CN115335518A - 用于核糖核酸提取的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及双水相系统中核糖核酸(RNA)的分离、浓缩和/或纯化。在一些实施例中，本发明提供用于从包括生物材料的流体混合物中分离、浓缩和/或纯化RNA的样品制备方法、组合物和试剂盒组分。

Description

用于核糖核酸提取的组合物和方法

技术领域

本发明涉及双水相系统中核糖核酸(RNA)的分离、浓缩和/或纯化。在一些实施例中，本发明提供用于从包括生物材料的流体混合物中分离、浓缩和/或纯化病毒RNA的样品制备方法、组合物和试剂盒组分。

背景技术

在病毒爆发或大流行期间，快速测试病毒是否存在的需求至关重要。当前用于检测RNA(如病毒RNA)的诊断测试需要具有足够浓缩量RNA的高质量样品，以便为下游应用提供良好的信噪比，如测试患者中病毒性疾病的存在。目前的方法只能处理少量的生物样品(导致测试样品具有非常少的病毒RNA)或需要使用多个纯化步骤(例如，基于柱的提取)，以分离足够的RNA用于测试。此外，这些方法价格昂贵，周转时间较慢，并且不易获得。

因此，需要更简单、更便宜并且可以快速准确地提供高质量RNA样品的新技术，如用于病毒RNA诊断测试。

发明内容

本文披露了用于分离、浓缩和/或纯化RNA(如病毒RNA)的新方法、组合物和试剂盒，其采用双水相系统(aqueous two-phase systems)(ATPS)而不需要复杂的设备。所述方法和组合物可以实现以下多项任务，包含裂解、去除污染物和/或浓缩靶分析物，如病毒RNA。

一些实施例提供了用于从包括病毒核糖核酸和污染物的流体生物混合物中分离并浓缩病毒核糖核酸的方法。污染物的实例包含，但不限于核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶、蛋白酶、和白蛋白。在某些实施例中，污染物包含，但不限于蛋白质、核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶、蛋白酶、白蛋白、裂解试剂、裂解盐、NaCl(氯化钠)、KCl(氯化钾)、(NH₄)₂SO₄(硫酸铵)、氯化铵、洗涤剂、两亲性分子、非离子洗涤剂、阴离子洗涤剂、阳离子洗涤剂、两性离子洗涤剂、Triton X-100、Nonidet P-40、脱氧胆酸钠、CHAPS、SDS、乙基三甲基溴化铵、金属离子、碳水化合物、甘油、金属螯合剂、EDTA、还原剂、Tris-2-羧乙基膦盐酸盐(Tris-2-carboxyethylphosphine hydrochloride)(TCEP)、碳、氰化物、一氧化碳、二硫苏糖醇(dithiothreitol)(DTT)、亚磷酸盐、次磷酸盐、亚磷酸、还原糖、抗坏血酸、甲酸、草酸、二异丁基氢化铝、肼、过氧化氢、碘化物、硫代硫酸盐、连二硫酸盐、二氧化硫、亚硫酸盐化合物、含有Sn2+离子的化合物、含有Fe2+离子的化合物、硼氢化钠、乙硼烷、锌汞齐、钠铅合金、钠汞齐、新生(原子)氢、氢化铝锂、巯基乙醇、离子盐、非离子盐或其任何组合。

可以使用的可能的聚合物包括，但不限于聚乙二醇(polyethylene glycol)(PEG)、疏水改性的聚乙二醇、聚(氧化烯)聚合物、聚(氧化烯)共聚物、疏水改性的聚(氧化烯)共聚物、聚乙烯基吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone)、聚乙烯醇、聚乙烯基己内酰胺、聚乙烯基甲基醚(polyvinyl methylether)、烷氧基化表面活性剂、烷氧基化淀粉、烷氧基化纤维素、烷基羟烷基纤维素、有机硅改性聚醚(silicone-modified polyethers)和聚N-异丙基丙烯酰胺或其任何组合。可以使用的可能的聚合物包括，但不限于Triton-X、Triton-114、Igepal CA-630和Nonidet P-40、阴离子表面活性剂(如羧酸盐、磺酸盐、石油磺酸盐、烷基苯磺酸盐、萘磺酸盐、烯烃磺酸盐、烷基硫酸盐、硫酸盐、硫酸化天然油脂、硫酸化酯、硫酸化烷醇酰胺、烷基酚)、乙氧基化和硫酸化非离子表面活性剂(如乙氧基化脂肪醇、聚氧乙烯表面活性剂、羧酸酯、聚乙二醇酯、脱水山梨醇酯、脂肪酸乙二醇酯、羧酸酰胺、单烷醇胺浓缩物、聚氧乙烯脂肪酸酰胺)、阳离子表面活性剂(如季铵盐、具有酰胺键的胺、聚氧乙烯烷基和脂环胺、n,n,n',n'四取代的乙二胺、2-烷基1-羟乙基2-咪唑啉)、和两性表面活性剂(如n-椰油3-氨基丙酸/钠盐、n-牛脂基3-亚氨基二丙酸盐、二钠盐、n-羧甲基n-二甲基n-9十八碳烯基氢氧化铵、n-椰油酰胺乙基n羟乙基甘氨酸和钠盐)。

合适的盐组分包括含阳离子如直链或支链三甲基铵、三乙基铵、三丙基铵、三丁基铵、四甲基铵、四乙基铵、四丙基铵和四丁基铵的无机盐；含有阴离子如磷酸根、硫酸根、硝酸根、氯离子和碳酸氢根的无机盐；亲液盐、离液盐、镁盐、锂盐、钠盐、钾盐、铯盐、锌盐、铝盐、溴化物盐、碘化物盐、氟化物盐、碳酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐、羧酸盐、硼酸盐、磷酸盐、NaCl、Na₂SO₄、柠檬酸钾、柠檬酸钠、乙酸钠、磷酸钠、磷酸钾、硫酸铵和乙酸铵。

在又另一个实施例中，披露了用于从包含病毒核糖核酸和污染物的流体混合物中分离并浓缩病毒核糖核酸的试剂盒。试剂盒可以包括组合物实施例中所述的组合物组分，但另外包括用于储存、包装和/或反应的注射器或移液管可触及的容器和可选地用于操控水溶液的设备。这样的容器和设备可以包括柱、试管、毛细管、塑料试管、falcon管、培养管、孔板、移液管和/或比色皿。

本发明的优点

在某些实施例中，披露的组合物和方法具有优于当前解决方案的几个优点。例如，当前的RNA纯化方法需要多个步骤并且依赖于基于固液相的相互作用，如基于柱或基于珠的提取方法。这些技术需要大量样品才能获得足够的RNA，以在分子测定中产生准确的结果。目前的方法不需要柱或珠。

此外，在某些实施例中，披露的组合物和方法能处理并提取大范围的流体混合物体积。它们可以采用多种不同类型的病毒转移介质(viral transfer media)(VTM)。此外，在某些实施例中，它们可以处理大量的VTM(例如，高达几毫升)，并且能有效地处理整个体积，从而提供更大量的干净、纯化的RNA样品用于测试。

此外，在某些实施例中，披露的组合物和方法能将RNA重悬于可变量的流体和多种溶液中。所述可变体积允许更高浓度的靶RNA，这可以改善下游分析。重悬溶液选择的灵活性也可以通过能为下游分析系统选择兼容的缓冲液来有助于下游分析。当前基于柱和珠的系统不能从中受益，因为它们的洗脱缓冲液具有不灵活的成分要求，并且它们具有更高的洗脱体积要求。

最后，在某些实施例中，披露的组合物和方法在从充满污染物的流体混合物中提取核糖核酸组分中出人意料地有效。令人惊讶的是，它们可以成功地分离核糖核酸组分，而无需使用另外的还原剂或载体核酸。

这些和其他特征和特性，以及相关组件的操作方法和功能及制造的经济性，在参考附图考虑以下详细描述和所附权利要求后将变得更加明显，所有这些构成本说明书的一部分，其中相同的参考数字表示各图中的对应部分。然而，应明确理解，附图仅用于说明和描述的目的，并不旨在作为对权利要求的限制的定义。如说明书和权利要求中所用，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”也包括复数指示物。

附图说明

图1是说明用于从流体混合物中分离并浓缩核糖核酸(如病毒RNA)的工作流程的示例实施例的示意图。

图2是说明用于从流体混合物中分离并浓缩核糖核酸(如病毒RNA)的工作流程的另一个示例实施例的示意图。

具体实施方式

除非另有说明，否则本文使用的术语(包括技术和科学术语)具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同含义并且省略可能混淆本发明要点的熟知功能和构造的详细描述。

如本文所用，“水性(aqueous)”是指溶剂/溶质系统的特征性质，其中溶剂化物质主要具有亲水特性。水性溶剂/溶质系统的实例包括那些以水或含水组合物为主要溶剂的系统。聚合物和/或表面活性剂组分(实施例中描述了其用途)是“水性的”，因为它们在与溶剂(如水)组合时形成水相。此外，如技术人员所理解的，在本文中，术语流体“混合物(mixture)”仅指本文定义的组分的组合。

如本文所用，双水相系统(ATPS)意指可以通过分配来实现分析物的分离或浓缩的液-液分离系统，其中两相、部分、区域、组分等与它们所暴露和可选地溶解的至少一种分析物以不同方式相互作用。当具有一定浓度的两种不混溶的相形成组分，如盐和聚合物，或两种不相容的聚合物(例如，PEG和葡聚糖)在水溶液中混合时，形成ATPS。ATPS方法相对便宜并且可扩展，因为它们采用两相分配将分析物(例如核酸)与污染物分离。

如本文所用，术语“分离(isolated)”是指将核酸从其原始环境中移出并因此从其原始环境改变。与源样品中存在的组分量相比，提供的分离的核酸通常具有更少的非核酸组分(例如，蛋白质、脂质)。包括分离的样品核酸的组合物可以是基本上分离的(例如，约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％不含非核酸组分)。

如本文所用，“浓缩(concentrated)”是指所讨论的分析物与悬浮分析物在其中的溶液的质量比高于所述分析物在其预浓缩溶液中的质量比。例如，它可以略高，或更优选地高至少两倍、十倍或一百倍。

如本文所用，“聚合物(polymer)”包括但不限于均聚物、共聚物、三元共聚物、无规共聚物和嵌段共聚物。嵌段共聚物包括但不限于嵌段、接枝、树枝状聚合物和星形聚合物。如本文所用，共聚物是指源自两种单体种类的聚合物；类似地，三元共聚物是指源自三种单体种类的聚合物。聚合物还包括各种形态，包括但不限于线性聚合物、支化聚合物、无规聚合物、交联聚合物和树枝状聚合物系统。例如，聚丙烯酰胺聚合物是指包括聚丙烯酰胺的任何聚合物，例如聚丙烯酰胺的均聚物、共聚物、三元共聚物、无规共聚物、嵌段共聚物或三元共聚物。聚丙烯酰胺可以是聚丙烯酰胺的线性聚合物、支化聚合物、无规聚合物、交联聚合物或树枝状聚合物。

本发明的实施例

一个方面提供了从包括核糖核酸组分和污染物的流体混合物中分离核糖核酸组分的方法，该方法包含：

a)将所述流体混合物添加到包括第一相溶液和第二相溶液的双水相系统(ATPS)中，使得所述核糖核酸分配到所述第一相溶液中并且所述污染物分配到所述第二相溶液中；以及

b)从所述第一相溶液中分离所述核糖核酸组分。

在一些实施例中，核糖核酸组分是核糖核酸或核糖核酸片段。在一些实施例中，核糖核酸片段低于250bp。

一些实施例进一步包括裂解过程的步骤，其中所述裂解过程包含以下步骤：

a)提供生物样品；

b)将所述生物样品与裂解试剂混合以形成样品混合物；

c)孵育所述样品混合物以得到包含核糖核酸组分和污染物的流体混合物。

在一些实施例中，裂解步骤在以上所述的分离步骤之前进行。在一些实施例中，在裂解步骤之前，从受试者(如患者)获得生物样品。

在一些实施例中，生物样品包括在进行本文所述的裂解过程时释放核糖核酸组分的生物材料。在一些实施例中，生物材料选自以下中的一种或多种：病毒、真核细胞、原核细胞、蛋白质外壳、囊泡、与蛋白质复合的RNA、三级RNA结构和未复合的RNA。在一些实施例中，生物材料是病毒。在其他实施例中，所述病毒是具有脂质双层的包膜病毒。在又其他的实施例中，病毒具有大于25千碱基的靶RNA序列。在一些实施例中，病毒具有在所述病毒的病毒包膜内的核衣壳中复合的靶病毒RNA。

在某些实施例中，病毒选自以下中的一种或多种：越病毒科(Yueviridae)、新城蚊子病毒科(Xinmoviridae)、武汉蜈蚣病毒科(Wupedeviridae)、植物杆状病毒科(Virgaviridae)、芜菁黄花叶病毒科(Tymoviridae)、塔螺病毒科(Turriviridae)、三层病毒科(Tristromaviridae)、整体病毒科(Totiviridae)、番茄斑萎病毒科(Tospoviridae)、番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)、番茄曲叶卫星病毒科(Tolecusatellitidae)、披膜病毒科(Togaviridae)、托巴套氏病毒科(Tobaniviridae)、复层噬菌体科(Tectiviridae)、阳光病毒科(Sunviridae)、嗜热圈形病毒科(Spiraviridae)、球脂状病毒科(Sphaerolipoviridae)、红火蚁病毒科(Solinviviridae)、南方菜豆花叶一品红病毒科(Solemoviridae)、小环状DNA病毒科(Smacoviridae)、长尾噬菌体科(Siphoviridae)、伴生豇豆病毒科(Secoviridae)、小节肢动物病毒科(Sarthroviridae)、古噬菌体科(Rudiviridae)、杆状网巢病毒科(Roniviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、逆转录病毒科(Retroviridae)、呼肠孤病毒科(Reoviridae)、四组分病毒科(Quadriviridae)、秦病毒科(Qinviridae)、伪病毒科(Pseudoviridae)、痘病毒科(Poxviridae)、马铃薯Y病毒科(Potyviridae)、马铃薯纺锤形块茎类病毒科(Pospiviroidae)、带球病毒科(Portogloboviridae)、多瘤病毒科(Polyomaviridae)、多去氧核糖核酸病毒科(Polydnaviridae)、多顺反子类小RNA病毒科(Polycipiviridae)、短尾噬菌体科(Podoviridae)、肺病毒科(Pneumoviridae)、嗜盐菌多形病毒科(Pleolipoviridae)、芽生噬菌体科(Plasmaviridae)、小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)、小双节病毒科(Picobirnaviridae)、藻类去氧核糖核酸病毒科(Phycodnaviridae)、白纤病毒科(Phenuiviridae)、幻影病毒科(Phasmaviridae)、复制酶置换四体病毒科(Permutotetraviridae)、泛布尼亚病毒科(Peribunyaviridae)、细小病毒科(Parvoviridae)、分体病毒科(Partitiviridae)、副黏液病毒科(Paramyxoviridae)、乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)、卵形病毒科(Ovaliviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、尼亚米病毒科(Nyamiviridae)、裸杆状病毒科(Nudiviridae)、野田村病毒科(Nodaviridae)、线极病毒科(Nimaviridae)、裸露RNA病毒科(Narnaviridae)、矮缩病毒科(Nanoviridae)、内罗病毒科(Nairoviridae)、多足类湖北病毒科(Mypoviridae)、肌尾噬菌体科(Myoviridae)、真菌单分子负链RNA病毒科(Mymonaviridae)、Mononiviridae、拟菌病毒科(Mimiviridae)、微小噬菌体科(Microviridae)、转座病毒科(Metaviridae)、中等嵌套病毒科(Mesoniviridae)、巨大双分RNA病毒科(Megabirnaviridae)、Medioniviridae、风疹病毒科(Matonaviridae)、马赛病毒科(Marseilleviridae)、海洋RNA病毒科(Marnaviridae)、软体动物疱疹病毒科(Malacoherpesviridae)、黄症病毒科(Luteoviridae)、李氏蜘蛛病毒科(Lispiviridae)、脂毛噬菌体科(Lipothrixviridae)、光滑病毒科(Leviviridae)、利什曼原虫布尼亚病毒科(Leishbuviridae)、大病毒依赖科(Lavidaviridae)、北岛病毒科(Kitaviridae)、虹彩病毒科(Iridoviridae)、丝状噬菌体科(Inoviridae)、传染性软腐病病毒科(Iflaviridae)、肥大唾腺炎病毒科(Hytrosaviridae)、低毒性病毒科(Hypoviridae)、疱疹病毒科(Herpesviridae)、代列尔噬菌体科(Herelleviridae)、戊型肝炎病毒科(Hepeviridae)、嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)、汉坦病毒科(Hantaviridae)、滴状病毒科(Guttaviridae)、球状病毒科(Globuloviridae)、类双生病毒科(Genomoviridae)、双生病毒科(Geminiviridae)、伽马线形病毒科(Gammaflexiviridae)、微小纺锤形噬菌体科(Fuselloviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)、费莫病毒科(Fimoviridae)、丝状病毒科(Filoviridae)、真杆状网巢病毒科(Euroniviridae)、内源病毒科(Endornaviridae)、双顺反子病毒科(Dicistroviridae)、德尔塔线形病毒科(Deltaflexiviridae)、囊状噬菌体科(Cystoviridae)、甲壳类林肯病毒科(Cruliviridae)、覆盖噬菌体科(Corticoviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)、长线形病毒科(Closteroviridae)、棒状病毒科(Clavaviridae)、圆环病毒科(Circoviridae)、楚病毒科(Chuviridae)、金色病毒科(Chrysoviridae)、花椰菜花叶病毒科(Caulimoviridae)、香石竹斑驳病毒样四体病毒科(Carmotetraviridae)、杯状病毒科(Caliciviridae)、雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)、博图欧尔密病毒科(Botourmiaviridae)、玻那病毒科(Bornaviridae)、双RNA病毒科(Birnaviridae)、二分DNA病毒科(Bidnaviridae)、双尾病毒科(Bicaudaviridae)、贝塔线形病毒科(Betaflexiviridae)、甜菜坏死黄脉病毒科(Benyviridae)、贝勒-保罗病毒科(Belpaoviridae)、杯状RNA病毒科(Barnaviridae)、杆状病毒科(Baculoviridae)、硅藻DNA病毒科(Bacilladnaviridae)、鳄梨日斑类病毒科(Avsunviroidae)、星状病毒科(Astroviridae)、蛇形病毒科(Aspiviridae)、非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)、囊泡病毒科(Ascoviridae)、节肢动物病毒科(Artoviridae)、动脉炎病毒科(Arteriviridae)、沙状病毒科(Arenaviridae)、指环病毒科(Anelloviridae)、瓶状病毒科(Ampullaviridae)、罗非鱼病毒科(Amnoonviridae)、混合病毒科(Amalgaviridae)、囊孢虫RNA病毒科(Alvernaviridae)、阿尔法四体病毒科(Alphatetraviridae)、阿尔法卫星病毒科(Alphasatellitidae)、阿尔法线形病毒科(Alphaflexiviridae)、异疱疹病毒科(Alloherpesviridae)、腺病毒科(Adenoviridae)、埃凯曼病毒科(Ackermannviridae)、和深海病毒科(Abyssoviridae)。

在一些实施例中，冠状病毒科是SAR-CoV、SARS-CoV-2、或MERS-CoV。

在一些实施例中，SAR-CoV-2包括选自以下中的一种或多种的变体：B.1.526、B.1.525、P.2、B.1.1.7、P.1、B.1.351、B.1.427、和B.1.429。

在一些实施例中，流体混合物为1uL至1000uL。在一些实施例中，流体混合物为500uL-1000uL。在一些实施例中，流体混合物为150uL-1000uL。在一些实施例中，流体混合物为1000uL。

另一个实施例进一步包括从受试者收集生物样品的步骤。可以通过多种方式从受试者(如患者)获得生物样品。

在一些实施例中，生物样品选自以下中的一种或多种：咽拭子、鼻拭子、唾液拭子、唾液样品、刺激唾液样品、咳出的痰液、胆汁样品、尿液样品、阴道拭子、宫颈管拭子、尿道拭子、精液样品、血液样品、血浆样品、血清样品、粪便样品、脑脊液、泪液样品、汗液样品、羊水样品或组织活检。在其他实施例中，生物样品选自唾液、咳出的痰液、尿液、胆汁、阴道液、宫颈管液、尿道液、精液、血液、血浆、血清、粪便、脑脊液、泪液、汗液、羊水或组织活检。

在又另一个实施例中，从第一相溶液中分离核糖核酸组分包含以下步骤：

a)将所述第一相溶液与RNA沉淀组分混合以形成混合溶液；

b)将所述混合溶液离心以形成含有所述核糖核酸的沉淀物；以及

c)将所述含有核糖核酸的沉淀物重悬于重悬液中以形成重悬沉淀物。

在一些实施例中，在与RNA沉淀组分混合之前，首先将第一相与第二相溶液分离。

在一些实施例中，重悬液的体积为5uL-200uL。在一些实施例中，重悬液为5uL、10uL、或60uL。

另一个实施例进一步包括对重悬沉淀物进行分子测定的步骤，以检测所述核糖核酸组分的存在或量化所述核糖核酸组分的量。在一些实施例中，分子测定选自以下中的一种或多种：下一代测序(next generation sequencing)(NGS)、PCR、qPCR、RT-PCR、RT-qPCR、ddPCR、生物分析仪、tapestation、qubit、nanodrop、ELISA、PCR-ELISA、MALDI-TOF、微阵列(microarray)、光度法(photometry)、分光光度法(spectophotometry)、透射系数(transmittance)、比浊法(turbidimetry)、浊度法(nephelometry)、反射测量技术(reflectometry)、细胞计量术(cytometry)、安培法(amperometry)、伏安法(voltammetry)、库仑法(coulometry)、核连缀(nuclear run-on)、核糖体图谱分析、RNA印迹、和原位杂交。在一些实施例中，此分子测定测试是否存在病毒性疾病，如COVID-19、SARS或MERS。

在一些实施例中，污染物是蛋白质、核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶、蛋白酶、白蛋白、裂解试剂、裂解盐、NaCl、KCl、(NH₄)₂SO₄、氯化铵、洗涤剂、两亲性分子、非离子洗涤剂、阴离子洗涤剂、阳离子洗涤剂、两性离子洗涤剂、Triton X-100、Nonidet P-40、脱氧胆酸钠、CHAPS、SDS、乙基三甲基溴化铵、金属离子、碳水化合物、甘油、金属螯合剂、EDTA、还原剂、Tris-2-羧乙基膦盐酸盐(TCEP)、碳、氰化物、一氧化碳、二硫苏糖醇(DTT)、亚磷酸盐、次磷酸盐、亚磷酸、还原糖、抗坏血酸、甲酸、草酸、二异丁基氢化铝、肼、过氧化氢、碘化物、硫代硫酸盐、连二硫酸盐、二氧化硫、亚硫酸盐化合物、含有Sn2+离子的化合物、含有Fe2+离子的化合物、硼氢化钠、乙硼烷、锌汞齐、钠铅合金、钠汞齐、新生(原子)氢、氢化铝锂、巯基乙醇、离子盐、非离子盐或其任何组合。

在一些实施例中，第一相溶液和第二相溶液选自聚合物-聚合物、聚合物-盐、醇-盐、胶束、反胶束、混合胶束、离子流体或短链醇。本领域技术人员应当理解，聚合物-聚合物例如是指ATPS，其中第一相溶液是聚合物溶液并且第二相溶液也是聚合物溶液。另一方面，“聚合物-盐”是指作为聚合物溶液的第一相溶液和作为盐溶液的第二相溶液。在一些实施例中，第一相溶液和第二相溶液是聚合物-盐组合。在一些实施例中，第一相溶液是10％-25％w/w聚合物溶液，并且第二相溶液是50％-70％w/w盐溶液。

在一些实施例中，第一相溶液包括选自以下的聚合物组分：聚乙二醇(PEG)、疏水改性的聚乙二醇、聚(氧化烯)聚合物、聚(氧化烯)共聚物、疏水改性的聚(氧化烯)共聚物、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙烯基己内酰胺、聚乙烯基甲基醚、烷氧基化表面活性剂、烷氧基化淀粉、烷氧基化纤维素、烷基羟烷基纤维素、有机硅改性聚醚和聚N-异丙基丙烯酰胺或其任何组合。

在一些实施例中，所述聚合物的分子量小于或等于2,000Da。在一些实施例中，所述聚合物的分子量小于或等于1,000Da。在其他实施例中，所述聚合物的分子量在200Da-1500Da、400Da-1000Da、600Da-1000Da、或700Da-900Da之间。在又其他的实施例中，所述聚合物的分子量小于1000Da、800Da、500Da、或200Da。在又其他的实施例中，所述聚合物的分子量小于2000Da、1900Da、1800Da、1700Da、1600Da、1,500Da、1400Da、1300Da、1200Da、1100Da、1000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da、或100Da。

另一方面提供了用于从包括核糖核酸和污染物的流体混合物中分离核糖核酸的组合物，其中所述组合物包括能形成双水相系统的第一相组分和第二相组分；其中所述第一相组分包括分子量小于2,000Da的聚合物；并且所述第二相组分包括选自由离子化合物和聚电解质组成的组的一种或多种盐组分。

在一些实施例中，所述聚合物的分子量小于或等于2,000Da。在一些实施例中，所述聚合物的分子量小于或等于1,000Da。在其他实施例中，所述聚合物的分子量在200Da-1500Da、400Da-1000Da、600Da-1000Da、或700Da-900Da之间。在又其他的实施例中，所述聚合物的分子量小于1000Da、800Da、500Da、或200Da。在又其他的实施例中，所述聚合物的分子量小于2000Da、1900Da、1800Da、1700Da、1600Da、1,500Da、1400Da、1300Da、1200Da、1100Da、1000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da、或100Da。

在一些实施例中，聚合物选自由以下组成的组：聚乙二醇(PEG)、疏水改性的聚乙二醇、聚(氧化烯)聚合物、聚(氧化烯)共聚物、疏水改性的聚(氧化烯)共聚物、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙烯基己内酰胺、聚乙烯基甲基醚、烷氧基化表面活性剂、烷氧基化淀粉、烷氧基化纤维素、烷基羟烷基纤维素、有机硅改性聚醚和聚N-异丙基丙烯酰胺、EOPO、聚丙二醇(polypropylene glycol)(PPG)、聚丙烯酸酯和3-(2-甲基丙氧基)丙-1-醇(UCON^TM)或其任何组合。在一些实施例中，聚合物是聚乙二醇(PEG)。EOPO是环氧乙烷(ethyleneoxide)(EO)和环氧丙烷(propylene oxide)(PO)的共聚物混合物。

在一些实施例中，盐组分选自由以下组成的组：含阳离子如直链或支链三甲基铵、三乙基铵、三丙基铵、三丁基铵、四甲基铵、四乙基铵、四丙基铵和四丁基铵的无机盐；含有阴离子如磷酸根、硫酸根、硝酸根、氯离子和碳酸氢根的无机盐；亲液盐、离液盐、镁盐、锂盐、钠盐、钾盐、铯盐、锌盐、铝盐、溴化物盐、碘化物盐、氟化物盐、碳酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐、羧酸盐、硼酸盐、磷酸盐、NaCl、Na₂SO₄、柠檬酸钾、柠檬酸钠、乙酸钠、磷酸钠、磷酸钾、硫酸铵和乙酸铵。

在一些实施例中，所述第一相组分包括选自由以下组成的组的聚合物：聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、环氧乙烷和环氧丙烷的共聚物混合物(EOPO)、聚丙烯酸酯和3-(2-甲基丙氧基)丙-1-醇(UCON^TM)；并且所述第二相组分包括选自由以下组成的组的盐：磷酸钾、柠檬酸钠、磷酸钠、硫酸铵和硫酸钠。

在一些实施例中，第一相组分是PEG并且第二相组分是磷酸钾。

在一些实施例中，第一相组分是PPG并且第二相组分是柠檬酸钠。

在一些实施例中，第一相组分是EOPO并且第二相组分是磷酸钠。

在一些实施例中，第一相组分是聚丙烯酸酯并且第二相组分是硫酸铵。

在一些实施例中，第一相组分是3-(2-甲基丙氧基)丙-1-醇并且第二相组分是硫酸钠。

在一些实施例中，第一相和第二相溶液一起形成总浓度为10％-25％w/w的聚合物和50％-70％w/w的盐。为了清楚起见，第一相和第二相溶液一起制成ATPS，其总浓度为10％-25％w/w聚合物和50％-70％w/w的盐。

另一方面提供了一种试剂盒，其包括本文所述的组合物中的任一种。

在一些实施例中，试剂盒进一步包括以下试剂或粉末中的一种或多种：裂解试剂、缓冲溶液、沉淀盐、蛋白酶粉、还原剂、共沉淀溶液、和载体核酸溶液。

在一些实施例中，试剂盒包含

23 mL缓冲溶液；

3 mL裂解试剂；

组合物的25x 820uL等分试样，所述组合物含有如本文所述的第一相组分和第二相组分；

2x 7mL沉淀盐的水溶液；

25mg蛋白酶粉；

60uL共沉淀剂的水溶液；和

可选地空管。

在一些实施例中，试剂盒还包含

2x 24mg还原剂；和

200uL载体核酸的水溶液。

在一些实施例中，使用无DNA酶/RNA酶的水制备水溶液。

另一方面提供了从包括核糖核酸和污染物的流体混合物中分离核糖核酸的方法，所述方法根据图1所示的步骤。

另一方面提供了从包括核糖核酸和污染物的流体混合物中分离核糖核酸的方法，所述方法使用本文所述的试剂盒，所述方法包含以下步骤中的一个或多个：

(a)将875μL无DNA酶/RNA酶的水添加至一小瓶的蛋白酶粉(25mg)中并混合均匀以形成溶液B1；将溶液B1在4℃下储存；

(b)将155μL无DNA酶/RNA酶的水添加至一小瓶的还原剂粉(24mg)中并混合均匀以形成溶液B2；将溶液B2在-20℃下储存；

(c)在室温下，将140-1000μL所述流体混合物转移到1.5mL微量离心管中；如果需要，添加缓冲溶液，使所述微量离心管含有1mL液体；

(d)将以下试剂按顺序添加至所述微量离心管中：10μL溶液B1；11μL溶液B2；5.6μL载体核酸溶液；和100μL裂解试剂以形成混合物；

(e)涡旋所述混合物并将其在室温下孵育10分钟；

(f)短暂地用移液管混合所述混合物并将所述混合物转移到如权利要求30所述的组合物的管中以形成溶液C；

(g)将溶液C管离心并涡旋其直至均质；

(h)将溶液C管以4,300x g离心1分钟以形成顶部相和透明的底部相；

(i)提取最高达120μL的所述顶部相并将所述顶部相转移到新的2mL微量离心管中，而不转移任何所述透明的底部相；

(j)向新的2mL微量离心管中添加230μL无DNA酶/RNA酶的水，如果需要，添加无DNA酶/RNA酶的水直至总体积为350μL；

(k)将以下试剂按顺序添加至所述新的2mL微量离心管中：510μL沉淀盐溶液、2μL共沉淀剂的溶液和860μL 100％异丙醇，以形成第二混合物；

(l)涡旋所述第二混合物直至均质，并在室温下孵育所述第二混合物5分钟；

(m)将所述混合物以4,300x g离心10分钟；

(n)弃去所有上清液，并添加1mL 40％异丙醇；

(o)将所述混合物以4,300x g离心2分钟；

(p)弃去所有上清液，并添加1mL 70％乙醇；

(q)将所述混合物以4,300x g离心2分钟；

(r)弃去所有上清液；

(s)将沉淀物在室温下干燥至少10min，直至完全干燥；

(t)将所述沉淀物重悬在至少10μL重悬缓冲液中；以及

(u)将缓冲液直接添加到干燥的沉淀物中，并用移液管上下混合30次或更多次。

在一些实施例中，蛋白酶选自由以下组成的组：Arg-C蛋白酶、BNPS-粪臭素、胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶6、胱天蛋白酶9、糜蛋白酶-高特异性(C端至[FYW]，不在P之前)、梭菌蛋白酶(梭菌肽酶B)、因子Xa、颗粒酶B、LysC、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、胃蛋白酶(pH1.3)、蛋白酶K、嗜热菌蛋白酶、Asp-N内肽酶、胱天蛋白酶1、胱天蛋白酶4、胱天蛋白酶7、胱天蛋白酶10、糜蛋白酶-低特异性(C端至[FYWML]，不在P之前)、CNBr、甲酸、羟胺、LysN、胃蛋白酶、葡萄球菌肽酶I、凝血酶、Asp-N内肽酶+N-末端Glu、胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶5、胱天蛋白酶8、肠激酶、谷氨酰内肽酶、氧碘苯甲酸、NTCB(2-硝基-5-硫氰基苯甲酸)(2-nitro-5-thiocyanobenzoic acid)、脯氨酸-内肽酶、烟草蚀纹病毒蛋白酶和胰蛋白酶。在一些实施例中，由蛋白酶粉制成的溶液浓度为10-40mg/mL。

在一些实施例中，还原剂选自由以下组成的组：Tris-2-羧乙基膦盐酸盐(TCEP)、碳、氰化物、一氧化碳、二硫苏糖醇(DTT)、亚磷酸盐、次磷酸盐、亚磷酸、还原糖、抗坏血酸、甲酸、草酸、二异丁基氢化铝、肼、过氧化氢、碘化物、硫代硫酸盐、连二硫酸盐、二氧化硫、亚硫酸盐化合物、含有Sn2+离子的化合物、含有Fe2+离子的化合物、硼氢化钠、乙硼烷、锌汞齐、钠铅合金、钠汞齐、新生(原子)氢、氢化铝锂、巯基乙醇。在一些实施例中，由还原剂制成的溶液浓度为50至250mg/mL。

在一些实施例中，载体核酸为RNA或DNA。在一些实施例中，由载体核酸制成的溶液浓度为0.2至2ug/uL。

在一些实施例中，裂解试剂选自由以下组成的组：裂解盐、NaCl、KCl、(NH4)2SO4、盐酸胍、氯化铵、洗涤剂、两亲性分子、非离子洗涤剂、阴离子洗涤剂、阳离子洗涤剂、两性离子洗涤剂、Triton X-100、Nonidet P-40、脱氧胆酸钠、CHAPS、SDS、乙基三甲基溴化铵、金属离子、碳水化合物、甘油、金属螯合剂和EDTA。在一些实施例中，裂解试剂的浓度为2M-20M。

在一些实施例中，沉淀盐选自由以下组成的组：乙酸钠、乙酸铵、氯化钠、氯化锂、碘化钠和乙酸钾。在一些实施例中，沉淀盐的浓度为5M-10M。

在一些实施例中，共沉淀剂选自由以下组成的组：PEG、线性聚丙烯酰胺、糖原、RNA、DNA。在一些实施例中，含有共沉淀剂的溶液为80％至100％w/w。

样品制备

可以通过以下方法中的一种或多种收集生物样品：咽拭子、鼻拭子、唾液拭子、唾液样品、刺激唾液样品、咳出的痰液、胆汁样品、尿液样品、阴道拭子、宫颈管拭子、尿道拭子、精液样品、血液样品、血浆样品、血清样品、粪便样品、脑脊液、泪液样品、汗液样品、羊水样品或组织活检。生物样品可以选自由以下组成的组：唾液、咳出的痰液、尿液、胆汁、阴道液、宫颈管液、尿道液、精液、血液、血浆、血清、粪便、脑脊液、泪液、汗液、羊水或组织活检。将待测试的生物样品重悬在适当体积的适当的病毒转移介质中，以成为样品混合物。应当理解，当生物样品是“拭子(swab)”时，它是指来自受试者的生物样品，所述生物样品是通过进行擦拭受试者身体的特定部位的行为获得的。例如，咽拭子涉及使用拭子从受试者的喉咙中获得样品。此样品可以含有例如唾液、咽喉细胞、细菌或病毒等，所有这些都结合成为称为“咽拭子”的生物样品，其可以可选地悬浮在流体介质中并放入容器中进行储存、转移或测试。

参考图1，示例方法实施例可以包括可选地第一步骤110：通过在合适的容器114中将生物样品112(即病毒转移介质中的样品混合物)和裂解缓冲液混合并在适当的温度(例如，在15°至40℃的范围内)下孵育足够的时间(例如，优选地在1至60分钟的范围内)以从生物样品中的细胞、外来体、蛋白质和/或其他材料中释放核酸，来制备流体混合物。在某些示例实施例中，裂解缓冲液可具有在4至11、7至10或8至9范围内的pH。裂解缓冲液中物质的浓度取决于待裂解的生物材料的量和提供所述生物材料的方式。原则上，技术人员已知的任何分离方法都可以适用于从生物样品中释放核酸。可以考虑的裂解方法特别是通过热作用的裂解、通过机械力作用的裂解、通过酶例如蛋白激酶K的裂解或通过使细胞与含有洗涤剂或离液化合物的裂解缓冲液接触或通过低渗溶液来裂解。在适当的情况下，也可以组合上述措施，例如通过在含有洗涤剂或离液化合物的裂解缓冲液中机械破坏细胞，或例如通过使用含有蛋白激酶K以及离液化合物的裂解缓冲液。在某些实施例中，可以将样品混合物和裂解缓冲液在室温下涡旋并孵育。

分析物的分离

可以在分离步骤120中将分离组分117添加到流体混合物中，在进行或不进行离心的情况下，形成具有新ATPS组分浓度的双水相系统，ATPS 129，以从污染物中分离靶核糖核酸。分离组分117可以包含溶于第一相溶液124的第一相形成聚合物组分和第二相溶液122，使得靶核糖核酸分配到第一相溶液124(例如，富含聚合物的顶部相)，而蛋白质和其他污染物分配到第二相溶液122(例如，富含盐的底部相)。

可以使用多种类型的ATPS 129，包含聚合物-盐系统、聚合物-聚合物系统和聚合物-表面活性剂系统。相分离分配可能受到一些因素的影响，如分离组分117、pH、分子量、相对浓度、以及离心、混合和孵育步骤的适当选择和特定顺序。

分离组分117可以包含有助于形成第一相溶液124和第二相溶液122的聚合物组分。合适的聚合物可以包含聚乙二醇(PEG)、疏水改性的聚乙二醇、聚(氧化烯)聚合物、聚(氧化烯)共聚物、疏水改性的聚(氧化烯)共聚物、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙烯基己内酰胺、聚乙烯基甲基醚、烷氧基化表面活性剂、烷氧基化淀粉、烷氧基化纤维素、烷基羟烷基纤维素、有机硅改性聚醚和聚N-异丙基丙烯酰胺、环氧乙烷和环氧丙烷的共聚物混合物EOPO)、聚丙二醇(PPG)、聚丙烯酸酯和3-(2-甲基丙氧基)丙-1-醇(UCON^TM)或其任何组合。

在ATPS 129的聚合物盐实施例中，第二相溶液122可以包含溶解的盐。合适的盐包含，但不限于含阳离子如直链或支链三甲基铵、三乙基铵、三丙基铵、三丁基铵、四甲基铵、四乙基铵、四丙基铵和四丁基铵的无机盐；含有阴离子如磷酸根、硫酸根、硝酸根、氯离子和碳酸氢根的无机盐；亲液盐、离液盐、镁盐、锂盐、钠盐、钾盐、铯盐、锌盐、铝盐、溴化物盐、碘化物盐、氟化物盐、碳酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐、羧酸盐、硼酸盐、磷酸盐、NaCl、Na₂SO₄、柠檬酸钾、柠檬酸钠、乙酸钠、磷酸钠、磷酸钾、硫酸铵和乙酸铵。

在一些实施例中，形成含有平均分子量小于或等于2,000Da(例如，100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000Da)的聚合物的第一相溶液124。

分析物的转移

在步骤130中，将顶部相124转移到容器132中。在一些实施例中，可以留下一定量的顶部相。

分析物的浓缩

希望减少含有靶核糖核酸的工作溶液的处理体积。在ATPS中，这可以通过减少顶部相的体积来实现。

分析物的回收

在可选地回收步骤140中，浓缩的靶核糖核酸可以通过离心与沉淀组分组合，以从溶液中分离靶核糖核酸并使其脱盐为在容器132底部形成的沉淀物142。在步骤150中，可以去除上清液并且可以将由靶核糖核酸组成的沉淀物142重悬在合适的缓冲液中。

实例

将参考以下实例更详细地描述本发明。本领域技术人员将容易理解，提供的实例仅用于说明目的，并不意味着限制由随后的权利要求限定的本发明的范围。以下和本申请中其他地方给出的所有参考文献特此通过援引包括在本文中。

实例1-核酸分配到ATPS中的不同相

通过将已知数量的核酸掺入不同的ATPS组合物中，彻底混合，并允许足够时间的相分离来进行实验。相分离后，提取两相并使用多种测定(凝胶电泳、分光光度法、qPCR、ddPCR和生物分析)确定核酸含量。

结果：

根据聚合物的分子量以及双水相系统中聚合物和盐的浓度，核酸分配到不同的相中。当聚合物分子量小于或等于400g/mol时，几乎所有核酸都倾向于分配到顶部相，不管浓度如何。当聚合物分子量大于或等于4600g/mol时，核酸倾向于分配到底部相。当聚合物分子量在600g/mol与1500g/mol之间时，核酸分配取决于ATPS组分的浓度，但是我们能够找到导致核酸优先分配到顶部相的浓度。

数据汇总如下表1中所示。百分比描述了分配到各个相的核酸的相对量。在各种不同的聚合物和盐浓度下进行实验。以下结果是所有实验的平均值。

表1.百分比的汇总数据描述了分配到各个相的核酸的相对量。

实例2-从生物样品中分离病毒RNA的方法

材料和试剂的制备

所述方法需要以下试剂：

■在室温(例如15℃-30℃)下储存的补充缓冲液

■裂解剂[2至20M]

■ATPS

■重悬于水中并在低温(如4℃)下储存的蛋白酶[10-40mg/mL]

■沉淀盐[5至10M]

■共沉淀剂[80％至100％w/w]

■重悬于水中并在冷冻温度(如-20℃)下储存的还原剂[50至250mg/mL](可选的)

■载体核酸[0.2至2ug/ul](可选的)

从生物样品中分离病毒RNA的方法

参考图2，在可选的步骤200中，将受试者的样品(如鼻拭子或深喉拭子)浸入适当体积(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10ml或更多)的病毒转移介质中以形成样品混合物202。样品可以含有或可以不含目的病毒RNA。将适量的样品混合物202转移到合适的容器中。在此实施例中，使用的样品混合物202的量为1000ul。在此实施例中，合适的容器是微量离心管204。如果少于1000ul的样品混合物202可用，则最终体积可以用适合介质的补充缓冲液来补充，以获得最终体积为1000ul的样品混合物。可以可选地将1000ul样品混合物转移到新容器中。

在可选的步骤210中，将合适体积(如10ul)的蛋白酶溶液和合适体积(如100ul)的裂解剂(一起作为裂解缓冲液)添加到样品混合物中以形成流体混合物。可选地，将合适体积(如11ul)的还原剂和合适量(如5.6ul)的载体核酸添加至样品混合物中。将流体混合物涡旋混合。将流体混合物在室温(如15℃-30℃)下孵育10分钟。在某些示例实施例中，蛋白酶溶液可以含有以下中的一种或多种：Arg-C蛋白酶、BNPS-粪臭素、胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶6、胱天蛋白酶9、糜蛋白酶-高特异性(C端至[FYW]，不在P之前)、梭菌蛋白酶(梭菌肽酶B)、因子Xa、颗粒酶B、LysC、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、胃蛋白酶(pH1.3)、蛋白酶K、嗜热菌蛋白酶、Asp-N内肽酶、胱天蛋白酶1、胱天蛋白酶4、胱天蛋白酶7、胱天蛋白酶10、糜蛋白酶-低特异性(C端至[FYWML]，不在P之前)、CNBr、甲酸、羟胺、LysN、胃蛋白酶、葡萄球菌肽酶I、凝血酶、Asp-N内肽酶+N-末端Glu、胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶5、胱天蛋白酶8、肠激酶、谷氨酰内肽酶、氧碘苯甲酸、NTCB(2-硝基-5-硫氰基苯甲酸)、脯氨酸-内肽酶、烟草蚀纹病毒蛋白酶和胰蛋白酶。在某些实施例中，裂解试剂可以含有以下中的一种或多种：裂解盐、NaCl、KCl、(NH₄)₂SO₄、盐酸胍、氯化铵、洗涤剂、两亲性分子、非离子洗涤剂、阴离子洗涤剂、阳离子洗涤剂、两性离子洗涤剂、Triton X-100、Nonidet P-40、脱氧胆酸钠、CHAPS、SDS、乙基三甲基溴化铵、金属离子、碳水化合物、甘油、金属螯合剂和EDTA。在某些示例实施例中，所述还原剂可以含有以下中的一种或多种：Tris-2-羧乙基膦盐酸盐(TCEP)、碳、氰化物、一氧化碳、二硫苏糖醇(DTT)、亚磷酸盐、次磷酸盐、亚磷酸、还原糖、抗坏血酸、甲酸、草酸、二异丁基氢化铝、肼、过氧化氢、碘化物、硫代硫酸盐、连二硫酸盐、二氧化硫、亚硫酸盐化合物、含有Sn2+离子的化合物、含有Fe2+离子的化合物、硼氢化钠、乙硼烷、锌汞齐、钠铅合金、钠汞齐、新生(原子)氢、氢化铝锂、巯基乙醇。在某些实施例中，载体核酸可以含有RNA和/或DNA。

可选地将流体混合物用任何合适的流体转移装置(如自动移液管或移液管)进一步混合。在步骤220中，将全部内容物转移至新容器，如含有分离组分的管226中，以形成双水相系统(ATPS)229(或分离混合物)。在一个示例实施例中，将含有分离组分的管226在使用前短暂离心。涡旋分离混合物直到混合物变得均质。然后将分离混合物短暂离心以分离两相，顶部相224和底部相222。在此示例实施例中，将分离混合物以4,300x g左右离心1分钟。在某些示例实施例中，ATPS系统229由第一相组分和第二相组分形成。第一相组分包括分子量小于2,000Da的聚合物，并且第二相组分包括选自由离子化合物和聚电解质组成的组的一种或多种盐组分。在一个示例实施例中，第一相组分含有分子量小于2,000Da的聚合物。在一个示例实施例中，第一相组分含有选自由以下组成的组的聚合物：PEG、PPG、EOPO、聚丙烯酸酯和UCON(CAS#69226-89-73，如(2-甲基丙氧基)丙-1-醇)并且第二相组分含有选自由以下组成的组的盐：磷酸钾、柠檬酸钠、磷酸钠、硫酸铵和硫酸钠。

提取合适体积(如120ul)的顶部相224并用任何合适的流体转移装置(如自动移液管或移液管)转移到新容器236。在某些示例实施例中，如果少于120ul的顶部相224可用，则尽可能多地提取顶部相224。在一个示例实施例中，可以将容器226倾斜一定角度以沿容器壁收集顶部相224以避免转移任何底部相222。

在步骤230中，将合适体积(如260ul)的水添加到顶部相224中。在某些实施例中，如果少于120ul的顶部相224被转移，则添加足够的水以补足至350ul的最终体积。在此实施例中，水是去离子水。在一些实施例中，水中无DNA酶和/或无RNA酶。将合适体积(如580ul)的溶液沉淀盐、合适体积(如2ul)的共沉淀剂、合适体积(如980ul)的100％异丙醇添加到混合物中。可选地涡旋混合物以形成均质溶液。将混合物在室温下孵育合适的时间，如5分钟。然后将混合物以4,300x g左右离心5-20分钟或更长。在此实施例中，然后将混合物以4,300x g左右离心20分钟。在某些实例实施例中，沉淀盐可以含有以下中的一种或多种：乙酸钠、乙酸铵、氯化钠、氯化锂、碘化钠和乙酸钾。在某些示例实施例中，共沉淀剂可以含有以下中的一种或多种：PEG、线性聚丙烯酰胺、糖原、RNA和DNA。

在步骤240中，弃去所有上清液，留下沉淀物242。将合适体积(如1ml)的40％异丙醇添加至容器236中。将容器236以4,300x g左右离心2分钟。

在步骤250中，弃去所有上清液。将沉淀物242在室温下干燥直到沉淀物242完全干燥。在一个示例实施例中，将沉淀物242干燥至少10分钟。将沉淀物重悬于所需体积的合适重悬缓冲液中，如5ul、6ul、7ul、8ul、9ul、10ul、11ul、12ul、13ul、14ul、15ul、16ul、17ul、18ul、19ul、20ul、40ul、100ul或更多。在此实施例中，所需体积是10ul。在一个示例实施例中，将重悬缓冲液直接添加到沉淀物中并用自动移液管上下混合。在一个示例实施例中，重悬缓冲液可以是水。在另一个示例实施例中，重悬缓冲液可以是与下游分析兼容的缓冲液。

实例3-裂解缓冲液的试剂选择：裂解剂、还原剂和/或载体核酸

通过掺入相同量的已知拷贝的核糖核酸，使用不同的裂解缓冲液组合(即，具有或不具有裂解剂、还原剂和/或载体核酸的蛋白酶)通过与实例2中描述的相同的分离方法来进行实验。使用相同量的相同蛋白酶、ATS、沉淀盐和共沉淀剂。相分离后，提取两相并使用qPCR分析确定核糖核酸含量。对于每个反应，使用10ul工作溶液加10ul洗脱液。

结果：

下表2示出了汇总数据。数据表明还原剂不是必需的，表明裂解剂可以用作还原试剂/RNA酶抑制剂和裂解试剂两者。数据还表明载体核酸不是必需的。

表2.试剂选择的汇总数据。

对照-使用蛋白酶、裂解剂、还原剂和载体核酸的反应；

无还原试剂-使用蛋白酶、裂解剂和载体核酸的反应，无还原剂；

无载体RNA-使用蛋白酶、裂解剂和还原剂的反应，无载体核酸；

无还原试剂或载体RNA-使用蛋白酶、裂解剂的反应，无还原剂或载体核酸；

NTC＝阴性对照；ND＝未检测到；N/A＝不可用。

本发明的示例性实施例由此得到了充分描述。尽管描述涉及特定的实施例，但是本领域的技术人员将会清楚，本发明可以利用这些具体细节的变型来实践。因此，本发明不应被解释为局限于本文阐述的实施例。

Claims (53)

1.一种从包括核糖核酸组分和污染物的流体混合物中分离核糖核酸组分的方法，所述方法包含：

(a)将所述流体混合物添加到包括第一相溶液和第二相溶液的双水相系统(ATPS)中，使得所述核糖核酸分配到所述第一相溶液中并且所述污染物分配到所述第二相溶液中；以及

(b)从所述第一相溶液中分离所述核糖核酸组分。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述核糖核酸组分是核糖核酸或核糖核酸片段。

3.如权利要求1或2所述的方法，所述方法进一步包含裂解过程的步骤，其中所述裂解过程包含以下步骤：

i)提供生物样品；

ii)将所述生物样品与裂解试剂混合以形成样品混合物；以及

iii)孵育所述样品混合物以得到权利要求1所述的流体混合物。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述生物样品包含在进行权利要求3所述的裂解过程时释放核糖核酸组分的生物材料。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述生物材料选自以下中的一种或多种：病毒、真核细胞、原核细胞、蛋白质外壳、囊泡、与蛋白质复合的RNA、三级RNA结构及未复合的RNA。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述生物材料是病毒。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述病毒是具有脂质双层的包膜病毒。

8.如权利要求6所述的方法，其中所述病毒具有大于25千碱基的靶RNA序列。

9.如权利要求6所述的方法，其中所述病毒具有在所述病毒的病毒包膜内的核衣壳中复合的靶病毒RNA。

10.如权利要求6所述的方法，其中所述病毒选自以下中的一种或多种：越病毒科(Yueviridae)、新城蚊子病毒科(Xinmoviridae)、武汉蜈蚣病毒科(Wupedeviridae)、植物杆状病毒科(Virgaviridae)、芜菁黄花叶病毒科(Tymoviridae)、塔螺病毒科(Turriviridae)、三层病毒科(Tristromaviridae)、整体病毒科(Totiviridae)、番茄斑萎病毒科(Tospoviridae)、番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)、番茄曲叶卫星病毒科(Tolecusatellitidae)、披膜病毒科(Togaviridae)、托巴套氏病毒科(Tobaniviridae)、复层噬菌体科(Tectiviridae)、阳光病毒科(Sunviridae)、嗜热圈形病毒科(Spiraviridae)、球脂状病毒科(Sphaerolipoviridae)、红火蚁病毒科(Solinviviridae)、南方菜豆花叶一品红病毒科(Solemoviridae)、小环状DNA病毒科(Smacoviridae)、长尾噬菌体科(Siphoviridae)、伴生豇豆病毒科(Secoviridae)、小节肢动物病毒科(Sarthroviridae)、古噬菌体科(Rudiviridae)、杆状网巢病毒科(Roniviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、逆转录病毒科(Retroviridae)、呼肠孤病毒科(Reoviridae)、四组分病毒科(Quadriviridae)、秦病毒科(Qinviridae)、伪病毒科(Pseudoviridae)、痘病毒科(Poxviridae)、马铃薯Y病毒科(Potyviridae)、马铃薯纺锤形块茎类病毒科(Pospiviroidae)、带球病毒科(Portogloboviridae)、多瘤病毒科(Polyomaviridae)、多去氧核糖核酸病毒科(Polydnaviridae)、多顺反子类小RNA病毒科(Polycipiviridae)、短尾噬菌体科(Podoviridae)、肺病毒科(Pneumoviridae)、嗜盐菌多形病毒科(Pleolipoviridae)、芽生噬菌体科(Plasmaviridae)、小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)、小双节病毒科(Picobirnaviridae)、藻类去氧核糖核酸病毒科(Phycodnaviridae)、白纤病毒科(Phenuiviridae)、幻影病毒科(Phasmaviridae)、复制酶置换四体病毒科(Permutotetraviridae)、泛布尼亚病毒科(Peribunyaviridae)、细小病毒科(Parvoviridae)、分体病毒科(Partitiviridae)、副黏液病毒科(Paramyxoviridae)、乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)、卵形病毒科(Ovaliviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、尼亚米病毒科(Nyamiviridae)、裸杆状病毒科(Nudiviridae)、野田村病毒科(Nodaviridae)、线极病毒科(Nimaviridae)、裸露RNA病毒科(Narnaviridae)、矮缩病毒科(Nanoviridae)、内罗病毒科(Nairoviridae)、多足类湖北病毒科(Mypoviridae)、肌尾噬菌体科(Myoviridae)、真菌单分子负链RNA病毒科(Mymonaviridae)、Mononiviridae、拟菌病毒科(Mimiviridae)、微小噬菌体科(Microviridae)、转座病毒科(Metaviridae)、中等嵌套病毒科(Mesoniviridae)、巨大双分RNA病毒科(Megabirnaviridae)、Medioniviridae、风疹病毒科(Matonaviridae)、马赛病毒科(Marseilleviridae)、海洋RNA病毒科(Marnaviridae)、软体动物疱疹病毒科(Malacoherpesviridae)、黄症病毒科(Luteoviridae)、李氏蜘蛛病毒科(Lispiviridae)、脂毛噬菌体科(Lipothrixviridae)、光滑病毒科(Leviviridae)、利什曼原虫布尼亚病毒科(Leishbuviridae)、大病毒依赖科(Lavidaviridae)、北岛病毒科(Kitaviridae)、虹彩病毒科(Iridoviridae)、丝状噬菌体科(Inoviridae)、传染性软腐病病毒科(Iflaviridae)、肥大唾腺炎病毒科(Hytrosaviridae)、低毒性病毒科(Hypoviridae)、疱疹病毒科(Herpesviridae)、代列尔噬菌体科(Herelleviridae)、戊型肝炎病毒科(Hepeviridae)、嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)、汉坦病毒科(Hantaviridae)、滴状病毒科(Guttaviridae)、球状病毒科(Globuloviridae)、类双生病毒科(Genomoviridae)、双生病毒科(Geminiviridae)、伽马线形病毒科(Gammaflexiviridae)、微小纺锤形噬菌体科(Fuselloviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)、费莫病毒科(Fimoviridae)、丝状病毒科(Filoviridae)、真杆状网巢病毒科(Euroniviridae)、内源病毒科(Endornaviridae)、双顺反子病毒科(Dicistroviridae)、德尔塔线形病毒科(Deltaflexiviridae)、囊状噬菌体科(Cystoviridae)、甲壳类林肯病毒科(Cruliviridae)、覆盖噬菌体科(Corticoviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)、长线形病毒科(Closteroviridae)、棒状病毒科(Clavaviridae)、圆环病毒科(Circoviridae)、楚病毒科(Chuviridae)、金色病毒科(Chrysoviridae)、花椰菜花叶病毒科(Caulimoviridae)、香石竹斑驳病毒样四体病毒科(Carmotetraviridae)、杯状病毒科(Caliciviridae)、雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)、博图欧尔密病毒科(Botourmiaviridae)、玻那病毒科(Bornaviridae)、双RNA病毒科(Birnaviridae)、二分DNA病毒科(Bidnaviridae)、双尾病毒科(Bicaudaviridae)、贝塔线形病毒科(Betaflexiviridae)、甜菜坏死黄脉病毒科(Benyviridae)、贝勒-保罗病毒科(Belpaoviridae)、杯状RNA病毒科(Barnaviridae)、杆状病毒科(Baculoviridae)、硅藻DNA病毒科(Bacilladnaviridae)、鳄梨日斑类病毒科(Avsunviroidae)、星状病毒科(Astroviridae)、蛇形病毒科(Aspiviridae)、非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)、囊泡病毒科(Ascoviridae)、节肢动物病毒科(Artoviridae)、动脉炎病毒科(Arteriviridae)、沙状病毒科(Arenaviridae)、指环病毒科(Anelloviridae)、瓶状病毒科(Ampullaviridae)、罗非鱼病毒科(Amnoonviridae)、混合病毒科(Amalgaviridae)、囊孢虫RNA病毒科(Alvernaviridae)、阿尔法四体病毒科(Alphatetraviridae)、阿尔法卫星病毒科(Alphasatellitidae)、阿尔法线形病毒科(Alphaflexiviridae)、异疱疹病毒科(Alloherpesviridae)、腺病毒科(Adenoviridae)、埃凯曼病毒科(Ackermannviridae)、和深海病毒科(Abyssoviridae)。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述冠状病毒科是SAR-CoV、SARS-CoV-2、或MERS-CoV。

12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述流体混合物为1uL至1000uL。

13.如权利要求3-12中任一项所述的方法，所述方法进一步包含从受试者收集所述生物样品的步骤。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述生物样品选自以下中的一种或多种：咽拭子、鼻拭子、唾液拭子、唾液样品、刺激唾液样品、咳出的痰液、胆汁样品、尿液样品、阴道拭子、宫颈管拭子、尿道拭子、精液样品、血液样品、血浆样品、血清样品、粪便样品、脑脊液、泪液样品、汗液样品、羊水样品或组织活检。

15.如权利要求13所述的方法，其中所述生物样品选自唾液、咳出的痰液、尿液、胆汁、阴道液、宫颈管液、尿道液、精液、血液、血浆、血清、粪便、脑脊液、泪液、汗液、羊水或组织活检。

16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中从所述第一相溶液中分离所述核糖核酸组分包含以下步骤：

i)将所述第一相溶液与RNA沉淀组分混合以形成混合溶液；

ii)将所述混合溶液离心以形成含有所述核糖核酸的沉淀物；以及

iii)将所述含有核糖核酸的沉淀物重悬于重悬液中以形成重悬沉淀物。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述重悬液的体积为5uL-200uL。

18.如权利要求16或17所述的方法，所述方法进一步包含对所述重悬沉淀物进行分子测定的步骤，以检测所述核糖核酸组分的存在或量化所述核糖核酸组分的量。

19.如权利要求18所述的方法，其中所述分子测定选自以下中的一种或多种：下一代测序(NGS)、PCR、qPCR、RT-PCR、RT-qPCR、ddPCR、生物分析仪、tapestation、qubit、nanodrop、ELISA、PCR-ELISA、MALDI-TOF、微阵列、光度法、分光光度法、透射系数、比浊法、浊度法、反射测量技术、细胞计量术、安培法、伏安法、库仑法、核连缀、核糖体图谱分析、RNA印迹、及原位杂交。

20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述污染物是蛋白质、核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶、蛋白酶、白蛋白、裂解试剂、裂解盐、NaCl、KCl、(NH₄)₂SO₄、氯化铵、洗涤剂、两亲性分子、非离子洗涤剂、阴离子洗涤剂、阳离子洗涤剂、两性离子洗涤剂、Triton X-100、Nonidet P-40、脱氧胆酸钠、CHAPS、SDS、乙基三甲基溴化铵、金属离子、碳水化合物、甘油、金属螯合剂、EDTA、还原剂、Tris-2-羧乙基膦盐酸盐(TCEP)、碳、氰化物、一氧化碳、二硫苏糖醇(DTT)、亚磷酸盐、次磷酸盐、亚磷酸、还原糖、抗坏血酸、甲酸、草酸、二异丁基氢化铝、肼、过氧化氢、碘化物、硫代硫酸盐、连二硫酸盐、二氧化硫、亚硫酸盐化合物、含有Sn2+离子的化合物、含有Fe2+离子的化合物、硼氢化钠、乙硼烷、锌汞齐、钠铅合金、钠汞齐、新生(原子)氢、氢化铝锂、巯基乙醇、离子盐、非离子盐或其任何组合。

21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述第一相溶液和所述第二相溶液选自聚合物-聚合物、聚合物-盐、醇-盐、胶束、反胶束、混合胶束、离子流体或短链醇。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述第一相溶液和所述第二相溶液是聚合物-盐组合。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述第一相溶液和第二相溶液一起形成总浓度为10％-25％w/w的聚合物和50％-70％w/w的盐。

24.如权利要求22或23所述的方法，其中所述第一相溶液包括选自以下的聚合物组分：聚乙二醇(PEG)、疏水改性的聚乙二醇、聚(氧化烯)聚合物、聚(氧化烯)共聚物、疏水改性的聚(氧化烯)共聚物、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙烯基己内酰胺、聚乙烯基甲基醚、烷氧基化表面活性剂、烷氧基化淀粉、烷氧基化纤维素、烷基羟烷基纤维素、有机硅改性聚醚和聚N-异丙基丙烯酰胺或其任何组合。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述聚合物的分子量小于或等于2,000Da。

26.如权利要求25所述的方法，其中所述聚合物的分子量在200Da-1500Da、400Da-1000Da、600Da-1000Da、或700Da-900Da之间。

27.如权利要求25所述的方法，其中所述聚合物的分子量小于1000Da、800Da、500Da、或200Da。

28.如权利要求25所述的方法，其中所述聚合物的分子量小于2000Da、1900Da、1800Da、1700Da、1600Da、1,500Da、1400Da、1300Da、1200Da、1100Da、1000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da、或100Da。

29.如权利要求22-28中任一项所述的方法，其中所述盐组分选自由以下组成的组：含阳离子如直链或支链三甲基铵、三乙基铵、三丙基铵、三丁基铵、四甲基铵、四乙基铵、四丙基铵和四丁基铵的无机盐；含有阴离子如磷酸根、硫酸根、硝酸根、氯离子和碳酸氢根的无机盐；亲液盐、离液盐、镁盐、锂盐、钠盐、钾盐、铯盐、锌盐、铝盐、溴化物盐、碘化物盐、氟化物盐、碳酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐、羧酸盐、硼酸盐、磷酸盐、NaCl、Na₂SO₄、柠檬酸钾、柠檬酸钠、乙酸钠、磷酸钠、磷酸钾、硫酸铵和乙酸铵。

30.一种用于从包括核糖核酸和污染物的流体混合物中分离核糖核酸的组合物，其中所述组合物包含能形成双水相系统(ATPS)的第一相组分和第二相组分；其中所述第一相组分包含分子量小于2,000Da的聚合物；并且所述第二相组分包含选自由离子化合物和聚电解质组成的组的一种或多种盐组分。

31.如权利要求30所述的组合物，其中所述聚合物具有小于或等于2,000Da的分子量。

32.如权利要求31所述的组合物，其中所述聚合物具有小于或等于1,000Da的分子量。

33.如权利要求31所述的组合物，其中所述聚合物的分子量在200Da-1,500Da、400Da-1,000Da、600Da-1,000Da、或700Da-900Da之间。

34.如权利要求31所述的组合物，其中所述聚合物的分子量小于1,000Da、800Da、500Da、或200Da。

35.如权利要求31所述的组合物，其中所述聚合物的分子量小于2,000Da、1,900Da、1,800Da、1,700Da、1,600Da、1,500Da、1,400Da、1,300Da、1,200Da、1,100Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da、或100Da。

36.如权利要求30-35中任一项所述的组合物，其中所述聚合物选自由以下组成的组：聚乙二醇(PEG)、疏水改性的聚乙二醇、聚(氧化烯)聚合物、聚(氧化烯)共聚物、疏水改性的聚(氧化烯)共聚物、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙烯基己内酰胺、聚乙烯基甲基醚、烷氧基化表面活性剂、烷氧基化淀粉、烷氧基化纤维素、烷基羟烷基纤维素、有机硅改性聚醚和聚N-异丙基丙烯酰胺、环氧乙烷和环氧丙烷的共聚物混合物(EOPO)、聚丙二醇(PPG)、聚丙烯酸酯和3-(2-甲基丙氧基)丙-1-醇(UCON^TM)或其任何组合。

37.如权利要求30-36中任一项所述的组合物，其中所述盐组分选自由以下组成的组：含阳离子如直链或支链三甲基铵、三乙基铵、三丙基铵、三丁基铵、四甲基铵、四乙基铵、四丙基铵和四丁基铵的无机盐；含有阴离子如磷酸根、硫酸根、硝酸根、氯离子和碳酸氢根的无机盐；亲液盐、离液盐、镁盐、锂盐、钠盐、钾盐、铯盐、锌盐、铝盐、溴化物盐、碘化物盐、氟化物盐、碳酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐、羧酸盐、硼酸盐、磷酸盐、NaCl、Na₂SO₄、柠檬酸钾、柠檬酸钠、乙酸钠、磷酸钠、磷酸钾、硫酸铵和乙酸铵。

38.如权利要求30-37中任一项所述的组合物，其中所述第一相组分包含选自由以下组成的组的聚合物：聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、环氧乙烷和环氧丙烷的共聚物混合物(EOPO)、聚丙烯酸酯和3-(2-甲基丙氧基)丙-1-醇(UCON^TM)；并且所述第二相组分包含选自由以下组成的组的盐：磷酸钾、柠檬酸钠、磷酸钠、硫酸铵和硫酸钠。

39.如权利要求38所述的组合物，其中所述第一相组分是聚乙二醇(PEG)并且所述第二相组分是磷酸钾。

40.如权利要求38所述的组合物，其中所述第一相组分是聚丙二醇(PPG)并且所述第二相组分是柠檬酸钠。

41.如权利要求38所述的组合物，其中所述第一相组分是环氧乙烷和环氧丙烷的共聚物混合物(EOPO)并且所述第二相组分是磷酸钠。

42.如权利要求38所述的组合物，其中所述第一相组分为聚丙烯酸酯并且所述第二相组分为硫酸铵。

43.如权利要求38所述的组合物，其中所述第一相组分是3-(2-甲基丙氧基)丙-1-醇(UCON^TM)并且所述第二相组分是硫酸钠。

44.如权利要求30-43中任一项所述的组合物，其中所述第一相组分是水中10％-25％w/w的聚合物。

45.如权利要求30-44中任一项所述的组合物，其中所述第二相组分是水中50％-70％w/w的盐组分。

46.一种试剂盒，所述试剂盒包含如权利要求30-45中任一项所述的组合物。

47.如权利要求46所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含以下试剂或粉末中的一种或多种：裂解试剂、缓冲溶液、沉淀盐、蛋白酶粉、还原剂、共沉淀剂的水溶液、和载体核酸的水溶液。

48.如权利要求46所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含:

23mL缓冲溶液；

3mL裂解试剂；

如权利要求30所述的组合物的25x 820uL等分试样；

2x 7mL沉淀盐的水溶液；

25mg蛋白酶粉；

60uL共沉淀剂的水溶液；以及

可选地空管。

49.如权利要求48所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含：

2x 24mg还原剂；以及

200uL载体核酸的水溶液。

50.一种根据图1或图2所示的步骤从包括核糖核酸和污染物的流体混合物中分离核糖核酸的方法。

51.一种从包括核糖核酸和污染物的流体混合物中分离核糖核酸的方法，所述方法使用如权利要求46至50中任一项所述的试剂盒，所述方法包含以下步骤中的一个或多个：

(a)将875μL无DNA酶/RNA酶的水添加至一小瓶的蛋白酶粉(25mg)中并混合均匀以形成溶液B1；将溶液B1在4℃下储存；

(b)将155μL无DNA酶/RNA酶的水添加至一小瓶的还原剂粉(24mg)中并混合均匀以形成溶液B2；将溶液B2在-20℃下储存；

(c)在室温下，将140-1000μL所述流体混合物转移到1.5mL微量离心管中；如果需要，添加缓冲溶液，使所述微量离心管含有1mL液体；

(d)将以下试剂按顺序添加至所述微量离心管中：10μL溶液B1；11μL溶液B2；5.6μL载体核酸溶液；和100μL裂解试剂，以形成混合物；

(e)涡旋所述混合物并将其在室温下孵育10分钟；

(f)短暂地用移液管混合所述混合物并将所述混合物转移到如权利要求30-45中任一项所述的组合物的管中以形成溶液C；

(g)将溶液C管离心并涡旋其直至均质；

(h)将溶液C管以4,300x g离心1分钟以形成顶部相和透明的底部相；

(i)提取最高达120μL的所述顶部相并将所述顶部相转移到新的2mL微量离心管中，而不转移任何所述透明的底部相；

(j)向新的2mL微量离心管中添加230μL无DNA酶/RNA酶的水；如果需要，添加无DNA酶/RNA酶的水直至总体积为350μL；

(k)将以下试剂按顺序添加至所述新的2mL微量离心管中：510μL沉淀盐溶液、2μL共沉淀剂的溶液和860μL 100％异丙醇，以形成第二混合物；

(l)涡旋所述第二混合物直至均质，并在室温下孵育所述第二混合物5分钟；

(m)将所述混合物以4,300x g离心10分钟；

(n)弃去所有上清液，并添加1mL 40％异丙醇；

(o)将所述混合物以4,300x g离心2分钟；

(p)弃去所有上清液，并添加1mL 70％乙醇；

(q)将所述混合物以4,300x g离心2分钟；

(r)弃去所有上清液；

(s)将沉淀物在室温下干燥至少10分钟，直至完全干燥；

(t)将所述沉淀物重悬在至少10μL重悬缓冲液中；以及

(u)将缓冲液直接添加到干燥的沉淀物中，并用移液管上下混合30次或更多次。

52.如权利要求51所述的方法，其中：

所述蛋白酶选自由以下组成的组：Arg-C蛋白酶、BNPS-粪臭素、胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶6、胱天蛋白酶9、糜蛋白酶-高特异性(C端至[FYW]，不在P之前)、梭菌蛋白酶(梭菌肽酶B)、因子Xa、颗粒酶B、LysC、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、胃蛋白酶(pH1.3)、蛋白酶K、嗜热菌蛋白酶、Asp-N内肽酶、胱天蛋白酶1、胱天蛋白酶4、胱天蛋白酶7、胱天蛋白酶10、糜蛋白酶-低特异性(C端至[FYWML]，不在P之前)、CNBr、甲酸、羟胺、LysN、胃蛋白酶、葡萄球菌肽酶I、凝血酶、Asp-N内肽酶+N-末端Glu、胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶5、胱天蛋白酶8、肠激酶、谷氨酰内肽酶、氧碘苯甲酸、NTCB(2-硝基-5-硫氰基苯甲酸)、脯氨酸-内肽酶、烟草蚀纹病毒蛋白酶和胰蛋白酶；

所述还原剂选自由以下组成的组：Tris-2-羧乙基膦盐酸盐(TCEP)、碳、氰化物、一氧化碳、二硫苏糖醇(DTT)、亚磷酸盐、次磷酸盐、亚磷酸、还原糖、抗坏血酸、甲酸、草酸、二异丁基氢化铝、肼、过氧化氢、碘化物、硫代硫酸盐、连二硫酸盐、二氧化硫、亚硫酸盐化合物、含有Sn2+离子的化合物、含有Fe2+离子的化合物、硼氢化钠、乙硼烷、锌汞齐、钠铅合金、钠汞齐、新生(原子)氢、氢化铝锂、巯基乙醇；

所述载体核酸为RNA或DNA；

所述裂解试剂选自由以下组成的组：裂解盐、NaCl、KCl、(NH4)2SO4、盐酸胍、氯化铵、洗涤剂、两亲性分子、非离子洗涤剂、阴离子洗涤剂、阳离子洗涤剂、两性离子洗涤剂、TritonX-100、Nonidet P-40、脱氧胆酸钠、CHAPS、SDS、乙基三甲基溴化铵、金属离子、碳水化合物、甘油、金属螯合剂和EDTA；

所述沉淀盐选自由以下组成的组：乙酸钠、乙酸铵、氯化钠、氯化锂、碘化钠和乙酸钾；并且

所述共沉淀剂选自由以下组成的组：PEG、线性聚丙烯酰胺、糖原、RNA、DNA。

53.如权利要求51或52所述的方法，其中：

由所述蛋白酶粉制成的溶液浓度为10至40mg/mL；

由所述还原剂制成的溶液浓度为50至250mg/mL；

由所述载体核酸制成的溶液浓度为0.2至2ug/uL；

所述裂解试剂的浓度为2M至20M；

所述沉淀盐的浓度为5M至10M；以及

含有所述共沉淀剂的溶液为80％至100％w/w。

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