CN115305234B

CN115305234B - 一种制备间充质干细胞的方法、间充质干细胞和应用

Info

Publication number: CN115305234B
Application number: CN202211194577.1A
Authority: CN
Inventors: 龚士欣; 顾雨春; 李楠; 彭钦清; 吴理达
Original assignee: Chengnuo Regenerative Medical Technology Beijing Co ltd
Current assignee: Chengnuo Regenerative Medical Technology Beijing Co ltd
Priority date: 2022-09-28
Filing date: 2022-09-28
Publication date: 2023-01-17
Anticipated expiration: 2042-09-28
Also published as: WO2024066156A1; CN115305234A

Abstract

本发明提供了一种制备间充质干细胞（MSC）的方法、间充质干细胞和应用。该方法通过诱导EPSC分化获得滋养层干细胞（TSC），进一步诱导TSC分化获得成熟稳定的MSC，大大提高了MSC产量。本发明分化获得的MSC增殖速度较快，倍增时间约1.5天，且连续传代16次或更多，间充质干细胞表面标志表达水平仍保持正常，通过该传代可大量制备EPSC来源的MSC；此外，本发明制备的MSC具有分泌较高水平FGF4的能力，有利于开发成为一种治疗2型糖尿病的细胞治疗剂。

Description

一种制备间充质干细胞的方法、间充质干细胞和应用

技术领域

本发明涉及细胞生物学领域，具体涉及一种制备间充质干细胞的方法、间充质干细胞和应用。

背景技术

2017年，剑桥大学韦尔科姆基金会桑格研究所刘澎涛博士领导的团队首次利用小鼠发育最初期的4-8个细胞胚胎，培育出了一种全能干细胞系——扩展多潜能干细胞（Expanded Potential Stem Cells，EPSC）。新细胞不仅能发育成任何类型的细胞，且发育潜力超过胚胎干细胞（ESC）和诱导性多能干细胞（iPSC）等，对人类的再生医学意义重大，有望为研究治疗流产和发育紊乱问题开辟新方向（Establishment of mouse expandedpotential stem cells）。

随后，邓宏魁研究组利用EPSC细胞建立了快速制备基因修饰动物模型的技术(Liet al.， 2019a)，并利用人EPSC细胞高效制备功能性肝细胞（EPS-Heps）(Wang et al.，2020)，与传统人多能干细胞制备的肝细胞相比，EPS-Heps在转录谱上更类似于人原代肝细胞。该研究结果突出了EPSC细胞产生功能性细胞的应用潜力，可以为体外制备功能细胞提供更好的来源。为了突破EPSC培养依赖饲养层细胞的制约，邓宏魁研究组通过对饲养层分泌的细胞因子和胞外基质等进行研究，建立了成分确定的，无异源的培养体系（xeno-freeEPS culture condition）。无饲养层、无异源体系培养的人EPCS细胞能够在体外长期稳定地培养60代以上，且能维持人EPSC细胞的基本性质（Chemically defined and xeno-freeculture condition for human extended pluripotent stem cells）。

间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，MSC）是Freidenstein等于1976年首次在骨髓里发现的一群贴壁生长细胞，形态和成纤维细胞相似，呈克隆性增殖。后研究发现间充质干细胞来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细胞，广泛存在于人体多种组织中，具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等潜能。

间充质干细胞可以从各种人体组织如骨髓中分离出来，脂肪组织，脐带血，外周血，新生儿组织，胎盘等，但是可从成人组织中获得的间充质干细胞的数量有限，并且需要侵入性程序来分离间充质干细胞，并且会给供体带来意想不到的风险。

作为这些成体来源的间充质干细胞的替代方案，现有技术已报道了由诱导人多能干细胞分化为间充质干细胞的方法。然而，迄今为止已知的方法存在周期较长、产量较低、异种病原体污染等问题，不利于间充质干细胞作为细胞治疗剂的商品化。例如，专利申请CN110713973B依次对多能干细胞诱导分化成前体间充质干细胞以及成熟间充质干细胞，分化时间长达30天。Xiaofang Wang 等（Immune modulatory mesenchymal stem cellsderived from human embryonic stem cells through a trophoblast-like stage）通过诱导类滋养层干细胞分化最终获得MSC，分化时间虽然缩短了，但是后续的传代时间约10天，细胞增殖缓慢，且传代5代后细胞开始出现衰老；专利申请CN114540282A中通过将iPSC形成拟胚体诱导MSC分化，分化方案比较复杂，且最后获得的MSC可能纯度不高。目前，也没有关于由EPSC分化制备MSC的文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备间充质干细胞的方法，本发明首次以扩展多潜能干细胞为起始细胞，解决了现有技术诱导分化时间较长、传代时间长、细胞增殖缓慢的问题，无血清无异种来源的培养体系解决了安全性问题，并且即使在重复传代培养后，间充质干细胞的特性也得以长期保持。

本发明的另一个目的是提供由该方法制备的间充质干细胞。

为实现上述目的，本发明提供了一种制备间充质干细胞的方法，包括：1）提供扩展多潜能干细胞或包括扩展多潜能干细胞的细胞培养物；2）将所述扩展多潜能干细胞或包括扩展多潜能干细胞的细胞培养物置于滋养层干细胞分化培养基中培养，得到滋养层干细胞或包括滋养层干细胞的细胞培养物；3）将所述滋养层干细胞或包括滋养层干细胞的细胞培养物置于间充质干细胞分化培养基中培养，得到间充质干细胞或包括间充质干细胞的细胞培养物；4）将所述间充质干细胞或包括间充质干细胞的细胞培养物置于所述间充质干细胞扩增培养基中进行传代培养，同时保持间充质干细胞的特性。

进一步，其中所述步骤2）进行4-8天，例如6天。

进一步，其中所述步骤3）包括：所述滋养层干细胞或包括滋养层干细胞的细胞培养物分化培养5-7天（例如5天）得到P1代细胞，P1代细胞继续分化培养6-9天（例如7天）得到所述间充质干细胞或包括间充质干细胞的细胞培养物。

进一步，所述步骤4）包括：所述P1代细胞传代培养得到P2代细胞，所述P2代细胞传代培养至P3代细胞，所述P3代细胞传代培养至P4代细胞，所述P4代细胞继续进行后续传代培养，每3天传代一次。

进一步，所述滋养层干细胞分化培养基包括基础培养基、2-mercaptoethanol（2-巯基乙醇）、KSR（KnockOut™ 血清替代物）、ITS-X supplement（ITS-X补充剂）、L-AA-pi、EGF（表皮细胞生长因子）、GSK3β受体抑制剂CHIR99021、ALK4/5/7抑制剂A83-01、ALK5抑制剂SB431542、VPA（丙戊酸）、ROCK抑制剂 Y27632和BMP4。

更进一步，所述滋养层干细胞分化培养基包括基础培养基、0.1 mM 2-mercaptoethanol（2-巯基乙醇）、20% KSR（KnockOut™ 血清替代物）、1% ITS-Xsupplement（ITS-X补充剂）、1.5 μg/ml L-AA-pi、50 ng/ml EGF（表皮细胞生长因子）、2 μMCHIR99021、0.5 μM A83-01、1 μM SB431542、0.8 mM VPA（丙戊酸）、5 μM Y27632和10 ng/mL BMP4；所述基础培养基是RKO-E6培养基或者是由DMEM/F-12培养基和IMDM培养基按照1:1配置。

进一步，所述间充质干细胞分化培养基包括α-MEM培养基、1×NEAA细胞培养添加物、1×GlutaMax添加剂、 2-mercaptoethanol、胎牛血清和人血小板提取物。

更进一步，所述间充质干细胞分化培养基由α-MEM培养基、1×NEAA细胞培养添加物、1×GlutaMax添加剂、0.1 mM 2-mercaptoethanol、5%胎牛血清和5% 人血小板提取物组成。

进一步，所述间充质干细胞扩增培养基由α-MEM培养基、1×NEAA细胞培养添加物、1×GlutaMax添加剂、0.1 mM 2-mercaptoethanol、5%胎牛血清和5% 人血小板提取物组成。

进一步，所述步骤2）中获得的滋养层干细胞是表达GATA3和KRTF细胞表面标志物的滋养层干细胞。

进一步，所述步骤3）和步骤4）中获得的间充质干细胞是能够分化成脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌细胞、神经细胞和心肌细胞的多能性间充质干细胞。

进一步，所述步骤3）和步骤4）中获得的间充质干细胞是表达CD44、CD73、CD90、CD105、CD166细胞表面标志物的间充质干细胞。

更进一步，在16代或更多代的间充质干细胞中，表达所述CD44、CD73、CD90、CD105、CD166的细胞比例不低于95%。

进一步，所述步骤3）和步骤4）中获得的间充质干细胞是表达HLADR、CD34、CD45的间充质干细胞。

更进一步，在16代或更多代的间充质干细胞中，表达所述HLADR、CD34、CD45的细胞比例不高于3%。

本发明还提供了一种通过上述方法制备的间充质干细胞。

进一步，所述间充质干细胞是能够分化成脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌细胞、神经细胞和心肌细胞的多能性细胞。

进一步，所述间充质干细胞表达CD44、CD73、CD90、CD105、CD166细胞表面标志物。

进一步，所述间充质干细胞表达HLADR、CD34、CD45的间充质干细胞。

此外，本发明还提供了通过上述方法制备的间充质干细胞在制备治疗2型糖尿病或抗高血糖药物中的应用。

有益效果。

（1）本发明首次以扩展多潜能干细胞为起始细胞成功制备得到间充质干细胞。

（2）本发明首次由扩展多潜能干细胞分化获得滋养层干细胞。

（3）本发明获得的间充质干细胞增殖速度快，传代效率高，倍增时间约为1.5天。

（4）本发明显著提高了间充质干细胞的分化效率，并且即使在长期传代培养（例如16次或更多次传代）后仍表现出稳定保持间充质干细胞特性的优异效果，通过该传代可大量制备人多能干细胞来源的间充质干细胞。

（5）本发明制备的扩展多潜能干细胞来源的间充质干细胞具有分泌较高水平FGF4的能力，对2型糖尿病具有较好的治疗效果。

除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。

术语“或”是指列举的可选择要素中的单个要素，除非上下文明确地另外指出。

术语“包括”或“包含”指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。当使用“包括”或“包含”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。

术语“干细胞”指未分化或未充分分化的细胞，其一方面能够自我复制(self-renewing)，即产生更多的与其自身相同的细胞，另一方面是能够分化为两种或更多种成熟细胞类型。根据干细胞的来源，可以将干细胞分为胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES细胞)和成体干细胞(adult stem cell)。胚胎干细胞可来自早期动物胚胎，例如胚泡(即早期胚胎)的内细胞团，具有分化为身体每种细胞类型的能力(全能性)。成体干细胞存在于成体的各种器官和组织中，具有分化并替换其所在组织的细胞的能力（多能性）。

术语“诱导多能干细胞（iPSC）”指通过人工诱导某些基因的表达从某些成体细胞(如成纤维细胞)获得的具有全能性或多能性的干细胞。在本领域已知的一些方法中，可通过将某些干细胞相关基因转染到非多能细胞如成体成纤维细胞来获得iPSC。转染可以通过使用病毒如逆转录病毒或慢病毒的病毒转导来实现。在一些方法中，转染基因可包括转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc，尽管同时转染其他基因有可能提高诱导效率。在另一些方法中，可利用慢病毒系统采用Oct4、Sox2、Nanog和Lin28基因转化体细胞。在iPSC中诱导表达的基因包括但不限于Oct-3/4；Sox基因家族的某些成员(例如Soxl、Sox2、Sox3和Sox15)；Klf家族的某些成员(例如Klfl、Klf2、Klf4和Klf5)、Myc家族的某些成员(例如C-myc、L-myc和N-myc)、Nanog、Lin28、Tert、Fbx15、ERas、ECAT15-1、ECAT15-2、Tcl1、β-Catenin、ECAT1、Esg1、Dnmt3L、ECAT8、Gdf3、Fth117、Sal14、Rex1、UTF1、Stella、Stat3、Grb2、Prdm14、Nr5a1、Nr5a2或E-cadherin，或其任何组合。目前已经可以从市场上购得用于制备iPSC的各种试剂，如重编程载体、表达盒、培养基等，甚至商业化的iPSC。hiPSC指从人体细胞诱导获得的iPSC。

术语“扩展多潜能干细胞（Expanded Potential Stem Cells，EPSC）”，也称潜能性扩展干细胞，具有“幼稚”或基态的特性，并且具有分化为胚外细胞系（卵黄囊中的滋养细胞和胚外内胚层）以及源自胚泡内部细胞群的固有胚胎细胞的巨大潜力。EPSC不仅能发育成任何类型的细胞，且发育潜力超过胚胎干细胞（ESC）和诱导多能干细胞（iPSC）。EPSC可用于研究和研发，例如疾病建模、治疗筛选、毒性试验、遗传疾病研究和生殖生物学研究。EPSC可用于体外产生功能细胞，目前 EPSC已成功分化为胰腺细胞、神经元、T细胞等多种细胞类型。EPSC可采用文献中报道的方法制备，例如，采用专利US10745670B2中的方法制备。EPSC和iPSC的细胞表面标志物类似，因此EPSC鉴定也使用iPSC干性基因，例如，ESRG、OCT4、SOX2、NANOG、LIN28A、POU5F1。本发明中通过检测细胞表面ESRG、OCT4、SOX2、NANOG的表达情况来鉴别EPSC是否存在。

术语“间充质干细胞（MSC）”通常是指一类具有分化潜能的多能干细胞。其符合国际细胞治疗学会(ISCT)的如下定义：1)MSC可呈集落粘附生长；2)MSC细胞表面表达标记物CD105，CD73和CD90，且不表达内皮、造血或免疫细胞标记，例如CD45，CD34，CD14，CD11b，CD79α，CD19和HLA-DR。MSC细胞可在脂肪、骨髓、牙髓、脐带等不同组织中获得，也可由胚胎干细胞（ESC）或诱导多能干细胞（iPSC）诱导分化而得。例如，本发明的间充质干细胞是由扩展多潜能干细胞（EPSC）经特定培养基诱导分化制备而成。

术语“滋养层干细胞（Trophoblast Stem Cells，TSC）”是胎盘组织细胞的祖细胞，逐步分化为滋养层前体细胞、绒毛膜滋养层、合胞体滋养层和多核巨细胞等。滋养层干细胞可从胚胎滋养外胚层直接获得，或通过自发分化、基因敲除和分离胚体等方式诱导胚胎干细胞分化，但自发分化细胞异质性高，不易控制，基因敲除途径只能反映出细胞分化过程中部分标志性基因表达的变化。Caroline Kubaczka等通过在小鼠胚胎成纤维细胞中瞬时过度表达滋养层关键调节因子 Tfap2c、Gata3、Eomes 和 Ets2 来完全克服DNA 甲基化和组蛋白修饰组成的独特的表观遗传屏障，诱导的滋养层干细胞能够自我更新，在形态、标记基因表达和甲基化模式方面与胚泡来源的滋养层干细胞几乎相同。

术语“明显的”是指容易通过一种或多种标准方法检测出的数量、水平、数值、数目、频率、百分比、尺度、尺寸、量、重量或长度或事件的范围。术语“不明显的”和等效术语是指标准方法不容易检测到或检测不到的数量、水平、数值、数目、频率、百分比、尺度、尺寸、量、重量或长度或事件的范围。在一个实施例中，如果一个事件发生的机会小于5％、4％、3％、2％、1％、0.1％、0.01％、0.001％或更短，那么其是不明显的。

附图说明

图1 实施例1中制备的EPSC的细胞鉴定结果。（A）iPSC和iPSC诱导EPSC形成传代到10代后克隆的形态图；（B）EPSC的AP染色图；（C）Q-PCR检测EPSC和iPSC的KLF17/DPPA3/KLF4/OCT4/DUX4表达情况图，横坐标分别为OCT4、KLF4、KLF17、DPPA3和DUX4，无单位；纵坐标为基因表达量，无单位。

图2 不同培养基诱导EPSC向TSC分化后TSC表面标志基因GATA3/KRT7的Q-PCR结果；EPSC-M1代表M1培养基诱导培养组，EPSC-M2代表M2培养基诱导培养组，EPSC-M3代表M3培养基诱导培养组；横坐标分别为GATA3、KRT7，无单位；纵坐标为GATA3、KRT7的基因表达量，无单位。

图3 EPSC向TSC分化过程第1天和第4天不同培养基诱导组的细胞形态图；通过普通光学显微镜观察（放大倍数100×）。

图4 EPSC向MSC分化过程中TSC和P1-P8代MSC细胞形态图；通过普通光学显微镜观察（放大倍数100×）。

图5 EPSC诱导分化MSC（实施例2中制备的P2代MSC）细胞标志物流式检测结果；通过细胞流式分析，EPSC诱导分化MSC标志物CD44、CD73、CD90、CD105、CD166、HLADR、CD34和CD45表达情况；具体检测方法详见实验方法部分的细胞流式检测；流式检测间充质干细胞标志物CD44、CD73、CD90、CD105、CD166细胞比例应不低于95%，HLADR、CD34和CD45-细胞比例应不高于3%。

图6 EPSC诱导分化的MSC（实施例2中制备的P4代MSC）的成脂、成骨和软骨分化后染色鉴定图；a为诱导分化为成脂细胞的油红O染色鉴定；b为诱导分化的成脂细胞的茜素红S染色鉴定；c为诱导分化的软骨细胞阿辛蓝染色鉴定；其中放大倍数为100×。

图7 EPSC来源MSC（实施例2中制备的P4代MSC）和脐带、牙髓、脂肪来源MSC的FGF4分泌量ELISA检测结果；横坐标分别为EPSC-MSC、脐带-MSC、脂肪-MSC、牙髓-MSC；纵坐标为FGF4分泌量，单位为g/mL。

图8 未分化EPSC残留检测结果；采用RT-qPCR检测FB、EPSC和MSC表面的ESRG、OCT4、NANOG和SOX2基因表达情况；FB代表成纤维细胞，EPSC代表扩展多潜能干细胞，MSC代表实施例2中制备的P4代间充质干细胞；横坐标分别为NANOG、OCT4、ESRG、和SOX2，无单位；纵坐标为NANOG、OCT4、ESRG、和SOX2的基因表达量，无单位。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

试剂与实验方法。

试剂。

本文中提及的部分试剂信息如表1所示。

表1 试剂信息

实验方法。

流式检测步骤。

（1）吸去上清，加入提前预热的DPBS清洗细胞两次；

（2）加入1 mL TRyple，37℃消化5 min，期间每隔2分钟吹打1次；

（3）加入F-12终止消化，250 g离心5 min，去除上清；

（4）加入1mL DPBS清洗细胞1次；

（5）用100 μL 含4% FBS的DPBS重悬细胞；

（6）加入相应的流式检测抗体，4℃孵育30 min；

（7）250 g离心去除上清，加入1 mL DPBS清洗细胞3次；

（8）200 μL DPBS重悬细胞后进行上机检测。

实施例1 由诱导多能干细胞（iPSC）分化制备扩展多潜能干细胞（EPSC）。

本发明以诱导多能干细胞（iPSC）为起始细胞，经特定的培养基培养后诱导分化为扩展多潜能干细胞（EPSC）。所用iPSC可以按照中国专利公开CN109913494A中描述的方法（例如采用重编程因子组合Oct3/4、Klf4、Sox2、P53、L-Myc、Lin28、RARg、Lrh-1）制备，也可以按照中国专利公开CN113462638A中描述的方法(例如采用重编程因子组合OCT4、SOX2、E6和E7)制备，还可以采用市售的重编程试剂盒制备。

本实施例中所用的EPSC诱导和维持培养培养基配方如表2。

表2 EPSC诱导和维持培养培养基配方

由iPSC制备EPSC的步骤具体如下：

（1）培养iPSC，待其生长汇合度达到70% ~ 80%，超净台中操作，吸引器吸去上清，加入提前预热的DPBS清洗细胞两次，以T25培养瓶为例，加入预热的2 mL Tryple:DPBS(1:1)消化液细胞，放于37℃孵育2 min，吸去消化液，继续在37℃消化2 min。拍打培养瓶，使细胞脱落后加入2 mL DMEM/F-12轻轻吹打细胞，转移到15 mL离心管中，1000 rpm×5 min离心，去除上清，加入1 mL含有10 μM ROCKi的E8完全培养基，吹打细胞均匀后，取一部分细胞用台盼蓝染色（AP染色）液稀释5倍，进行细胞计数；

（2）将提前包被Matrigel的培养皿中的DMEM/F12吸去，加入新的含10 μM ROCKi的E8完全培养基，按照1×10⁴ 细胞/cm²的细胞密度将iPSC接种到培养皿中，注意将细胞悬液沿未包被面轻轻加入（勿直接加入包被层上）。将培养皿放置于37℃，5% CO2孵箱中培养；

（3）培养24小时后，从培养箱取出细胞，生物安全柜中操作，将旧液吸去，加入新的提前预热的EPSC完全培养基；

（4）之后每天对细胞进行全换液；

（5）待细胞汇合度达到70-80%时，对细胞进行传代，传代操作方法同iPSC；

（6）细胞传代10代后，观察EPSC形态，并收取P6代细胞采用RT-QPCR检测EPSC相关marker（OCT4/KLF4/KLF17/DPPA3/DUX4）表达情况。其中DPPA3对于早期胚胎发生和多能性维持至关重要，EPSC的DPPA3表达应该明显高于iPSC。

结果如图1所示，传10代的EPSC克隆形态明显隆起，边缘折光性增加（图1的 A图），同时AP染色能够观察到明显的克隆着色（图1的B图），其中DPPA3、KLF4和KLF17的表达高于iPSC中的表达至少3倍以上，OCT4和DUX4的表达没有显著下调（图1的C图），表明本实施例制备的EPSC具有较高的多能性。

实施例2 从扩展多潜能干细胞（EPSC）制备间充质干细胞（MSC）的方法。

1、EPSC传代。

EPSC生长汇合度达到约70%-80%后，吸去上清，加入提前预热的DPBS清洗细胞两次，之后加入预热的Tryple消化细胞呈单细胞状态，终止消化离心后去除上清，使用1 mLEPSC培养基重悬细胞，进行细胞计数；

按照细胞密度1.0×10⁴ /mL，将EPSC细胞接种到提前铺有matrigel的六孔板中，每孔2mL培养基，放于5% CO₂，37℃恒温培养箱中培养细胞24小时。

2、EPSC向滋养层干细胞（Trophoblast Stem Cells，TSC）的诱导分化（第1-6天）。

本部分对TSC分化培养基进行筛选优化，设置3种培养基实验组，具体如下：

M1培养基：主要由DMEM/F-12和IMDM按照1:1配置，同时包含0.1 mM 2-mercaptoethanol、20% KSR、0.5 μM A8301、10 ng/mL BMP4、PD173074；

M2培养基：主要包含DMEM/F-12、0.1 mM 2-mercaptoethanol、0.2% 胎牛血清、0.3% BSA、1% ITS-X supplement、1.5 μg/ml L-AA-pi、50 ng/ml EGF、2 μM CHIR99021、0.5 μM A83-01、1 μM SB431542、0.8 mM VPA、5 μM Y27632；

M3培养基：主要由E6培养基或者DMEM/F-12和IMDM按照1:1配置，同时包含0.1 mM2-mercaptoethanol、20% KSR、1% ITS-X supplement、1.5 μg/ml L-AA-pi、50 ng/ml EGF、2 μM CHIR99021、0.5 μM A83-01、1 μM SB431542、0.8 mM VPA、5 μM Y27632和10 ng/mLBMP4。

EPSC传代后吸去旧液，分成3份，分别更换上述3种培养基后将细胞放于5% CO2，37℃恒温培养箱中培养6天。

之后每2天更换一次培养基，诱导分化第6天，RT-PCR检测3种培养基诱导的TSC相关基因GATA3/KRTF/HCGβ/TFAP2C/HLAG的表达情况，确定最优分化方案。

如图2所示，M1培养基诱导分化获得的TSC的GATA3/KRT7基因表达最高，M2培养基诱导分化获得的TSC的GATA3/KRT7基因表达最低。

如图3所示，在EPSC向滋养层干细胞分化过程中的第1天和第4天观察细胞形态，M1培养基诱导分化组的细胞贴壁异常，已经贴壁的细胞呈现圆形贴壁，且细胞增殖缓慢，生长第4天细胞形态基本未改变，且细胞基本没有增殖，M2培养基诱导分化组和M3培养基细胞第一天观察贴壁正常，细胞多呈现短梭形，4天后观察细胞均增殖正常。

综合TSC标志基因的表达情况和细胞形态与增殖情况，最终选择M3培养基为本发明的最优TSC分化培养基，采用M3培养基分化诱导得到的TSC细胞（P0代）进行后续实验。

3、滋养层干细胞向间充质干细胞的诱导分化（第7-18天，P0-P2）。

本部分的MSC分化培养基成分包含α-MEM、1×NEAA、1×GlutaMax、0.1 mM 2-mercaptoethanol、5%胎牛血清和5% 人血小板提取物。

TSC消化传代，吸去上清，加入提前预热的DPBS清洗细胞两次，之后加入预热的Tryple消化细胞呈单细胞状态，终止消化离心后去除上清，使用1 mL MSC分化培养基重悬细胞，进行细胞计数；将细胞按照（1-10）×10⁴/cm²密度接种到提前包被Matrigel的培养皿中，放于5% CO₂，37℃恒温培养箱中培养5天，此时细胞记为P1。

P1代细胞汇合度约达到100%，吸去上清，加入提前预热的DPBS清洗细胞两次，之后加入预热的Tryple消化细胞呈单细胞状态，终止消化离心后去除上清，使用1 mL MSC分化培养基重悬细胞，进行细胞计数；将细胞按照（1-10）×10⁴/cm²密度接种到提前包被Matrigel的培养皿中，放于5% CO₂，37℃恒温培养箱中培养7天，此时细胞记为P2。

如图4所示，P1代和P2代细胞能够呈现平行螺旋状的MSC形态特征，但P1代细胞的表面标志物水平还未达到MSC表面标志物的标准，P2代细胞表面标志物水平完全达标，因此，从TSC分化培养至P2代细胞，能够获得成熟稳定的间充质干细胞。从TSC诱导分化得到MSC的过程需要12天。

4、MSC传代（P2-P8）。

本部分为MSC的扩增传代过程，MSC扩增培养基成分包含α-MEM、1×NEAA、1×GlutaMax、0.1 mM 2-mercaptoethanol、5%胎牛血清和5% 人血小板提取物。

待上述步骤3中得到的P2代细胞汇合度达到约80%-90%，重新消化细胞呈单细胞，按照（1-10）×10⁴/cm₂密度接种到提前包被Matrigel的培养皿中，放于5% CO₂，37℃恒温培养箱中培养3天，此时细胞记为P3，同时收取细胞进行流式检测MSC相关标志基因表达情况。

待P3代细胞汇合度达到约80%-90%，重新消化细胞呈单细胞，按照（1-10）×10⁴/cm²密度接种到提前包被明胶的培养皿中，放于5% CO2，37℃恒温培养箱中培养3天，此时细胞记为P4。

待P4代细胞汇合度达到约80%-90%，重新消化细胞呈单细胞，按照（1-10）×10⁴/cm²密度接种到提前包被明胶的培养皿中，放于5% CO₂，37℃恒温培养箱中培养3天，此时细胞记为P5。

之后细胞生长汇合度达到约80%-90%后，对细胞进行消化传代，按照0.8×10⁴-1×10⁴/cm₂密度接种到提前包被明胶的培养皿中，放于5% CO₂，37℃恒温培养箱中培养。

如图4所示，得到P2代细胞之后，每3天传代一次，观察P3代及后续传代细胞的形态，P3-P11代细胞均能够呈现平行螺旋状的MSC形态特征，未见细胞体积增大或增殖减缓等衰老现象，并且能够稳定地增殖传代。

扩增起始接种细胞数为72万，生长4天后细胞增殖到420万，计算倍增时间为38.6小时（约1.5天）。由此可见，本发明制备得到的MSC增殖速度较快。

细胞倍增时间计算公式：DT=t*[lg2/(lgNt-lgN0)]），t为培养时间，N0为首次记下的细胞数，Nt为t时间后的细胞数。

实施例3 EPSC衍生的间充质干细胞的表征。

间充质干细胞表面标志物分析。

为了确认实施例1的方法制得的多能干细胞来源的间充质干细胞是否具有间充质干细胞的特性，使用流式细胞仪分析实施例2中的P2代细胞的表面标志物。

如表3和图5所示，P1代细胞的CD44和CD105比例低于95%，可见P1代细胞还未分化成成熟的MSC；P2代MSC细胞表达CD44、CD73、CD90、CD105、CD166比例均大于95%，HLADR和CD34、CD45表达比例低于3%，此时已完全分化为成熟的MSC；P2代细胞继续传代扩增至16代，MSC的表面标志物仍维持在合格水平。

表3 不同代次MSC表面标志物流式检测结果

间充质干细胞三系分化能力分析。

为了分析实施例2中制备的MSC的分化能力，将实施例2中制备的P2代MSC，分别采用成骨、成脂和成软骨分化培养基（Biowit）进行培养，每2-3日换液。待培养至2-3周，分别对诱导后的成脂细胞、成骨细胞和软骨细胞进行油红O染色、茜素红染色和阿辛蓝染色鉴定。

结果如图6所示，油红O染色（图6的a）、茜素红染色（图6的b）和阿辛蓝染色（图6的c）鉴定均呈阳性，说明本发明由EPSC细胞分化的MSC具备分化成脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞的能力。

实施例4 不同来源间充质干细胞FGF4分泌量比较。

FGF4属于成纤维细胞生长因子（FGF）家族成员，已有文献报道旁分泌FGF4 具有抗高血糖活性。专利CN111944035B公开了FGF4及其治疗糖尿病的应用，发现FGF4可通过促进肌肉和肝脏的葡萄糖摄取来发挥降糖作用，而且FGF4可直接作用于巨噬细胞以阻断肝脏、肌肉和脂肪组织中的炎性反应，进而增强胰岛素敏感性。Lei Ying等（Paracrine FGFstarget skeletal muscle to exert potent anti-hyperglycemic effects）发现旁分泌FGF4 以 AMPKα依赖但不依赖胰岛素的方式上调骨骼肌中 GLUT4 细胞表面的丰度，进而发挥其抗高血糖作用。

间充质干细胞可分泌FGF-4等生长因子，FGF-4可快速诱导AKT的活化，随后ERK被激活，进而大大增强细胞增殖能力。因此，本实施例通过检测本发明MSC与脐带、牙髓、脂肪来源MSC的FGF4分泌量，来验证本发明MSC的增殖能力和治疗2型糖尿病的潜能。

使用ELISA试剂盒检测EPSC来源的MSC（实施例2中得到的P4代）和脐带、牙髓、脂肪来源的MSC的FGF4分泌量。

结果如图7所示，EPSC来源的MSC的FGF4分泌量（6333 pg/mL)远高于脐带来源(2520 pg/mL)、牙髓来源(1341 pg/mL)和脂肪来源(2186 pg/mL)MSC的FGF4分泌量。因此证明，本发明制备得到的MSC具有治疗2型糖尿病的巨大潜力。

实施例5 EPSC残留检测。

EPSC同iPSC一样拥有无限增殖的能力，在体内可以形成畸胎瘤；因此，要将EPSC技术应用于再生医学并为患者提供可移植的细胞或者组织，我们必须确保EPSC来源的细胞或者器官的安全性，即必须确保未分化的EPSC细胞被排除在分化细胞之外。因此，本实施例通过检测未分化EPSC细胞的残留来验证由EPSC分化的MSC的安全性。

实验分为3组：MSC（本发明实施例2中得到的P4代细胞）组、EPSC（本发明实施例1中制备）组、FBC（成纤维细胞）组。提取上述3组细胞的RNA，并采用实时定量PCR方法检测其ESRG、OCT4、Nanog和SOX2的表达情况，具体步骤如下。

（1）RNA提取。

根据收取的细胞量加入500 μL或者1 mL的Trizol，充分吹打均匀，裂解细胞。加入1/5体积的酚氯仿，充分震荡，冰上放置15分钟，每隔3分钟震荡一次。4℃，12,000 rpm，离心15分钟。取上清到另一个新管，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀。-20℃，放置30分钟。4℃，12,000 rpm，离心15分钟。倒掉上清，加入预冷的75%乙醇，将沉淀弹起后上下颠倒。4℃，12,000 rpm，离心5分钟，去上清，重复上述步骤一次。55℃烘干沉淀，根据沉淀大小加入适量的ddH2O（65℃预热），65℃溶解。Nanodrop测定RNA浓度。

（2）反转录。

取制备的RNA样品1 μg，根据链式反应反转录试剂的要求进行反转录，反转录体系如下：

。

将上述样品混匀后离心，45℃孵育15分钟，85摄氏度灭活5分钟，得到的cDNA稀释20倍用于后续反应。

（3）实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR, qRT-PCR）。

将上述得到的样品按照如下体系进行qRT-PCR 检测，反应体系如下：

。

结果如图8所示，本发明制备的MSC表面标志基因ESRG、OCT4、Nanog和SOX2表达量均显著低于EPSC和成纤维细胞表面上述四种标志基因的表达量。说明本发明由EPSC分化制备的MSC中的EPSC未分化残留极少，具有较高的安全性。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims

1.一种制备间充质干细胞的方法，其特征在于，包括：

步骤1）提供扩展多潜能干细胞或包括扩展多潜能干细胞的细胞培养物；

步骤2）将所述扩展多潜能干细胞或包括扩展多潜能干细胞的细胞培养物置于滋养层干细胞分化培养基中培养，得到滋养层干细胞或包括滋养层干细胞的细胞培养物；所述滋养层干细胞分化培养基包括基础培养基、2-巯基乙醇、KnockOut™血清替代物、ITS-X补充剂、L-AA-pi、表皮细胞生长因子、GSK3β受体抑制剂CHIR99021、ALK4/5/7抑制剂A83-01、ALK5抑制剂SB431542、丙戊酸、ROCK抑制剂Y27632和BMP4；所述基础培养基是E6培养基或者是由DMEM/F-12培养基和IMDM培养基按照1:1配置；

步骤3）将所述滋养层干细胞或包括滋养层干细胞的细胞培养物置于间充质干细胞分化培养基中培养，得到间充质干细胞或包括间充质干细胞的细胞培养物；所述间充质干细胞分化培养基包括α-MEM培养基、1×NEAA细胞培养添加物、1×GlutaMax添加剂、2-巯基乙醇、胎牛血清和人血小板提取物；

步骤4）将所述间充质干细胞或包括间充质干细胞的细胞培养物置于所述间充质干细胞扩增培养基中进行传代培养，同时保持间充质干细胞的特性；所述间充质干细胞扩增培养基由α-MEM培养基、1×NEAA细胞培养添加物、1×GlutaMax添加剂、0.1 mM 2-巯基乙醇、5%胎牛血清和5% 人血小板提取物组成；

所述步骤3）和步骤4）中获得的间充质干细胞是表达CD44、CD73、CD90、CD105、CD166细胞表面标志物的间充质干细胞；

在16代或更多代的间充质干细胞中，表达所述CD44、CD73、CD90、CD105、CD166的细胞比例不低于95%。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2）进行4-8天。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤2）进行6天。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3）包括：所述滋养层干细胞或包括滋养层干细胞的细胞培养物分化培养5-7天得到P1代细胞，所述P1代细胞继续分化培养6-9天得到所述间充质干细胞或包括间充质干细胞的细胞培养物；

所述步骤4）包括：所述P1代细胞传代培养得到P2代细胞，所述P2代细胞传代培养至P3代细胞，所述P3代细胞传代培养至P4代细胞，所述P4代细胞继续进行后续传代培养，每3天传代一次。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤3）包括：所述滋养层干细胞或包括滋养层干细胞的细胞培养物分化培养5天得到P1代细胞，所述P1代细胞继续分化培养7天得到所述间充质干细胞或包括间充质干细胞的细胞培养物。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述滋养层干细胞分化培养基包括基础培养基、0.1 mM 2-巯基乙醇、20% KnockOut™血清替代物、1% ITS-X补充剂、1.5 μg/ml L-AA-pi、50 ng/ml 表皮细胞生长因子、2 μM CHIR99021、0.5 μM A83-01、1 μM SB431542、0.8mM 丙戊酸、5 μM Y27632和10 ng/mL BMP4。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述间充质干细胞分化培养基由α-MEM培养基、1×NEAA细胞培养添加物、1×GlutaMax添加剂、0.1 mM 2-巯基乙醇、5%胎牛血清和5%人血小板提取物组成。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2）中获得的滋养层干细胞是表达GATA3、KRT7细胞表面标志物的滋养层干细胞。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3）和步骤4）中获得的间充质干细胞是能够分化成脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌细胞、神经细胞和心肌细胞的多能性间充质干细胞。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3）和步骤4）中获得的间充质干细胞是表达HLADR、CD34、CD45的间充质干细胞；

在16代或更多代的间充质干细胞中，表达所述HLADR、CD34、CD45的细胞比例不高于3%。

11.通过权利要求1~10任一项所述的方法制备的间充质干细胞。

12.如权利要求11所述的间充质干细胞，其特征在于，所述间充质干细胞是能够分化成脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌细胞、神经细胞和心肌细胞的多能性细胞；

所述间充质干细胞表达CD44、CD73、CD90、CD105、CD166细胞表面标志物；在16代或更多代的间充质干细胞中，表达所述CD44+、CD73+、CD90+、CD105+、CD166+的细胞比例不低于95%；

所述间充质干细胞表达HLADR、CD34、CD45，在16代或更多代的间充质干细胞中，表达所述HLADR、CD34、CD45的细胞比例不高于3%。

13.通过权利要求1~10任一项所述的方法制备的间充质干细胞在制备治疗2型糖尿病或抗高血糖药物中的应用。