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CN115300635A - 治疗肺动脉高压的吸入剂的仿生肺表面活性物载体和药物 - Google Patents

治疗肺动脉高压的吸入剂的仿生肺表面活性物载体和药物 Download PDF

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CN115300635A
CN115300635A CN202210957604.XA CN202210957604A CN115300635A CN 115300635 A CN115300635 A CN 115300635A CN 202210957604 A CN202210957604 A CN 202210957604A CN 115300635 A CN115300635 A CN 115300635A
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何海青
杜淑雯
张灵敏
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Abstract

本发明涉及一种仿生肺表面活性物载体，其由总脂和模拟肽制备而成，在所述总脂中，二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷酯酰乙醇胺‑聚乙二醇2000、胆固醇的质量比为8‑12：1：1：1；所述肺表面活性物模拟肽为SP‑B蛋白的模拟肽和/或SP‑C蛋白的模拟肽。所述仿生肺表面活性物载体具有装载率高，稳定性高的优点。本发明还涉及由所述仿生肺表面活性物载体装载治疗肺动脉高压的药物的吸入剂剂型，其使所载药物获得更均匀的肺内分布，所述吸入剂药物在成分和生理功能上更接近天然肺表面活性物，可以延缓产品的降解、提高药物的利用率，达到很好的肺动脉高压治疗效果。

Description

治疗肺动脉高压的吸入剂的仿生肺表面活性物载体和药物
技术领域
本发明涉及药物剂型领域，具体是涉及治疗肺动脉高压的吸入剂的载体和药物及其制备方法。
背景技术
常见的肺部疾病包括哮喘、支气管炎、肺结核、感染和非感染性肺炎、慢性阻塞性肺病、肺动脉高压、肺癌等。其中肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension，PAH)是以肺动脉压力增高、肺血管重塑为特征的一种恶性肺部疾病。PAH会导致患者右心功能衰竭直至死亡，致残率和病死率极高。传统上对于PAH采用抗凝药、利尿剂、地高辛、洋地黄、吸氧等支持性治疗为主，疗效非常有限。近年来通过研究PAH发病机制，开发出针对前列环素、一氧化氮、内皮素-1等多种信号通路的靶向药。这些靶向药以口服为主，包括前列环素受体激动剂(曲前列尼尔，贝前列素、司来帕格)、5型磷酸二酯酶抑制剂(西地那非，他达拉非)、内皮素受体拮抗剂(波生坦，安立生坦，马昔腾坦)、可溶性鸟苷酸环化酶激动剂(利奥西呱)等，兼有少量注射剂型(依前列醇，曲前列尼尔)。上述靶向药能降低肺动脉压力、改善PAH症状，但患者长期预后仍不理想、致死率仍居高不下。
联合治疗是指联用两种或两种以上不同作用途径的药物进行治疗。联合用药可以发挥药物的最大疗效，降低毒性，减少药物剂量。对于PAH这种已经明确有多个致病通路的疾病，理论上联合治疗较单药治疗效果更好。PAH靶向药的联合应用有序贯联合治疗和起始联合治疗两种策略。近年发布的多项随机对照试验结果显示，序贯联合治疗和起始联合治疗均可显著减少PAH患者临床恶化事件发生。因此，中国肺动脉高压诊断与治疗指南(2021版)推荐，除PAH危险分层为低危的患者或老年患者，危险分层为中危或高危的患者均推荐使用联合治疗。目前最常用的PAH联合靶向治疗是5型磷酸二酯酶抑制剂与内皮素受体拮抗剂的联合，例如波生坦+西地那非，安立生坦+他达那非等。
同时，这些口服和注射药的毒副作用和药源性不良反应始终无法消除。例如，作为PAH的临床一线用药，波生坦有致畸作用和肝毒性、西地那非可引起严重心脏事件和视力异常。针对现有PAH治疗药物不良反应多、生物利用度低、预后差等局限性，对现有药物进行剂型改变、或通过剂型调整使一些难以成药的靶点得以成药，成为治疗PAH的重要思路。
与口服和注射相比，吸入给药治疗PAH和其他肺部疾病有着巨大的优势。首先，肺部是PAH的直接病变部位，吸入给药可将药物直接递送到病变组织；其次，肺部吸收面积大，起效快；再次，吸入给药避免了首过效应、生物利用度高，可以减小药物用量并降低药物在人体其他组织的分布及相关不良反应。因此，吸入给药已经成为哮喘和慢性阻塞性肺病等肺部疾病最有效的治疗手段，也是治疗PAH理论上的最佳给药途径。但目前PAH的吸入性药物非常有限，仅有伊洛前列素、曲前列尼尔等少数种类有吸入剂型，而绝大部分常用靶向药例如波生坦、西地那非等均没有实现能有效应用的吸入剂型。
吸入给药虽然有上述优势，但也面临药物的有效性、免疫原性和安全性等三个关键问题需要解决，也就是如何提高药物在肺部的驻留、如何避免药物被肺部免疫系统识别和清除、以及如何避免药物(主要是制剂中的辅料)损伤肺部和人体。前两个问题涉及肺部防御系统对外源物质的清除，第三个问题则主要由药物制剂成分决定。肺部防御系统主要由免疫细胞和肺表面活性物(pulmonary surfactant)组成。肺表面活性物是由肺泡II型上皮细胞合成和分泌的一种脂-蛋白复合物，覆盖在肺泡表面。外源物质进入肺部后，会被肺表面活性物阻挡、经过纤毛运动排出，或被免疫细胞识别清除。因此，吸入性药物为了提高肺部驻留、减小免疫原性，需要克服肺表面活性物的阻拦和免疫细胞的识别。
肺表面活性物中的脂质约占90％，蛋白约占10％。脂质成分中主要为磷脂酰胆碱(约70-80％)，还包括少量磷脂酰甘油(约8％)、磷脂酰乙醇胺(约8％)、胆固醇(约8％)等。蛋白成分中主要是表面活性物相关蛋白(surfactant associated protein，SP蛋白)。SP蛋白有四种，包括亲水性的SP-A、SP-D蛋白和疏水性的SP-B、SP-C蛋白。后两者虽然含量较少(约1-2％)，但对于维持肺泡结构有着重要作用，特别是SP-B是肺表面活性物中维持肺泡表面张力的关键组分，并能防止肺表面活性物被磷脂酶降解(Hite RD,et al.Surfactantprotein B inhibits secretory phospholipase A2 hydrolysis of surfactantphospholipids.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol.2012)。基于SP-B的氨基酸序列和结构特征，一种含21个氨基酸的多肽可以模拟SP-B生理功能(Cochrane CG,etal.Pulmonary surfactant protein B(SP-B):structure-functionrelationships.Science.1991)。这种多肽的氨基酸序列是KLLLLKLLLLKLLLLKLLLLK(KL4多肽)，或RLLLLRLLLLRLLLLRLLLLR(RL4多肽)，KL4多肽也被称作西那普肽(Sinapultide)。还有其他几种多肽也可以模拟SP-B或SP-C的功能。
肺表面活性物在临床上广泛用于新生儿呼吸窘迫综合征的治疗。作为药物的肺表面活性物分天然型和合成型两种。天然型肺表面活性物从牛或猪等动物的肺组织中提取，例如美国的Survanta(守肺佳)和Infasurf、意大利的Curosurf(固尔苏)和国产的珂立苏、肺活通等。合成型肺表面活性物则是根据天然肺表面活性物的主要成分和比例配制，如美国的Exosurf和Lucinactant(芦西纳坦，商品名Surfaxin)。其中Exosurf只含磷脂，而芦西纳坦除磷脂外还加入KL4多肽，在成分、功能、疗效上比Exosurf更接近天然肺表面活性物。与天然型表面活性物相比，合成型肺表面活性物在临床疗效及安全性等方面基本一致，而批次间差异更小、也没有传播动物疾病的潜在危险，有着独特的优势。在PAH动物模型中，SP蛋白含量减少，降低了肺功能(Gutierrez JA,et al.Decreased surfactant proteins inlambs with pulmonary hypertension secondary to increased blood flow.Am JPhysiol Lung Cell Mol Physiol.2001)。因此，补充含SP蛋白或其模拟肽的肺表面活性物，可以直接改善PAH患者的肺功能。
利用磷脂、鞘脂、胆固醇等材料制备脂质体(liposome)作为药物载体已有报道，但脂质体载药主要用于肿瘤等疾病的注射治疗，罕有用于吸入给药。目前代表性的脂质体吸入药物是美国英斯麦德公司(Insmed)开发的阿米卡星脂质体用于治疗感染性肺病(例如禽分枝杆菌感染导致的难治性非结核分枝杆菌肺病)。在该产品中阿米卡星被二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和胆固醇组成的脂质体装载，与静脉注射阿米卡星相比，吸入阿米卡星脂质体延长了阿米卡星在肺部的释放，同时减少了全身暴露，从而降低了全身毒性。国内有向DPPC中加入脂肪醇、表面活性剂、不饱和磷脂等成分并将其作为吸入药物载体装载胰岛素降低血糖水平的尝试(专利申请号CN200610025706)。国外有使用双硬脂酸甘油酯、蜂蜡或硬脂酸配合油酸及乳化剂制成纳米脂质体装载西地那非吸入治疗PAH的报道(Nafee N,etal.Nanostructured lipid carriers versus solid lipid nanoparticles for thepotential treatment of pulmonary hypertension via nebulization.Eur JPharmSci,2018)。但在上述研究中，脂质体各有其构成，且与天然肺表面活性物成分存在较大区别，更缺失了肺表面活性物中关键的SP蛋白，因此不论从成分、理化性质、还是生理功能来说，都与天然肺表面活性物有很大的差异。
发明内容
基于此，本发明的目的是提供一种治疗肺动脉高压的吸入剂的仿生肺表面活性物载体和药物，由本发明所述仿生肺表面活性物载体制备的药物，具有装载性高，稳定性好，生物活性好的特点。
为达到上述目的，本发明通过包括以下的技术方案实现。
本发明的第一个方面，提供一种仿生肺表面活性物载体。
一种仿生肺表面活性物载体，其由总脂和肺表面活性物模拟肽制备而成，在所述总脂中，二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷酯酰乙醇胺-聚乙二醇2000、胆固醇质量比为8-12：1：1：1；所述总脂和所述模拟肽的质量比为100：0.8-1.2。
在其中一些实施例中，所述仿生肺表面活性物载体由总脂和模拟肽制备而成，其中总脂由二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷酯酰乙醇胺-聚乙二醇2000、胆固醇四种成分构成，在所述总脂中，二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷酯酰乙醇胺-聚乙二醇2000、胆固醇的质量比为9-11：1：1：1；更优选二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷酯酰乙醇胺-聚乙二醇2000、胆固醇质量比为10：1：1：1。
在其中一些实施例中，所述总脂和所述模拟肽的质量比为100：0.9-1.1，最优选为100：1。
在其中一些实施例中，所述肺表面活性物模拟肽为SP-B蛋白的模拟肽和/或SP-C蛋白的模拟肽。
在其中一些优选的实施例中，所述SP-B蛋白的模拟肽选自SEQ ID NO.1-7中至少一种。更优选为SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2。
在其中一些优选的实施例中，所述SP-C蛋白的模拟肽选自SEQ ID NO.8-10中至少一种。
本发明的第二方面，是提供仿生肺表面活性物载体在制备治疗肺动脉高压的吸入剂药物中作为药物载体的应用。
本发明的第三方面，是提供一种治疗肺动脉高压的吸入剂药物。
一种治疗肺动脉高压的吸入剂药物，其由上述仿生肺表面活性物载体装载治疗肺动脉高压的药物制备而成。
在其中一些实施例中，所述药物为西地那非和波生坦中的一种或两种。
在其中一些优选的实施例中，所述药物为西地那非和波生坦。
在其中一些实施例中，所述吸入剂药物中的药脂比1：20-40。
在其中一些优选的实施例中，所述吸入剂药物中的药脂比1：30-40，最优比为：1：30。
本发明的第四方面，是提供所述仿生肺表面活性物载体的制备方法。
一种所述仿生肺表面活性物载体的制备方法，包括以下步骤：
将所述二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷酯酰乙醇胺-聚乙二醇2000、胆固醇的氯仿溶液中加入模拟肽，混匀，恒温水浴旋转蒸发直至氯仿溶剂蒸发，形成均匀的脂质薄膜层；
加入水，使脂质薄膜层充分水化，水化完全后将水化溶液先用的醋酸纤维素膜反复挤出，获得仿生肺表面活性物。
本发明的第五方面，是提供所述治疗肺动脉高压的吸入剂药物的制备方法。
一种所述治疗肺动脉高压的吸入剂药物的制备方法，包括以下步骤：
将所述二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷酯酰乙醇胺-聚乙二醇2000、胆固醇的氯仿溶液中加入所述模拟肽，以及所述治疗肺动脉高压的药物，混匀，恒温水浴旋转蒸发直至氯仿溶剂蒸发，形成均匀的脂质薄膜层；
加入水，使脂质薄膜层充分水化，水化完全后将水化溶液先用的醋酸纤维素膜反复挤出，获得治疗肺动脉高压的吸入剂药物。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
将仿生肺表面活性物(bPS)作为药物载体用于治疗肺动脉高压等肺部疾病具有多种优势，除了已经公开的bPS自身即具有治疗作用，能够降低肺泡表面张力，改善肺功能之外，(1)所述bPS与天然肺表面活性物的成分相似，是理想的药物制剂辅料，避免了对肺部造成的损伤；(2)本发明所述bPS与天然肺表面活性物的功能相似，使所搭载药物可以逃避免疫细胞识别和天然肺表面活性物阻拦，提高了药物在肺部驻留和渗透；(3)发明人发现合适组成的bPS使所载药物(西地那非和波生坦)获得更均匀的肺内分布。与现有的利用脂质体进行载药的方式相比，本发明提供的bPS通过在合适的总脂成分中加入SP-B蛋白和/或SP-C蛋白的多肽模拟物(例如KL4多肽或RL4多肽)，在成分和生理功能上更接近天然肺表面活性物，降低了产品在肺部的表面张力、提高了产品粒径稳定性，可以增加产品在肺部的分布、延缓产品的降解、提高药物的利用率。
附图说明
图1.不同药脂比条件下制备的bPS-SF-BT的粒径和分散系数稳定性分析。
图2.bPS-SF-BT的粒径电位和透射电镜图。
图3.不同剂量条件下药物和bPS的细胞活力结果示意图。
图4.PAH大鼠治疗前后的肺动脉压力波形图和分析结果示意图。
图5.bPS-SF-BT对肺动脉管腔狭窄和闭塞的治疗作用结果示意图。
图6.bPS-SF-BT对肺动脉高压引发右心肥大的治疗作用结果示意图。
图7.不含和含有模拟肽的bPS-SF-BT与疏水性固体的接触角测试结果比较。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明的一些实施例中涉及一种仿生肺表面活性物载体(bPS)，其由总脂和肺表面活性物模拟肽制备而成，在所述总脂中，二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷酯酰乙醇胺-聚乙二醇2000、胆固醇质量比为8-12：1：1：1；所述总脂和所述模拟肽的质量比为100：0.8-1.2。同时还涉及到有所述的仿生肺表面活性物载体附载治疗肺动脉高压的药物，制备成吸入剂。
相比于口服或注射给药，对药物进行吸入剂型修饰是治疗肺动脉高压疾病的新思路。本发明所提供的bPS装载药物的方法能够实现对一种或多种药物的有效包封和递送，其在以下实施例实验中中同时装载肺动脉高压靶向药西地那非和波生坦的包封率最高分别可达到93.15％和74.57％，实现了药物的良好包封。bPS装载药物后通过吸入给药这一途径治疗肺部疾病能够避免药物的肝脏首过效应，提高生物利用度，达到缓释、减少给药频率的作用。bPS装载的西地那非和波生坦经吸入后首先分布到肺部，进而抑制肺动脉平滑肌细胞增殖，扩张肺动脉血管，降低平均肺动脉压力，进一步减轻右心肥厚，提高心功能改善预后，达到肺动脉高压治疗效果。
研究显示直径大于5μm的药物颗粒主要沉积在上呼吸道，直径在1～5μm药物颗粒可沉积在空气流速较低的中央和远端气道，而直径小于1μm的药物颗粒可以在呼吸道中大量沉积，并最终到达肺泡区。本发明中所制备的bPS载药后平均粒径约为123.37nm，颗粒尺寸达到沉积肺泡的理论要求。
研究表明纳米材料的细胞毒性是其临床转化的严重且亟待解决的问题之一。本发明中所用的bPS各成分均为天然肺表面活性物的主要成分，避免了制剂材料对细胞的毒性。
除用药安全性外，减少药物免疫原性、防止药物的体内消除是另一需要解决的问题。研究发现许多大分子药物如多肽、蛋白质和核酸容易聚集并被巨噬细胞清除。本发明中所制备的bPS载药后平均粒径约为123.37nm，颗粒尺寸可规避肺泡巨噬细胞的捕获和吞噬；同时bPS具有肺泡亲和性，减少免疫刺激，使得药物能够长时间驻留肺部，延长药物稳定性和生物利用度。
本发明模拟肽(analogue)的氨基酸序列如表1和表2所示。
Figure BDA0003791987980000091
Figure BDA0003791987980000092
Figure BDA0003791987980000101
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1：薄膜分散法制备含SP-B模拟肽的仿生肺表面活性物
所述制备方法包括以下步骤：
用氯仿分别溶解二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二棕榈酰磷酯酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DPPE-PEG2000)、胆固醇至浓度100mg/ml，用氯仿:甲醇＝1:1(v:v)分别溶解二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、SP-B模拟肽KL4至浓度10mg/ml。向50ml圆底烧瓶中加入5ml氯仿，依次加入DPPC 3.923ml(392.3mg)、DPPG 3.923ml(39.23mg)、DPPE-PEG2000 0.3923ml(39.23mg)、胆固醇0.3923ml(39.23mg)，总脂质量为510mg。再加入总脂质量1％的KL4多肽510ul(5.1mg)，超声震荡30s充分混匀瓶中各成分，于50℃恒温水浴、180rpm转速的条件下旋转蒸发2h，直至氯仿溶剂蒸发，圆底烧瓶底部形成均匀的脂质薄膜层。
向旋转蒸发后的瓶中加入5-10ml水，40℃水浴超声水化15min，使脂质层充分水化，水化完全后将水化溶液先用400nm孔径的醋酸纤维素膜反复挤出21次，再用200nm孔径的醋酸纤维素膜反复挤出21次后获得仿生肺表面活性物，在后文中简写为bPS。最后将溶液用50kDa超滤管以5000rpm转速离心20min若干次，直至浓缩到所需浓度，并收集储存于4℃备用。
实施例2：仿生肺表面活性物包载两种PAH治疗药物西地那非和波生坦
按实施例1所提供的方式溶解bPS各原料成分，再将西地那非(Sildenafil，SF)用氯仿:甲醇＝1:1(v:v)溶解成浓度为10mg/ml，波生坦(Bosentan，BT)用氯仿溶解成浓度为10mg/ml。向圆底烧瓶中加入实施例1提供的各原料成分，再按药物总量与总脂质成分的比例(即药脂比)为1:10至1:50(w:w)的相应比例投入西地那非、波生坦，超声震荡混匀，后续旋蒸等步骤与实施例1一致。获得的仿生肺表面活性物包载两种PAH治疗药物西地那非和波生坦，在后文中简写为bPS-SF-BT。
为了对bPS-SF-BT进行稳定性测试，将上述按不同药脂比制备的bPS-SF-BT在4℃保存5天，每天取适量用水稀释后使用纳米激光粒度仪(型号Nano ZS90)测定其粒径和分散系数，根据粒径和分散系数的变化情况进行稳定性分析，结果见图1。本发明所述仿生肺表面活性物在较大的药脂比范围内制备的稳定性均较好，且按1：30药脂比制备的产品稳定性最好。
实施例3：测定bPS-SF-BT中药物的包封率
用高效液相色谱法(HPLC)测定不同药脂比条件下bPS-SF-BT中西地那非和波生坦的含量，色谱条件为ACE 5C18-AR柱(250mm×4.6mm,5μm)，柱温箱40℃，流动相为乙腈:0.1％三氟乙酸水溶液(70:30，v/v)，检测波长254nm，流速1ml/min，样品体积10μL。通过HPLC先建立西地那非和波生坦标准品的浓度标准曲线，再由此测算出不同药脂比条件下，bPS-SF-BT中两种药物的含量(表3.1-3.5)。
结果显示药脂比为1:30时bPS-SF-BT的药物包封率相对最优，分别为西地那非93.15％，波生坦74.57％，证实仿生肺表面活性物具有良好的药物包封效率。本发明的实施例4-实施例9中，除非特殊说明，均使用药脂比为1:30的bPS-SF-BT。表3.1至表3.5：单独装载西地那非、波生坦的包封率，以及同时装载西地那非与波生坦的包封率。
表3.1
Figure BDA0003791987980000111
Figure BDA0003791987980000121
表3.2
Figure BDA0003791987980000122
表3.3
Figure BDA0003791987980000123
表3.4
Figure BDA0003791987980000124
Figure BDA0003791987980000131
表3.5
Figure BDA0003791987980000132
实施例4：鉴定bPS-SF-BT的物理特性
按实施例2得到装载西地那非和波生坦两种药物的仿生肺表面活性物bPS-SF-BT后，取适量bPS-SF-BT用水稀释后采用纳米激光粒度仪(型号Nano ZS90)测定其平均粒径约为123.37nm，平均电位约为-31.67mV，分散系数为0.08(图2A)。取稀释后的10μl bPS-SF-BT滴到预先用碳膜包被好的铜网上，用2％磷钨酸溶液(pH 7.0)染色，室温下自然静置干燥后用透射电子显微镜(型号JEM-1400)对bPS-SF-BT颗粒进行观察测量，显示其粒子大小与纳米激光粒度仪所测基本一致(图2B)。因此，所制备的bPS-SF-BT具备纳米药物的基本物理特性。
实施例5：检测bPS-SF-BT的细胞毒性
小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞MLE-12用DMEM/F12培养基(含10％胎牛血清、1％的青霉素/链霉素双抗溶液)培养并用于细胞毒性测试。细胞以1×104个/孔的密度均匀种于96孔板中，24小时后更换新鲜的培养基，并加入浓度范围为20-200ug/ml的西地那非(SF)、波生坦(BT)、西地那非和波生坦(SF-BT)和bPS-SF-BT，每种浓度设5个重复孔。加药24h后加入10％CCK-8试剂，将其置于细胞培养箱中反应1.5-2h后使用酶标仪(型号Synergy H1)测定波长为450nm处的吸光度。细胞活力的计算公式为：活力百分比(％)＝(OD加药-OD空白)/(OD细胞-OD空白)*100。
从图3结果可知，单独西地那非、单独波生坦或两药联合在一定剂量下具有抑制细胞增殖的细胞毒性，而bPS在测试剂量范围内细胞活力皆在90％以上，呈现出很低的细胞毒性。而在测试剂量范围内bPS-SF-BT的细胞活力均处于70％以上，具有良好的安全性。
实施例6：bPS-SF-BT对肺动脉高压大鼠的治疗效果评价一(肺动脉压力测量)
选用Sprague Dawley大鼠(雄性，200克)建立肺动脉高压的动物模型。通过颈背部一次性注射野百合碱(MCT)50mg/kg构建PAH模型。在注射7天后开始对大鼠施以药物治疗，未经bPS装载的西地那非和波生坦为口服灌胃给药，bPS-SF-BT使用小动物雾化给药仪(型号YLS-8B)进行吸入给药。给药剂量为：西地那非6mg/kg，波生坦11mg/kg，给药频率每3天一次，直至MCT注射后的第25天。
在MCT注射后第25天时进行血流动力学评价，采用导管法测定各组的右心室收缩压(RVSP)。具体测量方法为：将大鼠用4％三溴乙醇腹腔注射麻醉后仰卧位固定于手术台，腹部剃去毛发后于胸口处找出并分离颈外静脉，使用预充1000U/ml肝素钠溶液的PE50导管，直接经颈外静脉进入右心室，另一端与血压换能器相连，待出现右心室压力信号后，使用生理信号记录分析系统(型号BL-420N)记录实时RVSP的压力波形并计算RVSP。
图4结果显示，正常组的RVSP(等同于平均肺动脉压)约13mmHg，肺高压组的RVSP约47mmHg，口服西地那非和波生坦有一定的降压效果，RVSP在35mmHg，而雾化吸入给药bPS-SF-BT降压效果更佳，RVSP约17mmHg，说明以bPS作为西地那非和波生坦的药物载体的吸入给药能够达到非常优秀的PAH治疗效果。
实施例7：bPS-SF-BT对肺动脉高压大鼠治疗效果评价二(肺动脉管腔增生程度测定)
肺动脉重塑是PAH的主要病理特征，主要指肺血管因内膜损伤、中层肥厚、外膜纤维化以及基底膜硬化等原因导致肺动脉管腔进行性狭窄、闭塞，肺血管阻力不断升高、肺动脉压力不断增大。
在实施例6结束，即MCT注射后第25天完成血流动力学评价后，解剖取肺组织，经生理盐水漂洗后用4％多聚甲醛固定24至48h，随后对组织进行石蜡切片并进行苏木素-伊红染色(hematoxylin and eosin，HE)，观测肺小动脉的形态。具体步骤为：
(1)固定后的肺组织由低浓度酒精到高浓度的酒精逐级脱水，并进行浸蜡与包埋，切片后展片，石蜡切片于二甲苯中脱蜡5-10min，然后经无水，95％乙醇，85％乙醇，75％乙醇各5min，水冲洗1min；
(2)苏木素染液染色3-5min，水洗1-2min；
(3)0.8％-1％的盐酸酒精分化，用稀碳酸锂水溶液返蓝，然后水洗1-2min；
(4)伊红染液染色1-2sec，不需水洗，直接放入95％乙醇，无水乙醇中脱水1-2min；
(5)二甲苯透明、封固、镜检。
通过图5的肺组织肺门横切的HE染色结果我们可以观察到各测试组中肺血管的变化情况。PAH会导致大鼠肺动脉管腔严重狭窄和闭塞，口服西地那非和波生坦组对PAH大鼠的肺动脉管腔狭窄、闭塞有一定的抑制作用，而雾化吸入给药bPS-SF-BT的抑制作用更加明显，说明以bPS作为西地那非和波生坦的药物载体的吸入给药能够更好的抑制肺动脉管腔狭窄和闭塞，从而抑制肺动脉压力的升高。
实施例8：bPS-SF-BT对肺动脉高压大鼠治疗效果评价三(右心肥厚指数测定)
肺动脉高压会引起右心室代偿性肥大，导致心功能下降和晚期的右心衰竭。在实施例6结束，即注射后第25天完成血流动力学评价后，解剖取心脏组织并用生理盐水漂洗，去除心房、心耳和大血管，分离左、右心室，滤纸吸干血液和多余水分，使用分析天平分别测定右心室(right ventricular，RV)和左心室+室间隔(left ventricular+septum，LV+S)重量，由此得到右心肥大指数，其计算公式为：RV/(LV+S)。
从图6结果可知，PAH导致了大鼠严重右心肥大，口服西地那非和波生坦(口服制剂)虽然对PAH大鼠的右心肥大有一定的抑制作用，但抑制效果无统计学差异。而雾化吸入给药bPS-SF-BT的抑制作用非常明显，与PAH组相比有统计学差异，说明以bPS作为西地那非和波生坦的药物载体的吸入给药更好的抑制了PAH引起的右心肥大，改善了心脏功能。
实施例9：不含和含有模拟肽的bPS-SF-BT与疏水性固体的接触角测试结果比较
按实施例2所提供的方式，以1:30的药脂比制备两种类型的bPS-SF-BT，其一为完全按实施例2中的成分组成，即含有KL4模拟肽的bPS-SF-BT；其二为去除KL4模拟肽、其他成分组成保持不变，即不含KL4模拟肽的bPS-SF-BT。上述两种bPS-SF-BT滴加到铺设Parafilm的疏水性固体表面上，使用接触角测定仪(型号Kruss DSA-100)进行测定和比较。在固体表面性质已知的情况下，通过接触角测试可获得液体的亲疏水性质，即固体表面的性质和液体性质同性则相吸(接触角小),异性则相斥(接触角大)。
由图7结果可见，含KL4模拟肽的bPS-SF-BT比不含KL4模拟肽的bPS-SF-BT在疏水性固体上的接触角小，证实含有KL4模拟肽的bPS-SF-BT的疏水性更大。因此，本发明提供的bPS通过加入SP-B蛋白和/或SP-C蛋白的多肽模拟物(例如KL4多肽或RL4多肽)，在成分和生理功能上更接近天然肺表面活性物，降低了产品在肺部的表面张力，从而可以增加产品在肺部的分布、提高药物的利用率。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (14)

1.一种仿生肺表面活性物载体，其特征在于，其由总脂和模拟肽制备而成，在所述总脂中，二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷酯酰乙醇胺-聚乙二醇2000、胆固醇的质量比为8-12：1：1：1；所述总脂和所述模拟肽的质量比为100：0.8-1.2，所述肺表面活性物模拟肽为SP-B蛋白的模拟肽和/或SP-C蛋白的模拟肽。
2.根据权利要求1所述的仿生肺表面活性物载体，其特征在于，在所述总脂中，二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷酯酰乙醇胺-聚乙二醇2000、胆固醇的质量比为9-11：1：1：1；更优选二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷酯酰乙醇胺-聚乙二醇2000、胆固醇质量比为10：1：1：1。
3.根据权利要求1所述的仿生肺表面活性物载体，其特征在于，所述总脂和所述模拟肽的质量比为100：0.9-1.1，最优选为100：1。
4.根据权利要求1-3任一项所述的仿生肺表面活性物载体，其特征在于，所述SP-B蛋白的模拟肽选自SEQ ID NO.1-7中至少一种。
5.根据权利要求4所述的仿生肺表面活性物载体，其特征在于，所述SP-B蛋白的模拟肽为SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2。
6.根据权利要求1-3任一项所述的仿生肺表面活性物载体，其特征在于，所述SP-C蛋白的模拟肽选自SEQ ID NO.8-10中至少一种。
7.权利要求1-6任一项所述的仿生肺表面活性物载体在制备治疗肺动脉高压的吸入剂药物中作为药物载体的应用。
8.一种治疗肺动脉高压的吸入剂药物，其特征在于，其以权利要求1-6任一项所述的仿生肺表面活性物载体装载治疗肺动脉高压的药物制备而成。
9.根据权利要求8所述的治疗肺动脉高压的吸入剂药物，其特征在于，所述药物为西地那非和波生坦中的一种或两种。
10.根据权利要求9所述的治疗肺动脉高压的吸入剂药物，其特征在于，所述药物为西地那非和波生坦。
11.根据权利要求8所述的治疗肺动脉高压的吸入剂药物，其特征在于，所述吸入剂药物中的药脂比1：20-40。
12.根据权利要求11所述的治疗肺动脉高压的吸入剂药物，其特征在于，所述吸入剂药物中的药脂比1：30-40，优选为1：30。
13.根据权利要求9所述的治疗肺动脉高压的吸入剂药物，其特征在于，所述西地那非和波生坦的质量比为1：4至4：1，优先地，为1：2至2：1，最优选为1：2。
14.一种权利要求8-13任一项所述治疗肺动脉高压的吸入剂药物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将所述二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷酯酰乙醇胺-聚乙二醇2000、胆固醇的氯仿溶液中加入所述模拟肽，以及所述治疗肺动脉高压的药物，混匀，恒温水浴旋转蒸发直至氯仿溶剂蒸发，形成均匀的脂质薄膜层；加入水，使脂质薄膜层充分水化，水化完全后将水化溶液用醋酸纤维素膜反复挤出，获得治疗肺动脉高压的吸入剂药物。
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