CN115414378A - 一种基于黄芩多糖的免疫增强剂在中华绒螯蟹养殖中的应用 - Google Patents
一种基于黄芩多糖的免疫增强剂在中华绒螯蟹养殖中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了以黄芩多糖作为免疫增强剂的饵料制备工艺，及其在中华绒螯蟹养殖中的应用。本发明制备的黄芩多糖可显著提高中华绒螯蟹的固有免疫力，包括显著抑制中华绒螯蟹致病菌嗜水气单胞菌增殖，提高中华绒螯蟹抵御嗜水气单胞菌侵染的存活率；显著提高中华绒螯蟹血淋巴细胞总数，增强血淋巴细胞的吞噬活性，抑制血淋巴细胞凋亡；显著提高中华绒螯蟹血淋巴血清中溶菌酶、过氧化物酶等免疫效应分子的表达量，抑制炎症细胞因子的产生。本发明所使用的黄芩多糖来源于黄芩苷提取过程中产生的有机废水，废水中黄芩多糖含量约5.20％，因此，本发明具有成本低、无毒副作用、抗菌效果和免疫增强效果显著的特点，提高了黄芩利用率，降低了环境污染。
Description
技术领域
本发明涉及源于黄芩苷提取废液中回收的黄芩多糖，及其作为免疫增强剂在中华绒螯蟹饵料中的应用。
背景技术
中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)，又称毛蟹、河蟹、大闸蟹或清水蟹，属于节肢动物门(Arthropod)、甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、弓蟹科(Varunidae)、绒螯蟹属(Eriocheir)，是我国重要的名特优淡水经济养殖品种。目前，中华绒螯蟹在全国各地均有养殖(西藏自治区除外)，其中江苏、湖北、安徽、辽宁、江西和山东6省的产量约占全国总产量的93％左右。根据《中国渔业统计年鉴》报道，2018年我国中华绒螯蟹总产量高达75万吨之多。然而，随着养殖规模不断扩大，中华绒螯蟹各种疾病频发，导致河蟹养殖业遭受巨大损失，严重制约了河蟹养殖产业的可持续发展。
迄今为止，抗生素和化学类消毒剂依然是防治河蟹病害的主要防控措施，但是，这种防控方法既污染水体环境、破坏水生生物多样性，又会导致耐药菌产生。因此，整个水产养殖行业，急需寻找一种环境友好、防治效果显著、毒副作用小、增强河蟹机体免疫力的防治技术。
中药多糖是一种广谱、高效的免疫调节剂，是水产养殖领域应用最广泛、研究最深入的免疫增强剂。然而，在中华绒螯蟹养殖业中，关于中药多糖免疫增强剂的产品，仍然尚未见到相关产品上市。本发明将为河蟹免疫增强剂产品的开发提供技术支持，促进河蟹免疫增强剂产品的开发与推广。
发明内容
本发明的目的一：是黄芩苷提取过程中废液的综合利用，延长黄芩苷提取工艺的产品线，降低黄芩苷提取废液中有机物的含量；同时，确定快速回收并干燥废液中回收得到的黄芩多糖；
本发明的目的二：提供一种基于黄芩多糖作为免疫增强剂的饵料制备方法，明确该饵料在中华绒螯蟹养殖业中应用。
本发明的目的三：明确黄芩多糖对中华绒螯蟹的免疫增强机制，包括抗菌活性及其对固有免疫的调节作用。
本发明采用以下技术方案：
(1)废液处理：黄芩苷提取废液是强酸性溶液，黄芩多糖完整的保留在废液中，为了防止废液对后续多糖提取设备的腐蚀，首先调pH值至弱酸性或中性；
(2)浓缩：黄芩提取过程中，多次滤液合并后，产生的废液约为黄芩干重的30倍以上，根据黄芩多糖的含量，需要将弱酸性或中性的废液进行浓缩，水浴加热回流浓缩；
(3)提取：采用传统的乙醇沉淀法，加入3-4倍体积的食用酒精，得到黄芩多糖沉淀；
(4)压滤：弃掉上清液，采用压滤方法将黄芩多糖压成块状固体；
(5)快速烘干：使用切片机，将上述块状黄芩多糖切成薄片，放入烘箱中，得到干燥的黄芩多糖；
(6)配方设计：以鱼粉、田螺肉粉、花生饼粉、米粉淀粉等作为基础营养配方，黄芩多糖作为免疫增强剂，制得水中稳定性好、免疫增强效果显著的中华绒螯蟹饵料。
上述步骤(1)中的pH值为6.0～7.0之间；
上述步骤(2)中，浓缩温度为50～70℃，浓缩真空度为0.4Mpa～0.8Mpa，浓缩液的体积约占浓缩前总体积的10％～30％；
上述步骤(3)中，食用酒精度大于90％(v/v)，酒精和黄芩多糖的混合液中的酒精度为70％～80％(v/v)，沉淀时间为3-8小时，沉淀温度4～10℃；
上述步骤(4)中，，块状固体黄芩多糖中含水量介于15％～35％之间；
上述步骤(5)中，黄芩多糖薄片厚度约0.5～2mm，烘箱温度设置40～60℃，干燥时间为0.5～3h；
上述步骤(6)中，河蟹饵料中黄芩多糖含量约占1.0％～3.0％，饵料在水中的稳定性大于2小时。
黄芩多糖河蟹饵料包衣小丸的制备
基丸的制备
黄芩多糖河蟹饵料组成：白鱼粉38％、田螺肉粉15％、花生饼粉10％、豆饼粉 5％、甜玉米粉4％、骨粉3％,青鱼粉6％、农虾肉粉17％、黄芪多糖2％。按比例将上述物质倒入粉碎机中粉碎，取出后放入搅拌机中搅拌30分钟混匀，加纯化水继续搅拌制备成“轻握成团，触之即散”的湿物料，置挤出机内，调节挤出转速200r·min-1,经挤出机筛板(孔径1.5mm)挤出,条状物料置滚圆机内,滚圆转速400r·min-1、滚圆时间4 min,使颗粒完全滚圆。取出微丸烘干,经热处理后筛分出12-30目间小丸备用,收率为 94.3％。
基丸的包衣
向乙基纤维素水分散体(25％)中加入5％(w/v)的滑石粉，让后将等体积的纯化水搅拌均匀，用高速分散匀质机匀化3min，过100目筛即得包衣液，包衣过程中持续搅拌，包衣增重10％。称取1000g基丸，30℃预热微丸3min，置于流化床包衣机内，采用底喷式，喷液速度为1.0～1.5mL·min-1，入风频率为30～40Hz，流化床包衣机内的温度始终维持 25～30℃。在操作过程中保持小丸不黏结，包衣完成后将此小丸丸与0.2％(w)的微粉硅胶混匀，50℃烘箱干燥，使用水分测定仪测定微丸水分直至≤1％时，收取12-30目间包衣小丸。
黄芩多糖释放度测定
中国药典2020年版释放度测定法第二法测定(0931溶出度与释放度测定法)，取黄芩多糖河蟹饵料包衣小丸(约相当于黄芪多糖1.0g)，分别以磷酸钠缓冲液(pH8.0)、磷酸盐缓冲液(pH6.8)、醋酸盐缓冲液(pH4.0)1000ml为释放介质，转速为每分钟75转，依法操作，2h取溶液5ml，滤过，取续滤液于490nm波长处测定吸收度A1；另取黄芩多糖河蟹饵料包衣小丸(约相当于黄芪多糖0.1g)置于研钵中研细，加水100ml超声处理10min，滤过，取滤液与490nm波长处测定吸收度A2。按下式计算黄芪多糖2h释放度：
结果标明，三种释放介质中释放2h，黄芩多糖河蟹饵料包衣小丸完整，无裂解现象， 2h黄芪多糖释放度均低于5％。
本发明进行了一系列免疫攻毒实验研究。研究结果表明，黄芩多糖可显著抑制嗜水气单胞菌增殖；嗜水气单胞菌侵染中华绒螯蟹后，黄芩多糖可提高中华绒螯蟹的成活率；在细胞免疫方面，黄芩多糖可显著提高中华绒螯蟹血淋巴细胞数量及其吞噬活性，抑制血淋巴细胞的凋亡；在体液免疫方面，黄芩多糖可激活中华绒螯蟹的TGF-β信号通路，抑制炎症细胞因子的表达，同时激活机体免疫细胞产生大量溶菌酶、过氧化物酶和抗菌肽等基因的表达。这说明，黄芩多糖在调节中华绒螯蟹免疫应答反应方面，是极佳的免疫增强剂。
本发明的有益效果：抗菌活性，可有效抑制嗜水气单胞菌的增殖；个体水平，提高中华绒螯蟹的存活率；固有免疫方面，可显著提高免疫效应分子的表达水平，抑制炎症细胞因子的表达，从而实现对中华绒螯蟹的免疫增强功能。本发明是中华绒螯蟹抵御嗜水气单胞菌等病原入侵的天然免疫增强剂，具有抗菌、抗病毒、无毒副作用、低污染、低成本、制备方法简单的特点，降低了黄芩苷提取过程中的污染，提高了黄芩苷提取产业的附加值，符合国家节能减排、碳中和碳达峰的要求。
附图说明
图1为本发明的黄芩多糖对中华绒螯蟹血淋巴细胞总数的影响图；
图2为本发明的黄芩多糖对中华绒螯蟹血淋巴细胞吞噬活性的影响图；
图3为本发明的黄芩多糖对中华绒螯蟹血淋巴细胞吞噬指数的影响图。
具体实施方式
下面将详细介绍本发明的具体实施方式。
实施例1
抑菌实验：嗜水气单胞菌(大连海洋大学宋林生课题组提供)，
用打孔器将滤纸制成直径为6mm的圆形纸片,经高温灭菌后,浸泡黄芩多糖水提液,待其干燥后将纸片平铺在均匀的涂布好细菌的平板上,对照用无菌蒸馏水浸泡纸片。标记后倒置于37℃恒温光照培养箱中培养，24h后观察记录抑菌圈的大小(表1)。
表1黄芩多糖对嗜水气单胞菌的抑菌圈
攻毒实验
将中华绒螯蟹分为Blank组、PBS组、嗜水气单胞菌处理组(Ah组)、黄芩多糖处理组(黄芩多糖浓度分别为0.5％、1.0％和2.0％，分别标记为HQ0.5、HQ1.0和HQ2.0)，每组河蟹50只。其中，HQ0.5、HQ1.0和HQ2.0组提前24小时注射不同浓度黄芩多糖，24 小时后，Ah组、HQ0.5组、HQ1.0组和HQ2.0组，分别注射嗜水气单胞菌处理，注射后，分别在0h、3h、6h、12h、24h和48h随机从各实验组取6只河蟹进行采样。
死亡率实验
根据攻毒实验的要求，分别在0h、3h、6h、12h、24h和48h测定各实验组中华绒螯蟹的死亡率(表2)。嗜水气单胞菌侵染48小时后，Blank组和PBS组，河蟹死亡率为 0，Ah组河蟹死亡率为76％，HQ0.5、HQ1.0和HQ2.0组死亡率，随着黄芩多糖浓度的增加，死亡率分别为32％、26％和18％，这表明嗜水气单胞菌侵染后，黄芩多糖可显著提高中华绒螯蟹的存活率。
表2嗜水气单胞菌侵染后，不同浓度黄芩多糖对中华绒螯蟹死亡率的影响
注：每个实验组50只中华绒螯蟹。
黄芩多糖对中华绒螯蟹体液免疫的调节
根据攻毒实验的要求，使用南京建成的溶菌酶、酚氧化物酶、TNF-α检测试剂盒，分析中华绒螯蟹血淋巴中免疫指标的变化。
实验结果表明，嗜水气单胞菌攻毒后0～48h内，Blank组及PBS组中，中华绒螯蟹血淋巴中溶菌酶活力、酚氧化物酶活力及TNF-α浓度均无显著性变化。
溶菌酶：Ah组河蟹，嗜水气单胞菌处理6h、12h和24h后，溶菌酶活力分别提高56.72％、52.18％和42.53％；HQ0.5组河蟹，嗜水气单胞菌处理6h和12h后，溶菌酶活力分别提高66.34％和58.77％；HQ1.0组河蟹，嗜水气单胞菌处理6h和12h后，溶菌酶活力分别提高76.54％和83.48％；HQ2.0组河蟹，嗜水气单胞菌处理6h和12h后，溶菌酶活力分别提高89.87％和95.46％(表3)。
表3嗜水气单胞菌侵染后，黄芩多糖对中华绒螯蟹血淋巴溶菌酶活性的影响
酚氧化物酶：Ah组河蟹，嗜水气单胞菌处理3h、6h和12h后，酚氧化物酶活力分别提高60.99％、52.99％和43.46％；HQ0.5组河蟹，溶菌酶活力分别提高84.12％、69.38％和52.86％；HQ1.0组河蟹，溶菌酶活力分别提高91.19％、56.67％和51.46％；HQ2.0组河蟹，溶菌酶活力分别提高106.99％、81.32％和57.31％；(表4)。
表4嗜水气单胞菌侵染后，黄芩多糖对中华绒螯蟹血淋巴酚氧化物酶活性的影响
TNF-α浓度测定：嗜水气单胞菌处理后，HQ0.5组、HQ01.0组和HQ2.0组河蟹血淋巴中炎症细胞因子TNF-α的浓度显著低于Ah组河蟹，这说明嗜水气单胞菌可引发河蟹炎症反应，而黄芩多糖可显著抑制嗜水气单胞菌引发的河蟹的炎症反应(表5)。
表5嗜水气单胞菌侵染后，黄芩多糖对中华绒螯蟹血淋巴TNF-α浓度的变化
黄芩多糖对中华绒螯蟹细胞免疫的调节
根据攻毒实验的要求，按血淋巴与抗凝剂1：1的比例从中华绒螯蟹鳌足基部学腔中抽取500ml血淋巴，迅速放入1.5ml离心管中，4℃，1000rpm离心3min，移除上清液，加入100ul 4％的多聚甲醛，轻轻吹打使细胞分散开，室温下固定15min。
将固定好的血淋巴细胞滴到血球计数板的计数区间内，盖上盖玻片，于显微镜下统计各类血细胞的总数量，每个样品2重复5次(图1)。实验结果表明，嗜水气单胞菌侵染显著降低中华绒螯蟹血淋巴细胞总数，而黄芩多糖可显著提高被嗜水气单胞菌侵染的河蟹中的血淋巴细胞数量，抑制嗜水气单胞菌引起的血淋巴细胞凋亡，从而提供河蟹的细胞免疫能力。
将对数培养期的嗜水气单胞菌经热灭活处理(85℃，30min)后离心，用含有1 mg/mL异硫氰酸荧光素(FITC)的NaHCO3(0.1mol/L，pH 9.0)重悬，25℃孵育3h， PBS清洗细菌以除掉多余的FITC。将标记的细菌重新悬浮于PBS中，调节浓度至1×108 CFU/mL，-20℃保存备用。将血淋巴细胞与FITC标记的嗜水气单胞菌以1:100比例混合，室温孵育1h。取200μL此混合物于载玻片上，置于湿盒中沉降30min后，用灭菌生理盐水洗2-3次，再加入台盼蓝淬灭细胞外的FITC，10min后用灭菌生理盐水洗 2-3次，室温干燥后加甘油封片，荧光显微镜下观察血淋巴细胞的吞噬活性，每一个载玻片上大约计数100个血细胞。吞噬活性(phagocytic activity)包括吞噬率(phagocytic rate,PR)和吞噬指数(phagocyticindex,PL)，其中PR＝有吞噬作用的细胞数目/细胞总数×100％；PL＝吞噬细胞中细菌的总数/有吞噬作用的细胞总数。
实验结果表明，嗜水气单胞菌侵染后，中华绒螯蟹血淋巴细胞的吞噬活性在6～24小时显著提高，在这一时间段内，黄芩多糖可进一步提高血淋巴细胞的吞噬活性，黄芩多糖处理组内，中华绒螯蟹血淋巴细胞的吞噬率显著高于同一时间点Ah组中华绒螯蟹血淋巴细胞(图2)。
血淋巴细胞的吞噬指标结果表明，嗜水气单胞菌侵染后，中华绒螯蟹血淋巴细胞的吞噬指标在6～12小时显著提高，在这一时间段内，黄芩多糖可进一步提高血淋巴细胞的吞噬率，黄芩多糖处理组内，中华绒螯蟹血淋巴细胞的吞噬率显著高于同一时间点Ah组中华绒螯蟹血淋巴细胞(图3)。
Claims (8)
1.一种基于黄芩多糖的免疫增强剂在中华绒螯蟹养殖中的应用，其特征在于，包括黄芩多糖浓缩液制备：黄芩提取液，加盐酸沉淀后，过滤得到滤液(pH＝1.0～2.0)，调pH值至6.0～7.0；低温(温度：50℃～70℃)真空(真空度：0.4Mpa～0.8Mpa)浓缩，得到浓缩液。
2.根据权利要求1所述的基于黄芩多糖的免疫增强剂在中华绒螯蟹养殖中的应用，其特征在于：酒精沉淀黄芩多糖：向所述浓缩液加入食用酒精(酒精度大于90％(v/v))，直至酒精度达到约70％(v/v)，低温沉淀3-8小时，过滤得到黄芩多糖沉淀；将沉淀进行压滤，得到固形物，然后切片(切片厚度：0.5mm～2.0mm)，多糖切片置于40～60℃的烘箱0.5～3.0h，获得干燥的黄芩多糖。
3.根据权利要求1所述的基于黄芩多糖的免疫增强剂在中华绒螯蟹养殖中的应用，其特征在于：黄芩多糖浓缩液的体积为黄芩苷滤液体积的10％～30％；浓缩罐真空度根据浓缩温度随时调整。
4.根据权利要求2所述的基于黄芩多糖的免疫增强剂在中华绒螯蟹养殖中的应用，其特征在于：压滤后的黄芩多糖，密度和硬度均需满足切片要求，根据密度和硬度调整切片厚度；根据切片厚度，调整烘干机的温度和时间参数。
5.根据权利要求2所述的基于黄芩多糖的免疫增强剂在中华绒螯蟹养殖中的应用，其特征在于：黄芩多糖饵料制备：将干燥的黄芩多糖加入到河蟹基础饲料中，包括鱼粉、田螺肉粉、花生饼粉、米粉淀粉等，黄芩多糖含量百分比为1.0％～3.0％。
6.根据权利要求5所述的基于黄芩多糖的免疫增强剂在中华绒螯蟹养殖中的应用，其特征在于：黄芩多糖饵料稳定性：调整河蟹饵料中黄芩多糖及其它各组分含量比例，控制原料含水量10％～15％，粗纤维组分3.0～6.0％；饵料在水中的稳定性大于2h。
7.根据权利要求6所述的基于黄芩多糖的免疫增强剂在中华绒螯蟹养殖中的应用，其特征在于：将加工得到的河蟹饵料，饲喂河蟹，分析饵料中黄芩多糖含量对河蟹免疫增强作用效果，最终确定饵料中黄芩多糖的最佳比例为2.0％左右。
8.根据权利要求1-7所述的基于黄芩多糖的免疫增强剂在中华绒螯蟹养殖中的应用，其特征在于：源于黄芩苷提取废液中的黄芩多糖，可作为免疫增强剂添加到中华绒螯蟹饵料中，调节中华绒螯蟹免疫力。
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- 2022-06-15 CN CN202210677322.4A patent/CN115414378A/zh active Pending
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