CN115337409B - 白蛋白结合型近红外荧光探针-脂肪酸共轭物及其制备方法和应用 - Google Patents
白蛋白结合型近红外荧光探针-脂肪酸共轭物及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
白蛋白结合型近红外荧光探针‑脂肪酸共轭物及其制备方法和应用，属于药物制剂新辅料和新剂型领域，所述的白蛋白结合型近红外荧光探针‑脂肪酸共轭物具体是用含有氨基取代的脂肪酸取代花菁类染料共轭链中的氯原子，通过分子内电荷转移效应对其光学性质进行改造，使其具有更长的斯托克斯位移，能够增强体内成像的分辨率。其次，共轭物中的脂肪酸基团能够与血浆中的白蛋白通过非共价键相互作用，从而具有良好的淋巴归巢能力和肿瘤靶向性。这种脂肪酸修饰的近红外荧光探针克服了临床肿瘤和前哨淋巴结诊断中荧光染料不稳定以及成像分辨率低的缺陷，使其在体内可以实现良好的肿瘤和淋巴结定位成像功能。
Description
技术领域
本发明属于药物制剂新辅料和新剂型领域，具体涉及以内血浆源性白蛋白为载体，设计并合成在体内与血浆中白蛋白通过非共价键结合的近红外荧光探针-脂肪酸共轭物，以及其在肿瘤转移的前哨淋巴结和肿瘤诊断方面的应用。
背景技术
癌症严重威胁人类的生命安全和健康。手术切除仍是治疗癌症的主要方式，尤其针对实体瘤。据报道，有90％以上癌症相关的死亡是由于转移所致。前哨淋巴结作为肿瘤细胞向远端组织或器官转移的第一站。因此，精准的识别原发肿瘤和前哨淋巴结对于指导外科医生为临床患者制定治疗方案具有重要意义。目前，一些放射性示踪剂或者蓝色染料(亚甲蓝)常用于原发肿瘤或者前哨淋巴结的临床诊断。但是放射性元素对人体有害，蓝色染料会在组织中弥散导致前哨淋巴结不精准的诊断，限制了临床应用的普及。近红外荧光成像技术由于其非入侵性、良好的稳定性和组织干扰低等优点被广泛用于临床疾病的诊断，在疾病诊断领域具有一定的优势。
目前，近红外荧光染料吲哚菁绿(ICG)及其衍生物被广泛用于前哨淋巴结或肿瘤荧光成像。然而，ICG也存在体内成像分辨率低、光稳定性差、体内消除快等缺点，这降低了前哨淋巴结或肿瘤定位的精准性。理想的用于体内高分辨率成像的近红外荧光探针具备以下特点：(1)具有良好的光稳定性；(2)高荧光量子产率；(3)大的斯托克斯频移。因此，研发高分辨率荧光探针提高前哨淋巴结和肿瘤的精准诊断具有重要的意义。
白蛋白是血浆中最丰富的蛋白质，具有生物相容性好、免疫原性低、体内半衰期长(19天)、肿瘤靶向性和淋巴归巢等特点。目前，白蛋白在药物递送领域被广泛作为药物的递送载体。基于此，利用近红外荧光探针搭载体内的白蛋白将提高其荧光成像效率。
发明内容
针对现有前哨淋巴结和肿瘤诊断中成像方法存在的缺陷，本发明设计了生物安全性好、肿瘤靶向性高、淋巴归巢能力好、成像分辨率高的白蛋白结合型近红外荧光探针-脂肪酸共轭物，用于肿瘤转移的前哨淋巴结和原位肿瘤的精准定位。
本发明通过以下技术方案实现上述目的：
本发明提供三种白蛋白结合型近红外荧光探针-脂肪酸共轭物，所述的近红外荧光探针-脂肪酸共轭物为近红外荧光探针与氨基取代的脂肪酸通过取代反应得到；所述的近红外荧光探针为含有氯苯环的吲哚菁绿衍生物，选自新吲哚菁绿(IR820)、IR780及IR808；所述的近红外荧光探针-脂肪酸共轭物所选择的氨基取代的脂肪酸的结构为NH2-(CH2)n-COOH，其中，n＝2-23，优选为6-16。
进一步地，本发明优选新吲哚菁绿(IR820)分别与8-氨基辛酸、12-氨基月桂酸和16-氨基软脂酸通过取代反应相连得到的近红外荧光探针-脂肪酸共轭物。
本发明所述的新吲哚菁绿和氨基取代的脂肪酸通过取代所得的近红外荧光探针-脂肪酸共轭物中，选择新吲哚菁绿(IR820)作为模型荧光探针，并将其与8-氨基辛酸、12-氨基月桂酸和16-氨基软脂酸相连。其结构式分别为：
所述三种白蛋白结合型近红外荧光探针-脂肪酸共轭物的合成路线和制备方法如下：
IR820与8-氨基辛酸、12-氨基月桂酸和16-氨基软脂酸分别以1:1～1:5的摩尔比溶于溶剂中，搅拌5～10分钟使其完全溶解。然后向反应体系中加入三乙胺(TEA)并充入氮气，并将反应体系加热到70-90℃，避光搅拌1～6小时，观察到反应物的颜色由绿色逐渐变为蓝色。反应结束后，除去溶剂，纯化，得到产物IR-OA、IR-LA和IR-PA。
上述制备方法中，所述溶剂为无水DMF、乙酸乙酯(EA)、丙酮(CP)或是四氢呋喃。
本发明所述白蛋白结合型近红外荧光探针-脂肪酸共轭物在制备白蛋白结合型共轭物中的应用。
本发明所述白蛋白结合型近红外荧光探针-脂肪酸共轭物在制备肿瘤或肿瘤转移淋巴结诊断成像剂中的应用。
本发明所述白蛋白结合型近红外荧光探针-脂肪酸共轭物作为成像剂在注射给药或皮下局部给药中的应用。
本发明具有以下有益效果：
通过使用氨基取代的脂肪酸对IR820进行修饰，由于IR820的共轭链的吸电子基团氯原子被共电子基团仲胺取代，导致IR820的共轭结构缩短，紫外吸收峰发生蓝移，IR-OA、IR-LA和IR-PA的斯托克斯位移增大。尽管IR820的氯原子被取代，但是其荧光特性并未受到影响，仍具有近红外荧光成像的能力，因此可以将IR-OA、IR-LA和IR-PA作为荧光成像探针加以应用。由于IR820分子上修饰了脂肪酸基团，IR-OA、IR-LA和IR-PA能与白蛋白通过非共价键结合，因此具备了淋巴归巢和肿瘤靶向能力，并提高淋巴和肿瘤成像的分辨率和成像效率。本发明为开发安全、有效、稳定、便携的前哨淋巴结和原位肿瘤的临床诊断提供了新的策略和思路，满足了临床上对肿瘤转移的前哨淋巴结和原位肿瘤荧光成像剂的迫切需求。
附图说明
图1为本发明实施例1的近红外荧光探针-脂肪酸共轭物(IR-OA)的1H NMR核磁谱图。
图2为本发明实施例1的近红外荧光探针-脂肪酸共轭物(IR-OA)的高分辨质谱图。
图3为本发明实施例1的近红外荧光探针-脂肪酸共轭物(IR-LA)的1H NMR核磁谱图。
图4为本发明实施例1的近红外荧光探针-脂肪酸共轭物(IR-LA)的高分辨质谱图。
图5为本发明实施例1的近红外荧光探针-脂肪酸共轭物(IR-PA)的1H NMR核磁谱图。
图6为本发明实施例1的近红外荧光探针-脂肪酸共轭物(IR-PA)的高分辨质谱图。
图7为本发明实施例2的近红外荧光探针-脂肪酸共轭物(IR-OA、IR-LA和IR-PA)的白蛋白结合凝胶结果图。
图8为本发明实施例3的近红外荧光探针-脂肪酸共轭物IR-OA的白蛋白复合物(BSA-IR-OA)经过不同时长光照后的荧光发射光谱图。
图9为本发明实施例3的近红外荧光探针-脂肪酸共轭物IR-LA的白蛋白复合物(BSA-IR-LA)经过不同时长光照后的荧光发射光谱图。
图10为本发明实施例3的近红外荧光探针-脂肪酸共轭物IR-PA的白蛋白复合物(BSA-IR-PA)经过不同时长光照后的荧光发射谱图。
图11为本发明实施例4的近红外荧光探针-脂肪酸共轭物(IR-OA、IR-LA和IR-PA)以及白蛋白复合物(BSA-IR-OA、BSA-IR-LA和BSA-IR-PA)的紫外吸收光谱图。
图12为本发明实施例4的近红外荧光探针-脂肪酸共轭物(IR-OA、IR-LA和IR-PA)以及白蛋白复合物(BSA-IR-OA、BSA-IR-LA和BSA-IR-PA)的荧光发射光谱图。
图13为本发明实施例5的近红外荧光探针-脂肪酸共轭物(IR-OA、IR-LA和IR-PA)及IR820对4T1细胞、PC3细胞和L02的细胞毒性图。
图14为本发明实施例6的近红外荧光探针-脂肪酸共轭物(IR-OA、IR-LA和IR-PA)在4T1细胞中1h的摄取结果图。
图15为本发明实施例6的近红外荧光探针-脂肪酸共轭物(IR-OA、IR-LA和IR-PA)在4T1细胞中4h的摄取结果图。
图16为本发明实施例7的近红外荧光探针-脂肪酸共轭物(IR-OA、IR-LA和IR-PA)及IR820在肿瘤转移淋巴结的荧光成像图。
图17为本发明实施例8的近红外荧光探针-脂肪酸共轭物(IR-OA、IR-LA和IR-PA)及IR820在肿瘤的荧光成像图。
图18为本发明实施例9的近红外荧光探针-脂肪酸共轭物(IR-OA、IR-LA和IR-PA)在给予小鼠静脉注射后主要器官的H&E染色图，用以证明IR-OA、IR-LA和IR-PA对个体器官的长短期安全性。
图19为本发明实施例9的近红外荧光探针-脂肪酸共轭物(IR-OA、IR-LA和IR-PA)在给予小鼠足垫皮下注射后主要器官的H&E染色图，用以证明IR-OA、IR-LA和IR-PA对个体器官的长短期安全性。
图20为本发明实施例9的近红外荧光探针-脂肪酸共轭物(IR-OA、IR-LA和IR-PA)在给予小鼠静脉注射后的肝肾功能指标结果图，用以证明IR-OA、IR-LA和IR-PA对肝肾功能的长短期安全性。
图21为本发明实施例9的近红外荧光探针-脂肪酸共轭物(IR-OA、IR-LA和IR-PA)在给予小鼠足垫皮下注射后的肝肾功能指标结果图，用以证明IR-OA、IR-LA和IR-PA对肝肾功能的长短期安全性。
具体实施方式
通过以下具体实例，对本发明的上述内容作进一步的详细说明，但并不表示实施例对本发明的限制。
实施例1：白蛋白结合型近红外荧光探针-脂肪酸共轭物(IR-OA、IR-LA和IR-PA)的合成
将IR820(200mg，0.236mmol)和8-氨基辛酸(112.7mg，0.708mmol)或12-氨基十二烷酸(152.5mg，0.708mmol)或16-氨基十六烷酸(192.2mg，0.708mmol)溶解在无水DMF(6mL)中并搅拌5分钟。然后，向反应体系中加入三乙胺(TEA，134μL，0.946mmol)并充入氮气。在温度为85℃的条件下避光反应3小时。在反应过程中观察到溶液的颜色从绿色变为蓝色。并采用薄层色谱法(TLC)监测反应过程。反应结束后，减压旋蒸除去DMF。最后，以乙酸乙酯/甲醇(v/v＝10:1～3:1)为洗脱液梯度洗脱，通过硅胶柱层析纯化产物，得到蓝色固体IR-OA、IR-LA和IR-PA，产率分别为82％、79％和77％。
采用高分辨质谱(HRMS)和核磁共振氢谱确证实施例1中制得的IR-OA、IR-LA和IR-PA的结构。结果如图1-6所示。d-DMSO为核磁共振中所选择的溶剂，波普解析结果如下：
IR-OA：1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.15(d,J＝8.5Hz,2H),7.97(dd,J＝8.6,5.6Hz,4H),7.79–7.70(m,2H),7.57(dd,J＝16.1,8.4Hz,4H),7.39(t,J＝7.5Hz,2H),5.86(d,J＝13.0Hz,2H),4.08(d,J＝7.5Hz,4H),3.75(t,J＝6.8Hz,2H),2.55(dd,J＝14.7,8.1Hz,4H),2.20(t,J＝7.4Hz,2H),1.90(s,12H),1.77(ddd,J＝27.7,14.7,7.5Hz,12H),1.52(d,J＝7.1Hz,2H),1.41(q,J＝6.5,6.0Hz,2H),1.38–1.20(m,6H),0.89–0.84(m,2H).ESI-MS:m/z＝948.432[M-Na]-。
IR-LA：1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.14(d,J＝8.7Hz,2H),7.97(dd,J＝8.8,5.5Hz,4H),7.75(d,J＝12.9Hz,2H),7.59(d,J＝8.9Hz,2H),7.56(t,J＝7.7Hz,2H),7.39(t,J＝7.5Hz,2H),5.87(d,J＝12.7Hz,2H),4.10(s,4H),3.75(d,J＝7.0Hz,2H),2.56(t,J＝7.3Hz,8H),2.12(q,J＝7.3,6.8Hz,2H),1.91(s,12H),1.79(dq,J＝18.9,7.0Hz,10H),1.45(t,J＝7.1Hz,2H),1.42–1.38(m,2H),1.36–1.31(m,2H),1.29–1.22(m,8H),1.21(s,4H).ESI-MS:m/z＝1004.49384[M-Na]-。
IR-PA：1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.13(d,J＝8.3Hz,2H),7.97(t,J＝7.4Hz,4H),7.74(d,J＝13.1Hz,2H),7.65–7.52(m,4H),7.39(t,J＝7.6Hz,2H),5.86(d,J＝12.8Hz,2H),4.08(s,4H),3.75(s,2H),2.13(t,J＝7.7Hz,4H),2.56(s,2H),1.90(s,11H),1.78(t,J＝16.8Hz,14H),1.41(s,4H),1.22(s,12H),1.14(s,10H).ESI-MS:m/z＝1050.51120[M-Na]-。
实施例2：白蛋白结合型近红外荧光探针-脂肪酸共轭物与牛血清白蛋白(BSA)的结合实验
将BSA溶于pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中(PBS)，得到浓度为35μM的BSA溶液。将BSA溶液与IR-OA、IR-LA和IR-PA混合均匀后得到BSA-IR-OA、BSA-IR-LA和BSA-IR-PA溶液，并在37℃恒温摇床中孵育12小时。然后使用10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分析所有样品与BSA的结合情况。电泳结束后，将剥离的凝胶板用考马斯亮蓝染液染色，清洗后将其置于荧光成像仪中，并在激发波长660nm，发射波长790nm的波长下观察BSA-IR-OA、BSA-IR-LA和BSA-IR-PA的荧光。
结果如图7所示，在考马斯亮蓝染色结果中，含有白蛋白的组在63-75kDa范围内出现了蓝色条带；在荧光成像结果中，出现蛋白条带的相同位置只有BSA-IR-LA和BSA-IR-PA组出现了荧光条带，BSA-IR-OA组在白蛋白的位置没有出现荧光，这说明IR-LA和IR-PA与白蛋白的结合能力强于IR-OA。由于IR-OA、IR-LA和IR-PA是小分子化合物，在电泳中的移动速度较快而出现在凝胶板的最底端。
实施例3：白蛋白结合型近红外荧光探针-脂肪酸共轭物(IR-OA、IR-LA和IR-PA)在体外与白蛋白结合的光稳定性研究
光照是前哨淋巴结和肿瘤临床诊断必不可少的条件，因此考察荧光探针的光稳定性是非常必要的。将等摩尔量的BSA-IR-OA，BSA-IR-LA和BSA-IR-PA的复合物溶于相同体积的磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)中，在日光灯持续光照不同时间取样(0min、30min、1h、2h、3h、5h)，然后将样品置于黑色96孔板中，使用多功能酶标仪测其荧光发射光谱(激发波长660nm)。
BSA-IR-OA，BSA-IR-LA和BSA-IR-PA光稳定性的结果如图8，9和10所示，在连续光照3小时后，BSA-IR-LA和BSA-IR-PA的荧光强度几乎没有变化，而BSA-IR-OA的荧光强度下降了7％。此外，BSA-IR-OA、BSA-IR-LA、BSA-IR-PA在光照5小时后的荧光强度分别降低了36％、26％和10％，表明上述白蛋白偶联物均有不同程度的降解。其中，BSA-IR-PA具有最好的光稳定性。
实施例4：白蛋白结合型近红外荧光探针-脂肪酸共轭物(IR-OA、IR-LA和IR-PA)光学特性表征
制备了相同摩尔浓度的IR-OA、IR-LA、IR-PA以及BSA-IR-OA、BSA-IR-LA、BSA-IR-PA复合物，采用酶标仪测定样品的紫外吸收光谱。另外也测定上述样品的荧光发射光谱(激发波长为660nm)。
结果如图11所示，与BSA孵育后，观察到IR-LA和IR-PA的紫外吸收峰明显向长波移动(红移)。然而，与IR-OA相比，BSA-IR-OA的吸收峰几乎没有变化。上述结果表明，IR-LA和IR-PA能够通过强疏水作用力与BSA结合。如图12所示的荧光发射光谱中可以观察到IR-OA、IR-LA和IR-PA的荧光强度在与BSA孵育后显著增强，分别增加约3、36和149倍。
实施例5：白蛋白结合型近红外荧光探针-脂肪酸共轭物(IR-OA、IR-LA和IR-PA)的细胞毒性
小鼠乳腺癌细胞(4T1)、人前列腺癌细胞(PC3)和人正常肝细胞(L02)以2000个细胞/孔的密度埋入到无菌96孔板中，在37℃、5％CO2的培养箱中培养12小时。然后将培养液倒掉，加入不同浓度的IR-OA、IR-LA、IR-PA和IR820孵育细胞48小时。孵育结束后采用MTT法(吸收波长为570nm)测定三种细胞的细胞活力。
IR-OA、IR-LA、IR-PA和IR820对4T1细胞、PC3细胞和L02细胞的细胞毒性结果如图13所示，IR-OA、IR-LA和IR-PA孵育三种细胞48小时后的细胞活力接近100％，说明IR-OA、IR-LA和IR-PA在30.0625-1250nM的浓度范围内对三种细胞系是安全的。然而，IR820在625nM和1250nM的浓度下对三种细胞显示出显著的细胞毒性。这些结果表明IR-OA、IR-LA和IR-PA的安全性高于IR820。
实施例6：白蛋白结合型近红外荧光探针-脂肪酸共轭物(IR-OA、IR-LA和IR-PA)的细胞摄取
采用流式细胞仪测定4T1细胞对IR-OA、IR-LA和IR-PA的摄取情况。将4T1细胞以3×105细胞/孔的密度接种到12孔细胞培养板中孵育过夜。然后，使用相同摩尔浓度的IR-OA、IR-LA和IR-PA(5μM)孵育细胞1小时或4小时。孵育结束后，用冰冷的PBS冲洗细胞三次，用胰蛋白酶消化，离心并收集。最后，使用流式细胞仪测定细胞摄取。
摄取结果如图14和15所示，无论是在1小时或者是4小时，IR-OA、IR-LA和IR-PA在细胞中的荧光强度顺序均为IR-PA>IR-LA>IR-OA，这说明IR-PA具有最高的细胞摄取效率。
实施例7：白蛋白结合型近红外荧光探针-脂肪酸共轭物(IR-OA、IR-LA和IR-PA)在肿瘤转移前哨淋巴结的荧光成像
将4T1细胞以每20μL PBS中的5×105细胞的密度皮下接种于雌性Balb/c小鼠右后足垫建立肿瘤转移的前哨淋巴结动物模型。模型成功建立后，给予小鼠右后足垫皮下注射等量的IR-OA、IR-LA、IR-PA和IR820(2mg/kg，20μL)。在预先设定的时间点(5、15、30、45、60、80、100和120min)，使用小动物活体成像仪观察IR-OA、IR-LA、IR-PA和IR820在肿瘤转移的前哨淋巴结的荧光成像情况(激发波长为660nm，发射波长为790nm)。
结果如图16所示，IR-OA、IR-LA和IR-PA可通过淋巴引流在5min内到达前哨淋巴结，且在前哨淋巴结中的蓄积量随时间增加而增加。与IR820相比，IR-OA、IR-LA和IR-PA在体内与白蛋白结合后荧光增强，因此显示出更强的荧光信号和成像分辨率。此外，观察到IR820在皮下注射5-80min时在肝脏中显著分布，这可能是由于小分子在血液中快速扩散所致。值得注意的是，IR-PA表现出比IR-OA和IR-LA更高的荧光强度可能是由于其具有更高的光稳定性。以上结果表明IR-OA、IR-LA和IR-PA在体内与白蛋白结合后具有明显的淋巴靶向性。
实施例8：白蛋白结合型近红外荧光探针-脂肪酸共轭物(IR-OA、IR-LA和IR-PA)在肿瘤部位的荧光成像
将含有5×106 4T1细胞的100μL PBS皮下接种到雌性Balb/c小鼠右侧背部空白区域建立荷瘤小鼠模型。当肿瘤体积达到约300mm3时，将IR-OA、IR-LA、IR-PA和IR820通过尾静脉给药的方式注射到小鼠体内(剂量为2mg/kg)。然后在给药后不同时间点(1、2、4、8、12、24和48h)使用小动物活体成像仪监测IR-OA、IR-LA、IR-PA和IR820在肿瘤部位的荧光信号。
IR-OA、IR-LA、IR-PA和IR820在4T1荷瘤小鼠肿瘤部位的荧光成像如图17所示，与IR820给药组相比，IR-OA、IR-LA和IR-PA组在肿瘤部位的荧光信号更强。此外，IR-PA组具有比IR-OA、IR-LA和IR820更高的荧光强度和成像分辨率。以上结果表明，IR-OA、IR-LA和IR-PA能够搭载体内的白蛋白有效靶向到肿瘤。
实施例9：白蛋白结合型近红外荧光探针-脂肪酸共轭物(IR-OA、IR-LA和IR-PA)的体内安全性
为了考察IR-OA、IR-LA和IR-PA的短期和长期的体内安全性，随机将健康的雌性Balb/c小鼠分为6组(n＝3)。其中3组，皮下注射IR-OA、IR-LA和IR-PA(2mg/kg)到小鼠足垫，在给药后2小时或3周后处死小鼠，收集血清，并剖出小鼠的心、肝、脾、肺和肾，检测小鼠的肝肾功能指标和组织学分析。另外3组，尾静脉注射IR-OA、IR-LA和IR-PA(2mg/kg)到小鼠体内，在给药后2小时或3周后处死小鼠，收集血清，并剖出主要器官检测小鼠的肝肾功能指标和组织学分析。另外设置了2组对照组，分别小鼠足垫皮下注射或尾静脉注射生理盐水，在3周后处死小鼠，收集血浆和主要器官分别进行肝、肾功能检查和H&E染色分析。
通过H&E染色和肝肾功能指数评价IR-OA、IR-LA和IR-PA对健康Balb/c小鼠的急慢性毒性。结果如图18，19所示，在IR-OA、IR-LA和IR-PA静脉注射和足垫皮下注射后2小时和3周后，小鼠主要器官的组织切片没有明显的损伤。同理，毒理学检查结果如图20，21所示，IR-OA、IR-LA和IR-PA静脉和皮下给药组的肝肾功能指标均在正常值范围，与生理盐水组相比没有明显差异。以上实验结果表明IR-OA、IR-LA和IR-PA具有良好的体内生物安全性。
Claims (4)
1.一种白蛋白结合型近红外荧光探针-脂肪酸共轭物，其特征在于，其为IR820分别与12-氨基月桂酸和16-氨基软脂酸通过取代反应相连得到的近红外荧光探针-脂肪酸共轭物中的任一个，结构式分别为：
2.权利要求1所述白蛋白结合型近红外荧光探针-脂肪酸共轭物在制备白蛋白结合型共轭物中的应用。
3.权利要求1所述白蛋白结合型近红外荧光探针-脂肪酸共轭物在制备肿瘤或肿瘤转移淋巴结诊断成像剂中的应用。
4.权利要求1所述白蛋白结合型近红外荧光探针-脂肪酸共轭物在制备注射给药或皮下局部给药用成像剂中的应用。
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