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CN115462347B - 视黄酸代谢通路在先天性巨结肠疾病中的应用 - Google Patents

视黄酸代谢通路在先天性巨结肠疾病中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了视黄酸代谢通路在先天性巨结肠疾病中的应用，具体涉及视黄酸代谢通路在先天性巨结肠动物模型构建、检测、预防或治疗中的应用。本发明发现先天性巨结肠患者中视黄酸代谢通路异常；视黄醛脱氢酶ALDH1疾病段表达下调，具有显著差异(p<0.05)，说明ALDH1及其调控的视黄酸通路代谢物具有诊断或辅助诊断先天性巨结肠的作用；喂食ALDH1的抑制剂可以诱导典型的巨结肠表型，用于构建先天性巨结肠患病模型，更好的研究先天性巨结肠的发病、发展机制以及防治药物的筛选；还发现视黄酸、视黄醛、视黄醇及其类似物、衍生物具有治疗先天性巨结肠疾病的作用，可以很好地应用于先天性巨结肠疾病的防治。

Description

视黄酸代谢通路在先天性巨结肠疾病中的应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，涉及视黄酸代谢通路中的抑制剂在先天性巨结肠动物模型构建中的应用，具体涉及视黄酸代谢通路中的靶物质在先天性巨结肠疾病检测、预防和/或治疗中的应用。
背景技术
先天性巨结肠(Hirschsprung disease，HSCR)是新生儿消化道畸形最常见的疾病之一，具有明显的遗传倾向，发病机制未明。现阶段手术是唯一治疗手段，缺乏无创的诊疗方式、缺乏有效的治疗药物。基于真实世界临床队列阐明疾病发病机制,寻找新的治疗靶点和治疗方案，能切实改善现阶段的临床痛点和难点，从而提高疾病的临床疗效，是当前该研究领域的重点和热点。
先天性巨结肠的及时诊治可以减少先天性巨结肠肠炎发生的危险，获得良好的预后。该疾病确诊需要术后病变组织的病理切片。术前诊断方法主要为钡剂灌肠，直肠活检、直肠测压，以判断是否要实施“巨结肠根治术”。但检测方法复杂、具有一定的假阳性。此外该病目前也没有能够进行无创治疗的有效药物，同时也缺乏可行的用于科研筛选有效药物等目的的疾病动物模型，进一步使得对该病的诊断、预防、治疗方面的研究进展缓慢。
视黄酸，Retinoic Acid(下文有时称RA)，又称视磺酸、视黄酯、视黄酸、维甲酸、维A酸，分子式C20H28O2、CAS号302-79-4，是维生素A在体内的代谢产物，目前研究认为维生素A的生物活性与视黄酸密切相关。视黄酸有两种活性形式比较受关注，分别为全反式视黄酸(all-trans retinoic acid，ATRA，RA)和9-顺式视黄酸(9-cis retinoic acid，9cRA)。维生素A(视黄醇)、视黄醛、视黄酸等视黄醇衍生物统称为类视黄醇，这类物质结构都具有三个不同区域：β-白芷酮环、多烯旁链和极性末端。类视黄醇物质在众多细胞和组织中发挥重作用，尤其是对视觉形成、细胞增殖、细胞分化、免疫反应、神经功能和早期发育尤为重要。
ALDH1，又称ALDH1，乙醛脱氢酶1，醛脱氢酶家族成员，催化视磺醛为视磺酸，在哺乳动物的发育过程和体内稳态维持过程中发挥重要作用。
目前并未发现视黄酸、视磺醛、ALDH1等视黄酸代谢通路相关物质与先天性巨结肠相关的报道。
发明内容
为克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于阐释巨结肠发生发展的新的机制，提供一种先天性巨结肠小鼠模型、先天性巨结肠预的新的诊断、防治靶点和药物，为先天性巨结肠的研究和临床应用提供新的工具和药物，为极大的改善该类疾病的临床诊疗现状，降低家庭和社会的医疗负担，促进社会和谐发展，做出贡献。
本发明人对先天性巨结肠的表观遗传和染色质三维调控机制进行了深入研究。首先，选取了代表性的先天性巨结肠疾病的实例，通过蛋白组水平分析了患有先天性巨结肠疾病,包括短段型、常见型、长段型和全结肠型的儿童受试者，证明了先天性巨结肠患儿RA代谢通路异常；其中，RA代谢通路中的视黄醛脱氢酶ALDH1疾病段表达下调；进而，饲喂乳鼠ALDH1的抑制剂出现典型的巨结肠表型，从而制备得到了巨结肠动物模型。单细胞测序提示ALDH1集中在肠神经胶质细胞(EGC)，疾病段几乎无表达；在EGC前体神经嵴细胞(ENCC)敲低ALDH1致RA下调且细胞分化能力异常。可见，在肠神经发育过程ALDH1在ENCC中低表达影响RA-RARα复合物形成，导致其介导的超级增强子改变进而影响细胞分化命运形成巨结肠。此外，本发明人发现视黄酸代谢通路中的物质，如乙醛脱氢酶ALDH1、视黄酸具有诊断先天性巨结肠的作用。而且，进一步将视黄酸代谢通路中的表达缺陷物质视黄酸给予巨结肠表型小鼠证实，视黄酸能够逆转先天性巨结肠的发生和发展，具有预防和治疗先天性巨结肠疾病的作用。此外，本发明成功应用ALDH1抑制剂，例如NCT501，诱导产生了稳定的先天性巨结肠小鼠模型。
在上述研究基础上提出了本发明，具体包括如下方案：
本发明的第一个目的在于提供视黄酸代谢通路抑制剂在制备先天性巨结肠动物模型中的应用。
本发明的第二个目的在于一种先天性巨结肠动物模型的构建方法。
本发明的第三个目的在于提供上述构建方法制备的先天性巨结肠模型的应用。
本发明的第四个目的在于提供视黄酸代谢通路的激活剂在制备预防和/或治疗先天性巨结肠产品中的应用。
本发明的第五个目的在于提供定量检测视黄酸代谢通路中的物质的试剂在制备诊断或辅助诊断先天性巨结肠的产品中的应用。
本发明的第六个目的在于提供一种用于检测或辅助检测先天性巨结肠的产品。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一方面，提供视黄酸代谢通路抑制剂在制备先天性巨结肠动物模型中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述视黄酸代谢通路抑制剂是抑制ALDH1的基因表达或蛋白表达或蛋白活性的试剂、抑制视黄醇生成的试剂、抑制视黄醛生成的试剂、抑制视黄酸生成的试剂、抑制视黄酸与受体RARα结合的试剂和导致受体RARα功能异常的试剂中的至少一种。
在本发明的一些优选实施方式中，所述抑制ALDH1的基因表达或蛋白表达或蛋白活性的试剂包括敲除ALDH1基因的试剂、沉默ALDH1基因的试剂、抑制ALDH1基因转录、抑制ALDH1蛋白表达或活性的试剂。
在本发明的一些优选实施方式中，所述抑制ALDH1蛋白表达或抑制蛋白活性的试剂包括NCT-501、NCT-501hydrochloride、双硫仑、4-Hydroxynonenal(4-HNE)、4-Diethylaminob enzaldehyde、α-NETA、Win 18446、BODIPY aminoacetaldehyde(BAAA)、Prunetin和3-Hy droxybenzaldehyde中的至少一种。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述抑制ALDH1蛋白表达或蛋白活性的试剂为NCT-501。
本发明的第二方面，提供一种先天性巨结肠动物模型的构建方法，通过添加视黄酸代谢通路抑制剂来构建所述先天性巨结肠动物模型。
在本发明的一些实施方式中，所述构建方法为(I)或(II)：
(I)在小鼠孕3-18天，对孕鼠给药NCT501，每天1次，给药量为5-30mg/kg，持续时间≥5天，得到先天性巨结肠缺陷的模型小鼠；所述药物使用脂溶性溶剂配制；
优选为在小鼠孕8-10天对孕鼠给药，给药至小鼠出生，得到出生后具有先天性巨结肠缺陷的模型小鼠；
(II)在小鼠孕3-18天，对孕鼠给药NCT501，每天1次，给药量为5-30mg/kg，直至小鼠出生后的3周-16周，得到先天性巨结肠缺陷的模型小鼠；所述药物用水配制；
优选为在小鼠孕8-10天对孕鼠给药，直至出生后的3-4周，得到先天性巨结肠缺陷的模型小鼠。
以上两种方案的小鼠出生后，均表现出患有巨结肠的表型。所述表型具体体现在：1)结肠近端明显扩张膨大，结肠远端明显狭窄；2)结肠远端神经元数目显著低于结肠近段神经元数目。
在本发明的一些实施方式中，所述给药方式为口服、灌胃、腹腔注射或静脉注射。
在本发明的一些实施方式中，所述视黄酸代谢通路抑制剂是抑制ALDH1的基因表达或蛋白表达或蛋白活性的试剂、抑制视黄醇生成的试剂、抑制视黄醛生成的试剂、抑制视黄酸生成的试剂、抑制视黄酸与受体RARα结合的试剂和导致受体RARα功能异常的试剂中的至少一种。
在本发明的一些优选实施方式中，所述抑制ALDH1的基因表达或蛋白表达或蛋白活性的试剂包括敲除ALDH1基因的试剂、沉默ALDH1基因的试剂、抑制ALDH1基因转录、抑制ALDH1蛋白表达或活性的抑制剂。
在本发明的一些优选实施方式中，所述抑制ALDH1蛋白表达或蛋白活性的试剂包括NC T-501、NCT-501hydrochloride、双硫仑、4-Hydroxynonenal(4-HNE)、4-Diethylaminobenzald ehyde、α-NETA、Win 18446、BODIPY aminoacetaldehyde(BAAA)、Prunetin和3-Hydroxyb enzaldehyde中的至少一种。
其中，NCT-501是一种茶碱类的有效醛脱氢酶1A1(ALDH1A1)选择性抑制剂，抑制hALDH1A1时IC50值为40nM，选择性超过其它ALDH同工酶和其它脱氢酶(作用于hALDH1B1，hALDH3A1和hALDH2时，IC50值>57μM)。
NCT-501hydrochloride是一种茶碱类的有效醛脱氢酶1A1(ALDH1A1)选择性抑制剂，抑制hALDH1A1时IC50值为40nM，选择性超过其它ALDH同工酶和其它脱氢酶(作用于hALDH1B1，hALDH3A1和hALDH2时，IC50值>57μM)。
Disulfiram(Tetraethylthiuram disulfide)是特异性的乙醛脱氢酶1型抗体(ALDH1)抑制剂，对酒精具有急性敏感性。Disulfiram有效抑制人体和小鼠细胞中脂质体中的GSDMD孔形成，炎性体介导的细胞凋亡和IL-1β分泌。
4-Hydroxynonenal(4-HNE)是一种α，β不饱和羟基烯醛，是一种氧化/亚硝化应激生物标志物。4-Hydroxynonenalal是ALDH2的底物和抑制剂。4-Hydroxynonenalal可以调节许多信号传导过程，主要是通过与蛋白质，核酸和膜脂质中具有亲核官能团的共价加合物形成的。4-Hydroxynonenalal通过线粒体在癌症中起重要作用。
4-Diethylaminobenzaldehyde是一种可逆的醛脱氢酶(ALDHs)抑制剂，对ALDH1的Ki为4nM。4-Diethylaminobenzaldehyde具有较强的抗雄激素作用(IC50＝1.71μM)。
α-NETA是一种有效的，非竞争性的胆碱乙酰转移酶(ChA)抑制剂，IC50为9μM。α-NETA是一种有效的ALDH1A1(IC50＝0.04μM)和趋化因子样受体1(CMKLR1)拮抗剂。α-NETA微弱的抑制胆碱酯酶(ChE；IC50＝84μM)和乙酰胆碱酯(AChE；IC50＝300μM)。α-NETA具有抗癌活性。
Win 18446是具有口服活性的睾丸特异性的酶ALDH1a2的抑制剂，其IC50值为0.3μM。Win18446可逆的抑制多个物种的精子形成，抑制睾丸内视黄醇(HY-B1342)合成视黄酸(HY-14649)。
BODIPY aminoacetaldehyde(BAAA)是一种鼠类和人醛脱氢酶(ALDH)的荧光底物。BODIPY Prunetin是一种O-甲基化异黄酮，具有抗炎活性。
Prunetin是一种有效的人醛脱氢酶抑制剂。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述抑制ALDH1蛋白表达或蛋白活性的试剂为NCT-501。
本发明的第三方面，提供本发明第二方面所述的先天性巨结肠动物模型的构建方法制备的先天性巨结肠模型在研究先天性巨结肠发生和/或发展的分子机制、筛选预防和/或治疗先天性巨结肠的药物中的应用。
本发明的第四方面，提供视黄酸代谢通路的激活剂在制备预防和/或治疗先天性巨结肠产品中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述产品为药物。
在本发明的一些实施方式中，所述药物的剂型为适用于成人的剂型或儿童的剂型。
在本发明的一些实施方式中，所述适用于成人的剂型为采用视黄酸代谢通路的激活剂与本领域常规辅料通过本领域的常规方法制备成的常规药物剂型，所述常规药物剂型包括但不限于散剂、片剂、舌下片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂、注射剂、栓剂、气雾剂、泡腾片、滴剂、滴丸剂。
在本发明的一些实施方式中，所述适用于儿童的剂型优选为颗粒剂、糖浆剂、咀嚼片、分散片、混悬剂、泡腾片、滴剂、肠溶剂、灌肠剂、口崩片、溶液剂、冲剂、栓剂。
在本发明的一些实施方式中，所述视黄酸代谢通路的激活剂选自视黄酸的表达促进剂、视黄酸或其可药用盐、视黄醇的表达促进剂、视黄醇或其可药用盐、视黄醛的表达促进剂、视黄醛或其可药用盐、ALDH1的基因或蛋白表达促进剂、ALDH1酶活增强剂和COPZ1的基因或蛋白的表达促进剂中的至少一种。
本发明的第五方面，提供定量检测视黄酸代谢通路中的物质的试剂在制备诊断或辅助诊断先天性巨结肠的产品中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述视黄酸代谢通路中的物质包括视黄酸代谢通路中的基因、酶、代谢物和受体中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述视黄酸代谢通路中的物质为ALDH1基因或蛋白、COPZ1基因或蛋白、视黄酸、视黄醇和视黄醛中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述定量检测视黄酸代谢通路中的物质的试剂为定量检测ALDH1基因表达水平或蛋白表达水平或蛋白活性、COPZ1基因表达水平或蛋白表达水平或蛋白活性、视黄酸和视黄醛中的至少一种的试剂。
在本发明的一些实施方式中，所述产品包括试剂盒、诊断试剂、检测试剂、基因芯片或蛋白质芯片。
在本发明的一些实施方式中，所述产品包括高效液相检测法、质谱检测法、柱层析检测法、薄层色谱法、含或不含荧光标记物的聚合酶链式反应、环介导等温扩增反应、核苷酸或氨基酸序列测序法、变性梯度凝胶电泳、核酸分型芯片检测、原位杂交、高分辨率溶解曲线分析、单链构象异构多态分析或探针扩增阻滞突变系统分析检测视黄酸代谢通路中的物质表达水平的试剂。
在本发明的一些实施方式中，所述产品的受试样本包括来自待测对象的血液、体液、尿液、组织和细胞样品中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述待测对象为成人或儿童。
在本发明的一些优选实施方式中，所述待测对象为儿童。
本发明的第六方面，提供一种用于检测或辅助检测先天性巨结肠的产品，所述产品中包含定量检测黄酸代谢通路中的物质。
在本发明的一些实施方式中，所述视黄酸代谢通路中的物质包括视黄酸代谢通路中的基因、酶、代谢物和受体中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述视黄酸代谢通路中的物质为ALDH1基因或蛋白、COPZ1基因或蛋白、视黄酸、视黄醇和视黄醛中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述定量检测视黄酸代谢通路中的物质的试剂为定量检测ALDH1基因表达水平或蛋白表达水平或蛋白活性、COPZ1基因表达水平或蛋白表达水平或蛋白活性、视黄酸和视黄醛中的至少一种的试剂。
在本发明的一些实施方式中，所述产品包括试剂盒、诊断试剂、检测试剂、基因芯片或蛋白质芯片。
在本发明的一些实施方式中，所述产品包括高效液相检测法、质谱检测法、柱层析检测法、薄层色谱法、含或不含荧光标记物的聚合酶链式反应、环介导等温扩增反应、核苷酸或氨基酸序列测序法、变性梯度凝胶电泳、核酸分型芯片检测、原位杂交、高分辨率溶解曲线分析、单链构象异构多态分析或探针扩增阻滞突变系统分析检测视黄酸代谢通路中的物质表达水平的试剂。
在本发明的一些实施方式中，所述产品的受试样本包括来自待测对象的血液、体液、尿液、组织和细胞样品中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述待测对象为成人或儿童。
在本发明的一些优选实施方式中，所述待测对象为儿童。
本发明中的先天性巨结肠疾病包括：短段型、常见型、长段型和全结肠型。
本发明中，先天性巨结肠疾病的患者或受试者都没有年龄和性别的限制。
本发明的治疗巨结肠疾病的药物的使用对象还可以是其他哺乳动物，例如猴子、牛、马、猪、小鼠、大鼠、仓鼠、兔子、猫、狗、羊和山羊等。
本发明的治疗也包括预防，比如由于一些与疾病相关的因素而预计具有发病的高风险但还没有形成疾病的患者，或已经形成疾病但还没有自觉症状的患者，给予本发明的药物，或对于治疗疾病之后害怕疾病复发的患者，给予本发明的药物。
本发明的有益效果是：
本发明系统阐释了先天性巨结肠的靶向视黄酸代谢通路的新的发病机制，为先天性巨结肠疾病的动物模型构建以及先天性巨结肠疾病的诊断、预防和/或治疗提供了新的思路。其中，本发明通过专病队列多组学数据，发现先天性巨结肠患者中视黄酸(RA)代谢通路异常；视黄醛脱氢酶ALDH1疾病段表达下调，并且具有显著差异，说明乙醛脱氢酶ALDH1及其调控对视黄酸通路代谢物具有诊断或辅助诊断先天性巨结肠的作用。
而且发现了通过喂食视黄酸合成酶ALDH1的抑制剂，例如NCT501，从而抑制视黄酸合成的方式，可以抑制小鼠肠道神经发育、诱导典型巨结肠表型，成功地构建了一种先天性巨结肠的患病动物模型，为更好的研究先天性巨结肠的发病、发展机制、以及预防和/或治疗药物的筛选，提供了简单、可行、重复性好的方案。还发现了，通过激活视黄酸代谢通路或补充视黄酸代谢通路中的物质的方式，例如补充视黄酸、视黄醛、视黄醇，则具有显著的治疗先天性巨结肠疾病的作用，可以很好地应用于先天性巨结肠疾病的治疗，填补了该疾病无药可治的空白。
附图说明
图1为蛋白组提示代谢和神经发育通路在HSCR疾病段显著异常。其中图1a为差异蛋白GO/KEGG富集分析；图1b为差异蛋白enrichmentmap富集分析。
图2为视黄酸代谢通路异常，且其合成酶ALDH1蛋白和基因表达水平显著差异。图2a为代谢和神经通路共富集的蛋白表达热图；图2b为蛋白组火山图；图2c为代谢和神经通路共富集的蛋白其p值排序；图2d为ALDH1蛋白表达定量情况。
图3为转录组学提示视黄酸代谢通路异常，且其催化酶ALDH1蛋白和基因表达水平显著差异。图3a为转录组差异基因组富集分析；图3b为转录组视黄酸代谢通路相关基因表达热图；图3c为ALDH1在HSCR疾病段和健康段转录水平上表达差异情况；图3d为基于RT-qPCR在疾病段和健康段转录水平上ALDH1表达差异情况。
图4为基于巨结肠转录组数据证实含有RARα转录调控元件差异表达基因显著富集，调控的基因主要富集于神经发育相关通路。其中图4a为巨结肠转录组差异表达基因启动子区域转录因子的富集分析；图4b为具有RARα调控元件的差异表达基因富集分析，提示差异基因显著富集于视黄酸代谢通路。
图5为单细胞转录组测序数据，提示ALDH1在巨结肠疾病段显著下调。图5a为ALDH1主要表达在胶质细胞；图5b表示神经胶质细胞可按照表达谱系分为五个亚群；图5c为组织中ALDH1免疫组化和免疫荧光染色图。
图6为在ENCC中敲低ALDH1提示细胞系分化能力异常且胞包内RA降低。其中图6a为ALDH1敲低ENCC细胞系构建：PBMC-ENCC-control：对照组，空载；PBMC-ENCC-KD：ALDH1敲低组；PBMC-ENCC：野生型；GFP代表病毒感染效率，GFP+92.1％代表有92.1％的细胞被病毒感染，带了GFP标签；图6b为ENCC细胞系ALDH1显著敲低，RT-qPCR结果；图6c为ENCC细胞系ALDH1显著敲低，WB结果；图6d为ENCC细胞系ALDH1显著敲低，IF结果；图6e为Transwell迁移实验。
图7为ALDH1调控RA与RARα结合，进而转录水平上调控神经发育相关基因表达导致肠神经发育异常。图7a为ALDH1催化RA生成激活RARα调控基因表达示意图；图7b为RARα在基因启动子区域有较强富集；图7c为RARα富集的基因参与神经系统发育；图7d为RARα富集的基因在HSCR疾病段和正常段的差异蛋白表达热图；图7e为COPZ1基因转录起始位点(TSS)附近富集RARα和H3K4me3的ChIP-seq信号峰；图7f为转录组数据显示在ALDH1敲低的ENCC细胞中，COPZ1的表达情况。
图8为细胞系中敲低RARα引起超级增强子谱图变化。图8a为RARα与表观遗传调控标记物及乙酰化转移酶p300在基因组上共富集热图；图8b为RARα与乙酰化转移酶p300具有非常强的共富集；图8c为RARα在p300结合的基因组上具有较强富集；图8d为野生型细胞鉴定595个超级增强子；图8e为RARα敲低细胞鉴定312个超级增强子；图8f为韦恩图。
图9为ALDH1抑制剂NCT501阻碍小鼠肠道神经系统发育的症状表现。图9a为抑制剂组和对照组处理小鼠；图9b为小鼠体重统计；图9c为小鼠腹围/体重比统计；图9d为胃区贲门至肛门总长度比较；图9e为小鼠肠道长度统计；图9f为膨大回肠末端肠壁明显变薄，薄如气球；图9g为抑制剂组回肠部位以前肠道较细，回肠后肠道增粗。
图10为ALDH1抑制剂NCT501阻碍小鼠肠道神经系统发育的病理切片分析。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例1解析ALDH1通过视黄酸代谢途径调控先天性巨结肠发生发展的表观遗传分子机制
实验方法：
1)疾病组织多组学数据收集
收集HSCR疾病队列的结肠组织标本，区分扩张段和狭窄段，分别提取DNA、RNA、蛋白，进行基因组学、转录组学和蛋白组学测序。并通过荧光定量RT-PCR和WB检测ALDH1及下游RA代谢通路指标的表达情况；石蜡组织切片和免疫组化或免疫荧光染色检测ALDH1及下游RA代谢通路指标的表达情况；通过比较HSCR不同节段、不同段型结肠组织中ALDH1及下游RA代谢通路指标的表达差异性，明确ALDH1等与临床表型的关联性。
2)多能干细胞分化到神经细胞中ALDH1的分子机制探讨
ALDH1敲减和细胞系的建立：以ALDH1的外显子区作为靶点设计shRNA序列，然后人工合成互补的oligosDNA，连接至慢病毒表达载体中，经序列测定正确后，构建成ALDH1敲减载体；将构建好的ALDH1敲减载体包装成病毒感染正常人来源的诱导多能干细胞hiPSCs，通过筛选得到ALDH1稳定敲减的hiPSCs细胞系。其中载体元件hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin，靶向序列：cgGGCTAAGAAGTATATCCTT，shRNA序列见表1。
表1 ALDH1敲减载体元件相关信息
将ALDH1敲减的hiSPCs向肠神经嵴干细胞进行诱导分化，通过流式分析和RT-PCR等检测神经嵴干细胞的诱导分化效率，分析ALDH1对神经嵴干细胞的生成的影响；对诱导来的神经嵴干细胞进行细胞增殖分析、细胞划痕和transwell实验等验证ALDH1对神经嵴干细胞增殖和迁移能力的影响；进一步将神经嵴干细胞向神经元诱导分化，通过流式分析、免疫荧光染色、RT-PCR等检测神经元相关标志物、神经胶质细胞标志物的表达比率、表达水平等，并与对照组比较，进一步确定ALDH1对神经嵴干细胞神经细胞分化的影响。
3)剖析RA-RARα调控下游基因是通过超级增强子实现
分别收集ALDH1敲减的ENCC细胞并交联，提取细胞核，应用超声将DNA打断为200-500bp大小片段，分别应用RARα抗体、H3K27Ac、H3K4me1、H3K4me3、H3K27me3进行染色质免疫共沉淀富集它们特异性结合的DNA复合物，并解交联，纯化DNA进行测序，鉴定它们特异性结合的序列，比较ALDH1前后富集序列是否发生变化；结合RNA-Seq数据发现的RARα靶基因，进行比较分析，进一步验证敲减ALDH1与RARα调控下游靶基因是否具有相关性。
根据H3K4me1 ChIP-seq信号鉴定增强子，并结合H3K27Ac信号强度，鉴定超级增强子，比较ALDH1、RARα敲减后，ENCC细胞特异的超级增强子是否发生变化；比较这些超级增强子调控的基因表达变化，并应用gene ontology和KEGG富集策略分析ENCC发育相关通路是否发生变化。
实验结果：
从前瞻性出生队列公共平台的基础上建立先天性巨结肠专病队列，收集各类生物样本(包括血液样本60例、结肠组织样本40例、细胞样本30例)生成多维组学数据，包括蛋白质组学数据(组织40例，血液60例)、基因组学数据(血液40例)、转录组学数据(组织46例)、单细胞转录组数据(组织12例)、染色质富集测序组学(ChIP-seq，细胞样本20例)、染色质三维互作组学(细胞样本，10例)，建立不同患病个体的精准化医疗的参考基线，以期进一步解析疾病的发病机制。
其中，基于蛋白组学数据发现，巨结肠患儿疾病段差异表达蛋白主要集中在神经发育、应激、细胞定位免疫及代谢等通路(图1)，图1a表示，差异蛋白GO/KEGG富集分析，提示差异蛋白显著富集于代谢、髓鞘(神经相关)、细胞黏附及迁移等相关通路，其中代谢及神经发育通路在疾病段显著富集(p<0.05)；图1b表示，差异蛋白enrichmentmap富集分析，进一步提示差异蛋白显著富集于代谢、神经发育相关通路，其中，代谢及神经发育相关通路在疾病段显著富集(p<0.05)。以上结果表明，先天性巨结肠的通路异常中，代谢相关通路异常仅次于神经发育异常，提示肠道营养本身与疾病的发病机制密切相关。
同时，图2a的代谢和神经通路共富集的蛋白表达热图，提示了ALDH1在疾病段显著下调(p<0.05)；图2b的蛋白组火山图，提示了ALDH1在疾病段显著下调(p<0.05)；图2c的代谢和神经通路共富集的蛋白其p值排序，提示ALDH1排名很靠前显著下调(p<0.05)；图2d的ALDH1蛋白表达定量情况，提示了ALDH1在疾病段显著下调(p<0.05)。所以以上图2的结果显示，蛋白组表达谱热图和火山图数据均显示视黄酸代谢通路合成酶ALDH1蛋白和基因表达水平显著差异。并且，通过检测组织视黄酸代谢通路代谢物含量，也证实视黄酸代谢通路在巨结肠疾病中显著异常(p<0.05)。
蛋白组学样本收集及实验处理方法：收集手术切除的结肠组织标本，区分狭窄段和扩张段，各约200mg，迅速剔除肠系膜等非目的结缔组织，剪切成小块，用PBS冲洗干净后，装入小管中，液氮快速冷冻15s，然后转入-80℃低温冰箱中保存备用；待样本收齐一定数量后，利用RIPA提取蛋白质，并测量蛋白浓度，然后利用(液相色谱-质谱联用)LC-MS方法进行蛋白组学检测。
组织代谢物检测方法：收集ALDH1敲低和对照组细胞，用PBS冲洗3遍，弃上清，液氮快速冷冻15s，然后转入-80℃低温冰箱中保存备用；待样本收齐一定数量后，提取组织代谢物，利用LC-MS方法进行靶向代谢物检测分析RA代谢通路各个环节的产物如视黄醇、视黄醛、视黄酸等的变化情况，并对RA代谢通路产物进行定量分析。为了进一步探索ALDH1经由RA代谢通路在巨结肠发病相关的调控机制，基于转录组差异表达基因的启动子区域做转录因子的富集分析。共收集病人组织46例，对疾病段和健康对照段，分别提取RNA，进行RNA-Seq分析。结果见图3，其为基于巨结肠转录组数据证实含有RARα转录调控元件差异表达基因显著富集，调控的基因主要富集于神经发育相关通路。其中图3a为巨结肠转录组差异表达基因启动子区域转录因子的富集分析；图3b为具有RARα调控元件的差异表达基因富集分析；图3c为转录组学数据中ALDH1的基因表达量，提示ALDH1在疾病段显著下调(p<0.05)；图3d为实时荧光定量PCR实验检测的ALDH1的基因表达量，提示ALDH1在疾病段显著下调(p<0.05)。其中，巨结肠转录组数据证实差异表达基因显著富集于视黄酸通路(图3a-图3c)，实时定量荧光PCR实验进一步证实该结果对可靠性(图3d)。
以下，结合转录组学数据代谢相关通路富集分析，同样提示视黄酸(RA)代谢通路异常最为显著。
其中，转录组学样本收集及实验处理方法如下：收集手术切除的结肠组织标本，区分狭窄段和扩张段，各约200mg，迅速剔除肠系膜等非目的结缔组织，剪切成小块，用PBS冲洗干净后，装入小管中，液氮快速冷冻15s，然后转入-80℃低温冰箱中保存备用；待样本收齐一定数量后，用trizol试剂提取组学RNA，并进行RNA文库构建，利用imunima测序平台进行数据采集。
结果包括：图4显示基于巨结肠转录组数据证实含有RARα转录调控元件差异表达基因显著富集，调控的基因主要富集于神经发育相关通路。其中，图4a为转录组差异基因组富集分析，根据差异基因对MOTIF分析，得到差异基因富集的DNA区域，并预测其富集的转录因子，结果发现RARα显著富集，视黄酸代谢通路在疾病段显著下调(p<0.05)。进一步分析启动子区域有该RARα调控元件的基因，并对这些基因做GO的富集分析，以推测RARα下游基因的功能。图4b为具有RARα调控元件的差异表达基因富集分析，显示转录组视黄酸代谢通路相关基因表达热图，结果显示在富集的前10个通路中，与神经发育相关的有7个，提示ALDH1通过RARα调控肠神经的发育，与巨结肠发病密切相关，视黄酸代谢通路相关基因在疾病段显著下调(p<0.05)，提示差异基因显著富集于视黄酸代谢通路。
为了进一步解析ALDH1及其调控的RA代谢通路与神经发育、疾病状态的分子机制，收集6例病人疾病结肠组织，剥离粘膜层后，暴露肌间层，剪碎组织后用酶消化的方法制成单细胞悬液，然后用10X单细胞测序分析技术分析对其中的胶质细胞进行分群。
图5为单细胞转录组测序数据，提示ALDH1在巨结肠疾病段显著下调。其中，图5a的单细胞测序结果为ALDH1在主要表达在在肠神经胶质细胞(EGC)，其中正常段(HSK)表差较高，疾病段(HSX)几乎未见表达，与蛋白组和转录组数据一致。发明人进一步基于单细胞测序中神经胶质细胞进行分群，证实存在巨结肠患儿疾病段特有的神经胶质细胞亚群，图5b为神经胶质细胞可按照表达谱系分为五个亚群，与正常肠道的神经胶质细胞特征有异，ALDH1未见表达。图5c为组织中ALDH1免疫组化和免疫荧光染色图，提示ALDH1在疾病段显著下调(p<0.05)，进一步说明前述结果的可靠性。上述结果提示ALDH1低表达与巨结肠患儿疾病段中神经胶质细胞早期发育异常密切相关。
为进一步证实ALDH1及其调控的视黄酸合成代谢通路的功能，在ENCC中敲低ALDH1提示细胞系分化能力异常且胞内RA降低。Transwell迁移实验证实ALDH1敲低后ENCC的迁移能力显著显著降低(图6，p<0.05)，其中，图6a为ALDH1敲低ENCC细胞系构建：PBMC-ENCC-control：对照组，空载；PBMC-ENCC-KD：ALDH1敲低组；PBMC-ENCC：野生型。GFP代表病毒感染效率，GFP+92.1％代表有92.1％的细胞被病毒感染，带了GFP标签；图6b为ENCC细胞系ALDH1显著敲低，RT-qPCR结果，提示ALDH1在敲低细胞中表达确实下调；图6c为ENCC细胞系ALDH1显著敲低，WB结果；图6d为ENCC细胞系ALDH1显著敲低，IF结果；图6e为Transwell迁移实验，ALDH1敲低细胞，迁移能力显著下调(p<0.05)。
代谢物检测方法：收集ALDH1敲低和对照组细胞，用PBS冲洗3遍，弃上清，液氮快速冷冻15s，然后转入-80℃低温冰箱中保存备用；待样本收齐一定数量后，提取细胞代谢物，利用LC-MS方法进行靶向代谢物检测分析RA代谢通路各个环节的产物如视黄醇、视黄醛、视黄酸等的变化情况，并对RA代谢通路产物进行定量分析。
进一步进行其他实验，获得图7的结果，该实验结果表明，ALDH1在HSCR疾病段和正常段表达显著差异，表明ALDH1与HSCR具有密切关系，ALDH1可能调控肠道神经系统发育；ALDH1调控RA与RARα结合，进而转录水平上调控神经发育相关基因表达导致肠神经发育异常。图7a为ALDH1催化RA生成激活RARα调控基因表达示意图，其表明，由于ALDH1催化产生的RA能转运到细胞核内，与RARα结合激活下游调控元件，转录水平上调控下游基因表达；进一步探究RARα调控的基因是否与神经发育相关，证实ALDH1对肠道神经系统的调控作用，结合已发表数据申请人发现RARα调控元件在基因启动子区域有较高的富集，结果见图7b，其为RARα在基因启动子区域有较强富集；并且针对上述基因进行Gene ontology富集分析，发现这些基因主要参与神经节细胞轴突调控、突触囊泡循环、神经嵴细胞迁移、细胞黏附等，结果见图7c，其为RARα富集的基因参与神经系统发育；由于HSCR是肠道神经系统功能障碍引起的疾病，提示RARα参与调控的基因与HSCR的疾病表型和致病机理是一致的，进一步提示ALDH1经由RARα与HSCR具有密切关系，且RARα调控的部分基因，其蛋白表达水平在HSCR狭窄段有显著差异，结果见图7d，其为RARα富集的基因在HSCR疾病段和正常段的差异蛋白表达热图；随后，以COPZ1基因为例，其转录起始位点(TSS)附近富集RARα和H3K4me3的ChIP-seq信号峰，表明RARα结合在COPZ1基因启动子区域图，结果见7e，其为COPZ1基因转录起始位点(TSS)附近富集RARα和H3K4me3的ChIP-seq信号峰；图7f为转录组数据显示在ALDH1敲低的ENCC细胞中，COPZ1的表达情况。也即图7e-图7f表明转录组数据显示在ALDH1敲低的ENCC细胞中，COPZ1显著下调，提示了ALDH1表达降低导致RARα功能机制异常，不能正常调控下游基因的表达。
此外，图8为细胞系中敲低RARα引起超级增强子谱图变化。其中，图8a为RARα与表观遗传调控标记物及乙酰化转移酶p300在基因组上共富集热图；图8b为RARα与乙酰化转移酶p300具有非常强的共富集；图8c为RARα在p300结合的基因组上具有较强富集；此处说明了，通过比较RARα与表观遗传调控标记物在基因组上的共富集情况，发现RARα除了与典型启动子和增强子表观调控因子一致，与H3K4me1和H3K27Ac这类超级增强子的标记物富集情况也一致。表明RARα除了富集于增强子区域调控基因转录活动，还能参与调控超级增强子的形成，通过超级增强子调控远端基因转录促进基因表达。并且，p300与RARα在基因组上有非常强的共富集，其富集趋势具有很强的一致性(图8a-图8c)。另一方面，图8d为野生型细胞鉴定595个超级增强子；图8e为RARα敲低细胞鉴定312个超级增强子；图8f为韦恩图，以上图说明：p300是组蛋白乙酰化转移酶，催化组蛋白H3K27发生乙酰化修饰，提示RARα参与超级增强子的调控。为了进一步证实RARα参与超级增强子的调控，发明人等鉴定RARα敲低细胞中的超级增强子，发现原有超级增强子数量显著减少、新增了特有超级增强子(图8d-图8f)。对差异的超级增强子调控的基因进行GO分析，发现这些基因主要调控胶质细胞和肌肉细胞增殖，提示RARα的调控存在细胞或者组织特异性，与前期单细胞数据结果ALDH1集中在胶质细胞中高表达，与RARα表达具有相关性一致。上述数据提示ALDH1催化视黄醛脱氢成为RA，RA与RARα形成复合物DNA结合，进而介导调控神经发育的超级增强子形成，影响下游基因的表达，从而决定ENCC分化命运。
综上，ALDH1通过调节视黄酸代谢通路，调控视黄酸受体RARa与染色质结合，调控超级增强子形成，从而调控巨结肠疾病发生发展，为先天性巨结肠疾病机理提供了新的分子机制。并且，视黄酸和ALDH1作为先天性巨结肠诊断标志物的应用，具有特异性和敏感性，对巨结肠早期诊断具有重要诊断价值。
实施例2应用视黄酸合成抑制剂NCT501诱导先天性巨结肠小鼠模型
视黄酸合成抑制剂NCT501-诱导先天性巨结肠小鼠模型：
方案I：在小鼠孕3-18天，给孕鼠饲喂或灌胃给予溶解在2％DMSO，10％乙醇，88％玉米油的NCT501，每天1次，每次给药量以NCT501算为5-30mg/kg，持续时间≥5天(优选喂养至出生)，得到具有先天性巨结肠缺陷的模型小鼠。
方案II：在小鼠孕3-18天，给孕鼠饲喂或灌胃给予溶解或混悬在水中的NCT501，每天1次，每次5-30mg/kg，饲喂或灌胃孕鼠直至小鼠出生后的1周-16周(其中1-3周新生小鼠通过母乳喂养仍然能够摄入NCT501，3-16周小鼠通过饮水方式摄入药物)，得到具有先天性巨结肠缺陷的模型小鼠。
采用的孕鼠为C57BL/6J小鼠(每组10只)，购自广州中医药大学。实验前给小鼠常规食物和水。在所有研究中均采用了体重和孕龄匹配的小鼠。动物研究得到广州医科大学动物保护与利用委员会的批准，并根据机构指南进行。
本实施例构建了一种先天性巨结肠缺陷的模型小鼠，包括如下步骤：将5mgNCT501药物混溶于200ml水中配制混悬液，在母鼠孕期9天开始给小鼠喂食加有该NCT501的水，给药量为5mg/kg，持续喂食到母鼠生产3周后，得到先天性巨结肠缺陷的模型小鼠，将模型小鼠处死，收集小鼠的结肠组织，通过对结肠组织进行切片和免疫组化/免疫荧光染色以及RT-PCR、WB等检测神经元相关标记物MAP2、PGP9.5、HUC、peripherin及胶质细胞标记物GFAP、S100B、MBP等的表达情况，并与对照组(饲喂水)进行比较，明确ALDH1抑制剂对乳鼠肠神经发育的影响。结果见图9，图9为ALDH1抑制剂NCT501阻碍小鼠肠道神经系统发育的症状表现。图9a为抑制剂组和对照组处理小鼠；图9b为小鼠体重统计；图9c为小鼠腹围/体重比统计；图9d为胃区贲门至肛门总长度比较；图9e为小鼠肠道长度统计；图9f为膨大回肠末端肠壁明显变薄，薄如气球；图9g为抑制剂组回肠部位以前肠道较细，回肠后肠道增粗。结果发现，与对照组小鼠相比，采用了抑制剂处理的小鼠，小鼠体重显著降低；小鼠腹围/体重比显著增高；胃区贲门至肛门总长度变短；并且，抑制剂组膨大回肠末端肠壁明显变薄，薄如气球，回肠部位以前肠道较细，回肠后肠道增粗。综上，抑制剂显著降低了体重和结肠长度(图9)。
免疫荧光统计结果显示，用NCT501处理的孕鼠，其子代小鼠的神经元标记物PGP9.5在结肠远端有显著下调(参见图10)，图10为ALDH1抑制剂NCT501阻碍小鼠肠道神经系统发育的病理切片分析，抑制剂处理组，小鼠肠道神经元显著减少(p<0.05)。
综上，在小鼠孕8-10天，给小鼠喂食视黄酸合成酶ALDH1的抑制剂NCT501，小鼠出生后，其子代表现出患有巨结肠的表型，具体体现在：1)结肠近端明显扩张膨大，结肠远端明显狭窄；2)结肠远端神经元数目显著低于结肠近段神经元数目，其中出生后1周的小鼠已有所表现，出生后3周的小鼠巨结肠表型已非常明显。
实施例3视黄酸或其他代谢物在预防和治疗先天性巨结肠疾病
为了证实视黄酸具有预防和治疗先天性巨结肠疾病的作用，发明人在传统巨结肠模型小鼠(Sox10基因突变鼠)以及实施例2造模成功的小鼠中，喂食视黄酸(10-500μg/kg)，按照小鼠肠道神经系统发育的过程，分为早(<E8.5天)、中(E8.5-11.5天)、晚(>E11.5天)三期，在巨结肠模型小鼠不同孕期添加视黄酸或其他代谢物(视黄醛、视黄醇)，待小鼠出生后，检测小鼠出生后的生长发育情况(体重、胸腹围比率、生存率、结肠造影等)；收集小鼠的结肠组织，通过测量结肠的长度、切片染色等，比较RA及其代谢物补充治疗对巨结肠模型小鼠巨结肠的发生率、肠道神经节细胞缺失肠道长度等方面有无差异，确定视黄酸补充对巨结肠基因小鼠具有预防和治疗作用。然后对肠道进行取材，将结肠在4％多聚甲醛(PFA)中固定24小时并包埋在石蜡中。准备切片(3μm)并在染色前脱蜡。之后进行神经元标记物PGP9.5的染色。
其中，传统的巨结肠模型小鼠的构建方法如下：
鼠源Sox10基因有4个转录本，选择鼠源Sox10-203(ENSMUST00000230532.1)转录本进行制作，在鼠源Sox10-203的exon3制作c.32A>T定点突变，对应的第11位氨基酸由E突变为V，exon4制作c.579G后插入G碱基，导致第193位氨基酸后移码突变。鼠源Sox10-203转录本包含5个exons，翻译起始位点ATG位于exon3，翻译终止位点TAG位于exon5，编码466aa。采用CRISPR/Cas9技术对Sox10基因进行修饰。过程包括：体外转录sgRNA，构建donor载体，将Cas9、sgRNA及donor显微注射到C57BL/6JGpt小鼠的受精卵中进行同源重组，获得F0代小鼠。经PCR&测序验证阳性的F0代小鼠与C57BL/6JGpt小鼠交配获得可稳定遗传的阳性F1代小鼠模型。
实验结果发现，与对照组相比，喂食视黄酸组、视黄醛组、视黄醇组，其肠道表型均显著改善，肠道神经元显著增多(p＜0.05)。
上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州市妇女儿童医疗中心
<120> 视黄酸代谢通路在先天性巨结肠疾病中的应用
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cgggctaaga agtatatcct t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aaggatatac ttcttagccc g 21
<210> 3
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aattcaaaaa 10

Claims (15)

1.视黄酸代谢通路抑制剂在制备先天性巨结肠模型中的应用；所述视黄酸代谢通路抑制剂为NCT-501和/或NCT-501 hydrochloride。
2.一种先天性巨结肠模型的构建方法，其特征在于，通过添加视黄酸代谢通路抑制剂来构建所述先天性巨结肠模型；所述视黄酸代谢通路抑制剂为NCT-501和/或NCT-501hydrochloride；所述构建方法为（I）或（II）：
（I）在小鼠孕3-18天，对孕鼠给药NCT501，每天1次，给药量为5-30mg/kg，持续时间≥5天，得到先天性巨结肠缺陷的模型小鼠；所述药物使用脂溶性溶剂配制；
（II）在小鼠孕3-18天，对孕鼠给药NCT501，每天1次，给药量为5-30mg/kg，直至小鼠出生后的3周-16周，得到先天性巨结肠缺陷的模型小鼠；所述药物用水配制。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法（I）中在小鼠孕8-10天对孕鼠给药，给药至小鼠出生，得到出生后具有先天性巨结肠缺陷的模型小鼠。
4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法（II）中在小鼠孕8-10天对孕鼠给药，直至出生后的3-4周，得到先天性巨结肠缺陷的模型小鼠。
5.权利要求2～4任一项中所述的先天性巨结肠模型的构建方法制备的先天性巨结肠模型在研究先天性巨结肠发生和/或发展的分子机制、筛选预防和/或治疗先天性巨结肠的药物中的应用。
6.视黄酸代谢通路的激活剂在制备预防和/或治疗先天性巨结肠产品中的应用，所述视黄酸代谢通路的激活剂选自视黄酸或其可药用盐。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述产品为药物。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为适用于成人的剂型或儿童的剂型。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述适用于儿童的剂型为颗粒剂、糖浆剂、咀嚼片、分散片、混悬剂、泡腾片、滴剂、肠溶剂、灌肠剂、口崩片、溶液剂、冲剂或栓剂。
10.定量检测视黄酸代谢通路中的物质的试剂在制备诊断或辅助诊断先天性巨结肠的产品中的应用，所述定量检测视黄酸代谢通路中的物质的试剂为定量检测ALDH1基因表达水平或蛋白表达水平或蛋白活性或视黄酸中的至少一种的试剂。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂盒、诊断试剂、检测试剂、基因芯片或蛋白质芯片。
12.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述产品包括高效液相检测法、质谱检测法、柱层析检测法、薄层色谱法、含或不含荧光标记物的聚合酶链式反应、环介导等温扩增反应、核苷酸或氨基酸序列测序法、变性梯度凝胶电泳、核酸分型芯片检测、原位杂交、高分辨率溶解曲线分析、单链构象异构多态分析或探针扩增阻滞突变系统分析检测视黄酸代谢通路中的物质表达水平的试剂。
13.根据权利要求10所述应用，其特征在于，所述产品的受试样本包括来自待测对象的血液、体液、尿液、组织和细胞样品中的至少一种。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述待测对象为成人或儿童。
15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述待测对象为儿童。
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