(包括细胞因子数据)和其他将由SMC审查的数据。用于确定活性生物剂量的药效动力学(PD)分析将包括B细胞清除、首个2级CRS和临床应答。
如果第一名接受0.3mcg治疗的患者出现≥3级的细胞因子释放综合征(CRS)或神经毒性，则将使用3+3方法以0.15mcg治疗一组患者。如果在0.15mcg未见≥3级的CRS或未抵最大耐受剂量(MTD)，则爬坡至0.3mcg。
如果没有报告DLT或≥2级AE的个例(排除外来的原因或疾病进展)，则下一个剂量水平的患者将在前一个剂量组的第21天后入组。如果在研究的加速部分的任何时间出现DLT或AE的情况，则将该研究将恢复为3+3设计。
第II阶段：传统的3+3剂量爬坡设计
第II阶段的主要目的是研究安全性、PK、免疫原性、初步疗效，以及确定二期推荐剂量(RP2D)。
共设定了如下5个剂量组：9.6mcg，16mcg，24mcg，34mcg，45mcg；每个剂量组3个病人。
在第一个给药周期中，第1周每周给药一次，第2周和第3周每周给药2次，DLT观察期为21天。
从第二个给药周期起，每周给药2次，周期长度为3周，持续至PD或不耐受。
患者在录入后首个72小时将入院进行观察，以开展初始剂量、中间剂量(如适用)以及爬坡剂量。第一剂(第1周期第1天，C1D1)将在3小时内缓慢输注。如果没有≥2级输液相关反应(IRR)，下一剂(第1周期第8天，C1D8)可以在2小时内给药，如果没有IRR，第3剂和后续剂量可以在1小时内给药。
需要在前3剂LMOAME前1小时使用抗组胺药和对乙酰氨基酚进行前驱用药(例如，在C1D1的初始剂量之前，在C1D8和C1D11的前2次BIW剂量之前)。可根据临床指征添加地塞米松用于后续输注。研究者可酌情减少或取消随后的地塞米松术前用药剂量。输注后将对患者进行一段相当于输注两倍时间的监测。如果前3剂出现CRS，则应在后续给药前1小时内给予20mg塞米松、抗组胺剂和对乙酰氨基酚的前驱用药。如果研究期间发生2次≥2级CRS事件或1次≥3级CRS事件，则为所有患者预防性使用对乙酰氨基酚650毫克口服、苯海拉明50毫克(口服或静脉注射)和托珠单抗8mg/kg(在超过1小时的时间内静脉输注)，然后给予首次爬坡剂量。
在第1周期的第8天，患者将按照BIW的安排以爬坡剂量水平接受第一剂，为期2周。DLT期为3周(引导剂量为1周，爬坡剂量为2周)。如果在给定剂量水平下发生单个≥3级的CRS或两个2级CRS事件，则将在每个剂量水平的第一个周期中添加第二个中间引导剂量，与第I部分相同(见上文)。在之前剂量水平的所有患者都已通过DLT评估期且未超过MTD后，提高爬坡剂量。对于第2周期及以后，患者将从第1天开始以BIW给药。这些周期的长度为3周。
患者将继续治疗直至出现疾病进展、DLT或无法耐受的毒性、退出治疗或取消知情同意，或在符合患者最佳利益的情况下由研究人员酌情决定。
在审阅所有安全性、PK、PD和初步功效数据之后，确定RP2D。然后以推定的RP2D将该剂量水平扩展到6-10名NHL患者，和6-10名B-ALL患者。
13.4拟收录人数
第I阶段
剂量组 递增百分比(％) 给药剂量(mcg) 病人数量
1-1 0.3 1-6
1-2 100 0.6 1-6
1-3 100 1.2 1-6
1-4 100 2.4 1-6
1-5 100 4.8 1-6
第II阶段
剂量组 递增百分比(％) 给药剂量(mcg) 病人数量
2-1 100 9.6 3-6
2-2 67 16 3-6
2-3 50 24 3-6
2-4 42 34 3-6
2-5 32 45 3-6
当最大耐受剂量(MTD)确定了之后，在NHL及B-ALL人群中会额外收录6-10个作为延展阶段研究，进一步确定在该MTD剂量下的安全性和有效性。
13.5给药方式
LMOAME的冻干粉剂在复溶后，通过静脉输注按照上述13.3部分描述的剂量和频率进行施用。
13.6入组标准
男性或女性18岁及以上，符合以下标准的患者将入选本研究：
-经组织学确认的以下几组B细胞恶性肿瘤中的一种疾病。淋巴细胞或淋巴瘤细胞的CD19抗原表达必须通过免疫组化和/或流式细胞术确认呈阳性；患者若之前接受过靶向CD19的治疗，必须在治疗后确定CD19的表达。
非霍奇金淋巴瘤(NHL)：
侵袭性B细胞NHL包括：
·弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，NOS
·原发性纵隔大B细胞淋巴瘤
·高级别B细胞淋巴瘤，有MYC和BCL2和/或BCL6重排
·高级别B细胞淋巴瘤，NOS
·由惰性NHL引起的高等级B细胞淋巴瘤
·套细胞淋巴瘤(可以表现为惰性或侵略性疾病)
·滤泡淋巴瘤，3B级
惰性B细胞NHL包括：
·滤泡型淋巴瘤(1-3A级)
·脾脏边缘区淋巴瘤
·粘膜相关淋巴组织的结外边缘区淋巴瘤(MALT淋巴瘤，不包括胃MALT淋巴瘤)
对于NHL患者入组的其他要求包括：
·进入第II阶段研究的NHL患者必须有≥1个由Lugano标准定义的可测量的靶病变(结节病变的SAD应≥15mm；结节外病变LD应≥10mm)。
·惰性淋巴瘤患者只有在符合系统治疗标准的情况下才会被纳入治疗范围。
·快速进展的高级别NHL患者只有在达到生物活性剂量水平后才会被纳入研究范围。
侵袭性NHL：之前必须接受过利妥昔单抗、环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松(R-CHOP、R-EPOCH或同等的含抗CD20的治疗)的治疗，接受过≥2线系统治疗，并接受过或不耐受所有其他被认为能带来临床获益的标准疗法。
惰性NHL：之前接受过≥2种系统治疗，包括利妥昔单抗或其他抗CD20单克隆抗体单独治疗或与化疗(如苯达莫司汀、CHOP、CVP)联合治疗后出现难治或复发，并且已经接受或不能耐受所有其他被认为具有临床效益的标准疗法。
B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)：
-费城染色体阳性或阴性B细胞白血病经一线治疗(诱导/巩固/维持)、挽救疗法(如blinatumomab、inotuzumabozogamycin、化疗)和所有可用的针对Bcr-Abl的酪氨酸激酶抑制剂治疗后难治或复发。
-已接受或不耐受所有其他已知能带来临床益处的标准疗法。
-复发或难治的CD19+B细胞ALL，所有已知有临床疗效的可用疗法均无效。
-入组前2个月没有活动性的急性或慢性移植物抗宿主病，入组时没有接受免疫抑制治疗。在第一次用药时，外周血细胞计数必须＜10000/mm3。在筛查期间可以用泼尼松和/或羟基脲来维持这一数值。B-ALL患者只有在剂量水平达到生物活性剂量水平后才会被纳入研究的剂量升级部分。生活活性剂量水平根据第一个≥2级CRS及外周B细胞耗竭的剂量水平来确定。
NHL和ALL患者都应满足以下标准：
-ECOG表现状态0-2，预期寿命大于3个月。
-在筛查期间，临床生化指标符合以下规定：
·总胆红素必须＜1.5倍于正常范围的上限(ULN)。如果总胆红素的升高可以合理地归因于肝脏存在转移性疾病，或者对于有记录的吉尔伯特综合征(非结合性高胆红素血症)的患者，总胆红素可以升商到3xULN。
·丙氨酸氨基转移酶(ALT)或天冬氨酸氨基转移酶(AST)必须＜3×ULN。如果AST和ALT的升高可以合理地归因于肝脏存在转移性疾病，那么AST和ALT可以升高到5xULN。
·计算出的肌酐清除率＞50mL/min(Cockcroft-Gault公式)
·血红蛋白必须≥8g/dL。
·中性粒细胞计数必须＞1,500/mm3。对于ALL来说，如果中性粒细胞减少被认为是由于白血病细胞累及BM而造成的，则没有中性粒细胞计数的标准。
·血小板计数必须大于75,000/mm3。对于ALL患者，如果血小板减少被认为是由于白血病细胞累及BM而引起的，则没有血小板计数的标准；根据研究者的判断，可以根据需要输血小板。
·所有患者在使用LMOAME首剂前，其外周血细胞计数必须≤10,000/mm3。这可以通过连续4天服用地塞米松，20-40毫克/平方米来实现。也可利用羟基脲的剂量来控制白细胞计数。如果这些措施不能使白细胞计数降低到≤10,000/mm3，患者将不被录用。
·凝血酶原时间-国际正常化比率(PT-INR)必须≤1.5。
-如果是女性，尿妊娠试验阴性，或在筛查前至少绝经1年。
-有生育能力的女性患者或有生育能力伴侣的男性患者必须从筛查开始使用一种或多种避孕方法，并在研究治疗期间持续到最后一次用药后3个月。避孕方法包括：
a.完全禁欲(如果与病人喜欢的通常生活方式一致)。周期性禁欲(例如，日历、排卵期、交感神经、排卵后)和戒断是不可接受的避孕方法。
b.在研究治疗前至少12周进行的女性绝育手术(双侧输卵管切除术加或不加子宫切除术)或输卵管结扎。
c.男性绝育(在筛选前至少6个月)。对于参加本研究的女性患者，其接受输精管切除术的男性伴侣应是其唯一的伴侣。
d.使用口服、注射或植入式荷尔蒙避孕方法；植入式子宫内避孕器(IUD)或子宫内避孕系统(IUS)；使用其他疗效相当的荷尔蒙避孕方法(失败率＜1％)，如荷尔蒙阴道环或透皮荷尔蒙避孕。
e.如果女性患者正在服用口服避孕药，在服用研究治疗前应稳定服用同一药物至少3个月。
-能够理解并愿意提供书面知情同意书，遵守预定的访问和研究程序。
13.7排除标准
-在开始LMOAME治疗之前的4周内进行过系统抗癌治疗(包括I/O疗法)。
-在进入研究前2周内接受放疗治疗。
-进入研究前3个月内接受CAR-T或移植治疗。
-在进入研究前14天内发生严重感染，需要使用抗生素进行治疗。
-之前接受过抗CD19靶向治疗的患者，只有在完成CD19靶向治疗后，其肿瘤细胞被证明仍表达CD19的情况下才可加入此研究。
-有脑转移或其他重大神经系统疾病的患者，但在施用首剂LMOAME前2周内无症状且放射学稳定、不需要使用类固醇的脑转移患者除外。ALL患者必须没有明显的CNS疾病。
-在首剂LMOAME前≤7天使用过皮质类固醇(每天＞10mg强的松或同等药物)或免疫抑制药物治疗，但以下情况除外：
·外用、眼用、关节内、鼻内或吸入性皮质类固醇药物
·使用地塞米松以降低ALL的外周血细胞计数
-在药剂的5个半衰期内或在开始使用LMOAME前的4周内(以较短者为准)使用过任何研究性产品(包括细胞或基因疗法)的治疗。
-目前患有自身免疫性疾病或有潜在中枢神经系统受累的自身免疫性疾病史。
-对药物产品配方中包含的任何成分(包括聚山梨酯80)过敏。
-接受或有证据表明使用非法药物、药物滥用或酒精滥用。
-入组前6个月内发生过任何脑血管意外(CVA)、短暂性脑缺血发作(TIA)、心肌梗死(MI)、不稳定心绞痛或纽约心脏协会(NYHA)定义的III级或IV级心力衰竭；入组后＜3个月内未控制的心律失常。
-筛选前4周内做过大手术或2周内做过小手术；伤口必须完全愈合(小手术如导管放置不属于排除标准)。
-有其他单克隆抗体治疗的3-4级过敏反应史，或已知对蛋白药物或重组蛋白或LMOAME药物制剂中的辅料过敏。
-存在先天性长QT综合征，QTcF＞480毫秒，使用心脏起搏器，左心室射血分数(LVEF)＜50％，需要干预的临床重大心律失常，心肌肌钙蛋白I或T＞2.0ULN，糖尿病控制不佳(HbA1c＞9％)，或高血压(收缩压＞160mmHg或舒张压＞100mmHg)。
-任何其他严重的基础疾病(如活动性胃溃疡、未受控制的癫痫发作、脑血管事件、胃肠道出血、凝血和凝血障碍的严重症状和体征、心脏状况)、精神、心理、家族或地理状况，根据研究者的判断，可能干扰计划的分期、治疗和随访，影响患者的依从性或使患者处于治疗相关并发症的高风险中。
-感染COVID-19，经过隔离且病毒检测阴性的患者可以参加。
-入组前5年内并发有其他恶性肿瘤的患者，但经充分治疗的宫颈原位癌、局部皮肤鳞状细胞癌、基底细胞癌、局部前列腺癌、乳腺原位导管癌或＜T1尿路上皮癌除外。
-之前进行过器官或异体干细胞/骨髓移植。在研究筛选前＞6个月接受过自体干细胞移植的患者，如果血液学参数符合入组要求，则符合条件。
-有3-4级免疫相关不良事件(irAEs)或需要停止先前治疗的irAEs病史，但用激素替代疗法管理的3级内分泌病除外。
-胸腔积液、心包积液或腹水需要经常引流或医疗干预
-在研究入组前4周内接种过活病毒疫苗。
-活动性乙型或丙型肝炎；没有活动性疾病的HBV携带者(HBV DNA滴度＜1000cps/mL或200IU/mL)，或已治愈的丙型肝炎(HCV RNA检测阴性)可以入选。
-已知的HIV感染。
13.8研究终点
安全性研究终点
-每个剂量水平严重不良反应(SAE)和不良反应(AE)的患者比例；
-DLT的类型、频率和剂量相关性；
-意外的临床或实验室发现。
PK研究终点：
PK参数，包括AUC，Cmax，Cmin，初始清除率，分布容积和消除半衰期
PD研究终点：
B细胞清除，细胞因子释放(包括IL-2，IL-6，IFNg，TNFa)
免疫原性研究终点：
抗药抗体(ADA)患者比例，中和抗体。
疗效终点：
客观缓解率(ORR)
序列信息
表6.接头序列

Claims (24)

1. 一种特异性结合CD19、CD3和CD28的三特异性抗体，其为单链融合蛋白，并且包含：
(1) 特异性结合CD19的第一结合结构域，其包含
氨基酸序列如SEQ ID NO: 17所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO: 19所示的轻链可变区，或
氨基酸序列如SEQ ID NO: 52所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO: 54所示的轻链可变区；
(2) 第一接头序列；
(3) 特异性结合CD3的第二结合结构域，其包含
氨基酸序列如SEQ ID NO: 28所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO: 30所示的轻链可变区，或
氨基酸序列如SEQ ID NO: 63所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO: 65所示的轻链可变区；
(4) 第二接头序列，其为SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列；和
(5) 特异性结合CD28的第三结合结构域，其包含氨基酸序列如SEQ ID NO: 39所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO: 41所示的轻链可变区。
2.根据权利要求1所述的三特异性抗体，其中
所述第一结合结构域包含氨基酸序列如SEQ ID NO: 17所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO: 19所示的轻链可变区；
所述第二结合结构域包含氨基酸序列如SEQ ID NO: 28所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO: 30所示的轻链可变区；并且
所述第三结合结构域包含氨基酸序列如SEQ ID NO: 39所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO: 41所示的轻链可变区。
3.根据权利要求1所述的三特异性抗体，其中
所述第一结合结构域包含氨基酸序列如SEQ ID NO: 52所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO: 54所示的轻链可变区；
所述第二结合结构域包含氨基酸序列如SEQ ID NO: 63所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO: 65所示的轻链可变区；并且
所述第三结合结构域包含氨基酸序列如SEQ ID NO: 39所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO: 41所示的轻链可变区。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的三特异性抗体，其中所述第一接头序列包含(G4S)n或(G2S)n，或所述第一接头序列为(G4S)n或(G2S)n，其中n为选自1-6的整数。
5. 根据权利要求4 所述的三特异性抗体，其中n为选自1-3的整数。
6. 根据权利要求5所述的三特异性抗体，其中所述第一接头序列选自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3的氨基酸序列。
7.根据权利要求1所述的三特异性抗体，其中
所述第一结合结构域包含如SEQ ID NO: 21或SEQ ID NO: 56所示的氨基酸序列，或由如SEQ ID NO: 21或SEQ ID NO: 56所示的氨基酸序列组成；
所述第二结合结构域包含如SEQ ID NO: 32或SEQ ID NO: 67所示的氨基酸序列，或由如SEQ ID NO: 32或SEQ ID NO: 67所示的氨基酸序列组成；和/或
所述第三结合结构域包含如SEQ ID NO: 43所示的氨基酸序列，或由如SEQ ID NO: 43所示的氨基酸序列组成。
8.根据权利要求2所述的三特异性抗体，其中
所述第一结合结构域包含如SEQ ID NO: 21所示的氨基酸序列，或由如SEQ ID NO: 21所示的氨基酸序列组成；
所述第二结合结构域包含如SEQ ID NO: 32所示的氨基酸序列，或由如SEQ ID NO: 32所示的氨基酸序列组成；和/或
所述第三结合结构域包含如SEQ ID NO: 43所示的氨基酸序列，或由如SEQ ID NO: 43所示的氨基酸序列组成。
9.根据权利要求3所述的三特异性抗体，其中
所述第一结合结构域包含如SEQ ID NO: 56所示的氨基酸序列，或由如SEQ ID NO: 56所示的氨基酸序列组成；
所述第二结合结构域包含如SEQ ID NO: 67所示的氨基酸序列，或由如SEQ ID NO: 67所示的氨基酸序列组成；和/或
所述第三结合结构域包含如SEQ ID NO: 43所示的氨基酸序列，或由如SEQ ID NO: 43所示的氨基酸序列组成。
10. 根据权利要求8所述的三特异性抗体，其包含如SEQ ID NO: 44所示的氨基酸序列，或由如SEQ ID NO: 44所示的氨基酸序列组成；或包含与如SEQ ID NO: 44所示的氨基酸序列具有至少80%同源性的氨基酸序列，或由与如SEQ ID NO: 44所示的氨基酸序列具有至少80%同源性的氨基酸序列组成。
11. 根据权利要求9所述的三特异性抗体，其包含如SEQ ID NO: 68所示的氨基酸序列，或由如SEQ ID NO: 68所示的氨基酸序列组成；或包含与如SEQ ID NO: 68所示的氨基酸序列具有至少80%同源性的氨基酸序列，或由与如SEQ ID NO: 68所示的氨基酸序列具有至少80%同源性的氨基酸序列组成。
12.一种分离的核酸分子，其编码根据权利要求1-11中任一项的三特异性抗体。
13. 根据权利要求12所述的分离的核酸分子，其包含如SEQ ID NO: 45或SEQ ID NO:69所示的核苷酸序列，或由如SEQ ID NO: 45或SEQ ID NO: 69所示的核苷酸序列组成。
14.一种表达载体，其包含根据权利要求12或13所述的分离的核酸分子。
15.一种宿主细胞，其包含根据权利要求12或13所述的分离的核酸分子或根据权利要求14所述的表达载体。
16.一种制备三特异性抗体的方法，包括：
(a) 提供根据权利要求12或13所述的分离的核酸分子或根据权利要求14所述的表达载体，
(b) 将(a)中所述的分离的核酸分子或所述表达载体引入宿主细胞，
(c) 培养(b)中获得的宿主细胞以表达所述三特异性抗体，和
(d) 从所述细胞的培养物中回收所述三特异性抗体。
17.一种制备三特异性抗体的方法，包括：
(a) 提供根据权利要求15所述的宿主细胞，
(b) 培养所述宿主细胞以表达所述三特异性抗体，和
(c) 从所述细胞的培养物中回收所述三特异性抗体。
18.根据权利要求1-11中任一项所述的三特异性抗体在制备用于治疗B细胞淋巴瘤或B细胞白血病的药物中的用途。
19.根据权利要求1-11中任一项所述的三特异性抗体在制备用于治疗难治型或复发型B细胞肿瘤的药物中的用途。
20.根据权利要求1-11中任一项所述的三特异性抗体在制备用于治疗侵袭性或惰性非霍奇金淋巴瘤，或B细胞急性淋巴细胞白血病的药物中的用途。
21.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-11中任一项所述的三特异性抗体，和药学上可接受的载体。
22.一种药物组合产品，其包含根据权利要求1-11中任一项的三特异性抗体，和另一种治疗剂。
23.根据权利要求22所述的药物组合产品，其中所述另一种治疗剂为用于治疗B细胞淋巴瘤或B细胞白血病的治疗剂。
24. 一种接头肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 6所示。
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