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CN115572668A - 用于计数霉菌菌落的培养装置和方法 - Google Patents

用于计数霉菌菌落的培养装置和方法 Download PDF

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库尔特·J·霍尔沃森
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3M Innovative Properties Co
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Abstract

本发明提供了一种用于计数霉菌菌落的薄膜培养装置。该装置包括带有设置在两者之间的生长区的耐水的第一衬底和第二衬底、设置在生长区中的干的、冷水可溶的胶凝剂和设置在生长区中的有效量的钙螯合化合物。相对于在不含有设置在生长区中的有效量的原本相同培养装置中生长的相同霉菌菌种的菌落的侧向扩大速率，有效量的钙螯合化合物能够降低在培养装置中生长的菌落形成单位的侧向扩大速率，其中降低菌落形成单位的侧向扩大速率基本上不延缓对菌落的检测。还提供了一种对应的方法。

Description

用于计数霉菌菌落的培养装置和方法
本申请是申请日为2014年5月5日、申请号为201480025430.7(国际申请号为PCT/US2014/036730)、发明名称为“用于计数霉菌菌落的培养装置和方法”的发明专利申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本专利申请要求2013年5月6日提交的美国临时专利申请No.61/819,690的优先权，该申请全文以引用方式并入本文。
背景技术
霉菌是真核微生物。它们在自然环境，即，土壤、空气、水和植物表面中无所不在。因为它们的异养性质和它们适应于宽泛的环境条件范围的能力，这些微生物在各种商品包括食品成分、加工食品、饮料、未充分清洁的食品加工设备和食品储存设施之中或之上作为昂贵的滋扰物频繁地出现。此外，一些酵母和霉菌对人类和动物健康可能具有危害。例如，多种霉菌产生霉菌毒素，并且一些霉菌微生物会引起人类和动物感染。
食品和其它商品中的霉菌污染可导致生产者、加工者和消费者的重大经济损失。商品(诸如，食品成分、加工食品和饮料)中霉菌污染的快速和准确测定对于食品工业中高品质食品产品的生产具有重要意义。
当前用于食品商品中霉菌的例行测定的操作很大程度上依赖于用于在半固体琼脂培养基上计数活真菌细胞的常规培养技术。尽管被广泛接受，但是这些方法具有诸多缺点，因为一般来讲，它们是劳动密集型的，并且再现性较低。此外，传统方法中遇到的普遍问题是，某些霉菌的菌丝生长的铺展类型经常超过附近菌落，并且阻止样品中活细胞的准确计数。
发明内容
本公开一般涉及检测样品中的霉菌微生物并对其进行计数。具体地，本公开涉及对薄膜培养装置中的霉菌菌落进行计数。发明人已发现，不含顶部空间并且具有一层相对较薄的营养物质(相对于传统琼脂培养皿培养装置)的薄膜培养装置对于在装置中生长的至少一些菌种的霉菌菌落，显示出显著的侧向菌落扩展(例如，菌落的径向铺展)速率。发明人还发现，钙螯合化合物可用于降低生长菌落的侧向扩展速率；意外的是，基本上不延缓对霉菌菌落的检测。有利的是，由钙螯合化合物引起的平均菌落直径的减小允许对样品中的霉菌微生物进行更准确的计数，样品包含原本将会在生长区的较大面积上铺展的霉菌菌种，从而与其它霉菌菌落重叠，并且使单独菌落的计数更加困难。
本公开提供薄膜培养装置。培养装置可包含耐水的第一衬底、耐水的第二衬底、设置在第一衬底和第二衬底之间的生长区、设置在生长区中的干的、冷水可溶的胶凝剂以及设置在生长区中的有效量的钙螯合化合物。当生长区用预定体积的含水液体水合并且用霉菌菌种的菌落形成单位接种时，相对于在不含有设置在生长区中的有效量的原本相同培养装置中生长的相同霉菌菌种的菌落的侧向扩大速率，有效量的钙螯合化合物能够降低在培养装置中生长的菌落形成单位的侧向扩大速率。降低菌落形成单位的侧向扩大速率基本上不延缓对菌落的检测。在任何实施例中，薄膜培养装置还可包含预定体积的含水液体，其中设置在生长区中的有效量的钙螯合化合物溶解于含水液体中，其浓度为：相对于在不含有设置在生长区中的有效量的原本相同培养装置中生长的相同霉菌菌种的菌落的侧向扩大速率，能够有效地基本上降低在含有设置在生长区中的有效量的培养装置中生长的霉菌菌种的菌落的侧向扩大速率。
在另一方面，本公开提供了一种用于计数微生物的方法。该方法可包括在包含设置在生长区中的有效量钙螯合化合物的薄膜培养装置中的生长区中形成接种的培养基、温育接种的培养基持续足以形成霉菌微生物的宏观可检测菌落的预定时间段、和计数生长区中霉菌微生物的宏观可检测菌落的数目。形成接种的培养基包括用预定体积的含水液体水合生长区。当生长区用预定体积的含水液体水合并且用霉菌菌种的菌落形成单位接种时，相对于在不含有设置在生长区中的有效量的原本相同培养装置中生长的相同霉菌菌种的菌落的侧向扩大速率，钙螯合化合物降低在培养装置中生长的菌落形成单位的侧向扩大速率。降低菌落形成单位的侧向扩大速率基本上不延缓对菌落的检测。在任何实施例中，该方法还可包括计数生长区中宏观可检测酵母菌落的数目。在任何实施例中，形成接种的培养基可包括将含水样品沉积到薄膜培养装置中，其中，在沉积含水样品之前，薄膜培养装置包含营养培养基、指示剂和/或有效量的钙螯合化合物。
在另一方面，本公开提供了一种试剂盒。试剂盒可包括用于生长霉菌微生物并对其进行计数的薄膜培养装置和容纳预定量的钙螯合化合物的容器。当设置在培养装置的生长区中时，在将装置接种之后，相对于在不含有设置在生长区中的有效量的原本相同培养装置中生长的相同霉菌菌种的菌落的侧向扩大速率，预定量的一部分足以降低在培养装置中生长的霉菌菌种的菌落形成单位的侧向扩大速率。降低菌落形成单位的侧向扩大速率基本上不延缓对菌落的检测。
词语“优选的”和“优选地”是指在某些情况下可提供某些有益效果的本发明实施例。然而，在相同的情况或其它情况下，其它实施例也可能是优选的。此外，述及一个或多个优选的实施例并非暗示其它实施例不可用，也并非旨在将其它实施例排除在本发明的范围之外。
术语“包含”及其变型形式在说明书和权利要求中出现这些术语的地方不具有限制的含义。
本文所用的“一种(个)”、“所述(该)”、“至少一种(个)”以及“一种(个)或多种(个)”可互换使用。因此，例如，霉菌微生物可解释为意指“一种或多种”霉菌微生物。
术语“和/或”意指所列要素的一个或全部，或者所列要素的任何两个或更多个的组合。
另外，在本文中，由端点界定的数值范围包括该范围内所含的所有数值(如，1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。
上述的“发明内容”并非意图描述本发明的每个公开的实施例或每种实施方式。以下“具体实施方式”更为具体地举例说明示例性实施例。在本专利申请全文的几处，通过例子列表提供指导，可以不同组合使用这些例子。在每一种情况下，所引用的列表均仅用作一个代表性的组，且不应被理解为排他性列表。
下面将结合附图和描述介绍上述及其它实施例的更多细节。通过描述、附图和权利要求书，其它特征、目标和优点将变得明显。
附图说明
图1为本公开的薄膜培养装置的一个实施例的顶部透视图。
图2为沿线2-2截取图3的薄膜培养装置的剖视图。
图3为根据本公开的薄膜培养装置的另选实施例的顶部透视图(局部剖视)。
图4为图3的薄膜培养装置的剖视图(局部剖视)。
具体实施方式
本公开一般涉及用于检测酵母和霉菌微生物的制品和方法。具体地，本公开涉及对薄膜培养装置中的霉菌菌落进行检测和计数。
薄膜培养装置的结构区别于针对酵母和霉菌的典型培养装置(例如，培养皿)，因为薄膜培养装置不具有在营养培养基表面与装置盖子表面之间的顶部空间。因此，与细胞群可垂直地扩展到培养皿的顶部空间(从而，使群落在装置中更易看见)的霉菌菌落生长培养皿相比而言，在薄膜培养装置中生长的霉菌菌落的细胞群必须水平地(侧向地)扩展穿过营养培养基。
此外，本领域中已知的是，游离钙的可用性可影响菌丝顶端处霉菌的生长(参见例如，S.L.Jackson和I.B.Heath；Microbiol.Mol.Biol.Re.；1993；57:367-382；该文献全文以引用方式并入本文)。具体地，限制霉菌菌丝顶端区中游离钙的量可显著降低菌丝顶端处的生长速率。本发明的制品和方法通过使用能够有效地允许生长而基本上不延缓群落的检测的一定量螯合剂，开拓了常常被用作阻止霉菌生长的防腐剂的钙螯合化合物的作用(例如，抑制霉菌菌丝的伸长)。意外的是，所用螯合剂的量实质上高于在用作某些食品中防腐剂时通常用于阻止霉菌生长的螯合剂的量。
不受理论的约束，本发明人已发现，半固体营养培养基中游离钙离子的浓度是影响在包含营养培养基的培养装置(例如，薄膜培养装置)中生长的霉菌菌落的侧向扩展速率的至少一个关键因素。此外，他们发现，在营养培养基中包含有效量的钙螯合化合物降低了霉菌菌落的侧向扩展速率和/或程度。然而，相对于不包含有效量的钙螯合化合物的类似培养装置，本发明使用生长延迟化合物意外地基本上不延缓对霉菌菌落的检测。
如本文所用的“透气的”指示这样的膜，当在它的边缘实质上暴露于空气时，它可在水平方向上(即平行于它的表面)充分地可透过空气，以便给上方的培养基提供充足的空气供应，从而支持培养基中的好氧微生物的生长。
如本文所用的“冷水复水的”指示这样的材料，它可悬浮在水中，例如，在室温水中形成分散体、溶液或凝胶。
如本文所用的“冷水可溶的”指示在室温水中形成溶液或凝胶的冷水复水的材料。
如本文所用的“生长区”指示旨在使微生物在其中生长的装置的各个部件的区。
如本文所用的“粉末”指示例如营养物质和/或胶凝剂的颗粒材料，其中颗粒具有适用于本公开装置中的平均直径，例如小于约400μm的平均直径。
如本文所用的“复水的培养基”指示已用水或含水试验样品再水合的冷水复水的培养基。
如本文所用的“基本上不可透过微生物和水蒸汽”指示这样的第二衬底，它们(i)在装置的装运、储存和使用期间防止下方培养基的非所需污染并且(ii)避免培养基的干燥，即，维持复水培养基中适于支持温育期间微生物的生长的水合水平。
如本文所用的“基本上不含水”指示水含量不大于约周围环境的水含量。
参考图1和2，本公开的薄膜培养装置100的一个实施例被示出为具有耐水的第一衬底12和耐水的第二衬底18的主体构件10。在任何实施例中，优选地，培养装置100还包括任选的透气膜14。尽管这些可能以任何合适的关系布置，但是图1示出部件的优选的布置，其中透气膜14固定到第一衬底12的上表面的至少一个生长区40并与它共延。培养装置100包括第一干涂层16。第一干涂层16的至少一部分设置在生长区40中。
在本公开的薄膜培养装置的任何实施例中，生长区40位于第一衬底12和第二衬底18之间，并且包括设置在第一衬底12或第二衬底18上的生长区40内的任何涂层或涂层的一部分。生长区40是培养装置中在薄膜培养装置的使用期间用样品和/或含水悬浮培养基(例如，营养物质发酵液、无菌水、缓冲液)水合的位置。在任何实施例中，生长区40位于第一衬底和第二衬底之间的任何地方。优选地，生长区40与第一衬底12和第二衬底18的边缘间隔开以避免温育期间的污染和/或无法接受的湿气损失。在任何实施例中，生长区40是由旨在容纳预定体积的样品和/或含水悬浮培养基的结构体(例如，本文所讨论的隔离物24(参见图1和2))限定。
在任何实施例中，第一干涂层16包含干的、冷水可溶的胶凝剂。第一干涂层16通常设置在主体构件10中，在存在的透气膜14上、第一衬底12(如果透气膜14不存在(未示出))上或第二衬底18上。在任何实施例中，第一干涂层16还可包含一种或多种营养物质以促进霉菌微生物的生长。在任何实施例中，营养物质包含钙离子(例如，钙盐)。第一干涂层16还可包含有效量的钙螯合化合物，如以下所讨论。在任何实施例中，第一干涂层16的至少一部分(或整个量)设置在薄膜培养装置的生长区40中。
在任何实施例中，本公开的薄膜培养装置任选地可包括第二干涂层(干涂层16')。第二干涂层16'可设置在存在的透气膜14(未示出)上；在第一衬底12上(如果膜14不存在)；或在第二衬底18上。在任何实施例中，第二干涂层16'可包含干的、冷水可溶的胶凝剂；营养物质或营养物质的混合物(任选地，含有钙盐)、钙螯合化合物、钙盐或前述组分中的任何两种或更多种的组合。在任何实施例中，第二干涂层16'可与第一干涂层16相同。在任何实施例中，存在的第二干涂层16')的至少一部分(或整个量)设置在薄膜培养装置的生长区40中。
第一干涂层16和/或第二干涂层16'可涂布到第一衬底12和/或第二衬底18上，使用美国专利No.4,565,783的发酵液涂布方法；美国专利No.5,089,413的粉末涂布方法，或它们的组合。
薄膜培养装置的生长区40中还包含有效量的钙螯合化合物。钙螯合化合物可设置(例如，以粉末涂层的形式)在生长区40的至少一部分中，于第一干涂层16(例如，以构成第一干涂层16的涂层混合物的组分的形式)和/或第二干涂层16'(例如，以构成第二干涂层16'的涂层混合物的组分的形式)中。
合适的钙螯合化合物可溶于含水液体中。溶解度足够高以实现降低在薄膜培养装置中生长的霉菌微生物的菌落的侧向扩大速率(相对于在不包含钙螯合化合物的原本相同薄膜培养装置中生长的相同霉菌微生物的菌落的侧向扩大速率)而基本上不延缓对培养装置中菌落的检测的浓度。合适的钙螯合化合物的例子包括但不限于乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)、柠檬酸和它们的盐(例如，钠盐)、水合物和溶剂化物。在任何实施例中，钙螯合化合物的盐优选地以游离酸形式，因为盐形式更可溶于水中。
钙敏感性染料也可用作根据本公开的钙螯合化合物，前提条件是该染料不另外实质上抑制霉菌微生物的生长。钙敏感性染料的示例包括但不限于偶氮氯膦III(双(4-氯-2-膦酸基苯偶氮)变色酸)、偶氮胂III(2,2'-(1,8-二羟基-3,6-二磺酸萘-2,7-双偶氮)双苯胂酸、2,7-双(2-胂羧基苯基偶氮)变色酸)、偶氮安替比林III(3,6-双(4-安替比林基偶氮)-4,5-二羟基-2,7-萘二磺酸)、羧基偶氮砷III(2-(2-胂羧基苯基偶氮)-7-(2-羧基苯基偶氮)变色酸)、托酚酮(2-羟基-2,4,6-环庚三烯-1-酮)、茜素红(1,2-二羟基蒽醌)、偶氮羧III(2,2'-[(1,8-二羟基-3,6-二磺酸-2,7-萘二基)双(偶氮)]双苯甲酸(9CI))、ω铬黑蓝(Omega chrome black blue)、依来铬灰3BL(Eriochrome grey 3BL)、Oxyacetazo I、紫脲酸铵(Murexide)(红紫酸铵(ammonium purpurate))、依来铬黑T、偶氮胂I(2-(1,8-二羟基-3,6-二磺酸-2-萘基偶氮)苯胂酸三钠盐、3-(2-胂羧基苯基)偶氮-4,5-二羟基-2,7-萘二磺酸三钠盐)、溴邻苯三酚红(5',5”-二溴邻苯三酚磺酞)、溴邻苯三酚紫、甲基百里酚蓝、钙黄绿素、邻甲酚酞络合酮(Orthocresolphthalein complexone)和伞形酮络合酮钙黄绿素蓝(umbelliferone complexone calcein blue)(4-甲基伞形酮-8-甲基氨基二乙酸)。
钙螯合化合物的有效量可根据若干变量(内在和外在变量)变化。与钙螯合化合物相关的一个内在变量是钙螯合化合物和钙之间的结合相互作用的解离常数。与钙螯合化合物相关的另一个内在变量是钙螯合化合物和可能存在于营养培养基和/或样品中且可与钙螯合化合物相互作用的其它二价阳离子(例如，Mg)之间的结合相互作用的解离常数。可影响钙螯合化合物的有效量的两个外在变量是i)根据本公开使用的营养培养基和/或样品材料中存在的二价阳离子(具体地，钙离子)的量和ii)营养培养基和/或样品材料的pH。本领域的普通技术人员应认识到，钙螯合化合物的解离常数可受它周围环境的pH影响。此外，本领域的普通技术人员还应认识到，pH影响可通过使用缓冲试剂减轻。
尽管本文公开的钙螯合化合物的有效量(或浓度)的范围将适用于许多情况(食品、饮料或环境测试)，但是用于具体样品的钙螯合化合物的有效浓度可通过制备化合物于含水液体(例如，水或Butterfields缓冲液)中的溶液，制备该溶液于无菌水或缓冲液中的若干稀释液(例如，2倍或5倍稀释液)，并且沿循实例12中所述的程序来简单地确定。相对于在不包含钙螯合化合物的原本相同薄膜培养装置中霉菌微生物的检测，有效量的任何本公开钙螯合化合物基本上不延缓待检测的霉菌微生物的宏观可观察菌落的检测。
在本公开的薄膜培养装置的任何实施例中，有效量的钙螯合化合物设置在本文所公开的一个或多个干涂层(例如，第一干涂层16和第二干涂层16')中。在任何实施例中，有效量设置在培养装置的生长区(例如，生长区40)中。因此，施加到生长区域的钙螯合化合物、钙盐和干涂层质量的比例被调整为使得当水合时生长区域包括具有一定浓度钙螯合化合物的水凝胶，该浓度能够有效地降低在培养装置中生长的霉菌微生物的菌落的侧向扩大速率而基本上不延缓菌落的检测。
在任何实施例中，有效量钙的螯合化合物(例如，乙二胺四乙酸二钠二水合物)以具有约0.5mg至约12mg钙螯合化合物每100cm2的干涂层的形式设置在薄膜培养装置中。在任何实施例中，有效量钙的螯合化合物以具有约0.5mg至约6mg钙螯合化合物每100cm2的干涂层的形式设置在薄膜培养装置中。在任何实施例中，有效量的钙螯合化合物以具有约1.0mg至约12mg钙螯合化合物每100cm2的干涂层的形式设置在薄膜培养装置中。在任何实施例中，有效量的钙螯合化合物以具有约1.0mg至约6mg钙螯合化合物每100cm2的干涂层的形式设置在薄膜培养装置中。在任何实施例中，有效量的钙螯合化合物以具有约3.0mg至约12mg钙螯合化合物每100cm2的干涂层的形式设置在薄膜培养装置中。
在下文详细讨论的本公开的任何方法中，一部分或整个有效量的钙螯合试剂可提供于薄膜培养装置的干涂层中。除此之外或另选地，在用样品接种培养装置之前、期间或之后不久，可将有效量的钙螯合化合物的一部分或整个有效量以液体形式引入到培养装置中。在任何实施例中，接种的培养装置中钙螯合化合物的浓度可以是约1mM至约9.0mM。在任何实施例中，接种的培养装置中钙螯合化合物的浓度可以是约1mM至约5mM。在任何实施例中，接种的培养装置中钙螯合化合物的浓度可以是约1mM至约2mM。
本领域的普通技术人员应认识到，含有相对高浓度钙的某些样品(例如，乳制品、芝麻、亚麻籽)可用于本公开的方法中。任选地，可调整钙螯合化合物(提供于培养装置中和/或当接种时添加到装置中)的量以抵消样品中存在的较高量的钙。这种方法示出于实例5中。
有效量的钙螯合化合物降低霉菌微生物侧向生长的速率。因此，在任何实施例中，在预定生长周期之后(即，在30℃下温育48小时之后)，在包含有效量的钙螯合化合物的薄膜培养装置中特定霉菌菌种的菌落的平均直径为小于不含有效量的钙螯合化合物的类似薄膜培养装置中相同霉菌菌种的群落的平均直径至少约30％。在任何实施例中，在预定生长周期之后，在包含有效量的钙螯合化合物的薄膜培养装置中特定霉菌菌种的菌落的平均直径为小于不含有效量的钙螯合化合物的类似薄膜培养装置中相同霉菌菌种的群落的平均直径至少约50％。在任何实施例中，在预定生长周期之后，在包含有效量的钙螯合化合物的薄膜培养装置中特定霉菌菌种的菌落的平均直径为小于不含有效量的钙螯合化合物的类似薄膜培养装置中相同霉菌菌种的群落的平均直径至少约90％。
返回到图示，第一干涂层16固定到存在的膜14或防水衬底中的一个(例如，第一衬底12，如图1-4中所示)的顶部表面的至少生长区40并且与它共延。第二衬底18在图1中也示出为以类似铰链方式沿主体构件10的一个边缘附接，第二衬底18在装运、储存和温育期间起到覆盖生长区40的作用。合适的第一衬底和第二衬底包括美国专利No.4,565,783中所述的衬底，该专利全文以引用方式并入本文。
第一衬底12优选地为由诸如聚酯、聚丙烯或聚苯乙烯的材料制成的相对刚性的防水膜，该材料将不吸收水或不以其它方式不利地受水影响。约100μm至约180μm厚的聚酯膜、约100μm至约200μm厚的聚丙烯膜和约300μm至约380μm厚的聚苯乙烯膜是合适的。其它合适的衬底包括具有聚乙烯涂层或其它防水涂层的纸材。合适的聚乙烯涂布的纸质衬底的示例是“Schoeller Type MIL”影印纸材(可从纽约的舒乐普拉斯基公司(Schoeller Pulaski,New York)购得)。在任何实施例中，如果希望透过第一衬底12观察菌落，第一衬底12可以是透明的或半透明的。
当第二衬底18在使用期间处在生长区40上方的适当位置时，透气膜14允许向生长区40供应充足的空气。在这种情况下，膜14可用于支持培养装置中好氧微生物(例如，好氧丝状真菌)的生长。在出于除用于生长之外或不同于用于生长的原因，例如，氧化使得微生物菌落更容易看见的染料，微生物需要空气的情况下也是可用的，如以下更充分地讨论。用于透气膜14的合适的特性和材料公开于美国专利No.5,089,413中，该专利全文以引用方式并入本文。
在任何实施例中，第一衬底12、第二衬底18或透气膜14中的任一个优选地具有在它上面印刷的可见的正方形网格图案，如美国专利No.5,089,413中所示，以有利于微生物菌落的计数。
在任何实施例中，第一干涂层16和/或第二干涂层16'可包含干培养基的任何合适的形式，该干培养基可冷水复水并且能够支持霉菌和任选地酵母微生物的生长。这种培养基为人们所熟知。在本公开装置的任何实施例中，第一干涂层16含有选自由一种或多种胶凝剂和用于生长微生物(例如，霉菌微生物)的一种或多种营养物质组成的组的至少一种成分。
用于第一干涂层16和/或第二干涂层16'中的合适的胶凝剂包括冷水可溶的天然和合成胶凝剂。天然胶凝剂诸如褐藻胶、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、瓜尔胶、刺槐豆胶、黄原胶和合成胶凝剂诸如聚丙烯酰胺一般来讲是合适的。当本发明的装置旨在用于霉菌测定时，胶凝剂的选择是尤其重要的。一些胶凝剂诸如瓜尔胶不适用于某些霉菌测定，因为霉菌具有代谢此类胶凝剂的能力。适当的胶凝剂可根据本发明的教导、符合用于装置所期望的用途进行选择。优选的胶凝剂包括刺槐豆胶和黄原胶，这些胶凝剂可单独使用，或优选地可彼此组合使用。
如上文所指出的那样，第一干涂层16可仅含有胶凝剂，并且不含有营养物质。在添加怀疑含有微生物的含水样品之前，使用者可添加根据待生长的微生物类型调整的营养物质。例如，可将干粉营养物质悬浮在快速蒸发液体诸如乙醇或挥发性氯氟烃中，并且可将悬浮液沉积到装置的生长区域中。在其它情况下，可将干粉营养物质悬浮例如分散或溶解于含水溶液中，含水溶液可涂布到(例如，如美国专利No.4,565,783中所述)或沉积到培养装置的生长区域中。在任一种情况下，当将营养物质悬浮液或溶液的等分试样添加到培养基的表面时，可允许液体蒸发，留下与胶凝剂一起的足够的营养物质。在其它情况下，可在使用样品接种培养装置之前、在将样品接种到培养装置中同时和/或在将样品接种到培养装置中之后，将营养物质或营养物质的混合物添加到含水样品中。
适用于薄膜培养装置的特定营养物质可取决于待在装置中生长的微生物，并且应由本领域的技术人员容易地选择。一般来讲，此类营养物质是冷水可溶的。
在任何实施例中，第一干涂层16和/或粘合剂层20可包含其它组分，诸如染料、交联剂或诸如抗生素的试剂。例如，对于一些用途来说，希望将染料掺入涂层中，或掺入粘附的粉末培养基的粘合剂中。合适的染料包括由生长的微生物代谢的或与生长的微生物以其它方式反应并因此引起菌落着色或发荧光以更易于显影的那些。此类染料包括例如显色酶底物，诸如5-溴-4-氯吲哚基磷酸二钠盐。其它合适的染料包括例如pH指示染料，诸如中性红或氯酚红。
对于一些用途来说，希望具有包含干培养基的薄膜培养装置，当复水时，该干培养基足够刚性以允许通过划线进行接种。为了形成可划线的培养基，可将有效量的合适的交联剂掺入到包括胶凝剂的干培养基中。合适的交联剂基本上不影响预期微生物的生长。本领域的技术人员容易地选择交联剂的合适类型和量。例如，对于瓜尔胶，交联剂诸如四硼酸钾或铝盐是合适的，并且可以例如小于干培养基的约1.0重量％的有效量添加。
在任何实施例中，薄膜培养装置可任选地包括执行某些微生物测试所必需的试剂。例如，可包括抗生素用于执行抗生素易感性测试。对于微生物鉴定，可包括在特定类型的微生物的存在下发生颜色改变的试剂。为使酵母或霉菌样品生长而不受细菌的干扰，可在干培养基中包括抑菌剂或杀菌剂，诸如氯霉素、氯四环素、酒石酸或合适的青霉素。
本公开的薄膜培养装置包括第二衬底，诸如如图1中所示，例如适于覆盖培养装置的至少生长区40的第二衬底18。在任何实施例中，第二衬底18优选是透明的以便有利于菌落的观察和计数。此外，第二衬底18基本上不可透过微生物和水蒸汽。一般来讲，第二衬底可由诸如制造第一衬底12所用的那些的材料制成。因为空气经由透气膜14供应到生长区，所以不必选择第二衬底以允许空气运输到培养基。用于第二衬底的优选材料是聚丙烯，例如以40μm厚双轴向取向的聚丙烯膜的形式。
第二衬底18可不含任何涂层，或可被涂布，例如于面向第一衬底12的表面上，以便有利于在接种的薄膜培养装置的生长区40上密封第二衬底18。此外，第二衬底诸如图3和4中所示的第二衬底18可任选地涂布(例如，在面向第一衬底12的表面上)有粘合剂层20'和第二干涂层16'的层。粘合剂层20'可与粘合剂层20相同或不同。第二干涂层16'包含冷水可溶的胶凝剂、营养物质、指示剂、选择剂或前述两者或更多者的组合。第二衬底18上的涂层可覆盖面向干涂层的整个表面，但优选地至少与培养基的生长区共延。当希望提供带有比可单独掺入第一干涂层16中更多胶凝剂的装置时，此类涂布的第二衬底是尤其优选的。
本发明装置还可包括在第一干涂层16和第二衬底18之间的隔离物部件，以便产生用以限定第一干涂层16的生长区40并且将含水样品限制于培养装置的生长区40的孔。隔离物部件的一个实施例在图2中示出为限定圆形洞26的隔离物24。洞26的壁提供在培养装置的生长区40上具有预定大小和形状的孔。隔离物24应足够厚以根据生长区的大小和待置于培养基上的样品的大小，形成所需体积例如1ml、2ml或3ml的孔。在任何实施例中，隔离物24由闭孔聚乙烯泡沫制成。然而，可使用疏水的(非润湿的)、对微生物惰性的并且在任何实施例中可消毒的任何材料。在任何实施例中，隔离物24可连接(例如，经由压敏粘合剂)到第一干涂层16、透气膜14(当存在时)和/或第一衬底12。
可以使用多种技术来制备本发明的装置。一般来讲，装置可通过手工或用如例如美国专利No.4,565,783、5,089,413和5,601,998中详细描述的常见实验室设备制成；这些专利全文以引用方式并入本文。
图3和4示出根据本公开的装置的另选的实施例。薄膜培养装置200包括具有带有顶部表面和底部表面的耐水第一衬底12的主体构件10'。膜14的底部表面固定到(例如，用粘合剂固定或以其它方式附接到)衬底12的顶部表面的至少生长区40。在任何实施例中，第一衬底12的顶部表面涂布有粘合剂层30，粘合剂层30用以固定膜14。粘合剂层30优选地是压敏的、不溶于水的并且实质上对预期微生物的生长具有非抑制性。优选的粘合剂包括本文结合粘合剂层20和20'所讨论的那些。通常，合适的衬底是可用的已经涂布有合适粘合剂的。然而，如果需要，可选择合适的衬底并且用合适的粘合剂进行涂布(例如，使用刮刀涂布机)。
将膜14固定到第一衬底12的方法应取决于粘合剂层30的性质。如果例如粘合剂层30是压敏的，则可将膜14置于粘合剂层30上，向下按压，从而粘附在适当位置。第一干涂层16以任何合适的方式固定到并且覆盖膜14的至少生长区40。
在任何实施例中，可包含一种或多种粉末的图3和4中所示的第一干涂层16是通过首先在膜14的顶部表面的至少生长区上形成粘合剂层来制备并固定。粘合剂优选地是压敏的、不溶于水的并且实质上对预期微生物(例如，霉菌微生物)的生长具有非抑制性。优选地，当润湿时，粘合剂层20还是足够透明的以允许观察微生物菌落。
合适的压敏粘合剂的非限制性示例是摩尔比为90/10的丙烯酸2-甲基丁酯/丙烯酸的共聚物(3M公司，明尼苏达州圣保罗(3MCompany,St.Paul,Minn.))。可使用的其它优选压敏粘合剂包括摩尔比为95/5或94/6的丙烯酸异辛酯/丙烯酸(3M公司(3M Company))以及硅橡胶。当掺入如上文所述的染料以便有助于菌落的显影时，将染料掺入粘合剂而非粉末一般来讲是优选的。
将粘合剂涂布(例如，使用刮刀涂布机)到膜14的顶部表面上以形成厚度优选地小于第一干涂层16或第二干涂层16'的颗粒的平均直径的层。一般来讲，涂布足够的粘合剂以将颗粒粘附到膜14，但又不太多而造成颗粒完全嵌在粘合剂中。一般来讲，约5μm至约12μm厚的粘合剂层是合适的。
为了形成粘附的粉末培养基，然后将冷水可溶的粉末层(第一干涂层16)基本上均匀地粘附到粘合剂层20的至少生长区。
第一干涂层16包含上文所讨论的一种或多种组分(例如，钙螯合化合物、营养物质、指示剂、选择剂、胶凝剂或前述组分中的任何两者或更多者的组合)。优选地，当胶凝剂包括在第一干涂层16中时，它是以这样的量包括的，使得置于培养基上的预定量的例如1ml至3ml的水或含水样品将形成复水培养基，这种复水培养基具有合适的粘度，例如当在25℃下用Brookfield Model L VF粘度计在60rpm下测量时约1500cps或更大。此粘度的培养基允许在温育期间装置的便利处理和堆叠并且提供培养基中的分立菌落形成。例如，将0.025g至0.050g粉末状瓜尔胶在20.3cm2的表面积上基本上均匀地铺展将提供当用1ml至3ml含水样品复水时足够粘稠的培养基。粉末颗粒的粒大小可用于控制每单位面积的涂层重量。例如，在100目瓜尔胶涂布至约0.05g/20.3cm2的重量，400目瓜尔胶涂布至约0.025g/20.3cm2的重量的情况下。
粘附的粉末培养基中胶凝剂与营养物质的优选的比率由装置上待生长的特定微生物确定。然而，出于一般目的，在任何实施例中，约4比1至约5比1的比率(总胶凝剂比总营养物质，基于重量计)可为优选的。可由粉末或凝聚粉末组成的第一干涂层16可通过适用于施加基本上均匀的层的任何手段施加到粘合剂层20。优选的方法包括使用振动式装置，或使用粉末涂布机。干涂层的另一优选形式，即经涂布的培养基，被制备成基本上不含水的涂层，将它直接涂布到膜、第一衬底和/或第二衬底的顶部表面的至少生长区上。经涂布的培养基一般自粘附于膜并且不需要介于膜和培养基之间的粘合剂层。
经涂布的培养基可通过制得含有胶凝剂和/或营养物质的溶液，将溶液涂布(例如，使用刮刀涂布机)到膜上并且使溶液的涂层干燥来制备。除上文所述的合适的胶凝剂以外，琼脂是用于经涂布的培养基中合适的冷水复水胶凝剂。胶凝剂还可用于使培养基溶液增稠以便有助于将它涂布到膜上。出于实用的目的，胶凝剂的量优选地小于引起溶液增稠至不适用于将培养基涂布到膜上的点。
本发明的装置还可包括隔离物部件。任选的隔离物部件可通过任何合适的手段固定在第一干涂层和第二衬底18之间。例如，隔离物部件可经由粘合剂层20粘附到膜14或第一衬底12。隔离物可通过将它压靠在压敏粘合剂层20上来固定。
第二衬底18优选地以类似铰链方式沿隔离物24的一个边缘粘附，并且任选地涂布有粘合剂层20'和第二干涂层16'。另选地，第二衬底18可直接粘附到衬底12(未示出)。
本公开的薄膜培养装置特别适用于生长好氧微生物并且尤其是好氧霉菌。一般来讲，本发明装置的使用涉及接种、温育和分离和/或分析的常规步骤。
在另一方面，本公开提供了一种用于计数样品中霉菌微生物的方法。该方法可与本文所公开的薄膜培养装置的任何实施例一起使用。该方法包括在薄膜培养装置中形成接种的培养基，温育接种的培养基持续足以形成霉菌微生物的宏观可检测菌落的预定时间段，以及计数薄膜培养装置中霉菌微生物的宏观可检测菌落的数目。
在该方法的任何实施例中，形成接种的培养基包括用预定体积的含水液体形成水合的生长区。在任何实施例中，使样品材料(例如，液体样品、固体样品或悬浮在液体中的固体样品)溶解或悬浮于预定体积中，并且因此样品和预定体积同时被沉积(例如，通过移取)到薄膜培养装置的生长区中。
另选地，在任何实施例中，样品材料在预定体积之前沉积到生长区中。
另选地，在任何实施例中，将预定体积的液体沉积到生长区中，并且使胶凝剂溶胀/水合。随后，打开培养装置并且使样品材料沉积到水合的凝胶上。在任何实施例中，例如，可使样品沉积在样品捕捉装置诸如膜过滤器上。
如果培养装置中的干涂层和/或粉末包含了微生物生长所需的营养物质，那么用于接种培养装置的样品材料或含水液体都不需要含有营养物质来有助于霉菌微生物的生长。然而，在任何实施例中，用于接种装置的样品材料和/或含水液体可包含一种或多种营养物质以有助于霉菌微生物的生长。此外，在任何实施例中，用于接种装置的样品材料和/或含水液体可包含选择剂(例如，抗生素、可被某些霉菌微生物代谢且不可被其它霉菌微生物代谢的必需营养物质)，该选择剂比可能存在的其它微生物(例如，细菌、酵母)更有利于所有霉菌微生物的生长，或比可能存在的其它霉菌微生物更有利于某些霉菌微生物。
为了使用图1和2的装置，使用者将透明的第二衬底18向后拉以暴露生长区，并且将预定量的含水液体(任选地，含有样品材料)放置，例如移取，于培养装置的生长区40内的第一干涂层16上。例示的实施例中的生长区40由隔离物24中的洞26限定。第一干涂层16从而成为复水的。然后将第二衬底18再放置于复水的培养基上，并且将样品均匀地分布在生长区上，例如通过将加重的板放置于被覆盖的装置的顶部上。然后将装置在合适的温度下温育并且持续合适的时间以便允许微生物菌落的生长。在培养基中生长的菌落可通过透过第二衬底18观察它们来计数。如果需要，可将菌落从培养基移除用于进一步鉴定和/或分析。
图3和4中示出的装置11的实施例与图1和2的实施例相同，除了图3中不存在隔离物24。为了使用此类实施例，可在将含水液体沉积到生长区上并且闭合装置之后，将模板(例如，限定生长区的加重的圆环)暂时施加到第二衬底18的顶部上，以将培养基的复水限制于模板界定的生长区。在生长区中胶凝剂的至少一部分变得水合的一段时间之后，可将模板从培养装置移除。通常，胶凝剂的至少一部分在2-3秒内变得水合。
根据本公开，在薄膜培养装置中形成接种的培养基包括用预定体积的含水液体形成水合的生长区。当水合的生长区形成时，生长区域中存在的钙螯合化合物在能够有效地降低在培养装置中生长的霉菌微生物的菌落的侧向扩大速率的浓度下溶解到接种的培养基中。意外的是，溶解浓度的钙螯合化合物降低了在培养装置中生长的霉菌微生物的菌落的侧向扩大速率，而基本上不延缓对菌落的检测。即，通常可在将装置温育与惯常用于不含有效量钙螯合化合物的装置中相同培养基所用的时间大致相同的时间段之后检测到菌落。在任何实施例中，有效量(即，有效浓度，当溶解于含水液体中时)的钙螯合化合物基本上不延缓对原本将在预定时间段内检测的存在的酵母微生物的检测。
本领域的普通技术人员充分知晓足以形成在特定营养培养基中生长的霉菌微生物的宏观可检测菌落的温育条件(例如，温度、时间长度)。通常，将培养装置在环境温度(大致25℃)至约32℃的温度下温育。根据待检测的霉菌微生物，可将培养装置温育约40小时至约120小时，包括端值在内。在任何实施例中，将培养装置温育约40小时至约96小时。
计数薄膜培养装置中霉菌微生物的宏观可检测菌落的数目包括观察培养装置的生长区中存在的菌落。在任何实施例中，观察菌落包括视觉上观察菌落。设想可直接视觉上观察菌落(即，操作者观察培养装置)或可间接地视觉上观察菌落(即，操作者观察培养装置的图像)。在任何实施例中，计数宏观可检测菌落的数目还可包括计数酵母微生物的宏观可检测菌落的第二数目。
在任何实施例中，可使用菌落计数设备将培养装置成像，诸如像购自3M公司(明尼苏达州圣保罗(St.Paul,MN))的PETRIFILM读板机或购自Synbiosis(英国剑桥(Cambridge,UK))的PROTOCOL菌落计数器。在任何实施例中，可使用可商购获得的图像分析软件对图像中的霉菌和/或酵母菌落进行检测和计数。
在另一方面，本公开提供了一种试剂盒。试剂盒可用于本文公开的计数霉菌微生物的方法的任何实施例中。试剂盒包括用于生长霉菌微生物并对其进行计数的薄膜培养装置和容纳预定量的钙螯合化合物的容器。当设置在培养装置的生长区中时，在将装置接种之后，相对于在不含有设置在生长区中的有效量的原本相同培养装置中生长的相同霉菌菌种的菌落的侧向扩大速率，预定量的一部分足以降低在培养装置中生长的霉菌菌种的菌落形成单位的侧向扩大速率，其中降低菌落形成单位的侧向扩大速率基本上不延缓对菌落的检测。
在试剂盒的任何实施例中，薄膜培养装置可包含耐水的第一衬底、耐水的第二衬底、设置在第一衬底和第二衬底之间的生长区、设置在生长区中的干的、冷水可溶的胶凝剂和设置在生长区中的有效量的钙螯合化合物。当生长区用预定体积的含水液体水合并且用霉菌菌种的菌落形成单位接种时，相对于在不含有设置在生长区中的有效量的原本相同培养装置中生长的相同霉菌菌种的菌落的侧向扩大速率，有效量的钙螯合化合物能够降低在培养装置中生长的菌落形成单位的侧向扩大速率。降低菌落形成单位的侧向扩大速率基本上不延缓对菌落的检测。
在任何实施例中，试剂盒还包含选自由以下项组成的组的试剂：营养物质、检测试剂、选择剂、缓冲剂、染料和包括前述试剂中任意两者或更多者的混合物。
本公开的方法和装置可用于在适于生长霉菌微生物的温度下温育48小时之后，相对于在不含钙螯合化合物的基本上相同薄膜培养装置中生长的霉菌微生物的平均菌落直径，使霉菌菌落的平均直径降低约30％、约50％或至少约90％。意外的是，即使菌落的侧向扩展已被降低最多至90％，但是在用于对霉菌菌落进行检测和计数的典型温育时间内仍可观察到菌落。有利的是，平均菌落直径的减小允许对样品中的霉菌微生物进行更准确的计数，样品包含原本将在生长区的较大面积上铺展并且与其它霉菌菌落重叠的霉菌菌种，使单独菌落的计数更加困难。
实施例
实施例A为一种薄膜培养装置，包括：
耐水的第一衬底；
耐水的第二衬底；
生长区，设置在第一衬底和第二衬底之间；
干的、冷水可溶的胶凝剂，设置在生长区中；以及
有效量的钙螯合化合物，设置在生长区中；
其中，当生长区用预定体积的含水液体水合并且用霉菌菌种的菌落形成单位接种时，相对于在不含有设置在生长区中的有效量的原本相同培养装置中生长的相同霉菌菌种的菌落的侧向扩大速率，有效量的钙螯合化合物能够降低在培养装置中生长的菌落形成单位的侧向扩大速率；
其中降低菌落形成单位的侧向扩大速率基本上不延缓对菌落的检测。
实施例B是根据实施例A所述的薄膜培养装置，还包括设置在生长区中的钙盐。
实施例C是根据实施例A或实施例B所述的薄膜培养装置，其中钙螯合化合物和/或存在的钙盐设置在第一干涂层中。
实施例D是根据前述实施例中任一项所述的薄膜培养装置，其中胶凝剂设置在第一干涂层中和/或第二干涂层中。
实施例E是根据前述实施例中任一项所述的薄膜培养装置，其中在适于生长霉菌微生物的温度下温育48小时之后，相对于在不含钙螯合化合物的基本上相同的薄膜培养装置中生长的霉菌微生物的平均菌落直径，有效量的钙螯合化合物足以使霉菌微生物的平均菌落直径降低至少30％。
实施例F是根据实施例E所述的薄膜培养装置，其中在适于生长霉菌微生物的温度下温育48小时之后，相对于在不含钙螯合化合物的基本上相同的薄膜培养装置中生长的霉菌微生物的平均菌落直径，有效量的钙螯合化合物足以使霉菌微生物的平均菌落直径降低至少50％。
实施例G是根据实施例F所述的薄膜培养装置，其中在适于生长霉菌微生物的温度下温育48小时之后，相对于在不含钙螯合化合物的基本上相同的薄膜培养装置中生长的霉菌微生物的平均菌落直径，有效量的钙螯合化合物足以使霉菌微生物的平均菌落直径降低至少90％。
实施例H是根据前述实施例中任一项所述的薄膜培养装置，其中钙螯合化合物包括乙二胺四乙酸、乙二醇四乙酸或柠檬酸。
实施例I是根据实施例H所述的薄膜培养装置，其中钙螯合剂包括乙二胺四乙酸二钠二水合物，其中乙二胺四乙酸二钠二水合物以约0.5mg/100cm2至约12mg mg/100cm2的涂层密度设置在生长区中的干涂层中。
实施例J是根据前述实施例中任一项所述的薄膜培养装置，还包括营养培养基以支持霉菌微生物的生长。
实施例K是根据前述实施例中任一项所述的薄膜培养装置，还包括指示剂。
实施例L是根据前述实施例中任一项所述的薄膜培养装置，还包括预定体积的含水液体，其中设置在生长区中的有效量的钙螯合化合物溶解于含水液体中，其浓度为：相对于在不含有设置在生长区中的有效量的原本相同培养装置中生长的相同霉菌菌种的菌落的侧向扩大速率，能够有效地降低在含有设置在生长区中的有效量的培养装置中生长的霉菌菌种的菌落的侧向扩大速率。
实施例M是根据前述实施例中任一项所述的薄膜培养装置，还包括粘附到第一衬底的透气膜，其中透气膜与培养装置的生长区基本上共延。
实施例N是一种用于计数微生物的方法，包括：
在薄膜培养装置的生长区中形成接种的培养基，该薄膜培养装置包含设置在生长区中的有效量钙螯合化合物；
温育接种的培养基持续足以形成霉菌微生物的宏观可检测菌落的预定时间段；以及
计数薄膜培养装置中霉菌微生物的宏观可检测菌落的数目；
其中形成接种的培养基包括用预定体积的含水液体形成水合的生长区；
其中，当生长区用预定体积的含水液体水合并且用霉菌菌种的菌落形成单位接种时，相对于在不含有设置在生长区中的有效量的原本相同培养装置中生长的相同霉菌菌种的菌落的侧向扩大速率，钙螯合化合物降低在培养装置中生长的菌落形成单位的侧向扩大速率；
其中降低侧向扩大速率基本上不延缓对菌落的检测。
实施例O是根据实施例N所述的方法，其中有效量的钙螯合化合物基本上不延缓对原本将在预定时间段内检测的存在的酵母微生物的检测。
实施例P是根据实施例O所述的方法，还包括计数生长区中宏观可检测的酵母菌落的数目。
实施例Q是实施例N至P中任一项所述的方法：
其中形成接种的培养基包括将含水样品沉积到薄膜培养装置中；
其中，在沉积含水样品之前，薄膜培养装置包含营养培养基、指示剂和/或有效量的钙螯合化合物。
实施例R是根据实施例N至Q中任一项所述的方法，其中将接种的培养基温育预定的时间段包括将接种的培养基温育约40小时和约96小时之间。
实施例S是根据实施例N至R中任一项所述的方法，其中计数宏观可检测菌落的数目包括获得薄膜培养装置的生长区的图像。
实施例T是一种试剂盒，包括：
薄膜培养装置，用于生长霉菌微生物并对其进行计数；以及
容器，容纳预定量的钙螯合化合物；
其中当设置在培养装置的生长区中时，在将装置接种之后，相对于在不含有设置在生长区中的有效量的原本相同培养装置中生长的相同霉菌菌种的菌落的侧向扩大速率，预定量的一部分足以降低在培养装置中生长的霉菌菌种的菌落形成单位的侧向扩大速率；
其中降低菌落形成单位的侧向扩大速率基本上不延缓对菌落的检测。
实施例U是根据实施例T所述的试剂盒，其中薄膜培养装置包括：
耐水的第一衬底；
耐水的第二衬底；
生长区，设置在第一衬底和第二衬底之间；
干的、冷水可溶的胶凝剂，设置在生长区中；以及
有效量的钙螯合化合物，设置在生长区中；
其中，当生长区用预定体积的含水液体水合并且用霉菌菌种的菌落形成单位接种时，相对于在不含有设置在生长区中的有效量的原本相同培养装置中生长的相同霉菌菌种的菌落的侧向扩大速率，有效量的钙螯合化合物能够降低在培养装置中生长的菌落形成单位的侧向扩大速率；
其中降低菌落形成单位的侧向扩大速率基本上不延缓对菌落的检测。
实施例V是根据实施例T或实施例U所述的试剂盒，还包括选自由以下项组成的组的试剂：营养物质、检测化合物、选择剂、缓冲剂、染料和包括前述试剂中任意两者或更多者的混合物。
以下实例旨在进一步说明本发明。它们不旨在限制本发明。
实例
材料
除非另有说明，否则所有的试剂均获自西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司。
表1：材料列表。
Figure BDA0003878382590000261
实例1-4：用于检测霉菌微生物的薄膜培养装置。
营养培养基粉末混合物的制备。
根据表中列出的量，将五批非蛋白质性组分4-11(表2)称重到250毫升塑料容器中。将EDTA以表3中示出的量添加到各批。在EDTA添加之后，将各粉末混合物在咖啡研磨机中匀化30秒(KitchenAid BCG1110B型；KitchenAid；密歇根州圣约瑟(St.Joseph,MI))。在匀化之后，添加表1的蛋白质性组分1-3，之后进行手动摇动30秒以混合粉末。比较例1用除EDTA之外的所有组分进行制备。如实例中所用的“EDTA”是指可购自西格玛奥德里奇(密苏里州圣路易斯)的乙二胺四乙酸二钠二水合物(CAS No.6381-92-6)。
表2：粉末混合物。
Figure BDA0003878382590000271
表3：各粉末制剂中所用的乙二胺四乙酸二钠的量。
EDTA质量(g)
比较例1 0
实例1 2
实例2 4
实例3 10
实例4 20
薄膜培养装置的制备。
以表2中所示的量，将包含1:1(w/w)黄原胶/刺槐豆胶(XLBG)的混合物的干燥的粉末状胶凝剂(300g)添加到共混粉末，之后进行手动摇动30秒以混合。根据美国专利No.4,476,226和5,089,413中概述的过程制备培养板。简而言之，从主卷切割3×4英寸(7.6×10.2cm)底部膜段(即，如本文上文所述的“第一衬底”)。主卷包括带有涂布在上面的粘合剂(如美国专利No.5,635,367的实例1中所述的非抑制性粘合剂共聚物(在乙酸乙酯和庚烷的溶液中大致24％固体)，该专利全文以引用方式并入本文)薄层的疏水涂布纸材。粘合剂用氯霉素和氯四环素配制，并且基本上如美国专利No.5,089,413的实例1中所述涂布到主卷上。将去除了2.4英寸(6.1cm)直径圆的大致0.57mm厚的泡沫层层合到各底部膜。将大致2克粉末施加到开口，之后进行左右和前后移动以使粉末均匀地分布在粘合剂上。通过倒置膜来去除多余的粉末，得到结合到粘合剂层的营养物质/凝胶混合物粉末的薄层。将包括粉末涂布有黄原胶/刺槐豆胶混合物的粘合剂层的透光顶部膜相似地切割成7.6×10.2cm片并且使用双面粘合带(明尼苏达州圣保罗的3M公司)粘附到底部膜的顶部边缘。粘合剂层包含与表4中所示的酶底物混合的上文所述的粘合剂。
表4：用于制造用于霉菌检测的薄膜培养装置的显色酶底物。
Figure BDA0003878382590000281
用黑曲霉接种薄膜培养装置并且温育该薄膜培养装置。
在Butterfield氏缓冲液中制备黑曲霉(ATCC 16484)的冷冻原液的系列稀释液以得到大致10菌落形成单位(CFU)每毫升。将涂布有上文所述的粉末制剂的膜培养装置通过以下来接种：提起覆盖片，将1毫升稀释的样品移取于经涂布的底部膜的中心，再放置覆盖片，并且通过使用配有3M PETRIFILM酵母和霉菌计数板(在下文中称为“PYM板”；明尼苏达州圣保罗的3M公司(3M Company,St.Paul,MN))的铺展装置施加向下的压力，将种菌径向地分布到泡沫层合物中开口圆的边缘。针对各粉末涂布制剂来制备三个复制品。在接种之后，将板置于在30℃的培养箱中。
薄膜培养装置的分析。
使用配置成计数3M PETRIFILM好氧计数板的3M PETRIFILM读板机(明尼苏达州圣保罗的3M公司(3M Company,St.Paul,MN))在42、48和66小时获得板的图像。使用ImagePro软件(Media Cybernetics公司)中的“计数/大小”功能确定菌落面积。使用以下强度值，将基于柱状图的阈值分割用于建立蓝色菌落的边缘：红色＝124-205，绿色＝182-255并且蓝色＝112-255。对于各图像，将重叠(触及)菌落和由未接种区域的边缘截断的(即，非圆形)不规则菌落从分析中排除。在温育42小时之后测定各批板的平均菌落大小(使用三个复制板的菌落直径计算)。结果记录于表5中。
表5：各制剂的菌落直径的比较。
Figure BDA0003878382590000291
在选择的温育时间段(分别42小时和66小时)之后，通过手动地计数蓝色着色菌落的数目确定定量的霉菌计数。各组复制培养装置的菌落的总数示于表6中。
表6：
制剂 42h 66h
比较例1 22 24
实例1 22 23
实例2 24 26
实例3 4 25
实例4 2 21
各种霉菌菌种的检测。
如针对黑曲霉培养物所述，将表7中所示的霉菌菌种连续稀释，接种、温育、成像并且分析。针对各霉菌菌种，将使用实例1-4的薄膜培养装置观察的平均菌落大小与使用比较例1的薄膜培养装置观察的平均菌落大小比较。样品的平均菌落大小的减小百分比记录于表7中。针对一些菌种，在含有浓度高于干粉末涂层1重量％的EDTA的培养装置中观察可见菌落的出现的延缓。
表7：
Figure BDA0003878382590000301
1–在此浓度的EDTA中米曲霉的平均菌落大小增大5％。
2–在此浓度的EDTA中念珠丝霉菌的平均菌落大小增大1％。
3–在此浓度下未检测出菌落
实例5：使用含有钙螯合化合物的薄膜培养装置检测高钙食品样品中的霉菌。
不含脂肪的脱脂乳购自当地杂货店。将3.7毫克乙二胺四乙酸二钠二水合物添加到10毫升不含脂肪的脱脂乳中，以得到1毫摩尔每升EDTA的最终浓度。将黑曲霉(ATCC#16484)的悬浮液在Butterfields缓冲液中稀释成大致500菌落形成单位每毫升的浓度。将100微升稀释的悬浮液添加到乳样品中。在简单地涡旋之后，根据制造商的说明，使用含有霉菌的1毫升乳样品接种PYM板。将PYM板在30℃下温育48小时，之后进行如上文所述的成像和菌落大小分析。还在Butterfield氏缓冲液中制备对照样品(不含乳)。菌落大小减小示于表8中。
表8：
Figure BDA0003878382590000311
实例6：使用含有钙螯合化合物的薄膜培养装置检测酵母微生物。
如上文所述制备薄膜培养装置。将三种酵母菌株从冷冻原液连续稀释以得到大致100CFU每ml的最终浓度。对薄膜培养装置如上文所述进行接种、孵育91小时、成像和分析。数据显示，这些非丝状生物体的菌落大小不受浓度小于1％的EDTA的存在的影响。如针对实例1-4所述计算菌落面积并且以像素为单位报告。在具有浓度高于1％的EDTA的培养装置中未检测出光滑念珠菌和胶红酵母菌落。数据示于图9中。
表9：酵母微生物的菌落面积(以像素为单位报告)。各测试报告为菌落面积的平均 值±标准偏差。
Figure BDA0003878382590000312
实例7-11：用于检测霉菌微生物的薄膜培养装置。
如实例1-4中所述的那样，使用表10中所示的营养物质制剂(不含先前实例的添加的硫酸镁7H2O、氯化锰和硫酸锌7H2O)，对薄膜培养装置进行制备、接种和分析。如实例1-4中所述的那样添加EDTA以达到表11中所示的最终浓度。将三复制份板的各制剂用黑曲霉接种、温育并且在48小时和72小时下成像，如针对实例1-4所述的那样。在温育48小时之后的数均菌落大小和在温育48小时和72小时之后观察到的菌落的数目分别报告于表12和13中。
表10：
Figure BDA0003878382590000321
表11：
EDTA质量(g) EDTA(重量％)
比较例2 0 0
实例7 0.12 0.5
实例8 0.18 0.75
实例9 0.24 1.0
实例10 0.35 1.5
实例11 0.47 2.0
表12：温育48小时后的菌落大小。
制剂 所分析的分离菌落的数目 平均菌落大小 菌落大小的减小
比较例2 11 16662 不适用
实例7 11 703 -96％
实例8 9 107 -99％
实例9 3 159 -99％
实例10 ND - -
实例11 ND - -
ND-通过用于图像处理的参数未检测出菌落。
表13：温育48小时和72小时后的菌落计数。
Figure BDA0003878382590000322
Figure BDA0003878382590000331
实例12：检测霉菌微生物的方法。
在此实例中，将EDTA添加到板，它溶解于1毫升种菌中而非设置成经涂布的营养物质制剂中的组分，如上文所述。如实例1中所述制备黑曲霉的稀释悬浮液。通过将3.7毫克EDTA溶解于10毫升Butterfield氏缓冲液中来制备1毫摩尔每升EDTA溶液。将黑曲霉稀释悬浮液添加到EDTA/Butterfield氏以得到大致5cfu每毫升的细胞浓度。通过根据制造商的说明将一毫升种菌添加到PYM板来制备五个复制装置。从不含有EDTA的5cfu/ml黑曲霉溶液来制备一组对照板。表14示出温育48小时和72小时之后每板的平均菌落计数。表15示出，在1mM EDTA中生长的霉菌菌落在温育48小时之后具有小于对照板的大致20倍的平均菌落直径。
表14：
EDTA浓度 CFU(48h) CFU(72h)
0mM(对照) 15 16
1mM 15 16
表15：
EDTA浓度 菌落面积(像素)
0mM(对照) 27840
1mM 1492
实例13：在薄膜培养装置中检测霉菌微生物的方法中EGTA的使用。
通过将15.2毫克EGTA溶解于10毫升Butterfield氏缓冲液中来制备4毫摩尔每升乙二醇四乙酸(EGTA)溶液。制备连续两倍稀释液以得到分别含有2毫摩尔每升和1毫摩尔每升EGTA的溶液。如实例中所用的“EGTA”是指可购自西格玛奥德里奇(密苏里州圣路易斯)(Sigma-Aldrich(St.Louis,MO))的乙二醇-双(2-氨基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸(67-42-5)。将黑曲霉的悬浮液稀释并且添加到如实例12中所述的溶液以得到大致5cfu/ml的最终细胞浓度。通过根据制造商的说明将1毫升霉菌悬浮液接种到PYM板来制备三个复制装置。分别在温育48小时和72小时之后获得板的图像。在选择的温育时间段(分别42小时和66小时)之后，通过手动地计数蓝色着色菌落的数目来确定定量的霉菌计数。各组复制培养装置的菌落的总数示于表16中。根据各板的图像确定板计数(三个板的总数)并且结果示于表16中。通过将板成像并且如上文所述分析图像确定温育48小时之后的平均菌落大小。结果如表17所示。
表16：
EGTA浓度 48小时计数 72小时计数
0mM(对照) 12 12
1mM 12 12
2mM 14 14
4mM 11 11
表17：
EGTA浓度 菌落面积(像素) 菌落面积减小
0mM(对照) 26522
1mM 24107 -9％
2mM 15177 -43％
4mM 5772 -78％
本文引用的所有专利、专利申请和专利公开的全部公开内容以及可供使用电子版材料均以引用方式并入。在本专利申请和以引证方式并入本申请的任何文献的公开内容之间存在矛盾的情况下，应以本发明的公开内容为准。上述的详细说明和实施例仅为了清楚理解本发明。而不应被理解为不必要的限制。本发明不限于上述的各种细节，本领域所属技术人员可在权利要求书限定的本发明内作出各种变化。
所有的标题是为了方便阅读，并且不应该用于限定标题下内容的意思，除非特指。
在不脱离本发明的实质和范围的前提下，可进行各种修改。这些以及其它实施例均在如下权利要求的范围以内。
以下实例进一步说明本发明的优点和实施例，但是这些实例中所提及的具体材料及其量以及其它条件和细节均不应被解释为是对本发明的不当限制。除非另外指明或显而易见，否则所有材料均可以商购，或者是本领域内的技术人员已知的。

Claims (6)

1.一种薄膜培养装置，包括：
耐水的第一衬底；
耐水的第二衬底；
生长区，设置在所述第一衬底和所述第二衬底之间，所述生长区包括营养培养基，以支持霉菌微生物的生长；
干的、冷水可溶的胶凝剂，设置在所述生长区中；以及
有效量的钙螯合化合物，设置在所述生长区中；
其中，当所述生长区用预定体积的含水液体水合并且用霉菌菌种的菌落形成单位接种时，相对于在不含有设置在所述生长区中的所述有效量的原本相同培养装置中生长的相同霉菌菌种的菌落的侧向扩大速率，所述有效量的钙螯合化合物能够降低在培养装置中生长的所述菌落形成单位的侧向扩大速率；
其中降低所述菌落形成单位的侧向扩大速率基本上不延缓对所述菌落的检测；
其中所述钙螯合化合物包含乙二胺四乙酸、乙二醇四乙酸或柠檬酸；
其中接种的所述培养装置中所述钙螯合化合物的浓度是约1mM至约2mM，并且其中在适于生长霉菌微生物的温度下温育48小时之后，相对于在不含所述钙螯合化合物的基本上相同的薄膜培养装置中生长的霉菌微生物的第二平均菌落直径，所述有效量的钙螯合化合物足以使所述霉菌微生物的第一平均菌落直径降低至少30％。
2.根据权利要求1所述的薄膜培养装置，还包括设置在所述生长区中的钙盐。
3.根据权利要求1所述的薄膜培养装置，其中所述钙螯合化合物包含乙二胺四乙酸二钠二水合物，其中所述乙二胺四乙酸二钠二水合物以约0.5mg/100cm2至约12mg/100cm2的涂层密度设置在所述生长区中的干涂层中。
4.根据权利要求1所述的薄膜培养装置，还包括预定体积的含水液体，其中设置在所述生长区中的所述有效量的钙螯合化合物溶解于所述含水液体中，其浓度为：相对于在不含有设置在所述生长区中的所述有效量的原本相同培养装置中生长的相同霉菌菌种的菌落的侧向扩大速率，能够有效地降低在含有设置在所述生长区中的所述有效量的培养装置中生长的霉菌菌种的菌落的侧向扩大速率。
5.一种用于计数微生物的方法，包括：
在根据权利要求1的薄膜培养装置中温育接种的培养基持续足以形成霉菌微生物的宏观可检测菌落的预定时间段；以及
计数所述生长区中霉菌微生物的宏观可检测菌落的数目；
其中形成所述接种的培养基包括用预定体积的含水液体水合所述生长区；
其中，当所述生长区用所述预定体积的含水液体水合并且用霉菌菌种的菌落形成单位接种时，相对于在不含有设置在所述生长区中的所述有效量的原本相同培养装置中生长的相同霉菌菌种的菌落的侧向扩大速率，所述钙螯合化合物降低在培养装置中生长的所述菌落形成单位的侧向扩大速率；
其中降低侧向扩大速率基本上不延缓对所述菌落的检测。
6.根据权利要求5所述的方法：
其中形成接种的培养基包括将含水样品沉积到所述薄膜培养装置中；
其中，在沉积所述含水样品之前，所述薄膜培养装置包含营养培养基、指示剂和/或所述有效量的钙螯合化合物。
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