CN115428767B - 高极长链饱和脂肪酸动物模型及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物体建模技术领域，具体涉及高极长链饱和脂肪酸动物模型及其构建方法。本发明动物模型，由模型组和对照组组合而成，其中以饲喂模型高脂饲料为模型组，以饲喂对照高脂饲料为对照组，模型高脂饲料与对照高脂饲料主要在极长链饱和脂肪酸含量上存在明显的差异，其他类型脂肪酸含量处于同等水平，从而构建形成只有极长链饱和脂肪酸增加的单因素动物模型，能够应用于极长链饱和脂肪酸对动物生理机能影响作用机制的研究，开辟了研究极长链饱和脂肪酸作用的新途径。
Description
技术领域
本发明属于生物体建模技术领域，具体涉及高极长链饱和脂肪酸动物模型及其构建方法。
背景技术
极长链饱和脂肪酸是指碳链长度超过二十碳的脂肪酸。研究显示，过氧化物酶体相关缺陷病、多发性硬化症等疾病患者体内存在极长链饱和脂肪酸(C22:0、 C24:0、C26:0)的积累。因此关于极长链饱和脂肪酸与神经系统功能关系的研究逐渐增多。目前的研究集中在体外细胞水平，主要是研究了C22:0、C24:0、C26:0对SH-SY5Y 或SK-N-BE等细胞的影响。而动物模型在探索疾病的发病机制、评价诊断方法、筛选防治药物等领域具有重要作用。但是由于市面上的极长链饱和脂肪酸试剂昂贵，在动物水平上应用成本极高，研究者很难实现从整体水平上通过饮食添加极长链饱和脂肪酸来研究其对机体的作用。
同时，有大量的研究显示动物组织中脂肪酸来源主要为饲粮中脂肪酸的沉积和脂肪酸的相互转化，但是饲粮中不仅包括极长链不饱和脂肪酸，还包括其他脂肪酸种类，采用饲粮饲喂的方式很难构建极长链饱和脂肪酸增高的单因素动物模型，那么如何优化模型的构建方案，通过饲喂特定饲料的方式，低成本高效的构建极长链饱和脂肪酸增高的单因素动物模型，推动极长链饱和脂肪酸在动物及人体内的生理功能的研究，是目前亟待解决的技术问题。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的之一在于提供高极长链饱和脂肪酸动物模型，以饲喂模型高脂饲料为模型组，饲喂对照高脂饲料为对照组，模型高脂饲料与对照高脂饲料主要在极长链饱和脂肪酸含量上存在明显的差异，构建形成只有极长链饱和脂肪酸增加的单因素动物模型。
本发明的目的之二在于提供高极长链饱和脂肪酸动物模型的构建方法。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种高极长链饱和脂肪酸动物模型，包括模型组和对照组，其中模型组由模型高脂饲料饲喂构建而成；对照组为对照高脂饲料饲喂构建而成；模型高脂饲料中极长链饱和脂肪酸含量为对照高脂饲料的至少8倍，模型高脂饲料与对照高脂饲料除极长链饱和脂肪酸之外的其他类型脂肪酸含量处于同等水平。
可选的，所述模型高脂饲料由模型用油与基础饲料混合制成，其中模型用油由花生油与亚麻籽油按照(110～125)：1的质量比混合制成。
可选的，所述对照高脂饲料由对照用油与基础饲料混合制成，其中对照用油由橄榄油与葡萄籽油按照(1～1.5)：1的质量比混合制成。
可选的，模型高脂饲料与对照高脂饲料中的油与基础饲料的配比相同。
可选的，模型高脂饲料与对照高脂饲料中油与基础饲料的质量配比为(1～3)：(7～9)。
可选的，所述基础饲料为不含有花生油或花生粕的实验动物生长繁殖饲料或维持饲料
可选的，所述动物模型为大鼠模型；进一步优选为3月龄雄性SD大鼠。
可选的，饲喂时间为12周。
上述高极长链饱和脂肪酸动物模型的构建方法，包括按照分组饲喂动物，饲喂温度保持23℃±2℃，相对湿度保持在50％～65％，昼夜明暗交替时间为12h/12h。
可选的，还包括动物处理与样本制备：完成饲喂后，禁食不禁水12h，使用腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，分离血清，低温保存备用；
处死大鼠，取出脑组织，快速分离脑皮质、海马，将其放于液氮中迅速冷冻，低温保存备用。
本发明有益效果：
本发明提供的高极长链饱和脂肪酸动物模型，由模型组和对照组组合而成，其中以饲喂模型高脂饲料为模型组，以饲喂对照高脂饲料为对照组，模型高脂饲料与非高脂饲主要在极长链饱和脂肪酸含量上存在明显的差异，其他类型脂肪酸含量处于同等水平，从而构建形成只有极长链饱和脂肪酸增加的单因素动物模型。
进一步，本发明利用花生油含有较高的极长链饱和脂肪酸的特点，通过花生油与亚麻籽油按一定方式进行配比，与基础饲料混合制成模型组饲喂用模型高脂饲料；通过橄榄油与葡萄籽油按一定方式进行配比，与基础饲料混合制成对照组饲喂用对照高脂饲料；实现模型高脂饲料与对照高脂饲料主要在极长链饱和脂肪酸含量上存在明显的差异，其他类型脂肪酸含量处于同等水平。
在本发明的一些实施中，通过实验验证，模型组与对照组相比，脑皮质中极长链饱和脂肪酸的含量明显增加，增加幅度大于30％，并且除了极长链饱和脂肪酸外，未见其他脂肪酸的明显变化，表明本发明构建的大鼠模型能够特异性的应用于极长链饱和脂肪酸对动物生理机能影响作用机制的研究，开辟了研究极长链饱和脂肪酸作用的新途径。
而且，本发明模型构建过程中所消耗的材料主要为常用植物油、普通饲料，成本较低，容易实现。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此；
下述试验所用的花生油、亚麻籽油、橄榄油和葡萄籽油均购自新乡当地超市，其中橄榄油为欧丽薇兰产品，葡萄籽油为晟麦产品，亚麻籽油为鲁花产品，花生油为鲁花产品。
下述试验所用基础饲料为大鼠维持饲料，由新乡医学院实验动物中心提供。
为了验证本发明构建方法能够获得脑皮质中极长链饱和脂肪酸的含量明显增加，且其他脂肪酸无明显变化的动物模型，应用于极长链饱和脂肪酸对动物生理机能影响作用机制的研究，开辟研究极长链饱和脂肪酸作用的新途径，设计下述对照验证试验：
1、配置饲喂饲料：
配置模型用油：取花生油与亚麻籽油按照125：1的质量比混合；
配置对照用油：取橄榄油与葡萄籽油按照1.5：1的质量比混合；
模型用油与对照用油中的脂肪酸含量对比如下表1所示：
表1
上述表1显示，对照用油(橄榄油:葡萄籽油＝1.5：1)共分离出11种脂肪酸，模型用油(花生油:亚麻籽油＝125:1)中共分离出12种脂肪酸。模型用油的极长链饱和脂肪酸含量(ΣVLCSFA)是模型用油的16倍左右。除几种极长链脂肪酸(碳链超过20个碳原子)、ΣVLCSFA和总饱和脂肪酸含量(ΣSFA)外，对照用油和模型用油的单不饱和脂肪酸(ΣMUFA)、多不饱和脂肪酸(ΣPUFA)含量处于同一水平。
配置模型高脂饲料和对照高脂饲料：
模型高脂饲料I：基础饲料与模型用油按照8：2质量比混合；
模型高脂饲料II：基础饲料与模型用油按照7：3质量比混合；
对照高脂饲料I：基础饲料与对照用油按照8：2质量比混合；
对照高脂饲料II：基础饲料与对照用油按照7：3质量比混合；
上述模型高脂饲料和对照高脂饲料由新乡医学院实验动物中心定期加工制备而成；
2、实验动物分组：
60只3月龄雄性SD大鼠购自郑州市惠济区华兴实验动物养殖场(动物许可证编号：SCXK(豫)20190002)。按照体重随机分为5组：空白对照组(BLK)、低剂量对照组 (L-CON)、低剂量模型组(L-MOD)、高剂量对照组(H-CON)、高剂量模型组(H-MOD)；
其中BLK组：基础饲料；
L-CON组：对照高脂饲料I；
L-MOD组：模型高脂饲料I；
H-CON组：对照高脂饲料II；
H-MOD组：模型高脂饲料II；
3、饲喂：
各组大鼠适应性饲喂1周后，按照分组分别给予不同的饲料进行饲喂，饲喂期间，所有大鼠自由摄食饮水，每周记录大鼠体重，温度保持在23℃±2℃，相对湿度保持在 50％～65％，昼夜明暗交替时间12h/12h；
4、模型处理与标本制备：
饲喂12周后，提前禁食不禁水12h，使用戊巴比妥钠(30mg/kg)进行腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，分离血清于–80℃保存备用；处死大鼠，取出脑组织(快速分离脑皮质、海马)，将其放于液氮中迅速冷冻，之后于–80℃保存备用；
5、气相色谱法测定大鼠脑皮质脂肪酸组成
样本制备：称取50mg额叶皮质，按重量︰体积(1:40)加入甲醇-二氯甲烷溶液(体积比3:1，含0.5g/L BHT抗氧化剂)，于组织细胞破碎仪中进行组织破碎匀浆，采用乙酰氯甲酯化法对匀浆液中的脂肪酸进行甲酯化；
检测与定量：气相色谱仪(7890A)和毛细管色谱柱(DB23)均为安捷伦公司，脂肪酸甲酯混标购自美国NU-CHEK公司，采用峰面积归一化法对脂肪酸进行定量，结果如下表2所示：
表2
说明：与L-CON组比，#P<0.05；与H-CON组比，&&P<0.01；与BLK组比，*P<0.05,**P<0.01；
上述表2所示数据显示，与L-CON组相比，L-MOD组C22:0含量增多(P<0.05)，其他脂肪酸的变化无统计学意义(P>0.05)；与H-CON组相比，H-MOD组C20:0、C22:0、C26:0、∑VLCSFA含量均增多(均为P<0.01)，其他脂肪酸的变化无统计学意义；
具体的，在20％高脂饲料条件下，模型组大鼠脑皮质C22:0含量较对照组增加了31.7％；在30％高脂饲料条件下，与对照组相比，模型组大鼠脑皮质C20:0含量增加了44.5％、C22:0含量增加了59.4％、C26:0含量增加了42.7％。而且，除了极长链饱和脂肪酸外，未见其他脂肪酸的明显变化。表明模型组动物大脑皮质极长链饱和脂肪酸较对照组显著增加，而其他类型脂肪酸含量未见明显变化，即极长链饱和脂肪酸增加的单因素动物模型制备成功。
在本发明的其他实施例中，按照上述同样的方法验证，模型用油为花生油与亚麻籽油按照(110～125)：1的质量比混合制成，对照用油由橄榄油与葡萄籽油按照(1～1.5)：1的质量比混合制成，使模型高脂饲料中极长链饱和脂肪酸含量为对照高脂饲料的至少 8倍，均能够成功构建极长链饱和脂肪酸增加的单因素动物模型。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (7)
1.一种高极长链饱和脂肪酸动物模型的构建方法，其特征在于，包括模型组和对照组，其中模型组由模型高脂饲料饲喂构建而成；对照组为对照高脂饲料饲喂构建而成；饲喂时间为12周；
模型高脂饲料中极长链饱和脂肪酸含量为对照高脂饲料的至少8倍，模型高脂饲料与对照高脂饲料除极长链饱和脂肪酸之外的其他类型脂肪酸含量处于同等水平；
所述模型高脂饲料由模型用油与基础饲料混合制成，其中模型用油由花生油与亚麻籽油按照（110～125）：1的质量比混合制成；
所述对照高脂饲料由对照用油与基础饲料混合制成，其中对照用油由橄榄油与葡萄籽油按照（1～1 .5）：1的质量比混合制成；
所述动物模型为大鼠模型。
2.如权利要求1所述的高极长链饱和脂肪酸动物模型的构建方法，其特征在于，模型高脂饲料与对照高脂饲料中的油与基础饲料的配比相同。
3.如权利要求2所述的高极长链饱和脂肪酸动物模型的构建方法，其特征在于，模型高脂饲料与对照高脂饲料中油与基础饲料的质量配比为（1 ~ 3）：（7 ~ 9）。
4.如权利要求1 ~3任一项所述的高极长链饱和脂肪酸动物模型的构建方法，其特征在于，所述基础饲料为不含有花生油或花生粕的实验动物生长繁殖饲料或维持饲料。
5.如权利要求1 ~ 3任一项所述的高极长链饱和脂肪酸动物模型的构建方法，其特征在于，所述大鼠为3月龄雄性SD大鼠。
6.如权利要求1~3任一项所述的高极长链饱和脂肪酸动物模型的构建方法，其特征在于，包括按照分组饲喂动物，温度保持23℃±2℃，相对湿度保持在50% ~ 65%，昼夜明暗交替时间为12h/ 12h。
7.如权利要求1~3任一项所述的高极长链饱和脂肪酸动物模型的构建方法，其特征在于，还包括动物处理与样本制备：完成饲喂后，禁食不禁水12h，使用腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，分离血清，低温保存备用；处死大鼠，取出脑组织，快速分离脑皮质、海马，将其放于液氮中迅速冷冻，低温保存备用。
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