CN115501379B - 一种具有抑制肿瘤血管生成和抑制肿瘤转移功能的血管栓塞微球的制备方法及其应用 - Google Patents
一种具有抑制肿瘤血管生成和抑制肿瘤转移功能的血管栓塞微球的制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种具有抑制肿瘤血管生成和抑制肿瘤转移功能的血管栓塞微球的制备方法及其应用，本发明所述制备方法包括：分散相的制备、连续相的制备、一阶乳液的制备和二阶乳化制备血管栓塞微球这四个主要步骤，本发明首先通过制备一阶乳液，改善褐藻酸硫酸酯溶液的粘度，再通过旋转膜乳化法，利用氮气加压和微孔膜腔旋转的方式，将压力和离心力结合，使一阶乳液更易离开膜孔，有利于单分散微球的形成，同时降低了连续相对分散相的剪切力，减少褐藻酸硫酸酯分子的降解，本发明所述方法制备出的血管栓塞微球不仅拥有良好的单分散性和粒径均一性，可用于血管栓塞领域，其还具有抑制肿瘤血管生成及抑制肿瘤转移的能力，因此，在肿瘤介入治疗领域有着广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域，具体涉及一种具有抑制肿瘤血管生成和抑制肿瘤转移功能的血管栓塞微球的制备方法及其应用。
背景技术
经导管动脉化学栓塞术（Transcatheter Arterial Chemoembolization，TACE）是指经动脉内导管将栓塞材料有控制地注入到病变器官的供应血管内，使之发生闭塞，中断血供，以期达到控制出血、治疗肿瘤和血管性病变及消除患病器官的技术。TACE临床上多用于常规疗法（如：手术、化疗）难以干预的恶性肿瘤治疗，现临床上新生血管生成导致的肿瘤组织血供恢复和肿瘤转移是制约TACE治疗效果的主要原因，褐藻酸硫酸酯是海藻酸经磺酸化改性获得的，其分子内具有大量的磺酸基团，使其较强的负电性及吸附作用，因此可以吸附细胞因子，使其具有抑制肿瘤血管生成和抑制肿瘤转移的功能，所以在抗肿瘤领域有着广泛的应用。
褐藻酸硫酸酯分子内除具有负电性较强的磺酸基基团，同时存在负电性较弱的羧基、羟基基团，使其不仅能够吸附金属离子、阿霉素、伊立替康等电性较强的强阳离子药物（磺酸基基团主导），还能够吸附细胞因子、抗体、肽类电性较弱的药物（羧基、羟基基团主导）。因此褐藻酸硫酸酯可通过吸附细胞因子的作用发挥抑制肿瘤血管生成和抑制肿瘤转移的功能。
褐藻酸硫酸酯分子水溶性较好，在体内会被快速代谢，无法实现长时间的细胞因子吸附作用，从而影响其功能的发挥。以褐藻酸硫酸酯为原料制备栓塞微球，能够实现褐藻酸硫酸酯在体内局部的长期滞留，持续发挥细胞因子吸附作用。将其用于肿瘤血管栓塞，既能够切断肿瘤血供，抑制肿瘤生长，还能够发挥其抑制肿瘤血管生成及抑制肿瘤转移功能，增强治疗效果。
微球作为新一代的栓塞产品，因其适形性和易用性，在临床肿瘤介入治疗中凸显成效。
因此采用褐藻酸硫酸酯为原料制备微球，既能够发挥栓塞功能，又具备抑制肿瘤血管生产和抑制肿瘤转移的功能，从而更好的发挥TACE治疗的治疗效果。
微球制备最常规的方法为搅拌乳化法，通过搅拌桨的剪切力使分散相形成小液滴分散到连续相中，但本原料粘度大，单纯依靠搅拌桨的剪切力，不足以形成稳定的乳化条件，因此易团聚粘连、成球不均一、稳定性差、不易质控、产率低。
微球制备膜法与搅拌法相比，具有一定优势，可通过以下几种方案解决原料粘性问题：
1）将原料水解再膜乳化，但血管栓塞微球细胞因子吸附能力与原料分子链的完整度密切相关，此法不适用；
2）氮气加压，但仅适用于粘度1mpa.s以下原料，本原料的粘度可达3mpa.s（20%，20℃），远超氮气加压能解决的极限，此法也不适用。
发明专利CN113730646A公开了一种高载药可降解褐藻酸硫酸酯血管栓塞微球及其制备方法和应用，所述专利制备微球的方式为搅拌乳化法，而经实验测试，搅拌乳化法制备的微球存在粘连现象。
发明专利CN103172779A公开了一种粒径可控的聚合物微球的制造方法及其制备的聚合物微球，所述专利通过在膜的一侧加压，将油相和水相的混合液压过膜得到均一的乳液，但此方法只适用于低粘度液体的乳化，否侧会导致微球粘连或不成球。
因此，由于褐藻酸硫酸酯具有粘度较高、对剪切力敏感等特性，以其为原料采用搅拌乳化法制备微球会对微球的单分散性和粒径的均一性有较大的影响；膜乳化法制备的微球具有单分散性好和粒径均一的优点，但传统的膜乳化法在以高粘度原料制备微球时存在一定困难。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种具有抑制肿瘤血管生成和抑制肿瘤转移功能的血管栓塞微球的制备方法及其应用，所制备的血管栓塞微球不仅拥有良好的单分散性和粒径均一性，还具有抑制肿瘤血管生成及抑制肿瘤转移的能力。
为了实现上述目的，本发明采取如下技术方案：
一种具有抑制肿瘤血管生成和抑制肿瘤转移功能的血管栓塞微球的制备方法，包括如下步骤：
（1）分散相的制备：将褐藻酸硫酸酯加入到溶剂中，溶解均匀后调节pH，得到分散相；
（2）连续相的制备：将乳化剂加入到油相中，搅拌至乳化剂完全溶解，得到连续相；
（3）一阶乳液的制备：在搅拌条件下，向步骤（2）得到的连续相中加入步骤（1）得到的分散相，得到第一阶段乳液；
（4）二阶乳化制备血管栓塞微球：将第一阶段乳液置于由疏水性微孔膜构成的密闭圆柱形腔体中，然后将腔体置于盛有连续相的圆柱形容器中，使连续相完全没过腔体；接着向连续相中加入交联剂，然后对连续相进行加热；之后轴向转动腔体，同时，向腔体中通入氮气，以恒定压力将分散相通过腔体中微孔膜的微孔压入连续相中，进行反应；反应完成后，用筛网筛分出微球，经洗涤，真空干燥后得到血管栓塞微球。
优选的，步骤（1）中，所述褐藻酸硫酸酯的分子量为1×104~3×105D；褐藻酸硫酸酯溶液的浓度为0.05~0.5 g/mL；所述pH为8~14；所述溶剂为去离子水。
优选的，步骤（2）中，所述乳化剂为Span60、Span80、Tween60、Tween80中的一种或多种；搅拌的温度为60~90℃；所述乳化剂的加入量为0.0005~0.03g/mL；所述油相为植物油。
优选的，步骤（3）中，分散相与连续相的体积比为1:1-5，搅拌转速≥300r/min，搅拌温度≥65℃。
优选的，步骤（4）中，密闭圆柱形腔体的材质为不锈钢、陶瓷或玻璃，密闭圆柱形腔体中微孔膜的孔径不大于500µm，所述密闭圆柱形腔体中的一阶乳液与圆柱形容器中连续相的体积比为1:1-30。
优选的，步骤（4）中，所述交联剂为环氧氯丙烷、戊二醛、丁二醇二缩水甘油醚、乙二醇二缩水甘油醚中的一种或多种；所述交联剂与密闭圆柱形腔体中一阶乳液所含分散相的体积比为1-10:1-10。
优选的，步骤（4）中，加热的温度为60~90℃；轴向转动的转速为300~800r/min。
优选的，步骤（4）中，反应的温度为60~90℃、反应的时间为2~20h；恒定压力为0.1~0.6MPa；筛网的孔径为180~200µm。
本发明提供利用上述制备方法所制备得到的具有抑制肿瘤血管生成和抑制肿瘤转移功能的血管栓塞微球。
本发明还提供上述血管栓塞微球在抗肿瘤领域中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明创新性地采用二阶乳化法制备血管栓塞微球，通过先制备一阶乳液，改善褐藻酸硫酸酯溶液粘度，再通过旋转膜乳化法，采用氮气加压和微孔膜腔旋转的组合方式，将压力和离心力结合，使一阶乳液更易离开膜孔，降低了连续相对分散相的剪切力，相比于传统的乳化法，本发明所述方法更适用于以高粘度、对剪切力敏感的大分子化合物为原料的微球制备。
2、本发明采用的二阶乳化法可以使形成的乳液更稳定，有利于单分散微球的形成；在二阶乳化过程前，将交联剂加入连续相中，实现了乳化和固化的同时进行，防止后续过程中因乳液不稳定导致的破乳或微球粘连情况的出现。
3、本发明采用的微球制备方法可通过调节氮气压力、微孔膜孔径和膜旋转速度等多个参数，实现对制备微球粒径的精准控制，保证微球的单分散性和粒径的均一性。
4、本发明制备的血管栓塞微球相对于其它微球不仅具有血管栓塞功能，还具备抑制肿瘤血管生成和抑制肿瘤转移的功能。
5.本发明制备的血管栓塞微球相对于褐藻酸硫酸酯本身，因增加了比表面积，增强其吸附能力，使其抑制肿瘤血管生成及抑制肿瘤转移的能力得到了显著的提升。
附图说明
图1为本发明实施例1的Huvec-c细胞体外成管显微镜图像（×200）；
图2为本发明实施例1的HepG2细胞迁移染色后显微镜图像（×200）；
图3为本发明实施例1的HepG2细胞划痕试验24h后显微镜图像（×100）；
图4为本发明实施例1与对比例1所制备微球对VEGF的吸附曲线图。
具体实施方式
以下通过具体较佳实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明并不仅限于以下的实施例。
需要说明的是，无特殊说明外，本发明中涉及到的化学试剂均通过商业渠道购买。
实施例1
一种具有抑制肿瘤血管生成和抑制肿瘤转移功能的血管栓塞微球的制备方法，包括如下步骤：
（1）分散相的制备：将10g褐藻酸硫酸酯加入到50 mL去离子水中溶解均匀后，用3mol/L的NaOH溶液调节pH至12.0，得到分散相；
（2）连续相的制备：向1000 mL大豆油中加入3g Span60，于75 ℃下搅拌至乳化剂溶解完全，得到连续相；
（3）一阶乳液的制备：在400 r/min的搅拌条件下，向150 mL温度为75 ℃的连续相中加入50 mL分散相，得到第一阶段乳液；
（4）二阶乳化制备血管栓塞微球：将第一阶段乳液置于由不锈钢微孔膜构成的密闭圆柱形腔体中，然后将所述腔体置于盛有850 mL的连续相的圆柱形容器中，使连续相完全没过所述腔体；接着向连续相中加入50mL环氧氯丙烷，再将连续相加热至75 ℃；之后轴向转动所述腔体，转速为300 r/min，同时，以0.2MPa的恒定压力向腔体中通入氮气将分散相通过微孔膜的微孔压入连续相中，于75℃下反应3h；反应完成后，用筛网筛分出微球，并分别用石油醚、乙酸乙酯、无水乙醇反复洗涤除去连续相，再经真空干燥后得到粒径为180~200µm血管栓塞微球。
实施例2
一种具有抑制肿瘤血管生成和抑制肿瘤转移功能的血管栓塞微球的制备方法，包括如下步骤：
（1）分散相的制备：将25g褐藻酸硫酸酯加入到50mL去离子水中溶解均匀后，用3mol/L的NaOH溶液调pH至14.0，得到分散相；
（2）连续相的制备：向1000 mL大豆油中加入3g Span80，于75 ℃下搅拌至乳化剂溶解完全，得到连续相；
（3）一阶乳液的制备：在400 r/min的搅拌条件下，向250mL温度为75 ℃的连续相中加入50mL分散相，得到第一阶段乳液；
（4）二阶乳化制备血管栓塞微球：将第一阶段乳液置于由不锈钢微孔膜构成的密闭圆柱形腔体中，然后将所述腔体置于盛有850 mL的连续相的圆柱形容器中，使连续相完全没过所述腔体；接着向连续相中加入5mL环氧氯丙烷，再将连续相加热至60℃；之后轴向转动所述腔体，转速为500r/min，同时，以0.1MPa的恒定压力向腔体中通入氮气将分散相通过微孔膜的微孔压入连续相中，于60℃下反应2h；反应完成后，用筛网筛分出微球，并分别用石油醚、乙酸乙酯、无水乙醇反复洗涤除去连续相，再经真空干燥后得到粒径为180~200µm血管栓塞微球。
实施例3
一种具有抑制肿瘤血管生成和抑制肿瘤转移功能的血管栓塞微球的制备方法，包括如下步骤：
（1）分散相的制备：将2.5g褐藻酸硫酸酯加入到50mL去离子水中溶解均匀后，用3mol/L的NaOH溶液调pH至8.0，得到分散相；
（2）连续相的制备：向1000mL大豆油中加入3g Tween60，于75 ℃下搅拌至乳化剂溶解完全，得到连续相；
（3）一阶乳液的制备：在400r/min的搅拌条件下，向50mL温度为75 ℃的连续相中加入50mL分散相，得到第一阶段乳液；
（4）二阶乳化制备血管栓塞微球：将第一阶段乳液置于由不锈钢微孔膜构成的密闭圆柱形腔体中，然后将所述腔体置于盛有850 mL的连续相的圆柱形容器中，使连续相完全没过所述腔体；接着向连续相中加入500 mL环氧氯丙烷，再将连续相加热至90℃；之后轴向转动所述腔体，转速为800 r/min，同时，以0.6MPa的恒定压力向腔体中通入氮气将分散相通过微孔膜的微孔压入连续相中，于90℃下反应20h；反应完成后，用筛网筛分出微球，并分别用石油醚、乙酸乙酯、无水乙醇反复洗涤除去连续相，再经真空干燥后得到粒径为180~200µm血管栓塞微球。
对比例1
一种具有抑制肿瘤血管生成和抑制肿瘤转移功能的血管栓塞微球的制备方法，包括如下步骤：
（1）分散相的制备：将10 g褐藻酸硫酸酯加入到50 mL去离子水中溶解均匀后，用3mol/L的NaOH溶液调pH至12.0，得到分散相；
（2）连续相的制备：向1000 mL大豆油中加入3g Span60，于75℃下搅拌至乳化剂溶解完全，得到连续相；
（3）搅拌乳化法制备血管栓塞微球：在400 r/min的搅拌条件下，向150 mL温度为75 ℃的连续相中加入50 mL分散相，接着加入50 mL环氧氯丙烷，于75 ℃下反应3 h，用筛网筛分出微球，并分别用石油醚、乙酸乙酯、无水乙醇反复洗涤除去连续相，再经真空干燥后得到血管栓塞微球。
本对比例与实施例1的区别是：本对比例制备血管栓塞微球的方式为搅拌法。
试验例1
对实施例1和对比例1中所得血管栓塞微球进行粒径和粒度的测量：
测试方法：采用激光散射粒度仪湿法粒径测定，以蒸馏水为悬浮剂，进行粒度测定。
结果分析：测定结果显示实施例1中本发明方法制备的微球粒径相差0~10µm，粒度测定PDI为0.015；而对比例1中搅拌乳化法制备的微球粒径相差0~90µm，粒度测定PDI为0.273。由实验数据可以得出，本发明所制备得到的血管栓塞微球有着更好的单分散性和粒径的均一性。
试验例2
对实施例1中所得血管栓塞微球进行体外血管生成、Transwell细胞迁移、细胞划痕试验。
（1）体外血管生成试验（Huvec-c细胞体外成管试验）
测试方法：
1）将对数生长期的Huvec-c细胞消化接种到六孔板中，次日，待细胞贴壁后，根据组别设置加入相应的含药培养基，同时设立阴性对照组；
2）ECMatrix胶配置：按照试剂盒说明书操作方法操作；
3）将ECMatrix胶添加到96孔板中，每孔50 µl，将铺设好胶的板子放置37 ℃培养箱中凝固1 h以上；
4）铺设细胞：用胰酶消化收集细胞，每孔加入200 µl细胞悬液（即每孔8000个细胞）至铺好胶的96孔板中，置于37 ℃培养箱中孵育8 h；
5）显微镜下拍照，观察血管生成情况；
6）图像处理软件分析图片中成管情况。
结果如图1及下表1所示：
表1 体外血管生成试验结果
（2）Transwell细胞迁移试验（HepG2细胞）
测试方法：
1）接种细胞：消化、计数细胞，调整细胞密度至1×105个/mL，取细胞悬液100 µL加入Transwell小室，下室加入500 µL含FBS的培养基；
2）培养细胞：24孔细胞培养板置于37 ℃，5% CO2培养箱中培养24 h；
3）细胞计数：用棉签擦去上室内的细胞，移去Transwell，倒置，风干，在24孔板中加入500µL的0.1%结晶紫溶液，然后将小室置于其中，使膜浸没在37℃染料中，于30 min后取出，用PBS清洗，在直径上取3个视野，照相（放大倍数为200×），计数。
结果如图2及下表2所示：
表2 Transwell迁移试验结果
（3）细胞划痕试验（HepG2细胞）
测试方法：
1）将对数生长期的细胞消化接种到六孔板中，次日，待细胞集合度达80%左右，用无菌枪头在六孔板中均匀划线；；
2）用PBS洗去漂浮细胞，然后换新鲜培养液，置于细胞培养箱中继续培养；
3）培养24 h后，取出细胞，拍照（放大倍数为100×），测量细胞迁移距离。
结果如图3及下表3所示：
表3 细胞划痕试验结果
结果分析：由上述三个试验结果可以看出，相同浓度下，微球组功效显著优于原料组。褐藻酸硫酸酯发挥抑制肿瘤血管生成和抑制肿瘤转移功能主要通过对细胞因子的吸附实现，制备成微球后增加了其比表面积，同时使其吸附基团分布于微球表面，从而发挥更强的吸附作用，有着更突出的功效。褐藻酸硫酸酯本身在体内会很快本降解代谢，而被制备成微球后，可达到长时滞留体内的目的，从而发挥长效作用。
将实施例1和对比例1所制备的微球进行人血管内皮生长因子（VEGF）吸附实验，具体实验步骤如下：
采用0.1M PBS试液配制1μg/mLVEGF溶液，分别精确称取0.10g实施例1和对比例1所制备的微球，放入7mL西林瓶中，加入上述VEGF溶液2mL，使微球浸泡于溶液中，置于37℃水浴中，不时摇动混匀，用微量注射器在第5、10、15、30、60、90、120min定时取样20μL，加入180μL 0.1M PBS中稀释，采用人血管内皮生长因子（VEGF）酶联免疫试剂盒测定样品中的VEGF含量，从而计算微球对VEGF的吸附量：吸附量＝(吸附前溶液VEGF含量-吸附后溶液VEGF含量)/微球重量，测得实施例1所制备的微球吸附VEGF量为9.2μg/g，对比例1所制备的微球吸附VEGF量为6.8μg/g。
从图4可以看出，本发明实施例1所制备血管栓塞微球与对比例1相比吸附VEGF速度更快，最大吸附量提高近30%，原因在于实施例1所制备微球粒径更均一，微球单分散性更好，而搅拌法制备微球粒径分布范围较宽，微球存在粘连现象，所以本专利制备微球比表面积更大，能使吸附VEGF等细胞因子的羧基、羟基基团暴露更充分。
最后需要说明的是：以上实施例不以任何形式限制本发明。对本领域技术人员来说，在本发明基础上，可以对其作一些修改和改进。因此，凡在不偏离本发明精神的基础上所做的任何修改或改进，均属于本发明要求保护的范围之内。
Claims (8)
1.一种具有抑制肿瘤血管生成和抑制肿瘤转移功能的血管栓塞微球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）分散相的制备：将褐藻酸硫酸酯加入到溶剂中，溶解均匀后调节pH，得到分散相；
（2）连续相的制备：将乳化剂加入到油相中，搅拌至乳化剂完全溶解，得到连续相；
（3）一阶乳液的制备：在搅拌条件下，向步骤（2）得到的连续相中加入步骤（1）得到的分散相，得到第一阶段乳液；
（4）二阶乳化制备血管栓塞微球：将第一阶段乳液置于由疏水性微孔膜构成的密闭圆柱形腔体中，然后将腔体置于盛有连续相的圆柱形容器中，使连续相完全没过腔体；接着向连续相中加入交联剂，然后对连续相进行加热；之后轴向转动腔体，同时，向腔体中通入氮气，以恒定压力将分散相通过腔体中微孔膜的微孔压入连续相中，进行反应；反应完成后，用筛网筛分出微球，经洗涤，真空干燥后得到血管栓塞微球；
其中，步骤（1）中，所述褐藻酸硫酸酯的分子量为1×104~3×105D，褐藻酸硫酸酯溶液的浓度为0.05~0.5 g/mL；所述pH为8~14；所述溶剂为去离子水。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述乳化剂为Span60、Span80、Tween60、Tween80中的一种或多种；搅拌的温度为60~90℃；所述乳化剂的加入量为0.0005~0.03g/mL；所述油相为植物油。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，分散相与连续相的体积比为1:1-5，搅拌转速≥300r/min，搅拌温度≥65℃。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，密闭圆柱形腔体的材质为不锈钢、陶瓷或玻璃，密闭圆柱形腔体中微孔膜的孔径不大于500µm，所述密闭圆柱形腔体中的一阶乳液与圆柱形容器中连续相的体积比为1:1-30。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，所述交联剂为环氧氯丙烷、戊二醛、丁二醇二缩水甘油醚、乙二醇二缩水甘油醚中的一种或多种；所述交联剂与密闭圆柱形腔体中一阶乳液所含分散相的体积比为1-10:1-10。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，加热的温度为60~90℃；轴向转动的转速为300~800r/min。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，反应的温度为60~90℃、反应的时间为2~20h；恒定压力为0.1~0.6MPa；筛网的孔径为180~200µm。
8.一种利用权利要求1~7任一项所述制备方法所制备得到的具有抑制肿瘤血管生成和抑制肿瘤转移功能的血管栓塞微球。
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